本发明属于酶学和有机化学领域， 涉及一种层析硅胶的再生 方法， 特别涉及一种辅酶 Q10层析硅胶的再生方法。 背景技术

辅酶 Q10 (Ubiquinone, Coenzyme Q10, CoQI O) 在氧化呼吸链 中起传递电子和质子的重要作用， 是形成 ATP的关键， 具有保护和 恢复生物膜结构的完整性、 稳定膜电位和增强免疫反应等作用， 被 广泛应用于心力衰竭、 冠心病、 高血压病、糖尿病、 癌症、 艾滋病、 急慢性肝炎、 帕金森症等疾病的辅助性治疗。 此外， 辅酶 Q10还被 广泛地用于食品、 保健品和化妆品等行业， 市场前景十分广阔。

国内外传统的辅酶 Q10生产方法主要有动植物组织提取法、化 学合成法和微生物发酵法三种。动植物组织提 取法受限于原料中辅 酶 Q10的含量， 提取的产量低、 成本高； 化学合成法在合成时会发 生顺、 反异构， 得到各类异构体的混合物， 需要分离， 也增加了合 成成本， 在化学合成时会加入一些有毒试剂， 对纯化获得适用于临 床的产品也提出了更高的要求；微生物发酵法 是近年兴起的新生产 方法， 由于微生物细胞易于大规模培养生长， 产品完全为天然的全 反式构型， 生物利用度高， 而且相对于化学合成法安全、 高效， 产 品中几乎无化学毒害物质残留， 易于分离純化， 临床疗效较好， 是 最有开发前景的生产方法。

微生物发酵法生产辅酶 Q10, 其提纯过程一般采用如下工艺： 发酵液经过过滤后， 滤渣干燥制粒， 得到辅酶 Q10菌粉， 菌粉再用 有机溶剂浸泡提取。 提取液浓缩至一定含量后上硅胶柱层析， 采用 石油醚、 丙酮混合溶剂进行洗脱， 洗脱液经减压浓缩干， 加无水乙 醇结晶， 过滤烘干得到辅酶 Q10结晶粗品。

硅胶作为一种吸附剂， 由于具有很大的比表面积， 吸附力强， 广泛应用于医药、 化工等多种行业的柱层析分离提純。 硅胶在柱层 析过程中， 会吸附一些强极性的杂质， 堵塞颗粒孔道， 使其活性下 降。 硅胶的生产成本也比较高， 而且其生产过程会污染环境。

在辅酶 Q10的提纯过程中， 柱层析工序所占成本超过 50%, 其 中硅胶消耗及溶剂损耗^ A占据最主要的成本，使得辅酶 Q10的生 产成本居高不下。

中国专利公开号 CN 101445435A介绍了一种辅酶 Q10清洁纯化 工艺： 将辅酶 Q10用有机溶剂溶解， 应用高压液相制备柱或中压硅 胶填充柱， 以洗脱剂洗脱，分段收集，获得高纯度的辅酶 Q10产品。 所述装柱的硅胶经 200 - 300°C高温活化后重复使用 10 - 200次。其 硅胶再生的方法采用的是高温活化的方法， 该方法能耗大， 而且每 次柱层析过程完成后均需将硅胶从柱内拆下来 ， 不但劳动强度大， 而且还会造成溶剂挥发、产生静电着火等安全 问题，溶剂损耗也大。 高温煅烧的方法虽能将硅胶内的有机杂质去除 ，但同时也会改变硅 胶内部孔径结构， 造成硅胶吸附力下降。

美国专利 US2007/0025976A1公开了一种辅酶 Q10的提纯工艺， 提到一种硅胶的再生方法： 在室温下用 1倍柱体积的乙醇洗脱， 然 后用 4 - 5倍柱体积的己烷在 50°C下洗脱。

此外， 还有专利文献报道了制备其它产品后硅胶柱的 再生方 法。

但是， 现有的专利文献关于硅胶柱（特别是制备辅酶 Q10后的 硅胶柱）的再生方法的相关报道， 都是采用正向洗柱的方法， 硅胶 重复使用的次数少。 发明内容

本发明人经过创造性的劳动和大量的试验， 发现了一种辅酶

Q10 层析硅胶的再生方法， 并且惊奇地发现， 对于分离提纯辅酶 Q10 后的硅胶柱， 经过本发明的方法处理后能够再次使用 （即用 于辅酶 Q10 的层析） ， 并且如此使用 -再生的循环次数可达 20 甚至 100次以上，同时层析收率能够保持 90%或 95%甚至 98%以上。 由此提供了下述发明： 一种辅酶 Q10层析硅胶的再生方法， 其特征在于， 从柱底进 高极性溶剂进行反方向洗柱。

