FLEISCHER MAXIMILIAN (DE)
| WO2008083352A1 | 2008-07-10 | |||
| WO2012010969A2 | 2012-01-26 |
| US4253271A | 1981-03-03 |
KALPESH K SHARMA ET AL: "High lipid induction in microalgae for biodiesel production", ENERGIES, MOLECULAR DIVERSITY PRESERVATION INTERNATIONAL (MDPI) AG, SWITZERLAND, vol. 5, 18 May 2012 (2012-05-18), pages 1532 - 1553, XP002689116, ISSN: 1996-1073, DOI: 10.3390/EN5051532
EMMA SUALI ET AL: "Conversion of microalgae to biofuel", RENEWABLE AND SUSTAINABLE ENERGY REVIEWS, ELSEVIERS SCIENCE, NEW YORK, NY, US, vol. 16, no. 6, 10 March 2012 (2012-03-10), pages 4316 - 4342, XP028496859, ISSN: 1364-0321, [retrieved on 20120323], DOI: 10.1016/J.RSER.2012.03.047
CHEN J.E.; SMITH A.G.: "A look at diacylglycerol acyltransferases (DGATs) in algae", JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY, vol. 162, 2012, pages 28 - 39, XP028946471, DOI: doi:10.1016/j.jbiotec.2012.05.009
POULSEN N.; KRÖGER N.: "A new molecular tool for transgenic diatoms", FEBS JOURNAL, vol. 272, 2005, pages 3413 - 3423
QUINN J.M.; MERCHANT S.: "Two copper-responsive elements associated with the Chlamydomonas Cyc6 gene function as targets for transcriptional activators", THE PLANT CELL, vol. 7, 1995, pages 623 - 638
SHARMA K.K.; SCHUHMANN H.; SCHENK P.M.: "High lipid induction in microalgae for biodiesel production", ENERGIES, vol. 5, 2012, pages 1532 - 1553, XP002689116, DOI: doi:10.3390/en5051532
| Patentansprüche 1. Verfahren zum Ernten von Mikroorganismen aus einem flüssigen Medium, umfassend die Schritte Kultivierung der Mikroorganismen in dem Medium, Induzieren einer Bildung eines Lipids durch die Mikroorganismen, und Abschöpfen der Mikroorganismen von der Oberfläche des Mediums. 2. Verfahren nach Anspruch 1, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , dass die Mikroorganismen bis zur stationären Phase kultiviert werden, bevor die Bildung des Lipids induziert wird. 3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , dass das Lipid ein Triacylglycerid, ein Fettsäureester, ein Alkan und/oder ein Wachs ist. 4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , dass das Lipid eine Dichte von unter 1 g/cm3, bevorzugt unter 0,95 g/cm3, ferner bevorzugt von unter 0,9 g/cm3 aufweist. 5. Verfahren nach Anspruch 1, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , dass die Mikroorganismen ausgewählt sind aus der Gruppe be¬ stehend aus Bakterien, Algen, Mikroalgen, Archaeen, Cyanobakterien, Kieselalgen, und Hefen. 6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , dass die Bildung des Lipids durch einen externen Auslöser induziert wird. Verfahren nach Anspruch 6, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , dass der externe Auslöser ausgewählt ist aus der Gruppe be¬ stehend aus Reduzieren oder Absetzen mindestens eines Nährstoffs des Mediums, Zugeben einer Substanz zu dem Medium, Verändern der Temperatur des Mediums, und Verändern des pH-Werts des Mediums ist. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , dass die Mikroorganismen ein genetisches Konstrukt tragen, welches ein Gen zur Bildung des Lipids enthält und das Gen unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors steht; und dass die Bildung des Lipids durch das Zugeben eines Stoffs induziert wird, der den induzierbaren Pro¬ motor steuert. Verfahren nach Anspruch 8, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , dass der induzierbare Promotor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Nitratreduktase-Promotor, HSP70 Promotor, Cab-II Promotor, Cab-I Promotor, Cyc6 copper responsive element und PNR/TNR Kassette. 10. Verfahren nach Anspruch 8, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , dass das Gen zur Bildung des Lipids Fettsäure-Acly-ACP- Thioesterase (FAT), Acyl-CoA Synthetase (ACS) , Bifunktionelle DGAT/Wachsester Synthase oder ein Protein des Kennedy Pathway kodiert, bevorzugt ein Protein, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Glycerin-3- Phosphat Acyltransferase (GPAT) , Acylglycerinphosphat- Acyltransferase (AGPAT) , Phosphorsäure Phosphohydrolase (PAP) , und Diacylglycerin-Acyltransferase (DGAT) . |
Selbst-separierende Mikroorganismen Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Ernten von Mikroorganismen aus einem flüssigen Medium.
