Cepa de la especie Trichoderma harzianum y usos en agricultura

La presente memoria descriptiva se refiere, como su título indica, a un cepa de Trichoderma harzianum y a sus usos en agricultura. Se propone su uso como abono/fertilizante y/o fitosanitario y/o bioestimulante frente al estrés biótico y abiótico.

La invención que se presenta aporta como una de las principales ventajas, que el uso de esta cepa presenta una alta eficacia en agricultura frente al uso de otros productos abonos/fertilizantes y/o bioestimulantes y/o pesticidas químicos cuya fabricación y uso dañan el medio ambiente y la salud humana.

Campo de la invención

La invención se encuadra en el campo de la agricultura, la microbiología y los productos abonos/fertilizantes y/o fitosanitahos y/o bioestimulantes.

Estado actual de la Técnica

Estableceremos previamente una serie de definiciones para una mejor comprensión de esta memoria descriptiva:

Abono o fertilizante: producto utilizado en agricultura o jardinería que por su aporte de nutrientes, facilita el crecimiento de las plantas, aumenta su rendimiento y mejora la calidad de las cosechas o que, por su acción específica, modifica, según convenga, la fertilidad del suelo o sus características físicas, químicas o biológicas.

Nutriente: elemento químico esencial para la vida vegetal y el crecimiento de las plantas. Además del carbono (C), el oxígeno (O) y el hidrógeno (H), procedentes especialmente del aire y del agua, los elementos nutrientes se clasifican en: nutrientes principales, nutrientes secundarios y micronutrientes.

Nutrientes principales: exclusivamente, los elementos nitrógeno, fósforo y potasio.

Nutrientes secundarios: calcio, magnesio, sodio y azufre.

HOJA RECTIFICADA (REGLA 91) Micronutrientes: los elementos boro, cobalto, cobre, hierro, manganeso, molibdeno y zinc, esenciales para el crecimiento de las plantas, aunque en pequeñas cantidades si se compara con los nutrientes principales y secundarios.

Fitosanitario: sustancia o mezcla de sustancias destinadas a prevenir la acción de, o destruir directamente, insectos, ácaros, moluscos, roedores, hongos, malas hierbas, bacterias, nemátodos y otras formas de vida animal o vegetal perjudiciales para la salud pública y también para la agricultura. Se incluye en este grupo los plaguicidas, defoliantes, desecantes y las sustancias reguladoras del crecimiento vegetal o fitorreguladores.

Bioestimulante: es cualquier sustancia que, al aplicarse a las plantas, es capaz de mejorar la eficacia de éstas en la absorción y asimilación de nutrientes, la tolerancia a estrés biótico o abiótico o mejorar alguna de sus características agronómicas, independientemente del contenido en nutrientes de la sustancia

Estrés biótico: estrés causado en las plantas por seres vivos como virus, bacterias, hongos, nemátodos, así como insectos y otras plantas.

Estrés abiótico: estrés causado en las plantas por causas no bióticas y que fundamentalmente se deben a sequía, altas y bajas temperaturas, salinidad, metales pesados, radiaciones ultravioleta, acidez del suelo, y aplicación de productos fitosanitarios fundamentalmente.

Género: categoría de la clasificación biológica (categoría taxonómica) que se ubica entre la familia y la especie, y que comprende una o más especies morfológicamente similares relacionadas filogenéticamente. Por “categoría taxonómica” se entiende el nivel de jerarquía utilizado para la clasificación de los organismos.

Nemátodo: gusanos multicelulares que pertenecen al grupo de los helmintos. Pueden encontrarse tanto en el agua como en medio terrestre. En referencia a los terrestres existen nemátodos bacterívoros, fungívoros, predadores de otros nemátodos, parásitos de insectos, de otros animales y parásitos de plantas (fitoparásitos). Para la presente memoria cuando hablemos de nemátodos nos referiremos a aquellos que viven en medio terrestre y tienen una actividad parásita de plantas y se denominan en el campo agrícola como “nemátodos fitoparásitos”.