不拘于理论的束缚， 一种可能的原因是硅胶柱层析本身是一种 正相层析，弱极性物质先被洗脱下来，强极性 杂质被吸附在柱头上， 若采用正向洗柱， 强极性杂质被往下洗脱的过程中会再次污染没 有 吸附强极性杂质的硅胶， 从而造成硅胶的使用次数大大减少。

根据本发明任一项所述的再生方法， 其特征在于如下的 （1 ) - ( 4 )项中的任一项或多项：

( 1 )所述高极性溶剂为选自乙酸乙酯、丙酮、丁� �、 乙醇（优 选丙酮） 中的一种或者多种、 或者高极性溶剂和低极性溶剂的混 合液， 其中高极性溶剂占混合液的体积大于 50%, 并且优选大于 90%;

( 2 ) 所述高极性溶剂的用量为 1 - 5倍柱体积， 优选 2-3倍 柱体积；

( 3 )所述洗柱的流速为 0. 5 - 2倍柱体积 /小时， 优选 0. 5 - 1倍柱体积 /小时；

( 4 ) 洗柱所用高极性溶剂的温度为 20 - 50 。

根据本发明任一项所述的再生方法， 其特征在于， 在洗柱之 后， 从柱顶进低极性溶剂进行正向平衡。

根据本发明任一项所述的再生方法， 其特征在于如下的 （1)

- (4)项中的任一项或多项：

(1) 所述低极性溶剂选自石油醚、 戊烷、 正己烷、 庚烷中 的一种或者多种， 或者高极性溶剂和低极性溶剂的混合液， 其中 低极性溶剂占混合液的体积大于 50%, 并且优选大于 90%;

(2)所述低极性溶剂的用量为 1-5倍柱体积， 优选地， 为 2 - 4倍柱体积， 更优选地， 为 3倍柱体积；

(3)所述平衡的流速为 0.5- 2倍柱体积 /小时， 优选 0.5-1 倍柱体积 /小时；

(4)平衡所用低级性溶剂的温度为 20*€ - 50*€。

将按照上述任一项所述的方法进行再生处理后 的辅酶 Q10层 析硅胶用于分离提纯辅酶 Q10, 并且将这样的 "再生-使用" 过 程进行一次或多次；优选进行 15 - 25次， 更优选进行 20 - 25次， 进一步优选进行 20次。 如此可实现层析柱重复使用 20次以上。 所述 "再生" 是指按照上述任一项所述的方法进行再生处理 ， 所 述 "使用" 是指将按照上述任一项所述的方法进行再生处 理后的 辅酶 Q10层析硅胶用于分离提纯辅酶 Q10。 所述 "使用" 的步骤 可以是本领域常用的方法， 例如参照产品说明书或者实施例 1所 示的步骤。

每当层析柱重复使用 15- 25次（优选 20次）之后， 再生方 法按照如下的步骤 1 ) - 4 )进行：

1)用双氧水反方向洗柱一次或多次；

2)用水反方向洗柱一次或多次；

3)拆下硅胶于 1001C - 150X烘干至水分小于 5% (w/w) ； 4 ) 重新装柱。 该方法能够实现硅胶的使用次数达到 100次以上。

根据本发明任一项所述的再生方法， 其中， 步骤 1 ) 中双氧 水的 pH为 9 - 11; 优选为 10. 5-11。 所述双氧水的 pH可以用 K0H 或 NaOH调节。

步骤 1 ) 中双氧水作用是使吸附在硅胶内的杂质氧化分 解除 去。 由于双氧水是碱性的， 所以需用热水再将碱性的双氧水置换 出来， 否则会残留在硅胶柱内， 对下一次的层析造成影响。 双氧 水洗和热水可有效清除有机溶剂难以洗脱掉的 那部分强极性杂 质。

