발명의명칭:방사선노출에따라방사선방호제� �출이조절되는 방사선반옹형나노입자및이의제조방법 기술분야

[1] 본발명은방사선방호제가결합되는블록공중합 체 (block copolymer)및상기 블록공중합체에방호제를결합한나노입자에관 한것으로서,구체적으로 방사선노출에따라방사선방호제방출이조절되 는방사선반웅형공증합체， 나노입자및이들의제조방법에관한것이다.

배경기술

[2] 최근일본후쿠시마원전사고와국내원자력발전 소 (power plant)의안전성에 대한불신，의학적진단및치료,비파괴검사를� �함한산업적방사선이용이 증가하고있다.특히방사선은의료,교육，원자� ��발전소，제조및비파괴검사 등의다양한분야에서활용되고있고국내관련종 사자는 10만명을상회하며 연평균 6 %씩성장하고있다 (ICRP간행물 U5, 2012년도).의료분야에서는 방사선이진단 (diagnosis)뿐아니라항암치료에도병행되며,인구 10만명당암 발생빈도는 OECD평균 552명 (남자 :307명 ,여자: 245명)수준으로이는꾸준히 증가하고있다 (국립암센터 , 2013년도통계, 2014년도발표).

[3] 방사능피폭형태는군사적피폭，산업적피폭， 의학적피폭등이 있는데，

의학적피폭중진단방사능의피폭의형태는내.� �부피폭의형태 (X- _ray , CT, PET-CT등)가있으며이러한피폭뿐만아니라，방� �능진단 /치료에복용하는 약물 (T-131, Tc-99m, P-32, Sr-89, Y-90)등에의해서도인체손상이야기된다.

[4] 인체는자연방사능 (l ~3mSv/year)이외에도인공방사능등을포함한다양� �� 형태의방사선을수시로접하고있으므로이의방 어에대한연구가시급하다. 그에따라，방사선피폭의인체유해성과의학적 이용의부작용을경감및 억제하는기술의개발이전세계적으로활발하나 국내의경우관련방사선 방호제제 (radioprotection agents)개발에대한원천기술이전무한실정이다.

[5] 방사선방호제제는크게방사능방호제 (Radioprotectors),방사능

완화제 (Radiomitigators),처치제 (Treatment),방사능민감제 (Radiosensitizers)로 나눌수있다.방사능방호제 (Radioprotectors)는방사선피폭전 (before

irradiation)에복용하여정상세포의손상을막는약 품으로서대표적인

약품으로는 WR-1065(amifostine), WR-2721 (phosphorilated amifostine)으로 방사선피폭에의해생성된라디칼소멸능 (radical scavenger)이뛰어난것으로 알려져있고，암세포를보호하는일없이，방사 선요법의부작용 (점막염，식도염， 직장염，급만성구강건조증，연하곤란，폐렴 ,방광염，피부염등)을감소시키고， 완전반응률 (complete response rates)을증가 (81 %)시킨다 (International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics' 2006May).이외에도 dipyridamole, adenosine monophosphate, tetracychlorodecaoxide, adeturon, deoxyspergualin등의합성제제 연구가진행되고있다.

[6] 방사능완화제 (Radiomitigators)는방사선피폭이후 (after irradiation)에정상세포 손상을완화시켜주는물질로서 Palifermin(Kepivance, marketed by Biovitrum, DNA repair), Captopril(ACE inhibitor, radiation-induced nephropathy완화)등이 있다.처치제 (Treatment)는방사선에피폭된정상세포 /조직의손상을개선하는 약품으로서 Pentoxyfilline과 vitamin E(antifibrotic treatment)등이 있다.방사능 민감제 (Radiosensitizers)는방사선치료시조사선량 (radiation dose)을줄이기 위한물질로서소세포암 (small cell carcinoma)의방사능치료에쓰이는

5-Nitroimidazole(Nimorazole), Tirapazamine(SR-4233),방사능핵종함유진단시약 및내부피폭제의배출을돕는킬레이트약물 (Radiogardase®-Cs, Ca-DTPA등) 등이 있다.

