Die Erfindung betrifft spezifische radioaktive Metallkomplexe auf der Basis von Bispidin und dessen Derivate als Chelatbildner und deren Verwendung für die nuklearmedizinische Diagnostik und Therapie sowie ein Verfahren zur Herstellung derartiger radioaktiver Metallkomplexe.

Die Nuklearmedizin als ein wichtiges Teilgebiet der modernen Medizin nutzt offene radioaktive Substanzen, sog. Radiopharmaka, zu diagnostischen und therapeutischen Zwecken. Die überwiegende Anzahl von Radionukliden mit diagno- stisch und therapeutisch nutzbaren Strahlungseigenschaften sind ihrer chemischen Natur nach Metalle und daher spielen Arbeiten zur Entwicklung von Metal- loradiopharmaka eine wichtige Rolle in der modernen Radiopharmakaforschung (C. J. Anderson, M. J. Welch: "Radiometal-Iabeled agents (non-technetium) for diagnostic imaging". Chem. Rev. 99 (1999) 2219-2234; W. A. Volkert, T. J. Hoffmann: "Therapeutic radiopharmaceuticals". Chem. Rev. 99 (1999) 2269- 2292).

Ein wesentlicher begrenzender Faktor bei der Entwicklung von Metalloradiophar- maka im allgemeinen und im besonderen auch für Kupferradiopharmaka ist der Mangel an geeigneten Komplexbildnern, mit denen das radioaktive Metall stabil an Biomoleküle angekoppelt werden kann. Insbesondere ist die Stabilität vieler Metallchelate hinsichtlich Hydrolyse, die unter Freisetzung des radioaktiven Metalls verläuft, unzureichend.

Kupferisotope sind sowohl für eine diagnostische als auch therapeutische Anwendung in der Endoradionuklidtherapie von Interesse. Das betrifft die Positronenemitter ⁶⁰ Cu, ⁶¹ Cu ₁ ⁶² Cu und ⁶⁴ Cu für die Positronen-Emissions-Tomographie

(PET) und ⁶⁴ Cu sowie das ß ^" -emittierende ⁶⁷ Cu (E _max = 0.576 MeV) als attraktive Radioisotope für Radiotherapie und Radioimmuntherapie (W. A. Volkert, T. J. Hoffmann a.a.O.; J. S. Lewis, M. J. Welch: „Copper Chemistry related to Ra- diopharmaceutical Production". In: M.Nicolini, U.Mazzi (Hrsg.) Proc. of 6. In- tern.Symp. on Technetium in Chemistry and Nuclear Medicine, (Bressanone, Sept. 2002) p. 23 - 33).

Die Nuklideigenschaften von ⁶⁴ Cu erlauben dessen Verwendung für PET-Imaging und Radiotherapie. Daher gestatten mit ^Cu-markierte Radiopharmaka eine Ra- diotherapie mit gleichzeitigem Monitoring der Verteilung und Biokinetik durch PET- Imaging. Das Nuklid ist in guten Ausbeuten und hoher spezifischer Aktivität in kleinen Zyklotronen zu erhalten und steht daher zu niedrigen Kosten für die Routinepräparation von Radiopharmaka für die Behandlung beispielsweise von Tumorerkrankungen zur Verfügung.

Ungeachtet dessen gibt es bisher nur wenige auf radioaktiven Kupferisotopen basierende Radiopharmaka. Beispiele sind einmal ⁶⁰ Cu-ATSM als Hypoxie-Marker bzw. ⁶⁴ Cu-ATSM und ⁶⁴ Cu-PTSM, die als potentielle Agentien zur Tumortherapie diskutiert werden. Weitere Stoffklassen sind kupfermarkierte Peptide und Antikör- per, in denen das radioaktive Kupfer über einen bifunktionellen Chelator an das Biomolekül gebunden ist.