根据本发明任一项所述的再生方法， 其中， 步骤 1 ) 中双氧 水的浓度为 3 % - 20 % ( w/w ) ； 优选 5%- 10% ( w/w ) 。

根据本发明任一项所述的再生方法， 其中， 步骤 2 ) 中的水 优选去离子水。

根据本发明任一项所述的再生方法，其中， 步骤 1 )和 2 )中， 双氧水和水的用量独立地为 1 - 5倍柱体积； 优选 2倍柱体积。

根据本发明任一项所述的再生方法，其中， 步骤 1 )和 2 )中， 双氧水和水的温度独立地为 50*€ - Ι ΟΟ ; 优选 70 - 80*€。

根据本发明任一项所述的再生方法， 其中， 步骤 3 ) 中的烘 干为常压烘干或减压烘干， 并且优选减压烘干。 在本发明中， 除非有特别说明， 术语 "硅胶" 或 "硅胶柱" 或 "硅胶层析柱" 具有相同的含义， 具体地是指经分离提纯辅酶 Q10后的硅胶层析柱。 在本发明的一个实施方案中， 其内径 25 - 500mm, 柱长 300 - 5000mm， 硅胶目数 60 - 400目； 在本发明的一 个具体的实施方案中， 其内径 400腿， 柱长 4000腿， 硅胶 200Kg ( 200 - 300目 )。 可选地， 上述硅胶的水分小于 5%, 柱压 0. 1 - 2MPa。

在本发明中， 除非有特别说明， 术语 "辅酶 Q10层析硅胶" 是指分离提纯辅酶 Q10后的硅胶柱； 具体地， 其上样液为用有机 溶剂从辅酶 Q10菌粉中提取的提取液， 所述有机溶剂可以是石油 醚、 戊烷、 正己烷、 庚烷中的一种或多种， 优选石油醚和或正己 烷。

在本发明中， 术语 "高极性溶剂" 是指溶剂极性指数 > 4. 0 的溶剂。 具体地， 所述高极性溶剂为选自乙酸乙酯、 丙酮、 丁酮、 乙醇中的一种或者多种、或者高极性溶剂和低 极性溶剂的混合液， 其中高极性溶剂占混合液的体积大于 50%, 并且优选大于 90%, 更 优选为 100 %。

在本发明中， 术语 "低极性溶剂" 是指溶剂极性指数 < 0. 2 的溶剂。 具体地， 所述低极性溶剂选自石油醚、 戊烷、 正己烷、 庚烷中的一种或者多种，或者高极性溶剂和低 极性溶剂的混合液, 其中低极性溶剂占混合液的体积大于 50%, 并且优选大于 90%, 更 优选为 100 %。

在本发明中， 层析收率的计算方法： 分段收集含辅酶 Q10的 层析液， 采用 TLC检测， 合并只含辅酶 Q10斑点的层析液， 取样 用 HPLC检测层析液中的辅酶 Q10外标含量及面积归一法含量，层 析收率 = (层析液体积 X层析液外标含量） I (上样液体积 X上样液 含量） X画。

在本发明中， 硅胶重复使用效果判断： 对比相同上样量、 洗 脱剂、 洗脱条件下层析收率的高低， 当层析收率大于或等于 90%, 则判断为重复使用效果较好， 当层析收率小于 90%, 则判断为重 复使用效果变差。 发明的有益效果

1. 采用反方向洗柱技术，有效防止正向洗柱时吸 附柱头的强 极性杂质再次污染其他硅胶，使层析硅胶可重 复使用 100次以上， 大大降低层析硅胶的消耗， 从而降低生产成本；

2. 采用柱内洗柱， 实现连续生产， 减少拆装柱的次数， 整个 生产过程做到全封闭体系， 既减轻劳动强度， 又减少溶剂挥发， 达到清洁生产的目的；

3. 采用在线洗柱替代传统的锅内搅拌洗涤，洗涤 时溶剂浓度 梯度大， 显著提高了洗柱的效率。 附图说明

Fig. 1: 硅胶再生流程示意图。 具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详 细描述， 但是 本领域技术人员将会理解， 下面的实施例仅用于说明本发明， 而 不应视为限定本发明的范围。 实施例中未注明具体条件者， 按照 常规条件或制造商建议的条件进行。 所用试剂或仪器未注明生产 厂商者， 均为可以通过市购获得的常规产品。 实施例 1 : 新的硅胶柱的层析效果（第 1次使用）