[7] 방사선방호제제약품의개발및산업화는선진국 에서활발히 진행되고있으며 amifostine, tempol등과같은순수단일화학성분을중심으로효 능검색및 개발이주를이루고있으나，저칼슴혈증，설사 ,오심，구토,졸음증，딸꾹질， 저혈압,적혈구이형, Stevens- Johnson syndrome및면역과민반웅등방호제의 독성 /부작용으로인하여실제적용은제한적인반면� �품의비용은고가 (예: Palifermin,€5,000/1 treatment)이고방호제시장의선점등으로사용이

일반화되어 있지않은형편이다.최근에는독성 /부작용을최소화할수있는 생물유래생의학적효능물질탐색 (screening)，특히방사선생체방어물질개발이 요구되며 ,방사선방호물질의효율적인 R&D개발을통한산업화에관심이 높아지고있다.국내의한국원자력연구소 (KAERI)와원자력병원,일부대학 둥에서방사선이생체에미치는영향및방사선방 호물질에관한연구가 제한적으로진행되고있다.근래개발된방사선� �호물질로는생약복합추출물인 HemoHIM이 있는데면역증진 /조혈세포증식등의생리활성증진물질로 소개되어 있고，상기추출물은한약재복합추출물의방사 선에대한생체방어 건강기능식품 (식약처)으로인정받아제품으로출시 ("방사선이용생체방어 기능성식품개발，，-보고서, KAERI)된바있다.그러나한약재의단순추출물에 한정되어방호효능에제한이많으며특히방사선 방호에필수적인히드록시 라디칼처리에어려움이있다.따라서방사선피� �전 (前)에는인체에영향을 주지않고피폭이후에는정상세포를보호하고손 상을방지하여높은

방호특성 (DRF)과효율적인 DNA수복능올가지는새로운방호제의개발이 시급하고，이의상품화를통한첨단핵심기능식 품또는의약품산업육성이 절실히요구된다.

[8] 최근의연구개발동향을고려할때，새로운나노 입자 (nanoparticle,

nanomedicine)기술을이용하여약물의안정성을확� �하는경우가많으므로, 이를통해생리활성기능 1등급수준의새로운방사선방호제를실용화하� � 방법에착안하여정상세포를보호하고방사선의 피해를최소화할수있는 방사선방호제제어방출용나노약물기술을개발 을고려할필요가있다.

이에，본발명자들은방사선노출이없을때에는 정상세포에대한영향을 최소화하고방사선노출이 있는경우에는방호제가효과적으로작용할수 있도록조절하는방안에대하여연구하던중，방 사선노출에따라방사선방호제 방출이조절되는방사선반웅형나노입자및이의 제조방법을확립함으로써본 발명을완성하였다.

발명의상세한설명

기술적과제

본발명은방사선노출에따라방사선방호제방출 이조절되는방사선반응형 블록공중합체 (block copolymer),방호제가결합된나노입자및이들의

제조방법을제공하여，방사선방호제가가지 는인체에미칠수있는부작용을 최소화하고방사선이조사되는경우방호제가안 정적으로방출되게하여 효과적으로세포및조직을보호하는데그목적이 있다.

과제해결수단

상기목적을달성하기위하여，본발명은셀레늄 화합물및

폴리에틸렌글리콜 (polyethylene glycol)을포함하고다당류또는고분자화합물을 포함하는블록공중합체 (block copolymer)를제공하고，상기블록공중합체에 방사선방호용물질을결합시켜제조한나노입자 를제공한다.

또한，본발명은

1)폴리에틸렌글리콜에셀레늄화합물을공유결� ��시키는단계；

2)상기단계 1)의공유결합된폴리에틸렌글리콜-셀레늄화합 물에다당류또는 고분자화합물을공유결합시키는단계를포함하 는블록공증합체제조방법을 제공하고，아울러상기블록공중합체에방사선 방호용물질을첨가하여 나노입자를제조하는단계를추가적으로포함하 는나노입자제조방법을 제공한다.

발명의효과

본발명의블록공중합체 (block copolymer)에방사선방호물질을결합하여 사용할경우방사선조사에선택적으로방호물질 이방출되게하는효과가있다. 구체적으로，방사선피폭전에는방호물질의 인체에대한영향을차단하여 부작용을최소화하고，방사선피폭이후에는나 노입자의붕괴에따른방호물질 방출 (release)로방사선노출에의한손상으로부터세포 및조직을보호하는 효과가있으므로，이러한방사선방호물질의제 어방출로인해본발명의 공중합체，나노입자및이들의제조방법은다양 한분야에유용하게활용할수 있다.