Wie bei Metalloradiopharmaka bereits ausgeführt, erfordert auch die Entwicklung von Kupferradiopharmaka geeignete Komplexbildner, mit denen das radioaktive Metall hydrolytisch und radiochemisch stabil gebunden werden kann. Die gegenwärtig ungenügende Verfügbarkeit solcher Komplexbildner ist ein gravierender begrenzender Faktor in der Entwicklung von Kupferradiopharmaka. Aus Arbeiten zur Entwicklung kupfermarkierter Antikörper haben sich cyclische Tetraaza- Verbindungen als die am häufigsten verwendeten Komplexbildner herausgestellt (P. J. Blower, J. S. Lewis, J. Zweit: „Copper Radionuclides and Radiopharmaceu- ticals in Nuclear Medicine,,. Nucl. Med. Biol. 23 (1996) 957-980; D. Parker: „Imaging and Targeting,, in Comprehensive Supramolecular Chemistry, vol. 10

„Supramolecular Technology,,, J. L Atwood, J. E. D. Davis, D. P. Mac Nicol, F. Vögtle, J.-M. Lehn (Hrsg.), Pergamon 1996, 487-536.) Jedoch erwiesen sich auch diese Verbindungen als insbesondere für eine therapeutische Anwendung ungeeignet, da sie zu unspezifisch wirken.

Als Grundvoraussetzung für Metallkomplexe, die mit Aussicht auf Erfolg als Ra- dioparmaka einsetzbar sind, werden sehr hohe Komplexstabilitäten und metabolische Stabilität hinsichtlich des Chelats gefordert. Da die Wahl des Komplexbildners Biokinetik, Verteilung und Metabolismus der radioaktiven Verbindung drama- tisch beeinflusst, sollte der Komplexbildner darüber hinaus strukturell variierbar sein, um Bioverteilungsmuster der Metall-Biomolekül-Konjugate optimieren zu können.

Somit liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, radioaktive Metall- komplexe bereitzustellen, in denen die radioaktive Metalle mit hoher Stabilität gebunden sind und die nach Applikation in den Körper metabolisch stabil sind.

Diese Aufgabe wird durch die in den Ansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen gelöst.

Insbesondere werden radioaktive Metallkomplexe auf Basis von Bispidin und dessen Derivate (Bispidin = 3,7-Diazabicyclo[3.3.1]nonan) als Chelatbildner mit der folgenden allgemeinen Formel (I) bereitgestellt,

X

worin

A und B unabhängig voneinander für H, -OR ¹ , -SR ¹ , -NHR ¹ , -OC(O)R ¹ , -NHC(O)R ¹ oder einen geradkettigen oder verzweigtkettigen (Ci _-8 ) Alkylrest stehen oder A und B zusammen für =0 oder =S stehen, wobei R ¹ Wasserstoff, einen geradkettigen oder verzweigtkettigen (C-ι_ ₈ ) Alkylrest, einen substituierten oder un- substituierten (Cβ-io) Arylrest, insbesondere Phenyl, darstellt, D jeweils eine Carboxylgruppe oder ein davon abgeleitetes Derivat, ausgewählt aus Estern, Amiden und Peptiden, ist, X, Y und Z unabhängig voneinander einen unsubstituierten oder substituierten Heterocyclus, ausgewählt aus Pyridin, Pyrimidin, Pyrazin, Thiophen, Furan, Pyra- zol, Imidazol, Thiazol, Chinolin, Chinazolin und Chinoxalin, darstellen, wobei die Substituenten aus geradkettigen oder verzweigtkettigen (Ci. ₈ ) Alkylresten, Halogen, geradkettigen oder verzweigtkettigen (Ci _-8 ) Alkoxyresten, Sulfonat, Carboxy- lat, Nitro, Cyan, Hydroxy, Benzyl oder Phenyl ausgewählt sein können, der Rest R in der jeweiligen Alkylenbrücke unabhängig voneinander für Wasserstoff, Hydroxy, einen geradkettigen oder verzweigtkettigen (Ci _-8 ) Alkylrest, einen geradkettigen oder verzweigtkettigen (Ci _-8 ) Alkoxyrest, -OC(O)R ¹ oder -NHC(O)R ¹ steht, wobei der Rest R ¹ wie vorstehend definiert ist, M ^* ein radioaktives Metall ist und m und n jeweils eine ganze Zahl zwischen 1 und 5 ist.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung der erfindungsgemäßen radioaktiven Metallkomplexe zur Diagnostik und Therapie sowie ein Verfahren zur Herstellung derartiger radioaktiver Metallkomplexe.

