MARSAIOLI ANITA JOCELYNE (BR)
BELOTI LILIAN LUZIA (BR)
DA COSTA BRUNA ZUCOLOTO (BR)
ZAMPIERI DÁVILA DE SOUZA (BR)
DE SOUZA ANETE PEREIRA (BR)
MARSAIOLI ANITA JOCELYNE (BR)
BELOTI LILIAN LUZIA (BR)
DA COSTA BRUNA ZUCOLOTO (BR)
ZAMPIERI DÁVILA DE SOUZA (BR)
| US20030143710A1 | 2003-07-31 |
KOTIK, M. ET AL.: "Epoxide hydrolases and their application in organic synthesis", CURR. ORG. CHEM., vol. 16, no. 4, 2012, pages 451 - 482
BELOTI, L.L. ET AL.: "A novel and enantioselective epoxide hydrolase from Aspergillus brasiliens is CCT 1435: Purification and characterization", PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION, vol. 91, 2013, pages 175 - 183
| REIVINDICAÇÕES Enzima recombinante caracterizada por ser a SEQ ID ns 1 . Processo de hidrólise enzimática de epóxidos caracterizado por empregar a enzima recombinante descrita na reivindicação 1 em um sistema bifásico, sólido:líquido ou líquido:líquido. Processo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato do substrato empregado no processo poder ser um epóxido de fórmula geral(l) I onde Ri, R2, R3 e R4 são, independentemente, hidrogénio, alquil, alquenil, alquinil, cicloalquil, cicloalquenil, héterociclos, aril, arilalquil, alcóxido, arilóxido, acil, alcóxicarbonil, derivados de acila, tais como ésteres, amidas, haletos, ácidos, entre outros; onde Ri, R2, R3 e R4 são os mesmos ou diferentes; onde Ri, R2, R3 e R4 podem estar opcionalmente substituídos com grupos hidróxi, amino, halo, carbóxi, sulfeto, entre outros; onde Ri e R3 ou R2 e R4 podem formar opcionalmente um carbociclo ou heterociclo. Processo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelas reações em sistema bifásico sólido:líquido ocorrer com adição de 5 a 50 mg, preferencialmente 20 mg de substrato adsorvido em 50 a 500 mg, preferencialmente 200 mg, de um suporte, em 0,5 a 10 ml_ de tampão fosfato contendo de 0,05 a 1 mg/mL, preferencialmente 0,3 mg/mL da enzima recombinante descrita na reivindicação 1. Processo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato do suporte ser selecionado dentre resina sólidas poliméricas apoiares ou moderadamente polares, com momento de dipolo entre 0,3 e 1 ,8; área superficial entre 330 a 900 m2/g; e diâmetro de poro entre 40 e 300 À, preferencialmente uma resina de éster acrílico ou poliaromática hidrofóbica. 6. Processo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelas reações em sistema líquido:líquido ocorrer com adição de 1 a 100 mg, preferencialmente 10 mg de substrato, 0,5 a 50 ml_, preferencialmente 3 ml_ de solvente orgânico e 0,1 a 10 ml_, preferencialmente 1 ml_, de tampão fosfato contendo de 0,1 a 1 mg/mL, preferencialmente 1 mg/mL da enzima recombinante descrita na reivindicação 1. 7. Processo, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato do solvente orgânico ser selecionado dentre solventes imiscíveis com água e com índices de polaridade entre 0 e 5, preferencialmente os alcanos acíclicos com índices de polaridade próximo a 0. 8. Processo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pela mistura reacional obtida nas reivindicações 4 e 6 ser mantida sob agitação entre 100 e 300 rpm, preferencialmente 250 rpm, com temperatura variando entre 30 e 40eC, preferencialmente 35°C, por 0,5 a 48 h, preferencialmente 24 h. 9. Processo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelas fases reacionais serem extraídas com solventes orgânicos de polaridade entre 1 e 5, preferencialmente acetato de etila. 10. Dióis vicinais caracterizado por serem obtidos de acordo com as etapas descritas nas reivindicações de 1 a 9. 1 1. Dióis vicinais, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por serem obtidos com pureza superior a 80% e conversões de até 100%. 12. Uso dos dióis vicinais conforme descritos na reivindicação 10 caracterizado por ser empregado como intermediário sintético chave na produção de fármacos, utilizados no tratamento de doenças cardiovasculares, como hipertensão e arritmia, e no combate a tumores. 13. Uso da enzima definida pela SEQ ID nQ 1 caracterizado por ser empregada em processos de hidrólise de epóxidos. |
Campo da invenção
A presente invenção refere-se a uma enzima recombinante do fungo Aspergillus brasiliensis CCT1435 e um processo de hidrólise enzimática de epóxidos. Mais especificamente, a presente invenção trata de um processo de obtenção de dióis vicinais enantiomericamente puros a partir de epóxidos racêmicos empregando uma epóxido hidrolase recombinante.
O processo enzimático para produção régio e enantiosseletiva de dióis vicinais de grande interesse em rotas sintéticas ocorre em sistemas bifásicos, eliminando a etapa de purificação.
Fundamentos da invenção
Os enantiômeros têm propriedades físicas idênticas e diferem somente na sua rotação óptica, entretanto, suas atividades biológicas podem diferir consideravelmente. A característica enantiomérica das moléculas é de grande importância para a indústria farmacêutica, pois as enzimas humanas são quirais. Os enantiômeros de drogas racêmicas podem ser absorvidos, ativados ou degradados com cinéticas distintas e podem apresentar diferentes tipos de atividade farmacológica. Devido a essa particularidade dos enantiômeros, é de suma importância que tanto fármacos, como outros produtos industriais contenham em suas fórmulas compostos enantiomericamente puros.