도면의간단한설명

도 1은본발명에따른셀레노시스타민-메톡시

폴리에틸렌글리콜-폴리락티드글리콜리드� �록공중합체 (block copolymer)를 합성하는과정을화학식으로나타낸도이다.

[17] 도 2는본발명의실시예에의해제조된엡셀렌 (ebselen)이결합된나노입자의 입자크기 변화를나타낸도이다:

[ 18] (a):방사선조사에의한입도분포의 변화;

[19] (b):투과전자현미경사진；및

[20] (c):방사선조사에의한평균입자크기의변화.

[21] 도 3은본발명의실시예에의해제조된나노입자로� �터 엡셀렌의방출속도에 방서선조사가미치는영향을나타내는그래프이 다.

[22] 도 4는본발명의실시예에의해제조된엡셀렌이결� �된나노입자를간

실질세포 (hepatocyte)에처리후방사선조사에의한영향을나 타낸도이다:

[23] (a):디엔에이 (DNA)의변화;

[24] (b):방사선조사후간실질세포의생존율의변화;

[25] (c):방사선조사후간실질세포의세포자살 (apoptosis)과세포괴사 (necrosis)의 변화;및

[26] RPM：방사선방호용물질을결합할수있는블록공 중합체 (radiosensitive polymeric micelles).

[27] 도 5은본발명의실시예에의해제조된나노입자를� �브씨 (BALb/C)쥐에 정맥주사하고방사선조사후쥐의생존율을나타 낸도이다:

[28] (a):쥐의생존율;

[29] (b):간조직에서정상간세포와비정상간세포의� �화;

[30] (c):쥐간조직의면역염색；및

[31] (d):간조직에서박스 (Bax)와비씨엘 (Bcl-2)의변화.

발명의실시를위한최선의형태

[32] 이하，본발명을상세히설명한다.

[33] 본발명은샐레늄화합물및폴리에틸렌글리콜 (polyethylene glycol)을포함하고 다당류또는고분자화합물을포함하는블록공중 합체 (block copolymer)를 제공한다.

[34] 상기상기샐레늄화합물은방사선에의해분해되 는디셀레니드 (diselenide) 화합물인것이바람직하나이에한정하지않고，

셀레노시스타민 (selenocystamine),셀레노시스틴 (selenocystine),

디셀레노디프로피오닉액시드 (diselenodipropionic acid),시스틴 (cystine), 시스타민 (cystamine)및이들의유도체로구성되는군으로부� ��선택되는어느 하나또는둘이상의복합체인것이더욱바람직하 나이에한정하지않으며， 폴리에틸렌글리콜과결합시킬수있는물질이면 특별한제한이없다.

[35] 또한,상기폴리에틸렌글리콜은메톡시폴리에� �렌글리콜 (methoxy

polyethylene glycol)일수있고，상기고분자화합물은

폴리락티드글리콜리드 (Poly(D,L-lactide-cx)-glycolicle)), 폴리카프로락톤 (Poly(e-caprolactone)),폴리락타이드 (Polylactide), 폴리락타이드코카프로락론 (Poly(lactide-co-caprolactone),

폴리글리코라이드 (Polyglyralide),폴리에틸렌글리콜폴리락타이드

블록공중합체 (Poly(ethylene glycol)/polylactide block copolymer),

폴리에틸렌글리콜폴리카프롤락톤블록공중합 체 (Polyethylene

glycol)/Poly(e-caprolactone) block copolymer),들록사머 (poloxamer),

풀루로닉 (pluronic),폴리우레탄 (polyurethane),실리콘 (silicone),

폴리디메틸실록산 (polydimethylsiloxane),테프론 (teflon),히아루론산 (hyaluronic acid),키토산 (Chitosan),덱스트란 (Dextran),풀루란 (Pullulan)및이들의유도체로 구성되는군으로부터선택되는어느하나또는둘 이상을흔합한것일수 있으나，이에한정하지는않는다.셀레늄화합� �-폴리에틸렌글리콜과결합하여 블록또는그라프트공중합체를합성하기위한물 질이면특별한제한이없다. 또한,셀레늄화합물 -폴리에틸렌글리콜결합체에다당류또는고분� �화합물을 결합할수도있다.예를들어,히아루론산또는키� ��산을소디움

시아노보로하이드라이드 (Sodium cyanoborohydride)로처리하여환원성 말단으로전환후샐레늄화합물-폴리에틸렌글� �콜과결합시켜블록

공중합체를만들수도있다.본발명의일양상에� �하면히아루론산또는 키토산을소디움시아노보로하이드라이드로처 리하여환원성말단으로전환후 셀레노시스타민 -폴리에틸렌글리콜과결합시켜블록공중합체� �만들수도 있다.