Als das radioaktive Metall M* können im Rahmen der vorliegendenErfindung insbesondere ein Nuklid des Kupfers, von seltenen Erden, Tc, In, Ga, Y oder Re eingesetzt werden. Vorzugsweise kann das radioaktive Metall M* aus ⁶⁴ Cu oder ¹⁸⁸ Re ausgewählt sein.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden Metallkomplexe bereitgestellt, wobei in der Formel (I) A und B unabhängig voneineinan-

der für H, -OR ¹ , -OC(O)R ¹ oder -NHC(O)R ¹ stehen oder A und B zusammen für =0 stehen,

D jeweils eine Carboxylgruppe oder ein davon abgeleitetes Esterderivat ist, X, Y und Z jeweils für ein unsubstituiertes oder substituiertes Pyridin stehen und der Rest R in der jeweiligen Alkylenbrücke unabhängig voneinander für Wasserstoff, Hydroxy, einen geradkettigen oder verzweigtkettigen (Ci _-8 ) Alkylrest, einen geradkettigen oder verzweigtkettigen (C _1-8 ) Alkoxyrest, -OC(O)R ¹ oder -NHC(O)R ¹ steht, wobei der Rest R ¹ wie vorstehend definiert ist.

In einer weiter bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden Metallkomplexe bereitgestellt, wobei in der Formel (I) A bzw. B für H bzw. OH stehen,

D jeweils eine -COOH Gruppe oder eine -COOMe Gruppe ist, X, Y und Z jeweils für 2-Pyridinyl stehen und der Rest R in der jeweiligen Alkyenbrücke jeweils für Wasserstoff steht, und m und n jeweils 1 sind.

Insbesondere Bispidine mit zwei tertiären Amin- und vier Pyridindonoren an einem sehr starren, von Diazaadamantan abgeleiteten Gerüst gelten als effektive Ligan- den insbesondere für beispielsweise Kupfer, dessen resultierende Komplexe außergewöhnlich stabil sind.

Ein wichtiges Merkmal der erfindungsgemäßen Verbindungen ist, dass sie eine gegenüber den im Stand der Technik verfügbaren Komplexen verbesserte chemi- sehe und radiolytische Stabilität aufweisen. Außerdem bietet das Bispidin- Grundgerüst vielfältige Möglichkeiten zur Einführung von Biomolekülen.

Die vorliegende Erfindung wird durch die nachstehenden, nicht-beschränkenden Beispiele weiter erläutert. Dabei werden repräsentativ die zwei speziellen, von Bispidin-9-ol und Bispidin-9-ol-dicarbonsäure abgeleiteten Chelatbildner verwendet.

abgeleitet von

Bispidin-9-ol Bispidin-9-ol-dicarbonsäure Chelatbildner A Chelatbildner B

Der Chelatbildner A kann als (Dimethyl-9-hydroxy-2-{(1Z)-1-[(1Z)-prop-2-en-1- ylidenamino]prop-1-en1-yl}-4-pyridin-2-yl-3,7-bis(pyridin-2- yl-methyl)-3,7- diazabicyclo[3.3.1]nonan-1 ,5-dicarboxylat bezeichnet werden. Der Chelatbildner B kann als (9-Hydroxy-2-{(1Z)-1-[(1Z)-prop-2-en-1-ylidenamino]prop-1-en 1-yl}-4- pyridin-2-yl-3,7-bis(pyridin-2-yl-methyl)-3,7-diazabicyclo[3 .3.1 ]nonan-1 ,5- dicarbonsäure bezeichnet werden.