Um grupo importante de moléculas quirais é constituído por epóxidos. Em química orgânica, um epóxido é um grupamento funcional reativo (éter cíclico) formado por um átomo de oxigénio unido a dois átomos de carbono, que por sua vez estão unidos por uma ligação covalente. Os epóxidos podem ser convertidos em dióis vicinais pela abertura do anel, em um processo de hidrólise. Nesse contexto, a biocatálise reúne as vantagens da química orgânica sintética e seletividade das reações catalisadas por enzimas, permitindo o uso de condições brandas, o que a torna uma ferramenta valiosa no âmbito da Química Verde.
As epóxido hidrolases (EHs) se destacam como biocatalisadores versáteis. Estas enzimas pertencem à família das α/β hidrolases, e catalisam a adição de uma molécula de água a um anel oxirano levando à formação do respectivo diol vicinal, sem necessidade de cofatores. O estado da técnica apresenta diferentes processos empregando epóxido hidrolases para a conversão de epóxidos em seus respectivos dióis vicinais.
O trabalho de Cao, Lee, Chen e Wood (2006) descreve a síntese do (ft)-fenil-1 ,2-etanodiol com epóxido hidrolases de batata e Agrobacterium radiobacter, em um processo realizado em solução tampão atingindo 100% de conversão e 98% de excesso enantiomérico (ee), com velocidade de 4,7 ± 0,7 μιτιοΙ/min/mg e uma taxa de hidrólise espontânea de 4,4% com 45 min de reação. Diferentemente, a presente invenção emprega uma única EH recombinante de Aspergillus brasiliensis para a conversão régio e enantiosseletiva de epóxidos aos seus respectivos dióis vicinais, o que facilita todo o processo, não havendo necessidade de expressão de duas enzimas. Ainda, o presente invento é vantajosamente operado em sistemas bifásicos sólido-líquido ou líquido-líquido, o que reduz a exposição do epóxido ao meio aquoso, reduzindo, portanto, sua taxa de hidrólise espontânea. Tal fato, ainda, permite a supressão de uma etapa de purificação do produto uma vez que o epóxido (reagente) e o diol (produto) se alocam em fases distintas, o que não é descrito no trabalho acima.
Já o trabalho de Monterde, Lombard, Archelas, Cronin, Arand e Frutoss (2004) apresenta a hidrólise de quatro epóxidos diferentes (óxidos de orto, meta e para-cloroestireno) por uma EH de Solanum tuberosum (batata). A reação se dá em meio "salt free" (água, sem o tampão), utilizando DMSO ou DMF como co-solvente para auxiliar a solubilização dos substratos. O presente invento, no entanto, não utiliza DMSO e DMF como co-solventes, os quais apesar de facilitarem o acesso da enzima ao substrato, são de difícil remoção ao final do processo e não evitam a hidrólise espontânea do epóxido, que pode não ser negligenciável em reações mais lentas. Etapas de extração com solventes orgânicos comuns, como acetato de etila, são ineficientes visto que carregam, junto com os produtos reacionais, os co-solventes. Além disso, possuem temperaturas de ebulição elevadas dificultando também o processo de evaporação para isolamento dos produtos. Ademais, a presente invenção é aplicável tanto para epóxidos terminais, como os do trabalho citado, quanto para epóxidos não terminais.
No trabalho de Yildirim, Tukel, Alagõz e Alptekin (2011 ), foi empregada uma EH de Aspergillus niger, imobilizada em suporte sólido (Eupergit C 250 modificado com etilenodiamina e glutaraldeído) por formação de uma base de Schiff, na hidrólise do óxido de estireno. A reação ocorre, portanto, em um meio bifásico sólido-líquido e emprega DMSO como co- solvente. Após a reação ser completada, a EH imobilizada é recuperada por filtração e o meio reacional é extraído com acetato de etila. Os produtos reacionais são, então, purificados por cromatografia em coluna. A temperatura ótima de reação determinada e utilizada no trabalho foi de 40 Q C. O presente invento, ao contrário do processo descrito no trabalho, evita o contato constante do epóxido com a água por imobilização do epóxido e não da enzima, impedindo elevadas taxas de hidrólise espontânea do mesmo. Nas condições de temperatura adotada no trabalho, a hidrólise espontânea no meio é ainda mais acentuada. Ainda, o presente invento opera tanto sobre epóxidos terminais quanto sobre epóxidos não terminais sem o emprego de co- solventes e dispensando etapas de purificação pós-reação.
O trabalho de Karboune, Archelas e Baratti (2009) apresenta o emprego de uma EH de A. niger imobilizada nas resinas Accurel EP 100 e DEAE-cellulose para hidrólise do óxido de p-cloro-estireno. Neste trabalho foram empregados os solventes orgânicos heptano ou heptano:dioxano em diversas proporções, o que evita a hidrólise espontânea do epóxido no meio reacional. Nada foi relatado sobre a atuação desta EH sobre outros esqueletos de epóxidos. O presente invento, conforme já discutido, pode atuar em epóxidos terminais e não terminais. Além disso, a EH descrita no trabalho não é enantioconvergente: a conversão reacional não deve, portanto, ultrapassar 50%. Diferentemente, o presente invento envolve uma catálise de epóxidos de maneira régio e enantiosseletiva, levando à produção de dióis vicinais com razoável pureza enantiomérica e podendo alcançar conversões de até 100%. Ademais, o presente invento, por empregar meios bifásicos, contorna a etapa de purificação necessária no trabalho exposto, dado que, no processo descrito no mesmo, o substrato e o produto permanecem na mesma fase reacional.