[36] 또한，상기폴리에틸렌글리콜은샐레늄화합물 에공유결합하고상기다당류 또는고분자화합물도셀레늄화합물에공유결합 하는것이바람직하나，이에 한정되지않는다.

[37] 아울러，상기블록공중합체는방사선노출에의 하여분해되는것이

바람직하나,이에한정되지않는다.

[38] 상기방사선은 α선， β선， γ선，양자，중양자，무거운원자핵의선속， X선，열선， 광선，우주선등을포함하나，이에한정되지않 고직접또는간접으로전리하는 능력을가진전자파또는입자선이면모두해당될 수있다.

[39] 상기노출은실험,사고，산업현장및항암치료� �을포함한의료활동등에 의한것을포함하나，이에한정되지않고방사선 에의해직접또는간접적으로 영향을받을수있는상황이면모두해당될수있다 .

[40] 또한，본발명은상기블록공중합체에방사선방 호용물질올결합시켜제조한 나노입자를제공한다.

[41 ] 상기방사선방호용물질은아미포스틴 (Amifostine),엡셀렌 (Ebselen),포스포릴 아미포스틴 (phosphorilated amifostine),디피리다몰 (dipyridamole),아데노신 모노포스페이트 (adenosine monophosphate) ,

테트라싸이클로로데카옥사이드 (tetracychlorodecaoxide),아데투론 (adeturon), 데옥시스퍼구알린 (deoxyspergualin),팔리퍼민 (Palifermin),캡토프릴 (Captopril), 펜특시필린 (Pentoxyfilline),비타민 E(vitamin E),비타민 Qvitamin C), 비타민 A(vitamin A), 5-니트로이미다졸 (5-Nitroimidazole),

티라파자민 (Tirapazamine),프루시안블루 (Prussian blue),펜테테이트칼슘 트리소디움 (pentetate calcium trisodium),스클레로글루칸 (scleroglucan), 베타글루칸 (beta-glucan),디셀레늄 (di selenium),샐레노시스타민 (selenocystamine), 셀레노시스틴 (selenocystine),디셀레노디프로피오닉액시드 (diselenodipropionic acid),커큐민 (curcumin),에피갈로카테킨에피갈레이트 (Epigallocatechin gallate), 카페익엑시드페네틸에스터 (Caffeic acid phenethyl ester)및이들의유도체로 구성되는군으로부터선택되는어느하나또는둘 이상의흔합인것이

바람직하나，이에한정하지않는다.

[42] 또한,본발명은

[43] 1)폴리에틸렌글리콜에셀레늄화합물을공유결� ��시키는단계;

[44] 2)상기단계 1 )의공유결합된폴리에틸렌글리콜-셀레늄화합� ��에다당류또는 고분자화합물을공유결합시키는단계를포함하 는블록공중합체제조방법을 제공한다.

[45] 상기블록공중합체제조방법은

[46] 1)용매에폴리에틸렌글리콜을용해시키는단계;

[47] 2)

디메칠아미노프로필에틸카보디이미드 (N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcar bodiimide)와하드록시숙신이미드 (N-hydroxysuccinimide)를첨가하여교반하는 단계;및

[48] 3)셀레늄화합물을첨가후교반한뒤투석하여동� ��건조하는단계를

포함하는방법일수있으나，이에한정되지는않 는다.