Verbindungen der allgemeinen Formel (M ^* x Bisp) werden durch Zugabe einer wässrigen Lösung des radioaktiven Metalls (M ) zu einer wässrigen oder wäss- hg/organischen Lösung eines Bispidinderivates (Bisp) erhalten, wobei sich bei Raumtemperatur oder leichtem Erwärmen innerhalb weniger Minuten der Metallkomplex in über 95 %iger Ausbeute bildet.

Beispiel 1 : Chelatbildner A, abgeleitet von Bispidin-9-ol

500 mg des entsprechenden Bispidon-Derivats (0,844 mmol) werden in 8,3 ml Dioxan gelöst. Zu dieser Lösung gibt man 5,8 ml Wasser. Unter Eiskühlung und Rühren tropft man 0,216 g NaBH ₄ (5,71 mmol), in 4,5 ml Wasser gelöst, zu. Die Reaktionslösung wird weitere 2 h unter Eiskühlung gerührt und für 2 Tage im Kühlschrank gelagert. Anschließend wird der pH-Wert der Lösung mit verd. HCl auf 1 eingestellt und das Reaktionsgemisch für 2-3 h bei Raumtemperatur gelagert. Nun engt man die Lösung um die Hälfte ein und bringt den pH-Wert mit 1 M NaOH auf 8. Im Anschluss wird 5 Mal mit CH ₂ Cb extrahiert und die organische Phase eingeengt.

Ausbeute: 60 % d. Th., Fp: 167 ⁰ C.

Elementaranalyse (C ₃₃ H ₃₃ N ₆ O ₅ ): ber. C: 66,77, H: 5,60, N: 13,48 %; gef. C: 64,84, H: 6,03, N: 13,36 % MS (ESI): 595 (M ⁺ )

Beispiel 2: Cu(II)- Komplex mit Chelatbildner A

100 mg des Chelatbildners A (0,168 mmol) werden in 2 ml MeOH erhitzt. Dazu gibt man eine heiße Lösung von 31 ,5 mg Cu(NO ₃ ) ₂ (0,168 mmol) in 1 ml MeOH.

Das Reaktionsgemisch wird abgekühlt und der Komplex mit Ether gefällt und abgetrennt.

Ausbeute: 21 ,9 % (d. Th.)

Elementaranalyse (C ₃₃ H ₃₃ N ₈ OnCu x H ₂ O): ber. C: 50,67, H: 4,38, N: 14,32 %; gef. C: 49,53, H: 4,53, N: 14,00 %.

Dünnschichtchromatogram (RP-18, Aceton/ Ammoniumacetat (5 %ig) 1 :1 ): R _f =

0,53

HPLC: (Jupiter Proteo 4 μ 90 A; Eluent A: CH ₃ CN + 0,1 % TFA, Eluent B: H ₂ O +

0,1 % TFA, 10 % A -> 70 % A (t= 20 min) : t _R = 10,76 min

Beispiel 3: Herstellung eines ^Cu-markierten Komplexes mit Chelatbildner A

Zu einer Lösung, die 0,1 mg Chelatbildner A in 100 μl 0.05M MES (Morpholinoethansulfonsäure) / NaOH- Puffer mit einem pH-Wert von 5,3 enthält, werden 10 μl ⁶⁴ CuCb (0,1 M HCl) gegeben. Die Lösung wird 15 Minuten auf 37 ⁰ C erwärmt.

Radiochemische Reinheit: > 95 %

Dünnschichtchromatogram (RP-18, Aceton/ Ammoniumacetat (5 %ig) 1 :1 ): R _f = 0,53 HPL: (Jupiter Proteo 4 μ 90 A; Eluent A: CH ₃ CN + 0,1 % TFA, Eluent B: H ₂ O + 0.1 % TFA, 10 % A -> 70 % A (t= 20 min) : t _R = 10,76 min