Die Kultivierung von Mikroorganismen in industriellem Maßstab hat in den letzten Jahren vielseitige Anwendungen gefunden. So werden beispielsweise mit Hilfe von Mikroorganismen verschiedene Substanzen biologischen Ursprungs, beispielsweise für Nahrungsergänzungsmittel, Feinchemikalien oder Medikamente hergestellt. Außerdem werden Mikroorganismen gezüchtet, um Biomasse zur Stromgewinnung oder zur Produktion von Biodiesel zu produzieren. Bakterien und Hefen werden in der Regel in
Fermentern oder Bioreaktoren kultiviert, wohingegen Algen und Cyanobakterien in offenen oder geschlossenen Aquakulturen gezüchtet werden. Die Kultivierung in großen Mengen erfolgt üblicherweise in einem flüssigen Medium, in welchem sich die Mikroorganismen vermehren und, gegebenenfalls, die gewünschten Substanzen produzieren. Anschließend werden die Mikroorganismen geerntet, wobei sie vom Kultivierungsmedium getrennt werden müssen. Herkömmlich geschieht dies durch Filtration, Sedimentation oder Zentrifugation . Daneben sind aber auch Verfahren bekannt, bei denen die Mikroorganismen mit Hilfe von Chemikalien ausflocken und anschließend sedimentieren . Kürzlich wurde ein Verfahren beschrieben, in dem die Mikroorganismen elektronischen Pulsen ausgesetzt werden, wodurch sie schneller sedimentieren (WO 2012/010969). Alle diese Verfah- ren benötigen jedoch relativ viel Energie (z.B. Filtration,
Zentrifugation, Elektroporation) oder bedürfen der Zugabe von chemischen Stoffen (Ausflockung) . Dies trägt erheblich zu den ohnehin hohen Kosten der Kultivierung von Mikroorganismen bei, die vor allem bei der Produktion von Biomasse zur Ener- gieerzeugung kaum amortisiert werden können.
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein effizientes Verfahren zum Kultivieren und Ernten von Mikroorganismen bereitzustellen, wodurch der gesamte Prozess wirtschaftlicher wird .
Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren zum Ernten von Mikro- Organismen aus einem flüssigen Medium gelöst. Das Verfahren umfasst die Schritte Kultivierung der Mikroorganismen in dem Medium, Induzieren einer Bildung eines Lipids durch die Mikroorganismen, und Abschöpfen der Mikroorganismen von der Oberfläche des Mediums. Indem die Mikroorganismen auf die In- duktion hin erhöhte Mengen eines Lipids bilden und speichern, nimmt die Menge an Lipiden innerhalb der Mikroorganismen stetig zu. Durch die geringe Dichte der Lipide nimmt gleichzei ¬ tig die Dichte der Mikroorganismen ab. Als Folge daraus stei ¬ gen die Mikroorganismen an die Oberfläche des Mediums, so dass es zu einer Trennung der Mikroorganismen vom Kulturmedium kommt. Die Mikroorganismen können anschließend von der Oberfläche des Mediums abgeschöpft werden. Dies kann bei ¬ spielsweise mit einem Sieb, durch einen Skimmer oder durch einen Überlauf erfolgen. Dadurch, dass die Trennung der Mik- roorganismen vom Medium automatisch bzw. passiv erfolgt, wird keine zusätzliche Energie benötigt. Zudem muss nicht das kom ¬ plette Medium zum Ernten der Mikroorganismen umgewälzt werden, wodurch weitere Energieeinsparungen möglich sind. Das Verfahren bedarf auch keiner Zugabe von chemischen Stoffen, die vor allem bei der Produktion von Substanzen für Lebensmittelzusätze und Medikamente durch Mikroorganismen nachtei ¬ lig wären.