[49] 상기용매는용매는,물 (¾0),에탄올，디메틸아세트아미드 (dimethyl acetamide, DMAc),디메틸포름아미드 (N,N-ditnethylfom amicle, DMF),메틸피로리딘

(N-methyl-2-pyrrolidinone, NMP),디메틸설폭사이드 (dimethyl sulfoxide, DMSO), 아세톤 (Acetone),테트라하이드라푸란 (tetra-hydrofuran, THF),

에틸렌카보네이트 (ethylene carbonate, EC),디에틸카보네이트 (diethyl carbonate, DEC),디메틸카보네이트 (dimethyl carbonate, DMC),에틸메틸카보네이트 (ethyl methyl carbonate, EMC),프로필렌카보네이트 (propylene carbonate, PC), 초산 (acetic acid),개미산 (formic acid),클로로포름 (Chloroform),

디클로로메탄 (dichloromethane)및 DMP로이루어진군으로부터선택되는어느 하나이상일수있으나이에한정되지않는다.

[50] 또한，상기제조방법에방사선방호용물질을첨 가하여나노입자를제조하는 단계를추가적으로포함하는나노입자제조방법 을제공한다.

[51] 상기나노입자제조방법은

[52] 1)상기단계 3)을거쳐제조된블록공중합체를디메칠술폭사� ��드 (Dimethyl sulfoxide, DMSO)또는아세톤에용해시키는단계;및 [53] 2)방사선방호용물질을첨가하여교반한뒤분산� ��용매제거과정을거치는 것이바람직하나，이에한정되지않는다.

[54] 각단계의교반은자석식교반기에의한것이며,� �기폴리에틸렌글리콜은 0.01 내지 30중량 %이고,상기디메칠아미노프로필에틸카보디이� ��드와

하드록시숙신이미드를첨가하여하는교반은 3시간동안하는것이며，상기 셀레늄화합물은 0.1내지 30중량%이고,셀레늄화합물을첨가후의교반은 24시간동안하는것이며,그뒤의투석은 24시간동안하는것이고，동결건조는 2일간수행하는것이바람직하나,이에한정하지� ��는다.

[55] 아울러，나노입자제조에사용되는상기블록공 중합체는 0.1내지 10

중량%이고，방사선방호용물질은 0.01내지 10중량 %인것으로하는것이 바람직하나，이에한정하지는않는다.

[56] 본발명에따라,디메칠아미노프로필에틸카보� �이미드와

하드록시숙신이미드를이용하여폴리에틸렌글 리콜에셀레늄화합물을 공유결합시킬수있음을확인하였고，폴리에틸 렌글리콜-샐레늄화합물 결합체에폴리락티드글리콜리드와같은고분자 화합물을공유결합시켜，도 1과 같이블록공중합체를합성할수있음을확인하였 다 (도 1참조).

[57] 또한，상기방법에따라방사선방호용물질이결 합된나노입자를제조하였고, 상기나노입자가방사선조사에의하여파괴되어 방사선방호용물질을 방출 (release)함을확인하였으며방사선량을증가시킬 수록약물방출속도도 증가함을확인하였다 (도 2및도 3참조).

[58] 또한，제조된나노입자에대한세포독성을실험 한결과，방사선방호용물질이 결합된나노입자를처리하고방사선조사를한경 우엡셀렌자체를처리한것과 유사한수준으로세포생존능이높은것을확인하 여，방사선방호효과가있음을 규명하였다 (도 4및도 5참조).

[59] 따라서 ,즉，방사선이조사되지않은때에는방사선방� �용물질이나노입자 형태로결합된상태이므로방출되지않아인체에 부작용등을나타내지않고, 방사선이조사된이후에는나노입자가파괴되면 서방호용물질이방출되어 세포및조직보호효과를발휘하므로，방사선방 호제의방출을조절할수있는 신규한방사선반웅형나노입자를제조한것임을 확인한것이다.

[60] 이하，본발명을실시예및실험예에의해상세히 설명한다.

[61] 단,하기실시예및실험예는본발명을예시하는� �으로서，본발명의내용이 하기실시예및실험예에한정되는것은아니다.

[62] <실시예 1 >폴리에틸렌글리콜 (polyethylene glycol)에셀레노시스타민 (seleno cystamine)을공유결합하는단계

[63] 폴리에틸렌글리콜을디메칠술폭사이드 (Dimethyl sulfoxide, 1SO)에 0.01 내지 30중량 %로녹이고각각동량의디메칠아미노프로필에� �카보디이미드와 하드록시숙신이미드를첨가하여자석식교반기 로 3시간동안교반하였다.이 용액에셀레노시스타민을 0.1내지 30중량 %첨가하고다시 24시간동안교반한 후투석막에넣고증류수로 ₂₄ 시간동안투석하여부산물과유기용매를

제거하였다.그후동결건조기로 2일동안건조하여

샐레노시스타민 -폴리에틸렌글리콜결합체를얻었다.