Beispiel 4: Chelatbildner B

190 mg Kalium-terf-butylat (1 ,69 mmol) werden im Kolben vorgelegt. Man gibt 100 mg Chelatbildner A (0,168 mmol) in 0,78 ml trockenem THF zu. Nach weiterer Zugabe von 1 ,5 ml THF wird die Lösung auf 0 ⁰ C abgekühlt. Anschließend werden unter starkem Rühren 15 μl Wasser zugetropft. Nun wird die Lösung für 8 h am Rückfluss gehalten. Nach dem Abkühlen neutralisiert man mit 1 M HCl. Die Reaktionslösung wird zur Reinigung über eine RP-18 Kartusche gegeben. Ausbeute: 25,5 % d. Th., Fp: 174 ⁰ C. MS (ESI): 565 (M ⁺ )

Beispiel 5: Cu(ll)-Komplex mit Chelatbildner B

100 mg Chelatbildner B (0,179 mmol) werden in 2 ml MeOH erhitzt. Dazu gibt man eine heiße Lösung von 33,6 mg Cu(NOa) ₂ (0,179 mmol) in 1 ml MeOH. Das Reaktionsgemisch wird abgekühlt, der Komplex mit Ether gefällt und abgetrennt. Ausbeute: 19,3 % d. Th. Dünnschichtchromatogram (RP-18, Aceton/ Ammoniumacetat (5 %ig) 1 :1 ): R _f = 0,83

HPLC: (Jupiter Proteo 4 μ 90 A; Eluent A: CH ₃ CN + 0,1 % TFA, Eluent B: H ₂ O +

0,1 % TFA,

10 % A -> 70 % A (t= 20 min) : t _R = 9,73 min

Beispiel 6: Herstellung des ^Cu-Komplexes mit Chelatbildner B

200 μl 10 ^"4 M Ligandlösung (Chelatbildner B) - in MES (Morpholinoethan- sulfonsäure) / NaOH- Puffer mit einem pH-Wert von 5,4 - wurden mit 50 μl ⁶⁴ CuCI ₂

(0,1 M HCl) versetzt (-250 kBq) und 1 min bei Raumtemperatur geschüttelt. Radiochemische Reinheit: > 99 %

Dünnschichtchromatogram (RP-18, Acetonitril + 0.1 % TFA/ Wasser + 0,1 % TFA

80:20) R _f = 0,16

HPLC: (Jupiter Proteo 4 μ 90 A; Eluent A: CH ₃ CN + 0,1 % TFA, Eluent B: H ₂ O +

0,1 % TFA, 10 % A -> 70 % A (t= 20 min) : t _R = 9,40 min

Beispiel 7: Stabilitätsuntersuchungen des ⁶⁷ Cu-Komplexes mit Chelatbildner B im Rattenplasma

500 μg des Liganden B werdenm in 50 μl Wasser/CH ₃ CN gelöst und 50 μl ⁶⁷ CuCI ₂ (0,1 M HCl) (-250 kBq) werden zugeben. Zu dieser Lösung gibt man 250 μl Phosphatpuffer (Sörensen, pH=7,4) und 250 μl Rattenplasma. Nun inkubiert man für 2 h bei 37 ⁰ C. Anschließend wird kaltes EtOH (Volumen entspricht dem Gesamtvolumen der Lösung) zugesetzt. Man zentrifugiert 5 min bei höchster Stufe, nimmt die EtOH-Phase ab und überprüft den Gehalt an Aktivität (min. 100 kBq). Nun gibt man weitere 550 μl kalten EtOH hinzu und zentrifugiert erneut. Die EtOH-Lösung wird von den ausgefallenen Proteinen abgetrennt und eingeengt. Man gibt etwa 100 μl Wasser/CH ₃ CN-Lösung (9:1) hinzu und säuert mit 5 μl TFA an.

Dünnschichtchromatogram (RP-18, Acetonitril + 0,1 % TFA/ Wasser + 0,1 % TFA 80:20)

HPLC: (Jupiter Proteo 4 μ 90 A; Eluent A: CH ₃ CN + 0,1 % TFA, Eluent B: H ₂ O + 0,1 %TFA, 10%A->70%A(t=20min)