HOJA RECTIFICADA (REGLA 91) En la actualidad, y hasta donde alcanzan nuestros conocimientos, existen un número limitado de productos con usos como abono/fertilizantes o fitosanitarios o bioestimulantes tanto de síntesis química, naturales o microbiológicos a nivel mundial. Cada día aumentan las restricciones al uso de fertilizantes químicos que provocan contaminaciones en los ríos y las tierras por exceso de nitrógeno o de fósforo, presencia de metales pesados u otras sustancias contaminantes. Igualmente, el uso de fitosanitarios con residuos peligrosos encuentra cada vez mayores problemas tanto desde el nivel regulatorio como el del usuario. Todo ello, ha dado lugar a que muchos de los productos existentes en el mercado han tenido o tendrán que ser prohibidos y retirados del mercado por su alta toxicidad para el ser humano o el medio ambiente o por la presencia de residuos tóxicos o por sus altos costes de fabricación que no los hacen competitivos. Esto, ha provocado que los agricultores tengan una limitación en cuanto a los productos a utilizar con las consiguientes pérdidas económicas.

Por todo ello, cualquier profesional del sector agrícola sabe que el desarrollo de nuevas sustancias y en concreto, el descubrimiento y desarrollo de nuevas cepas de microorganismos o composiciones agrícolas que no solo tengan un solo uso como abonos/fertilizantes o fitosanitarios o bioestimulantes sino que tenga varios usos en un único producto y que además no deje residuos, sean seguros y competitivos desde el punto de vista económico es de gran interés para el sector.

Antecedentes de la invención

Los hongos filamentosos del género Trichoderma spp. se encuentran libremente en el suelo. Desde hace unos años estás hongos están siendo utilizados y comercializados en el sector de la agricultura.

En ese sentido, se ha descrito efectos como abonos/fertilizantes o efectos como bioestimulante frente a estrés biótico o abiótico. Así, algunas cepas del hongo Trichoderma spp. son capaces de colonizar y crecer en asociación con las raíces de las plantas incrementando significativamente el crecimiento y desarrollo de estas (Ahmand and Baker. Phytopathology. 77: 182-189, 1987). En otros casos se ha descrito que esta colonización de las raíces por parte de algunas variedades de este hongo inducen resistencia local y sistémica frente a hongos fitopatógenos (Shoresh et al. Phytopathology. 95:76-84, 2005) por la producción de elicitores (Nimchuck et al. Annu Rev Genet. 37: 579-609, 2003).

HOJA RECTIFICADA (REGLA 91) En el aspecto fitosanitario, y como fungicida, en la actualidad, hay un total de 14 especies del hongo Tríchoderma spp. que están registradas como fitosanitarios actuando frente a hongos patógenos en la UE. De ellos, 10 cepas están caracterizadas como Tríchoderma harzianum. Igualmente, se han descrito algunas patentes que describen la posibilidad de uso alguna cepa de Tríchoderma harzianum frente a hongos como Verticillium en el cultivo del olivar (ES2391324B1).

En el aspecto fitosanitario y como nematicida, podemos indicar que se han descrito numerosos microoranismos para el control de nemátodos como Sphingobacterium spirítivorum cepa C-926 y Corynobacterium paurometabolum C-924 (MX250042), Pasteruria spp (MX193344), hongos del género Arthrobotrys (US4.666.714), Bacillus turingiensis (US5.270.448), Pochonia chlamydosporía (US2009169518), Verticillium chlamydosporíum CC334168 (WO1991/001642) y Paecilomyces carneus (WO2014/092529) y otras. Igualmente, dentro del género Tríchoderma spp, algunas cepas de las especies Tríchoderma asperellum y Tríchoderma atroviride han mostrado actividad nematicida mediante parasitismo. Finalmente, se ha descrito en la bibliografía trabajos científicos de Tríchoderma harzianum con efecto nematicida. Sin embargo, en este momento no hay ninguna especie de hongos Tríchoderma spp y por lo tanto ninguna cepa de Tríchoderma harzianum que cuente con registro fitosanitario como nematicida en la UE.