O documento WO2006108771 , depositado em 03/04/2006, apresenta um processo para obtenção de polióis a partir de epóxidos usando EH de diversas fontes microbianas, com especial atenção para a EH recombinante e comercial de Aspergillus niger (Fluka 71832). O processo se dá em meio líquido (tampão e octanol) ou com o epóxido polimerizado. A principal aplicação desta patente é a obtenção final de polímeros funcionais do tipo poliol, protegendo substratos contendo como o substituinte divalente X um grupo éter, éster, amino ou amido, grupos reativos polimerizáveis como R , e H ou grupamentos C1 -C4 alquil nos radicais R 2 , R3 e R 4 , conforme indicado na fórmula abaixo.
No entanto, os autores não protegem sequências primárias ou produção de novas EHs, mas somente a aplicação de EHs já conhecidas. Na presente invenção, entretanto, protegemos a sequência primária de uma nova EH de Aspergillus brasiliensis CCT 1435, recombinante e expressa em E. coli, assim como a sua aplicação na obtenção de dióis vicinais a partir de diversos epóxidos, os quais tem como principal finalidade a produção de intermediários sintéticos chaves de compostos com atividade biológica. Além disso, no documento WO2006108771 não é reivindicado a obtenção de dióis com elevada pureza enantiomérica, mas somente racêmicos. Na presente invenção, entretanto, tem-se como principal aplicação a produção de diois enantiomericamente puros ou enriquecidos. Ainda, a invenção citada não utiliza sistemas bifásicos sólido-líquido, onde o epóxido está adsorvido em na resina sólida, ou sistemas líquido-líquido, onde o epóxido encontra-se alocado em uma fase orgânica, como é feito no presente invento. O processo do documento de patente consiste somente na hidrólise de um epóxido com posterior polimerização do diol formado ou polimerização do epóxido com posterior hidrólise do polímero sólido funcionalizado.
O documento WO200706907, depositado em 14/04/06, protege o processo de obtenção de um epóxido interno ou um diol interno opticamente ativo por meio de epóxido hidrolase em que, o epóxido interno pode ser cis-2,3- dissubstituído, os substituintes do epóxido podem ser um aril, um aril-alquil ou um acil e a reação se passa em meio líquido (podendo conter um solvente orgânico). Esta patente somente protege a obtenção de epóxidos e dióis internos enantiomericamente enriquecidos. O presente invento, todavia, permite a obtenção de dióis internos e externos com elevada pureza enantiomérica em um processo régio e enantiosseletivo, utilizando uma única EH recombinante. Ainda, destaca-se que o documento de patente protege a utilização de sistemas bifásicos líquido-líquido onde uma das fases é um solvente orgânico ímiscível com a fase aquosa. O presente invento, no entanto, além disto permite a utilização de sistemas bifásicos sólido-líquido, onde o substrato encontra-se adsorvido em uma resina sólida, o que também reduz a taxa de hidrólise espontânea e suprime a etapa de purificação do produto uma vez que o epóxido (reagente) e o diol (produto) se alocam em fases distintas, o que não é descrito no trabalho acima.
Diante do exposto, a presente invenção apresenta vantagens sob vários aspectos. Primeiro porque propõe uma epóxido hidrolase recombinante de Aspergillus brasiliensis que atua em faixa de pH (6-9) e temperatura (30- 40 e C) adequadas para o processo. Esta enzima possui estrutura primária inédita e é a primeira EH recombinante produzida no Brasil. Além disso, o presente invento descreve um processo de obtenção de dióis vicinais a partir de epóxidos racêmicos terminais, di e trissubstituidos com elevada pureza enantiomérica, em um processo régio e enantiosseletivo que emprega uma epóxido hidrolase recombinante. Outro ponto crucial é que as reações da presente invenção ocorrem em sistemas bifásicos o que evita a hidrólise espontânea dos epóxidos no meio reacional pela diminuição do contato do epóxido com a fase aquosa. Outra vantagem da utilização de sistemas bifásicos em reações com EHs é a possibilidade de evitar a etapa de purificação do produto. Finalmente, o presente invento é versátil, convertendo diversos esqueletos de substratos a seus respectivos dióis vicinais
Com destaque para os produtos obtidos na presente invenção, tais dióis vicinais foram obtidos com pureza superior a 95% e conversões de até 100%. Dentre as aplicações dos dióis vicinais, a principal delas está relacionada com seu emprego como intermediário sintético chave na produção de fármacos, os quais são utilizados, por exemplo, no tratamento de doenças cardiovasculares, como hipertensão e arritmia, e no combate a tumores.
Breve descrição da invenção
A presente invenção se refere a uma enzima epóxido hidrolase recombinante do fungo Aspergillus brasiliensis CCT1435 caracterizada por ser a SEQ ID n s 1. É objeto adicional um processo de hidrólise enzimática de epóxidos racêmicos, empregando a enzima epóxido hidrolase recombinante, em sistemas bifásicos. Além disso, a presente invenção refere-se também aos dióis vicinais obtidos pelo processo descrito, com pureza superior a 95% e conversões de até 100%, e seus usos.
A invenção descreve um processo de hidrólise que compreende o emprego da enzima epóxido hidrolase recombinante em um sistema bifásico, sólido:líquido ou líquido:líquido. O substrato empregado no processo pode ser um epóxido de fórmula geral (I) onde Ri, R 2 , R3 e R 4 podem ter substituintes do tipo hidrogénio, alquil, alquenil, alquinil, cicloalquil, cicloalquenil, héterociclos, aril, arilalquil, alcóxido, arilóxido, acil, alcóxicarbonil, derivados de acila (ésteres, amidas, haletos, ácidos), entre outros. O número de substituintes no epóxido pode ser um ou mais, e os substituintes podem ser iguais ou diferentes. Todas estes radicais podem conter substituintes, como grupos hidróxi, amino, halo, carbóxi, sulfeto, entre outros. Opcionalmente, Ri e R3 ou
R 2 e R 4 juntos podem formar um carbociclo ou heterociclo. Nas reações em sistema bifásico sólido:líquido o substrato está adsorvido em um suporte e para as reações em sistema líquido:líquido o substrato é adicionado em um solvente orgânico. Para ambas as condições, a mistura reacional é mantida sob agitação e aquecimento e os produtos extraídos com solventes orgânicos no final do processo.