In einer vorteilhaften Weiterbildung werden die Mikroorganis- men bis zur stationären Phase kultiviert, bevor die Bildung des Lipids induziert wird. Bei der Kultivierung von Mikroor ¬ ganismen werden vier Wachstumsphasen unterschieden, Anlaufphase, exponentielle Phase, stationäre Phase und
Absterbephase. In der stationären Phase wird die Zellteilung reduziert und die Zellen produzieren bevorzugt Stoffe, die nicht der Zellteilung dienen, sondern in der Zelle gespeichert werden. Dementsprechend begünstigt die stationäre Phase auch die Bildung und Speicherung von Lipiden. In einer vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung ist das Lipid ein Triacylglycerid, ein Fettsäureester, ein Alkan und/oder ein Wachs. Der Begriff "Lipid" bezeichnet ganz oder teilweise hydrophobe Moleküle, die aufgrund ihrer langen Koh ¬ lenwasserstoffketten, von beispielsweise 5 bis 25 Kohlenstoffatomen, bevorzugt von 15 bis 25 Kohlenstoffatomen, wasserabweisend sind. Zu den Lipiden zählen Alkane, Fettsäuren, Triacylglyceride und Wachse sowie Membran-bildende Lipide wie Phospholipide, Sphingolipide und Glykolipide. Für die Ausfüh ¬ rung des erfindungsgemäßen Verfahrens sind insbesondere Fett ¬ säuren und Triacylglyceride mit hoher molekularer Masse und hohem Sättigungsgrad geeignet. Die Fettsäuren, bzw. die Fett ¬ säuren der Triacylglyceride enthalten vorzugsweise mindestens 10, weiter bevorzugt mindestens 15, ferner bevorzugt mindes ¬ tens 20 Kohlenstoffatome . Des Weiteren sind insbesondere vollständig gesättigte und mono-ungesättigte Fettsäuren sowie Triacylglyceride mit vollständig gesättigten und/oder mono ¬ ungesättigten Fettsäuren geeignet.
In einer vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung, weist das Lipid eine Dichte von unter 1 g/cm 3 , bevorzugt unter 0,95 g/cm 3 , ferner bevorzugt von unter 0,9 g/cm 3 auf. Fettsäuren und Triacylglyceride mit hoher molekularer Masse und hohem Sättigungsgrad haben eine besonders niedrige Dichte. Bilden die Mikroorganismen solche Lipide, steigen sie zügig an die Oberfläche des Mediums und bilden dort eine stabile Schicht. Dadurch kommt es zu einer schärferen Trennung der Mikroorganismen vom flüssigen Medium, wodurch das Abschöpfen der Mik- roorganismen erleichtert wird. Besonders bevorzugt ist die Bildung von Fettsäuren wie Ölsäure, Linolsäure,
Arachidonsäure, Eicosapentaensäure, und Docosahexaensäure, sowie Triacylglyceride mit diesen Fettsäuren. In einer vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung sind die Mikroorganismen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Bak ¬ terien, Algen, Mikroalgen, Archaeen, Cyanobakterien, Kieselalgen und Hefen. Zur Produktion von chemischen Substanzen und Naturstoffen wie beispielsweise Arzneimitteln, Feinchemika ¬ lien und Zusatzstoffen für die Lebensmittelindustrie werden vor allem Bakterien und Hefen verwendet. Zur Produktion von Biomasse hingegen werden bevorzugt Algen, Mikroalgen und Cyanobakterien verwenden. In einer besonders bevorzugten Weiterbildung der Erfindung werden die Mikroorganismen jedoch nicht zur Produktion von Flüssigkraftstoffen, wie beispielsweise Biodiesel, verwendet. Die Verwendung von Mikroorganis ¬ men, die auf Induktion hin ein Lipid bilden, ist insbesondere geeignet, zur Produktion von chemischen Substanzen und Naturstoffen. Die Mikroorganismen können kultiviert werden, bis ausreichende Mengen der Substanz oder des Naturstoffs gebil ¬ det wurden. Anschließend wird die Bildung des Lipids indu ¬ ziert, so dass die Mikroorganismen an die Oberfläche des Me- diums steigen und geerntet werden können. Ebenso ist die Ver ¬ wendung von Mikroorganismen, die auf Induktion hin ein Lipid bilden, insbesodere geeignet, zur Produktion von Biomasse. Die Mikroorganismen werden in der exponentiellen Phase kultiviert, wodurch eine optimale Zellteilung gewährleistet ist. Sobald die Zellteilung der Mikroorganismen abnimmt und somit die maximal mögliche Menge an Biomasse erreicht wurde, wird die Bildung des Lipids induziert. Auf diese Weise wird die Zellteilung, und damit der Aufbau von Biomasse, nicht durch die Produktion eines Lipids beeinträchtigt.