La cepa de Tríchoderma harzianum presentada en esta memoria tiene numerosas ventajas como que no produce residuos químicos tóxicos problemáticos desde el punto de vista sanitarios ni contaminantes para el suelo o los cauces acuáticos. Además, la presente cepa tiene varios usos conjuntos, presenta un uso como abono/fertilizante y como fitosanitario y como bioestimulante frente al estrés biótico y abiótico. Todo ello hace que mediante la utilización de una sola cepa podamos sustituir el uso de numerosos productos con las ventajas económicas y prácticas que ello conlleva al agricultor.

Descripción de la invención

Para solventar la problemática existente en la actualidad en agricultura con el uso de productos químicos como fertilizantes, fitosanitarios y bioestimulantes con la problemática de usar vahos productos (cada uno con una función) y la producción de contaminaciones medioambientales o de residuos tóxicos en su fabricación o uso, se ha ideado el uso en agricultura de una cepa de Tríchoderma harzianum no descrita hasta ahora en este campo de aplicación.

HOJA RECTIFICADA (REGLA 91) La cepa de la especie Tríchoderma harzianum está depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con el número de depósito CECT21179, de ahora en adelante “cepa de la invención”. Se trata de una cepa aislada de un entorno natural a partir de muestras de suelo.

En una realización preferente, la cepa de la invención se encuentra en estado esporulado. Se entiende por “estado esporulado” el estadio del hongo en el que éste se encuentra en forma de espora. El término “espora” se refiere a la célula reproductora producida en los esporangios de los hongos, ya sea asexualmente o como resultado de un proceso de reproducción sexual, generalmente haploide y unicelular, que al mismo tiempo permite la dispersión y la supervivencia por largo tiempo (dormancia) en condiciones adversas. La espora produce un nuevo organismo al dividirse por mitosis sin fusión con otra célula, produciendo un gametofito pluricelular. Cuando la espora germina surge de ella una primera hifa, por cuya extensión y ramificación se va constituyendo un micelio.

Otro aspecto de la invención se refiere a una composición, de ahora en adelante “composición de la invención”, que comprende entre otros elementos un elemento seleccionado de la lista:

(a) Cepa de la invención, preferente en estado esporulado.

(b) Productos del metabolismo (metabolites) y/o de la cepa de la invención.

(c) Una combinación de (a) y (b).

Tal y como se utiliza en la presente invención, el término “productos del metabolismo” o “metabolites” se refiere a cualquier molécula excretada por la cepa de la invención al medio. Ejemplos de estos metabolites son, aunque sin limitarnos, aminoácidos, nucleótidos, vitaminas, ácidos orgánicos, alcoholes, como los policies, azúcares, como los polisacáridos, antibióticos, enzimas, tales como por ejemplo, aunque sin limitarnos, enzimas hidrolíticas de pared celular, etc.

La composición de la invención además comprende elementos necesarios para el crecimiento y desarrollo de la cepa de la invención. Así, dicha composición comprende aunque sin limitarnos, fuentes de carbono, sales minerales y/o nutrientes orgánicos y/o inorgánicos.

La composición de la invención puede presentarse en cualquier forma de presentación adecuada para su administración o aplicación en agricultura, por ejemplo, aunque sin

HOJA RECTIFICADA (REGLA 91) limitarse, en forma líquida o sólida o sólida soluble en agua. Las formas de presentación líquidas o solida soluble en agua son adecuadas para su pulverización sobre el suelo, la planta o el material vegetal o bien para crear una solución en la que se sumerjan las plantas o el material vegetal. La presentación solida es adecuada para su dispersión sobre el suelo en forma de polvo, granular, peletizado, etc.