Breve descrição das figuras
A estrutura e operação da presente invenção, juntamente com vantagens adicionais da mesma podem ser mais bem entendidas mediante referência às figuras em anexo e à seguinte descrição:
A Figura 1 mostra a curva de calibração da cromatografia de gel filtração utilizada para determinação da massa molecular da EH AbCCT1435. A massa molecular estimada está indicada na linha de tendência como um quadrado maior, sendo 79 kDa para o dímero. A massa molecular do monômero desta proteína é de 44,3 kDa, logo a massa molecular esperada para o dímero seria 88,6 kDa.
A Figura 2 mostra um esquema do ensaio fluorogênico, baseado na liberação do ânion umbeliferila (3), utilizado para detecção da atividade de EHs.
A Figura 3 apresenta as curvas de otimização das condições reacionais, destacando o pH e a temperatura ótimos de atuação catalítica da EH AbCCT1435 para a hidrólise do substrato 1.
A Figura 4 mostra o gráfico de duplo recíproco de Lineweaver- Burk com ajuste linear e curva de Michaelis-Menten com ajuste não-linear utilizados para obtenção dos parâmetros cinéticos da hidrólise do substrato 1 pela EH AbCCT1435.
A Figura 5 apresenta os substratos (epóxidos) avaliados nos exemplos citados nesta invenção. Após ação catalítica da EH AbCCT1435 os epóxidos são convertidos aos seus respectivos dióis vicinais. A Figura 6 mostra os cromatogramas de CG-DIC de: A) óxido de estireno racêmico (fl/S-4, comercial); B) 1 -fenil-1 ,2-etanodiol racêmico (fi/S-4a, sintético); C) 1 -fenil-1 ,2-etanodiol obtido na presença da EH AbCCT1435 em sistema reacional bifásico sólido-líquído.
A Figura 7 apresenta o esquema da hidrólise enantioconvergente do óxido de estireno racêmico (S/R-4). A EH catalisa a adição nucleofílica régiosseletiva de uma molécula de água na posição β do enantiômero {R)-4 e na posição α do enantiômero (S)-4. No primeiro caso observa-se a retenção e no segundo caso a inversão de configuração do diol formado, ambos levando a formação de (R)-4a.
A Figura 8 mostra os cromatogramas de CG-DIC de: A) c/s-3- fenil-2,3-epóxipropanoato de etila racêmico {R/S-5, comercial); B) c s-3-fenil- 2,3-diidróxipropanoato de etila racêmico (fí/S-5a, sintético); C) c/s-3-fenil-2,3- epóxipropanoato de etila recuperado da reação na presença da EH AbCCT1435 em sistema reacional bifásico sólido-líquido D) c/s-3-fenil-2,3- diidróxipropanoato de etila obtido na presença da EH AbCCT1435 em sistema reacional bifásico sólido-líquido.
A Figura 9 apresenta os cromatogramas de CG-DIC de: A) óxido de estireno (4) recuperado da reação na presença da EH AbCCT1435 em sistema reacional bifásico líquido-líquido com heptano como fase orgânica reacional; B) (fí)-1 -fenil-1 ,2-etanodiol (4a) obtido a partir da hidrólise do (R/S)- óxido de estireno (4) pela EH AbCCT1435 em sistema reacional bifásico líquido-líquido com heptano como fase orgânica reacional; C) óxido de estireno (4) recuperado da reação na presença da EH AbCCT1435 em sistema reacional bifásico líquido-líquido com iso-octano como fase orgânica reacional; D) (fl)-1 -fenil-1 ,2-etanodiol (4a) obtido a partir da hidrólise do (fí/S)-óxido de estireno pela EH AbCCT1435 em sistema reacional bifásico líquido-líquido com iso-octano como fase orgânica reacional.
A Figura 10 apresenta os cromatogramas de CG-DIC do (fl)-1 ,2- octanodiol (6a) obtido a partir da hidrólise do ( ?/S)-1 ,2-epóxioctano (6) pela EH AÒCCT1435 em sistema reacional bifásico líquido-líquido cpm A) heptano e B) iso-octano como fase orgânica reacional;
A Figura 1 1 mostra os cromatogramas de CG-EM da reação de hidrólise do óxido de estireno em meio bifásico líquido-líquido pela EH AbCCT1435. A) Fase aquosa extraída com acetato de etila; B) Fase orgânica da reação.
Breve Descrição dos Anexos
- O Anexo 1 apresenta o gel de SDS-PAGE 12% relativo a purificação da EH AbCCT1435, onde M é o marcador Unstained Protein Molecular Weight Marker (Fermentas); 1 é a f ração insolúvel; 2 é a f ração solúvel; 3 corresponde ao fluxo inicial {flow-through); 4, 5, 6, 7 e 8 são eluições com 20 mM, 50 mM , 75 rriM, 250 mM e 500 mM de imidazol respectivamente.
- O Anexo 2 apresenta o espectro de dicroísmo circular obtido para a EH AbCCT1435 purificada em tampão fosfato (10 mM, pH 7,2) na condição oxidada (linha preta) e reduzida com TCEP (linha vermelha).