[64] <실시예 2>샐레노시스타민-폴리에틸렌글리콜-폴리� �티드글리콜리드

블록공중합체를합성하는단계

[65] 폴리락티드글리콜리드를디메칠술폭사이드에 0.01내지 30중량 %로녹이고 각각동량의디메칠아미노프로필에틸카보디이 미드와하드록시숙신이미드를 첨가하여자석식교반기로 3시간동안교반하였다.이용액에상기 <실시예 1>에 의해제조한셀레노시스타민 -폴리에틸렌글리콜결합체 0.01내지 30중량 %를 첨가하고다시 24시간동안교반한후디에칠에테르 (diethyl ether)에침전시켰다. 침전물은필터로거른후다시디에칠에테르 (diethyl ether)로세번이상세척을 하고실온에서건조하여

샐레노시스타민 -폴리에틸렌글리콜 -폴리락티드글리콜리드블록공중합체를 얻었다.

[66] <실시예 3>엡셀렌 (ebselen)이결합된나노입자의제조

[67] 샐레노시스타민 -폴리에틸렌글리콜 -폴리락티드글리콜리드블록공중합체을 디메칠술폭사이드또는아세톤에 0.1내지 30중량 %가되도록녹이고, 엡샐렌을 0.01내지 10중량 %가되도록첨가한후자석식교반기로교반하여 완전히녹였다.그후용액을증류수에분산시켜� �셀렌이결합된나노입자가 형성되도록한후유기용매는감압증류하여제거 하거나투석하여제거하였다. 상기과정을거쳐 엡셀렌을결합시킨나노입자는동결건조하거나 냉장

보관하는것이적당함을확인하였다.

[68] <실험예 1 >방사선조사에따른방사선방호용물질의방� �확인

[69] <1-1>방사선방호용물질이결합된나노입자� ��제조

[70] 폴리에틸렌글리콜을디메칠술폭사이드에 10중량 %로녹이고

폴리에틸렌글리콜과동량의디메칠아미노프로 필에틸카보디이미드와

하드록시숙신이미드를첨가하여폴리에틸렌글 리콜말단의카르복실기를 하이드록시숙신이미드로활성화시켰다.하이� �록시숙신이미드로말단을 활성화시킨폴리에틸렌글리콜에셀레노시스타 민을 1내지 3중량 %가되도록 첨가하고 24시간교반후,셀레노시스타민이결합된폴리에 틸렌글리콜을 얻었다.핵자기공명장치스펙트로스코피 (proton nuclear magnetic resonance spectroscopy: picoSpin 45， Thermo Scientific사, MA, USA)측정결과， 3.7 ppm에서 폴리에틸렌글리콜의에틸렌수소 (proton)의특성피크를확인하였고, 1.6 ppm에서셀레노시스타민의특성피크를확인하여 결합이돠었음을확인하였다. 또한폴리락티드글리콜리드를디메칠술폭사이 드에 10중량 %로녹이고동량의 디메칠아미노프로필에틸카보디이미드와하드 록시숙신이미드를첨가하여 폴리락티드글리콜리드말단의카르복실기를하 이드록시숙신이미드로

활성화시켰다.하이드록시숙신이미드로말단� �활성화시킨 폴리락티드글리콜리드에셀레노시스타민 -폴리에틸렌글리콜결합체를 10중량 %가되도록첨가한후 24시간이상교반하여

셀레노시스타민-폴리에틸렌글리콜-폴리락티� ��글리콜리드블록공중합체 (도 1 )를얻었다.핵자기공명장치스펙트로스코피측� ��결과 1.5 ppm과 4.8 ppm에서 폴리락티드글리콜리드의특정피크를확인하여 합성이되었음을확인하였다.