Con respecto a la composición de la invención donde uno de los elementos sea acorde a lo descrito en la lista (a), la cepa de la invención puede ser administrada sola tanto a las raíces como a la parte aérea de la planta, al material vegetal incluyendo de forma no limitativa a semillas, hojas o frutos o al suelo.

Con respecto a la composición de la invención donde uno de los elementos sea acorde a lo descrito en la lista (b), una vez excretados, los productos del metabolismo de la cepa de la invención pueden ser aislados y aplicados, solos o en combinación con la cepa (caso (c) de la lista), directamente a la planta, tanto a las raíces como a la parte aérea, al material vegetal, incluyendo pero sin limitarnos semillas, hojas o frutos o al suelo.

Cuando los productos del metabolismo son administrados en combinación con la cepa de la invención, el modo de administración puede ser simultáneo o secuencial. O bien, la cepa de la invención puede ser administrada sola tanto a las raíces como a la parte aérea de la planta, al material vegetal incluyendo pero sin limitarnos semillas, hojas o frutos o al suelo, de manera que se produzca dichos productos del metabolismo in situ.

El término “uso” o “tratamiento”, tal y como se entiende en la presente invención, se refiere a la utilización de la cepa de la invención como abono/fertilizante y/o bioestimulante frente a estrés biótico o abiótico y/o como fitosanitario tal y como viene establecidos en las definiciones de estos términos en la presente invención.

La cepa de la invención, y/o los productos de su metabolismo, o la composición de la invención, pueden usarse para el tratamiento a una planta, a un suelo, o al material vegetal, incluyendo pero sin limitarnos a semillas, hojas o frutos, en combinación con uno o más agentes fertilizantes, y/o bioestimulantes y/o fitosanitarios de manera simultánea o secuencial.

El modo de uso o tratamiento para la administración de la cepa de la invención, y/o de los productos de su metabolismo, así como de la composición de la invención, puede realizarse,

HOJA RECTIFICADA (REGLA 91) por ejemplo, aunque sin limitarnos, mediante el agua de riego, pulverización rociado, revestimiento, fumigación, impregnación, mezcla con el sustrato, inmersión de la raíz de la planta en una solución que comprenda la cepa de la invención, o esporas de la misma pregerminadas, y/o los productos de su metabolismo, o la composición de la invención.

Ventajas de la invención

Este uso novedoso de la composición en base a una nueva cepa de Trichoderma harzianum para el tratamiento frente a problemas en agricultura aporta múltiples ventajas sobre los productos disponibles en la actualidad siendo la más importante que presenta una alta eficacia agronómica y una multifuncionalidad frente a los productos de síntesis química que se conocen actualmente para usos muy concretos y limitados.

Es importante destacar la ventaja que supone que el uso de esta composición presenta un perfil toxicológico muy positivo según los estándares internacionales comparado con otros productos de síntesis química, gracias a la utilización de una cepa de un microorganismo de origen natural. Ello puede llevar a declarar esta composición como libre de residuos fitosanitarios con las claras ventajas agrícolas, sanitarias y económicas frente a los productos de síntesis.

Además, hay que destacar la ventaja que origina el uso de esta composición ya que al no contener productos químicos de síntesis evita la introducción de sustancias que pueden actuar como contaminantes o incrementando la toxicidad o fitotoxicidad de la composición agrícola.

Otra ventaja de esta nueva composición es que es más económica frente a los químicos tradicionales que son utilizados como abonos/fertilizantes, bioestimulantes o fitosanitarios.

Ejemplos

A continuación se ¡lustrará la invención mediante unos ensayos realizados, que ponen de manifiesto la efectividad de la cepa y de la composición de la invención en los diferentes usos descritos. Estos ejemplos específicos que se proporcionan sirven para ¡lustrar la naturaleza de la presente invención y se incluyen solamente con fines ilustrativos, por lo que no han de ser interpretados como limitaciones a la invención que aquí se reivindica. Por tanto, los ejemplos descritos más adelante ¡lustran la invención sin limitar el campo de aplicación de la misma.