Descrição detalhada da invenção
A presente invenção descreve um processo enzimático de hidrólise de epóxidos racêmicos para a obtenção de dióis vicinais enantiomericamente puros ou enriquecidos, empregando uma enzima recombinante do fungo Aspergillus brasiliensis CCT1435 em um sistema bifásico.
A enzima epóxido hidrolase (EH AbCCT1435) recombinante objeto de proteção do presente invento é caracterizada por ser a SEQ ID n s 1 , apresentando uma adição de 20 aminoácidos, sendo que 6 são Histidínas e 14 são aminoácidos codificados pelas bases que compõem os múltiplos sítios de clonagem, ambos adicionados ao N-Terminal da proteína. A EH AbCCT1435 recombinante é empregada no processo descrito abaixo.
É objeto da presente invenção um processo de hidrólise enzimática de epóxidos que compreende o emprego da enzima EH AbCCT1435 recombinante em um sistema bifásico, sólido:líquido ou líquido.líquido. O substrato empregado no processo pode ser um epóxido de fórmula geral (I)
(I)
onde:
Ri , R2, 3 e R podem ser substituintes do tipo hidrogénio, alquil, alquenil, alquinil, cicloalquil, cicloalquenil, héterociclos, aril, arilalquil, alcóxido, arilóxido, acil, alcoxicarbonil, derivados de acila (ésteres, amidas, haletos, ácidos, entre outros), entre outros. O número de substituintes no epóxido pode ser um ou mais, e os substituintes podem ser iguais ou diferentes. Todas estes radicais podem conter substituintes, como grupos hidróxi, amino, halo, carbóxi, sulfeto, entre outros. Opcionalmente, Ri e R 3 ou R 2 e R 4 juntos podem formar um carbociclo ou heterociclo.
Para as reações em sistema bifásico sólido.líquido são adicionados 5 a 50 mg, preferencialmente 20 mg de substrato, que está adsorvido em 50 a 500 mg, preferencialmente 200 mg, de um suporte selecionado dentre resina sólidas poliméricas apoiares ou moderadamente polares, com momento de dipolo entre 0,3 e 1 ,8; área superficial entre 330 a 900 m 2 /g; e diâmetro de poro entre 40 e 300 Á, preferencialmente uma resina de éster acrílico ou poliaromática hidrofóbica, em 0,5 a 10 ml_ de tampão fosfato contendo 0,05 a 1 mg/mL, preferencialmente 0,3 mg/mL de EH AbCCT1435.
Para as reações em sistema líquido:líquido são adicionados 1 a 100 mg, preferencialmente 10 mg de substrato, 0,5 a 50 ml_, preferencialmente 3 ml_ de solvente orgânico, selecionado dentre solventes imiscíveis com água e com índices de polaridade entre 0 e 5, preferencialmente os alcanos acíclicos com índices de polaridade próximo a 0, e 0,1 a 10 ml_, preferencialmente 1 mL, de solução de EH AbCCT1435 a 0,1 a 1 mg/mL, preferencialmente 1 mg/mL, em tampão fosfato. Para ambas as condições, a mistura reacional é mantida sob agitação entre 100 e 300 rpm, preferencialmente 250 rpm, e 30 a 40 -C, preferencialmente 35°C, por 0,5 a 48 h, preferencialmente 24 h.
Após este período, as fases reacionais são extraídas com solventes orgânicos de polaridade entre 1 e 5, preferencialmente acetato de etila, e analisadas por CG-EM e CG-DIC com coluna quiral a base de oc- ciclodextrina, β-ciclodextrina , γ-ciclodextrina e/ou derivados, para avaliação da conversão e enantiosseletividade, respectivamente.
Exemplo 1 : Expressão da EH AbCCT1435 recombinante em E. coli
Oligonucleotídeos moldes (primers) foram desenhados a partir das sequências de outras EHs do género Aspergillus depositadas em banco de dados (GenBank, n°- acesso: DQ458230; AJ238459.1 ; DQ443737.1 ).
Primer direto: 5' ATA.CATATG.ATGTCTGCTCCGTTCGGC 3';
Primer reverso: 5'ATA.Ç ÇGAG.CTACTTCTGCCACACCTGCTC 3'.
No par de primers está em destaque (sublinhado) os sítios de restrição das enzimas Ndel (primer direto) e Xhol (primer reverso).
A amplificação da sequência alvo foi feita por PCR e os produtos amplificados foram purificados utilizando o kit GFX PCR DNA and Gel Band Purification (GE Healthcare). Os fragmentos amplificados foram digeridos com as enzimas de restrição Nde\ e Xho\, e quantificados a 260 nm.
A clonagem da EH AbCCT1435 foi realizada em vetor plasmidial pET28a {Novagen) digerido com as mesmas enzimas de restrição (Nde\ e Xho\). A ligação do inserto ao vetor pET28a foi feita com a enzima T4 DNA ligase {Invitrogerí). Posteriormente, realizou-se a transformação em Escherichia coli DH10B. A verificação do plasmídeo recombinante foi realizada através de amplificação por PCR de colónias transformadas, utilizando primers flaqueadores do gene no vetor: T7 Promoter (5'- TAATACGACTCACTATAGGG-3') e T7 Terminator (5'-G CTAGTTATTG CT- CAGCGG-3'). A sequência completa de nucleotídeos da EH AbCCT1435 foi obtida em sequenciador ABI 3500 (Applied Biosystems). A linhagem competente de E. coli BL21 (DE3) Rosetta foi transformada com o vetor de um clone positivo em DH10B. Os clones de expressão foram armazenados à -70°C em meio 2YT+HMFM (36 mM K 2 HPO 4 , 13,2 mM KH 2 PO , 1 ,4 mM citrato de sódio, 0,4 mM MgSO 4 , 6,8 mM(NH 4 ) 2 SO 4 , 4,4% v/v de glicerol), suplementado com 30 μg/mL de canamicina e 34 μg/mL de cloranfenicol.