In einer bevorzugten Weiterbildung der Erfindung wird die Bildung des Lipids durch einen externen Auslöser induziert. Der Begriff "externer Auslöser" bezeichnet eine Einwirkung auf die Mikroorganismen von außen. Dadurch kann der Zeitpunkt der Bildung der Lipide exakt bestimmt werden. Es ist daher möglich, die Mikroorganismen bis zu einer optimalen Zelldichte im Medium zu kultivieren, um erst dann die Lipidproduktion zu induzieren. Dadurch kommt es in der Zelle nicht zu einer Konkurrenz zwischen Stoffwechselwegen, die die Zellteilung fördern und Stoffwechselwegen zur Bildung und Speicherung von Lipiden. Es wird zudem verhindert, dass die Lipidproduktion das Zellwachstum hemmt, wodurch es zu einer längeren exponen- tiellen Wachstumsphase käme und die Dauer der Kultivierung insgesamt verlängert würde.
In einer vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung ist der externe Auslöser ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Re ¬ duzieren oder Absetzen mindestens eines Nährstoffs des Medi ¬ ums, Zugeben einer Substanz zu dem Medium, Verändern der Temperatur des Mediums, und Verändern des pH-Werts des Mediums. Der Begriff „Nährstoffe" bezeichnet alle Substrate, die im Nährmedium vorhanden sein müssen, um ein optimales Wachstum der Mikroorganismen zu ermöglichen. Hierzu zählen, je nach kultiviertem Mikroorganismus, insbesondere organische oder anorganische Kohlenstoff-, Stickstoff-, Schwefel- und Phos ¬ phatverbindungen, Salze, Ammonium, Kalium, Natrium, Spuren- elemente, und Kieselsäure. Die Bildung von Lipiden innerhalb der Mikroorganismen erfolgt über Lipidbiosynthesewege, wobei zuerst einzelne Fettsäuren gebildet werden, die anschließend zu Triacylglyceriden verknüpft werden. Die Fettsäurebildung wird durch verschiedene Moleküle, wie das Acyl-Carrier- Protein (ACP) , die Fettsäure-Acly-ACP-Thioesterase (fatty acyl-ACP-thioesterase, FAT) und die Acyl-CoA-Synthetase
(acyl-CoA-synthetase, ACS) , durchgeführt. Die Bildung der Triacylglyceride erfolgt anschließend im sogenannten Kennedy Pathway. Die natürlichen Lipidbiosynthesewege von Mikroorga- nismen lassen sich durch die Änderung der Kultivierungsbedingungen induzieren bzw. fördern. Beispielsweise kann der Entzug von Nitrat oder Phosphat bei Algen, Mikroalgen und
Cyanobakterien zur Bildung und Speicherung von Lipiden führen (Sharma et al . , 2012) . Ebenso kann die Lipidbiosynthese und - speicherung durch die Zugabe, von Eisen, Zink oder Cadmium, induziert werden (Sharma et al . , 2012) . Auch eine Änderung des pH-Werts des Medium ins Basische, oder eine Erhöhung der Kultivierungstemperatur führt zu einer gesteigerten
Lipidbildung und -speicherung. Nicht zuletzt kann die
Lipidbildung auch durch die Änderung der Belichtung der Kultur beeinflusst werden. So bilden viele Algen vermehrt Lipi- de, wenn sie im Dunkeln kultiviert werden (Sharma et al . , 2012) . In einer vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung tragen die Mikroorganismen ein genetisches Konstrukt, welches ein Gen zur Bildung des Lipids enthält, wobei das Gen unter der Kon- trolle eines induzierbaren Promotors steht; und die Bildung des Lipids durch das Zugeben eines Stoffes induziert wird, der den induzierbaren Promotor steuert. Durch ein solches Konstrukt kann die Lipidbildung einerseits gezielt induziert und andererseits zusätzlich gesteigert werden, indem ein Pro- tein der Lipidbiosynthese überexprimiert wird. Als äußerer
Auslöser wird dem Medium beispielsweise eine Substanz zugege ¬ ben, die mit dem Promotor derart interagiert, dass sie ihn aktiviert. Alternativ ist es möglich dem Kulturmedium während der Anzucht der Mikroorganismen eine Substanz zuzusetzen, die mit dem Promotor derart interagiert, dass sie diesen inakti ¬ viert. Sobald die Mikroorganismen ein optimales Wachstum erreicht haben, wird der Promotor dann durch Entzug der Substanz aus dem Medium aktiviert. Bei Bakterien und Hefen sind eine Vielzahl von induzierbarer Promotoren bekannt.