[71] <1-2>방사선조사에의한나노입자파괴및방� ��선방호용물질방출확인

[72] 상기 <실험예 1-1>에의해제조된블록공중합체를메칠술폭� �이드에 2중량 %로녹이고엡셀렌을으2중량 %가되도록첨가한후감압증류또는투석방법에 의하여엡셀렌이결합된나노입자를제조하여그 결과를도 2에도시하였다.도 2(a)와도 2(c)에서와같이 엡셀렌이결합된나노입자는약 lOOnm전후의입경을 가지는것으로나타났지만방사선조사에의하여 나노입자가파괴된결과 입경이 50 nm전후의크기로감소하였다.도 2(b)는투과전자현미경으로방사선 조사후나노입자의형태변화를나타낸것이다.� �근모양의나노입자가방사선 조사후파괴되어불규칙한모양으로변한것을확 인할수있었고，이를통해 방사선방호용물질이방출된것임을알수있었다 .

[73] 또한，엡셀렌이결합된나노입자를 0.1내지 10중량 %가되도록완층용액에 분산후 3 C에서약물의방출속도를 UV스펙트로포토미터로측정하였다.그 결과,도 3에나타낸바와같이방사선량을증가시킬수록� �노입자가더많이 파괴되어약물의방출속도가빨라진것을확인하 였다.

[74] <1-3>방사선조사에따른세포보호효과확인

[75] 상기 <실험예 1-1>에의해제조된엡셀렌이결합된나노입자� �간실질세포 (hepatocyte)에처리하여세포독성실험을하였다.

[76] 구체적으로，간실질세포는쥐 (rat)유래의간실질세포를사용하였으며， 3 x 10 ⁴ 세포를 96 well plate에배양한뒤 0.001내지 1000 microgram/ml까지다양한 농도로엡샐렌이결합된나노입자를처리하고방 사선을조사하였다. 24시간 동안배양후세포에대한세포의생존율을 MTT assay를이용해평가하고， Comet assay를통해 DNA의꼬리형성도를평가하였으며,세포자살 (apoptosis)분석 (554 nm, Alexa Fluor® 532, affymetrix, CA, USA)에서세포가자살또는괴사되는 정도를평가하였다. (사용장비등을추가적으로기재하여주시기바� �니다.)

[77] 그결과，도 4의 (a)와같이방사선의선량에따라 DNA의꼬리형성도가

증가하는경향을보였으나，엡셀렌과엡셀렌이 결합된나노입자를처리한경우 상대적으로 DNA꼬리형성도가더적은것올확인하였다.또한� �도 4의 (b)와 같이 엡셀렌및엡셀렌이결합된나노입자를처리한경 우세포의 생존능이더 높은것을확인하였다.아을러，도 4의 (c)는엡셀렌및엡샐렌을결합한

나노입자를처리한경우세포의자살 (apoptosis)및괴사 (necrosis)정도를나타낸 것으로서，도 4의 (c)에서녹색은살아있는세포 (viable cell)를나타내며청색은 초기세포자살 (early apoptosis),붉은색중오른쪽은후기세포자살 (late apoptosis)그리고왼쪽은괴사 (necrosis)를나타낸다.엡셀렌및엡샐렌을결합한 나노입자를처리한경우세포의자살 (apoptosis)및괴사 (necrosis)가감소한것을 확인하였다.

[78] 또한,상기 <실험예 1-1>에의해제조된엡셀렌이결합된나노입자� �

발브씨 (BALb/C)쥐의꼬리에정맥주사하고방사선 (10 Gy)을조사한후 생존능을조사하였다.

[79] 그결과，도 5(a)와같이방사선을조사하고아무런처리를하� �않은쥐들은

10일후 20 %이하의생존율을보였지만엡셀렌을결합한나� �입자를주사한 경우 30일까지도 60 %이상의생존율을보였다.또한,도 5(b)와같이방사선조사 후，쥐의간조직에서비정상적인세포가 20 ^< ¾까지증가하였으나，엡셀렌이 결합된나노입자를주사한경우에는 10 %이하로억제된것을확인하였다.도 5(c)에서는면역염색결과，방사선조사후，쥐� �간조직의손상또는괴사를 발견할수있었으나，엡셀렌이결합된나노입자 를주사한경우에는조직이 양호한것을확인하였다.아울러,도 5(d)와같이웨스턴블롯 (western blot)분석 결과，세포사멸을나타내는박스 /비씨엘 (BAX/Bcl-2)비율이엡샐렌이결합된 나노입자를주사한경우에가장낮은것을확인하 였고，이를통해엡샐렌이 결합된방사선반웅형나노입자가방사선방호효 과가탁월함을확인하였다.