A indução da expressão da EH AbCCT1435 se deu através da adição de IPTG (0,4 mM, β-D-l -tiogalactopiranosídio de isopropila) ao meio de cultivo (LB acrescido de 30 μg/mL de canamicina, 34 μg/mL de cloranfenicol à 37°C e 300 rpm), após o inoculo atingir a fase exponencial de crescimento (DO 6 oonm ~ 0,8). A indução da expressão gênica se deu por 16h a 25 e C e 200 rpm.
Exemplo 2. Purificação da EH AbCCT1435 recombinante em E. coli
As células cuja expressão proteica foi induzida por IPTG foram coletadas por centrifugação, e a disrupção celular foi realizada por sonicação em tampão (tampão A: 50 mM de fosfato de sódio, pH 7,2), 2 mM de PMSF (fluoreto de fenilmetilsulfonila), 15 mM de β-mercaptoetanol, 0,1 % (v/v) de Tween-20 e 1 mg/mL de lisozima. A remoção dos restos celulares foi feita por centrifugação (20000gr, 4°C, 50 min). A purificação proteica foi realizada por cromatografia de afinidade ao níquel (resina Ni-NTA-Qiagen) em tampão (tampão B: 50 mM de fosfato de sódio: 250 mM NaCI, pH 7,2) com gradiente crescente de imidazol (20 50, 75, 250 e 500 mM).
A expressão da EH AbCCT1435 recombinante foi avaliada por SDS-PAGE com posterior coloração em "Coomassie Blue (Anexo 1 ); e a concentração foi obtida por absorbância a 280 nm, tendo-se como base o coeficiente de extinção molar teórico da proteína (ProtParam, ExPASy Proteomics Server), apresentando uma massa de aproximadamente 44 kDa . Exemplo 3. A cromatografia por exclusão de peso molecular da enzima purificada recombinante (EH AbCCT1435) foi realizada em coluna Superdex 200 10/300 GL (GE Healthcare), equilibrada com 2 volumes de coluna (48mL) com o tampão B (50 mM de fosfato de sódio: 250 mM NaCI, pH 7,2). Um volume de 250 μΙ_ de amostra foi injetada a fluxo de 0,5 mlJmin. Os padrões de calibração foram: HMW (High Molecular Weight) e LMW (Low Molecular Weight) Gel Filtration Calibration Kit (GE Healthcare), contendo as protéinas: Ferritina (440 kDa), Aldolase (158 kDa), Conalbumina (75 kDa), Ovalbumina (43 kDa), Anidrase Carbónica (29 kDa), Ribonuclease A (13,7 kDa), Aprotinina (6,5 kDa) e Blue Dextran 2000.
A cromatografia por gel filtração mostrou que a EH AbCCT1435 se encontra monodispersa em solução (Figura 1 ) como um homodimero de aproximadamente 79 kDa.
Exemplo 4. Espectro de dicroísmo circular da EH AbCCT1435 recombinante.
A técnica de dicroísmo circular foi utilizada para verificar a presença de estrutura secundária da EH AbCCT1435. Os experimentos de dicroísmo circular foram realizados no Laboratório de Espectrometria e Calorimetria (LEC) do Laboratório Nacional de Luz Síncrotron, utilizando o espectropolarímetro Jasco J-180. A EH AbCCT1435 foi analisada em tampão fosfato de sódio 10 mM, pH 7,2 na concentração de 6 μΜ na condição oxidada (sem agente redutor) e reduzida com TCEP (1 mM, f/7s-(2-carboxietil)fosfina) em cubetas de 1 mm de caminho óptico. Dez acumulações dentro do intervalo de 270-190 nm a uma taxa de 50nm/min foram registradas. .
Os experimentos de dicroísmo circular indicaram que a EH
AbCCT1435 apresenta estrutura secundária bem definida, havendo predomínio de α-hélices (Anexo 2).
Exemplo 5. Alinhamento da estrutura primária de proteínas homólogas a EH AbCCT1435.
A sequência de aminoácidos da proteína EH AbCCT1435 foi comparada com a da EH de Aspergillus niger LCP521 a qual possui estrutura resolvida e está depositada no PDB (protein data bank) sob o número de acesso PDB: 1Q07_A . O múltiplo alinhamento foi realizado utilizando o servidor ClustalW2, com edição posterior feito pelo programa GeneDoc.
Exemplo 6: Atividade catalítica da EH AbCCT1435 frente a substratos fluorogênicos O composto 0-(3,4-epóxibutil)umbeliferona (1) foi utilizado como substrato fluorogenico para a detecção da atividade da EH AbCCT1435 (Figura 2), e para otimização dos parâmetros reacionais, como pH e temperatura. Os ensaios foram realizados em placas de polipropileno de 96 poços, incubadas a 30 Q C em leitor de placas FlashScan 530 Analitic Jena e as leituras de fluorescência foram realizadas a cada 5 min por 90 min, utilizando comprimentos de onda de excitação e emissão de 390 nm e 460 nm, respectivamente. Os resultados foram comparados a reações controles positivas (100% de conversão) e negativas com (0% de conversão). As condições de reação foram:
Ensaio: 100 uM de 1 , 2 mM de NalO 4 , 2 mg/mL de BSA e 0,05 mg/mL de EH AbCCT1435, em tampão fosfato de sódio (50 mM, pH 7,2, 0,1% v/v de Tween- 20). Controle Positivo: 100 uM de 2, 2 mM de NalO 4 , 2 mg/mL de BSA e 0,05 mg/mL de EH AbCCT1435, em tampão fosfato de sódio (50 mM, pH 7,2, 0,1% v/v de Tween-20). Controle negativo: 100 uM de 1 , 2 mM de NalO 4 e 2 mg/mL de BSA, em tampão fosfato de sódio (50 mM, pH 7,2, 0,1% v/v de Tween-20).