HOJA RECTIFICADA (REGLA 91) Ejemplo 1 : Estudio de la capacidad bioestimulante de la cepa de la invención.

El objetivo del protocolo fue evaluar del potencial bioestimulante de la cepa de la invención. En concreto se estudiaron los siguientes aspectos: capacidad de solubilización de fósforo, capacidad de producción de compuestos sideróforos, capacidad de producción de proteasas. Estas capacidades son las 3 estudiadas para la cepa de la invención, las cuales no excluyen que dicho microorganismos posea otras propiedades bioestimulantes que no se hayan estudiado en este ejemplo. de solubilización de fósforo Mediante este ensayo se evalúa la capacidad de la cepa de la invención de solubilizar fuentes de fósforo complejas por transformación en fosfatos monobásicos, dibásicos, permitiendo a las plantas asimilar estas fuentes de manera más sencilla. Se trata de un ensayo in vitro cualitativo, donde se evalúa la capacidad de la cepa de crecer en un medio selectivo y se analiza su habilidad para formar halos, asociados al consumo de la fuente de fósforo presente en el medio de crecimiento.

En función de los resultados obtenidos se clasificará la cepa en una de las siguientes categorías:

(-): No se observa crecimiento.

(+): Se observa crecimiento.

(++): Se observa la formación de halos.

Para cuantificar la solubilización de fosfatos se preparó un cultivo de la cepa de la invención en matraz con medio líquido para favorecer su crecimiento. A partir de dicho cultivo se inocularon 5 pl por triplicado en el medio de cultivo de detección de solubilizadores de fósforo. Al mismo tiempo se realizó un control positivo con cepas de referencia solubilizadoras de fosfato para comprobar el funcionamiento adecuado del método y el buen estado del medio de cultivo.

Capacidad de producción de compuestos sideróforos: Mediante este ensayo se evalúa la capacidad de la cepa de la invención de producir compuestos quelantes de hierro, permitiendo la fijación del hierro de forma reversible. Se trata de un ensayo in vitro cuantitativo, donde se evalúa la capacidad de la cepa de crecer en un medio selectivo y se

HOJA RECTIFICADA (REGLA 91) analizar su habilidad para formar halos, asociados a la producción de compuestos sideróforos en el medio de crecimiento.

En función de los resultados obtenidos se clasificará la cepa en una de las siguientes categorías:

(-): No se observa crecimiento.

(+): Formación de un halo inferior a 5mm.

(++): Formación de un halo entre 5 y 10 mm.

(+++): Formación de un halo superior a 20 mm.

Para cuantificar la producción de sideróforos se preparó un cultivo de la cepa de la invención en matraz con medio líquido para favorecer su crecimiento. A partir de dicho cultivo se inocularon 5pl por triplicado en el medio de cultivo de detección de sideróforos. Al mismo tiempo se realizó un control positivo con cepas de referencia productoras de sideróforos para comprobar el funcionamiento adecuado del método y el buen estado del medio de cultivo. Mediante este ensayo se evalúa la capacidad de la cepa de la invención de producir proteasas, enzimas asociadas a diversas funciones, entre ellas la estimulación del crecimiento vegetal ya sea por efectos directos o indirectos sobre el individuo a tratar. Se trata de un ensayo in vitro cualitativo, donde se evalúa la capacidad de la cepa de crecer en un medio general enriquecido y se analizar su habilidad para formar halos, asociados a la secreción de enzimas de naturaleza proteolítica.

En función de los resultados obtenidos se clasificará la cepa en una de las siguientes categorías:

(-): No produce enzimas con capacidades proteolíticas

(+): Produce enzimas proteolíticas.