In einer vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung ist der induzierbare Promotor ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Nitrate-Reduktase-Promotor, HSP70 Promotor, Cab-II Promotor, Cab-I Promotor, Cyc6 copper responsive element und PNR/TNR Kassette. Diese Promotoren können zur induzierbaren Überexpression von Genen in Algen, Mikroalgen und Cyanobakterien genutzt werden (Quinn und Merchant, 1995; Poulsen und Kröger, 2005) . In einer vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung kodiert das Gen zur Bildung des Lipids die Fettsäure-Acly-ACP- Thioesterase (FAT), Acyl-CoA Synthetase (ACS) , Bifunktionelle DGAT/Wachsester Synthase (Bifunctional DGAT/wax ester
synthase) oder ein Protein des Kennedy Pathway, bevorzugt ein Protein, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Gly- cerin-3-Phosphat Acyltransferase (glycerol-3-phosphat
acyltransferase, GPAT) , Acylglycerinphosphat-Acyltransferase (acyl-glycerol-phosphat acyltransferase, AGPAT) , Phosphorsäu- re Phosphohydrolase (phosphatidic acid phosphohydrolase, PAP) , und Diacylglycerin-Acyltransferase (diacylglycerol acyltransferase, DGAT) . Durch die Einbringung eines zusätzlichen Gens eines Proteins, das an der Lipidbiosynthese beteiligt ist, kann die Bildung des Lipids nicht nur induziert sondern auch noch zusätzlich gefördert werden. Dabei ist es besonders vorteilhaft, wenn das Gen für ein Protein kodiert, dessen Menge in der Zelle für die Lipidbiosynthese limitierend ist, wie beispielsweise die Acyl-CoA-Synthetase (ACS) oder die Glycerin-3-Phosphat Acyltransferase (GPAT) . Alternativ können auch mehrere Gene, die für unterschiedliche Proteine der Lipidbiosynthese kodie ¬ ren, exprimiert werden. Die Lipidbildung und -speicherung in den Mikroorganismen kann weiter gesteigert werden, indem intrinsische Mechanismen, welche die Lipidbiosynthese begrenzen (sogenannte "Negativ-Feedback-Loop" Mechanismen) , gehemmt werden . Im Folgenden wird eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung anhand der beigefügten schematischen Zeichnung erläutert .
Figur 1 zeigt die Abfolge der Kultivierungsstadien von Mikro- Organismen über die Zeit (t) . Eine Impfkultur Mikroorganismen (1) von Phaeodactylum tricornutum wird in einem flüssigen Medium (3) aus künstlichem Meerwasser, das mit Phosphat, Nitrat und Kieselsäure angereichert ist, angeimpft. Die Kultur wird in einem Bioreaktor (2) unter Lichteinfall (4) kultiviert. Mit fortschreitender Zeit (t) wächst die Kultur durch Zellteilung der Mikroorganismen (1) . Sobald das Wachstum der Mikroorganismen (1) die stationäre Phase erreicht, wird als ex ¬ terner Auslöser (5) dem Medium (3) Nitrat entzogen. Dazu wird der Kultur neues Medium (3) ohne Nitrat zugeführt. Durch den Entzug von Nitrat beginnen die Mikroorganismen (1) mit der
Bildung und Speicherung von Lipiden, wodurch sie an die Oberfläche des Mediums (3) steigen. Von dort können sie durch Ab ¬ schöpfung (6) geerntet werden. Referenzen :
WO 2012/010969
Chen J.E., Smith A.G.; A look at diacylglycerol
acyltransferases (DGATs) in algae; Journal of Biotechnology,
2012, 162, 28-39; Poulsen N., Kröger N.; A new molecular tool for transgenic diatoms; FEBS Journal 2005, 272, 3413-3423
Quinn J.M., Merchant S . ; Two copper-responsive elements asso- ciated with the Chlamydomonas Cyc6 gene function as targets for transcriptional activators; The Plant Cell, 1995, 7, 623- 638;
Sharma K.K., Schuhmann H., Schenk P.M.; High lipid induction in microalgae for biodiesel production; Energies 2012, 5, 1532-1553;