As condições ótimas de ação enzimática foram determinadas variando-se a temperatura de 25 a 45 e C, e o pH de 4 a 10 (pH 4-5: tampão acetato, pH 6-8: tampão fosfato de sódio, pH 9-10: tampão glicina-NaOH, todos a 50 mM e 0,1 % v/v de Tween-20.
Os parâmetros da cinética enzimática foram determinados variando-se a concentração do substrato 1 entre 10 e 1500 uM e o tempo reacional de 0 a 90 min. Os valores de K M , V máx , k ca t e ε foram obtidos a partir das velocidades iniciais de cada condição e posterior ajuste linear do gráfico de duplo recíproco de Lineweaver-Burk ou ajuste não-linear da curva de Michaellis-Menten.
A EH AbCCT1435 hidrolisou 100% do substrato 1 em 30 min nas condições reacionais gerais utilizadas. A atuação catalítica ótima desta enzima ocorre na faixa de pH 6-9, preferencialmente 7,2, e de temperatura 30-40, preferencialmente 35 Q C (Figura 3). Os parâmetros da cinética enzimática foram: K M = 495 uM, V máx = 0,24 uM/s, k cat = 1 ,1 s " \ ε = 2,3.10 a M "1 .s "1 (Figura 4), demonstrando que esta enzima apresenta uma afinidade moderada pelo substrato 1.
Exemplo 3: Atividade da EH AbCCT1435 em sistemas bifásicos sólido-líquido
As reações em sistema sólido-líquido foram realizadas em frascos
Erlenmeyer (25 mL) contendo tampão fosfato de sódio (2 mL, 50 mM, pH 7,2; 0,1 % v/v de Tween-20), EH AbCCT1435 (1 mL, 1 mg/mL em tampão fosfato de sódio 50 mM, pH 7,2; 0,1 % v/v de Tween-20) e o substrato (20 mg) adsorvido na resina acrílica Amberlite XAD-7 HP(200 mg).
Todas as reações foram comparadas ao seu respectivo controle negativo [substrato (20 mg) adsorvido na resina acrílica Amberlite XAD-7 HP (200 mg) em tampão fosfato de sódio (3 mL, 50 mM, pH 7,2; 0,1 % v/v de Tween-20)] de forma a monitorar a hidrólise espontânea do epóxido no meio reacional.
Para adsorção do substrato na resina, dilui-se o epóxido (100 mg) em acetato de etila (100 mL). Em seguida, adiciona-se a resina (1 ,0 g) e a mistura é mantida sob repouso por 12 h à temperatura ambiente. Após este período o solvente é evaporado e o epóxido suportado é utilizado nas reações.
Para ativação e limpeza da resina utilizam-se lavagens exaustivas com água destilada e acetona (nesta sequência), seguido de secagem sob pressão reduzida.
Para avaliar a atividade da EH AbCCT1435 neste sistema bifásico sólido-líquido foram utilizados os substratos: óxido de estireno (4) e 3-fenil-2,3- epóxipropanoato de etila (5) (Figura 5).
a) Óxido de estireno
A hidrólise do óxido de estireno (4) na presença da EH AbCCT1435 no sistema sólidorlíquido em questão, levou à formação do (fl)-1 - fenil-1 ,2-etanodiol com 86% de excesso enantiomérico em 24h. Observou-se também que o epóxido remanescente permaneceu racêmico durante todo o curso reacional (Figura 6). Tais resultados indicam que a EH AbCCT1435 catalisa esta reação de maneira régio e enantiosseletiva. Logo, este processo pode ser descrito como enantioconvergente, se diferenciando dos processos de resolução cinética por permitir a obtenção do respectivo diol com elevada pureza enantiomérica e conversões superiores a 50% (Figura 7).
Vale ressaltar que não foi observada hidrólise espontânea do óxido de estireno no meio reacional utilizado.
b) 3-fenil-2,3-epóxipropanoato de etila
A partir da hidrólise do c/ ' s-3-fenil-2,3-epóxipropanoato de etila (5) na presença da EH AbCCT1435 no sistema sólido:líquido em questão foi obtido o 3-fenil-2,3-diidróxipropanoato de etila com 96% de excesso enantiomérico. O epóxido remanescente, assim como no caso do óxido de estireno, permaneceu racêmico (Figura 8).
Os resultados obtidos também indicam que a EH AbCCT1435 catalisa a hidrólise enantioconvergente do c/s-3-fenil-2,3-epóxipropanoato.
Não foi observada hidrólise espontânea do c/s-3-fenil-2,3- epóxipropanoato de etila no meio reacional.
Exemplo 4: Atividade da EH AbCCT1435 em sistemas bifásicos líquido-líquido
As reações em sistema líquido-líquido foram realizadas em frascos vedados de penicilina (10 mL) contendo solução tampão fosfato de sódio (0,5 mL, 50 mM, pH 7,2; 0,1 % v/v de Tween-20), solução da EH AbCCT1435 (0,5 mL à 1 mg/mL em tampão fosfato de sódio 50 mM, pH 7,2; 0,1 % v/v de Tween-20), solvente orgânico imiscível com água (3 mL) e o substrato (10 μ,Ι).
A hidrólise espontânea do epóxido no meio reacional foi monitorada através de controles negativos [substrato (10 μί) em solução tampão fosfato de sódio (1 mL, 50 mM, pH 7,2; 0,1 % v/v de Tween-20) e 3 mL de solvente orgânico imiscível com água].