Para verificar la síntesis de enzimas con capacidad proteolítica por parte de la cepa de la invención se preparó un cultivo de la cepa de la invención en matraz con medio líquido para favorecer su crecimiento. A partir de dicho cultivo se inocularon 5pl por triplicado en el medio de cultivo de detección de actividad proteolítica. Al mismo tiempo se realizó un control

HOJA RECTIFICADA (REGLA 91) positivo con cepas de referencia productoras de actividad proteolítica para comprobar el funcionamiento adecuado del método y el buen estado del medio de cultivo.

Resultados:

A continuación, se muestra una tabla resumen de las capacidades analizadas y evaluadas para la cepa de la invención

Se ha detectado que la cepa de la invención tiene efecto bioestimulante. Se ha comprobado la posible capacidad de solubilización de fosfatos, la producción de sideróforos y su posible relación con la capacidad de síntesis de enzimas proteolíticas.

Ejemplo 2: Estudio de la actividad quinolinítica in vitro de la cepa de la invención.

El objetivo del protocolo fue evaluar la actividad quinolinítica de la cepa de la invención en substratos determinados. Las enzimas quinoliníticas son producidas por algunos microorganismos en condiciones de ausencia de nutrientes y está favorecida por la presencia en el medio de estructuras de quitina complejas (como es el caso de la pared de los nemétodos). Con ello, se mide el potencial nematicida de la cepa de la invención. El método permite comparar microorganismos entre sí no sólo desde el punto de vista cualitativo sino también cuantitativo.

Los sustratos analizados fueron los siguientes:

4-Nitrophenyl N,N’-diacetyl-p-D-chitobioside: Un sustrato adecuado para actividad exoquitinasa

4-Nitrophenyl N-acetyl-p-D-glucosaminide: Un sustrato adecuado para actividad exoquitinasa

HOJA RECTIFICADA (REGLA 91) 4-Nitrophenyl p-D-N,N’,N”-tnacetylch¡totriose : Un sustrato adecuado para actividad endoquitinasa

La actividad de la cepa de la invención fue comparada frente un microorganismos control que está descrito que tiene actividad quinolinítica y con denominación Serratia marcenses CECT846.

Resultados:

A continuación, se muestra una tabla resumen de la actividad quinolinítica. La actividad quinolinítica indicada es la suma de las actividades en los 3 substratos indicados.

Los resultados indican la alta actividad quinolinítica lo que indica un elevado potencial como producto nematicida.

Ejemplo 3: Estudio de la eficacia nematicida de la cepa de la invención.

El objetivo del protocolo fue evaluar el modo de acción y la eficacia de la actividad frente a huevos y juveniles (J2) de los nemátodos la especie Meloidogyne incógnita y la especie Pratylenchus penetrans en condiciones in vitro. Las composiciones analizadas fueron dos. Composición compuesta por el hongo (Trichoderma harzianum) más el caldo de fermentación (metabolites) y la composición únicamente compuesta por el caldo de fermentación sin la presencia del hongo de la cepa de la invención (Trichoderma harzianum).

Ensayos con huevos de los nemátodos la especie Meloidogyne incógnita y de la especie Pratylenchus penetrans

HOJA RECTIFICADA (REGLA 91) Los ensayos fueron realizados en condiciones in vitro en placa de Petri con discos que contenían los huevos. 100 huevos fueron aplicados en cada placa de Petri correspondiente a cada uno de los géneros de nemátodos estudiada. Posteriormente, se aplicaron las composiciones indicadas y se mantuvieron a la temperatura ambiente del laboratorio (22°C) durante 7 días. Posteriormente las muestras fueron estudiadas mediante un microscopio. Se evaluaron los huevos no eclosionados y la presencia de juveniles tras el tiempo de estudio.

En todos los casos se introdujo un muestra sin tratamiento y otras que actuaron como controles para comprobar que buen funcionamiento del método y del ensayo.

Resultados:

A continuación, se muestra una tabla resumen de las eficacias.

HOJA RECTIFICADA (REGLA 91)

Los resultados indican la alta eficacia como nematicida de la cepa de la invención en las dos composiciones testadas en el ejemplo.

HOJA RECTIFICADA (REGLA 91)