层析柱内径 400腿，柱长 4000腿，硅胶 200Kg( 200 ~ 300目 ）， 采用湿法装柱， 边装边用橡皮锤敲打柱体，使硅胶装的紧密结 实。 装完后的层析柱用石油醚平衡 2小时。

取 300L辅酶 Q10浸膏（采用石油醚从辅酶 Q10菌粉中提取的 浓缩物， 含量 30mg/ml ) , 通过柱塞式计量泵上硅胶柱层析， 上 完样后用石油醚 /丙酮（20/1 )混合溶剂进行洗脱， TLC检测收集 辅酶 Q10层析液，合并合格的层析液，取样用 HPLC检测层析液中 的辅酶 Q10含量， 层析收率为 95. 3%, 层析液主峰 HPLC面积归一 法含量为 98. 12%。 实施例 2: 再生后硅胶柱的层析效果（经过 1个 "再生-使 用" 过程）

实施例 1洗脱完辅酶 Q10后的层析柱，从柱底以 500L/h的流 速泵入 1500L 温度 30 的丙酮进行反方向洗柱至柱顶流出液无 色， 再从柱顶以 500L/h的流速泵入 1500L温度 的石油醚平 衡层析柱。 平衡后的层析柱重新用来进行辅酶 Q10浸膏的层析， 按同实施例 1的上样量、 洗脱方式及收集方法， 重复使用的层析 收率为 94. 8%, 层析液主峰 HPLC面积归一法含量为 98. 10%。 实施例 3: 再生后硅胶柱的层析效果（经过 20个 "再生-使 用" 过程）

按实施例 2的洗柱方法和层析方法对该硅胶层析柱连续� �复 使用， 按同实施例 1 的上样量、 洗脱方式及收集方法， 至第 20 次层析收率为 93. 8%,层析液主峰 HPLC面积归一法含量为 98. 07%。 实施例 4: 再生后硅胶柱的层析效果（经过 21个 "再生-使 用" 过程）

取实施例 3使用过 20次的硅胶层析柱，从柱底泵入预先用氢 氧化钠调节至 PH=11、 浓度为 5%、 温度 80。 ( 、 用量为 1000L的双 氧水， 再泵入 1000L温度 80 ^e C热水洗涤， 洗完后用 N ₂ 将水压干， 拆下硅胶， 置于 150Ό干燥器内抽真空烘干至硅胶水分小于 5%。 烘干后的硅胶呈灰白色， 重新装入层析柱， 按同实施例 1的上样 量、洗脱方式及收集方法，进行第 21次层析，层析收率为 94. 5%, 层析液主峰 HPLC面积归一法含量为 98. 08% ₀ 实施例 5: 再生后硅胶柱的层析效果（经过 100个 "再生-使 用" 过程）

取实施例 4的硅胶层析柱， 按照实施例 2和实施例 4结合的 再生方法（即每按实施例 2再生方法进行 20个 "再生-使用" 过 程， 按实施例 4再生方法再生 1次） 重复使用， 使用至 100次， 按实施例 1的上样量、 洗脱方式及收集方法， 层析收率为 92. 1%, 层析液主峰 HPLC面积归一法含量为 98. 05%。 对照例 1: 采用正方向洗柱再生处理的硅胶柱的层析效果 按实施例 1方法层析一次后的硅胶， 从柱顶泵入 3倍柱体积 的丙酮进行正向洗柱至柱底流出液无色， 再从柱顶泵入 3倍柱体 积的石油醚平衡。 平衡后的层析柱重新用来进行辅酶 Q10浸膏的 层析， 按同实施例 1的上样量、 洗脱方式及收集方法， 层析收率 为 93. 8%,层析液主峰 HPLC面积归一法含量为 98. 10%。按此洗柱 方法和层析方法用该硅胶层析柱连续重复使用 ， 第 5次使用层析 收率为 83. 2%,层析液主峰 HPLC面积归一法含量为 98. 02%,重复 使用效果变差。 尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描 述， 本领域技 术人员将会理解。 根据已经公开的所有教导， 可以对那些细节进 行各种修改和替换， 这些改变均在本发明的保护范围之内。 本发 明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物 给出。