Foram testados os seguintes solventes orgânicos: heptano, iso- octano, tolueno, acetato de etila e álcool iso-amílico. Para avaliar a atividade da EH AbCCT1435 nos sistemas bifásicos líquido-líquido foram utilizados os substratos: óxido de estireno (4) e 1 ,2-epóxioctano (6) (Figura 5).
a) Óxido de estireno
As reações em sistema bifásico líquido:líquido foram efetivas na hidrólise enzimática do óxido de estireno (4) quando utilizados heptano ou iso- octano como fase orgânica reacional. Para estes casos, foi observada a formação do (fí)-1 -fenil-1 ,2-etanodiol na presença da EH AbCCT1435. Os excessos enantioméricos foram de 66% e 84%, respectivamente. Para o epóxido remanescente foram obtidos excessos enantioméricos de 30% e 36% (Figura 9).
Estes resultados, apesar de discretos, novamente apresentam indícios da possível atuação enantioconvergente da EH AbCCT1435 na hidrólise do óxido de estireno.
b) 1 ,2-epóxioctano
A hidrólise enzimática do 1 ,2-epóxioctano (6) foi realizada com sucesso nos sistemas bifásicos líquido:líquido envolvendo heptano ou iso- octano como fase orgânica reacional. Observou-se a formação do (fl)-1 ,2- octanodiol na presença da EH AbCCT1435, com excessos enantioméricos de 48% e 58%, respectivamente (Figura 10).
Exemplo 5: Extração dos dióis formados e recuperação do epóxido remanescente do meio reacional
a) Sistemas bifásico sólido-líquido
As resinas aplicadas a estes sistemas tendem a adsorver com maior eficiência compostos orgânicos com polaridades medianas a baixas. Os dióis formados nas reações destacadas nesta invenção possuem polaridade superior ao dos seus respectivos epóxidos de origem, tendendo a se deslocar da fase sólida (resina) para a fase líquida (solução tampão).
Logo, para extração dos produtos (dióis), a mistura reacional foi filtrada, e a fase líquida foi saturada com NaCI e extraída com acetato de etila (2 x 2 ml_). Para maior eficiência extrativa, após adição de NaCI e de acetato de etila, a mistura foi agitada em vórtex e centrifugada a 2000 rpm por 5 min para quebra da emulsão formada. As fases orgânicas obtidas foram combinadas, secas sob MgS0 4 anidro e filtradas para posterior análises cromatográficas.
A recuperação do epóxido remanescente foi realizada através da extração da fase sólida, previamente filtrada, com acetato de etila (2 x 2 ml_, repouso por 30 min), e posterior filtração.
b) Sistemas líquido-líquido
Neste tipo de sistema bifásico os compostos orgânicos com polaridades medianas a baixas tendem a se alocar na fase orgânica, neste caso os epóxidos. Já os dióis formados, devido as suas polaridades superiores tendem a se deslocarem da fase orgânica para a fase aquosa (solução tampão) reacional.
Assim, para extração dos produtos (dióis) e recuperação dos reagentes (epóxidos) foi realizada, inicialmente a separação das fases reacionais.
Os dióis foram removidos da fase aquosa através de saturação com NaCI, seguido de extração com acetato de etila (2 x 1 ml_). Assim, como no procedimento anterior, após adição de NaCI e de acetato de etila, a mistura foi agitada em vórtex e centrifugada a 2000 rpm por 5 min para quebra da emulsão formada. Por fim, as fases orgânicas foram combinadas, secas sob MgSO 4 anidro e filtradas para posteriores análises cromatográficas.
O epóxido remanescente foi recuperado diretamente da fase orgânica, uma vez que os solventes heptano e iso-octano são compatíveis com cromatógrafos gasosos e facilmente removidos por evaporação.
A Figura 1 1 mostra como este sistema é eficiente para a separação in situ dos componentes reacionais, o que evita as etapas de purificação indesejáveis aos processos industriais.
Exemplo 6: Técnicas cromatográficas utilizadas para determinação de conversões e excessos enantioméricos
a) Cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas (CG-EM) As análises de CG-EM foram realizadas em cromatógrafo Agilent 6890 acoplado a detector seletivo de massas HP 5973, operando por impacto de elétrons (El) com energia de ionização de 70 eV, na faixa de m/z 50-500. Foi utilizada uma coluna capilar de sílica fundida DB-5 (30 m x 0,25 mm x 0,25 μητι) com 5% de fenil-metilsiloxano para a separação dos compostos analisados. As análises foram realizadas em fluxo constante de He (1 mL/min), com injetor a 250 9 C e detector a 250 e C, e injeções em modo "split" 20:1 , utilizando 1 ,0 μΙ_ da solução a ser analisada. As condições de análise (rampas de aquecimento) foram: 80 Q C por 3 min, 80 - 290 9 C a 20 9 C/min, onde permaneceu constante por 5 min.
b) Cromatografia gasosa acoplada a detector de ionização de chama (CG-DIC)
A discriminação dos enantiômeros foi realizada em cromatógrafo Agilent 6850, acoplado com detector de ionização de chama (CG-DIC), equipado com injetor automático e coluna capilar de sílica fundida Chrompak®, de fase quiral Chirasil β-ciclodextrina (25 m x 0,25 mm x 0,25 μιτι). As análises foram realizadas a pressão constante de 10 psi, com injetor a 180 S C e detector a 250 9 C, sendo as injeções feitas no modo com divisor (1 :10) utilizando 1 μΐ_ da solução a ser analisada. As condições de análise (rampas de aquecimento) foram: 40 9 C/ 15 min, 40 - 180 9 C a 10 9 C/min, onde permaneceu constante por 5 min.
Next Patent: ELECTRONIC DEVICE FOR ELIMINATING BLIND SPOTS IN AUTOMOTIVE VEHICLES