VACUNOS

CAMPO TÉCNICO

La presente invención se relaciona con el campo técnico de preparaciones farmacéuticas para su aplicación en animales de ganadería, particularmente, una forma farmacéutica de liberación prolongada para la administración intrauterina de interferón tau bovino en vacunos y un método para la preparación de dicha forma farmacéutica.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

En la industria ganadera, la eficiencia productiva y las ganancias dependen en gran parte del número de crías nacidas, alto peso al destete y de una buena calidad de la composición corporal del animal, por lo que la fertilidad de las hembras es un factor fundamental para la optimización del manejo reproductivo de los bovinos. La falta del control en la gestación del ganado genera heterogeneidad en los nacimientos, lo que provoca que, al momento de la venta, no se cuente con animales con una distribución adecuada de peso y edad que satisfaga la demanda, lo genera una pérdida importante para los ganaderos. Uno de los enfoques para la optimización del manejo reproductivo es el uso de técnicas para la sincronización del celo en las hembras junto con métodos de reproducción asistida como la inseminación artificial.

El ciclo estral de una hembra bovina posee una duración promedio de 21 días. Este ciclo se divide principalmente en: la fase estro (día 0), que se caracteriza por el celo de la hembra bovina que generalmente coincide con el alza de las hormonas luteinizante (LH) y foliculoestimulante (FSH); la fase metaestro (días 1 - 3) que comprende las etapas de maduración folicular y la ovulación, formación del cuerpo lúteo e inicio de la secreción de progesterona, que es la hormona que mantiene el útero en un estado adecuado para la preñez; la fase diestro o fase luteal (días 4 -19) que comprende la maduración del cuerpo lúteo y altos niveles de progesterona en la sangre; y la fase proestro o fase folicular en la que las concentraciones de progesterona en sangre disminuyen producto de la lisis del cuerpo lúteo (Fundación Chile. Manual de producción bovina dirigido a profesionales y técnicos. Agosto 2008). Los días 16 a 18 del ciclo estral se conocen como “el periodo de reconocimiento materno”, periodo en el cual, si no se detecta un embrión, el útero comienza la producción de prostaglandina que es la hormona que destruye el cuerpo lúteo. En presencia de un embrión, existen mecanismos para evitar que el cuerpo lúteo se destruya. En rumiantes, el trofoblasto embrionario produce factores antiluteolíticos como el Interferón-tau (IFN-t), que actúan en el útero y previenen la liberación de prostaglandinas (Lenis Y. y cois. Interferón Tau en la ventana de reconocimiento materno embrionario bovino. Revista U.D.C.A Actualidad & Divulgación Científica. 13(1 ): 17-28). Las disfunciones del cuerpo lúteo tales como el acortamiento de la vida media de éste o una producción subnormal de progesterona son unas de las causas de la muerte embrionaria temprana, que representa la principal causa de pérdidas de gestaciones en rumiantes (Hernández J., Zarco A. Función del cuerpo lúteo y muerte embrionaria en rumiantes. Ciencia Veterinaria 8-1998).

El IFN-t, también llamado interferón trofoblástico, es un subtipo de interferón de tipo I, que tiene aproximadamente un 50% de identidad de su secuencia aminoacídica con el interferón a, aproximadamente un 30% con el interferón b, y alrededor de un 75% con el interferón w. El IFN-t tiene una actividad antiviral potente y propiedades antiproliferativas, puede activar las células NK (por sus siglas en inglés Natural KίIIbή, y puede regular una variedad de genes que responden a IFN (Roberts R.M. y cois. New and Atypical Families of Type I Interferons in Mammals: Comparative Functions, Structures, and Evolutionary Relationships. Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology. 1997. 56: 287 - 325).

En el estado de la técnica se ha visto que la administración de interferón al1 bovino (blFN-a) recombinante aumenta la tasa de preñez en ovinos y bovinos. Por ejemplo, se ha demostrado que la inyección intramuscular de 2 mg de blFN-a en ovinos, dos veces al día entre los días 12 a 16 del ciclo estral aumenta la cantidad de hembras preñadas y la supervivencia de los embriones (Nephew K.P. y cois. Effects of intramuscular administration of recombinant bovine interferon-alphail during the period of maternal recognition of pregnancy. Journal of Animal Science, 1990, 68(9): 2766-2770; Schalue-Francis T.K. y cois. Effect of injected bovine interferon-alpha 11 on estrous cycle length and pregnancy success in sheep. Journal of reproduction and fertility, 1991 , 91 (1 ):347-356; Martinod S. y cois. The effects of recombinant bovine interferon-a on fertility in ewes. Theriogenology, 1991 , 36(2): 231-239). A su vez, el documento de patente US 4,997,646 describe el uso de interferón a para aumentar la fertilidad y prolongar la vida media del cuerpo lúteo en bovinos. En los ejemplos de realización de dicho documento, se muestra que la aplicación del interferón a en vacas se realizó mediante la introducción de una solución de IFN-a en el útero, dos veces al día, entre los días 15 y 21 del ciclo estral, o mediante la administración parenteral de IFN-a, dos veces al día, entre los días 15 y 19 del ciclo estral.

Si bien la administración de interferón en bovinos junto con el uso de técnicas para la sincronización del celo en las hembras y métodos de reproducción asistida como la inseminación artificial pueden aumentar la fertilidad y supervivencia de embriones, la forma de administración del interferón es engorrosa y requiere de la presencia constante de personal técnico especializado. En consecuencia, se requiere de nuevas formas farmacéuticas que permitan la administración de interferón en los bovinos de forma fácil, de una sola dosis y de liberación prolongada para ejercer el efecto deseado dentro de la ventana de tiempo requerido.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a una nueva forma farmacéutica de liberación prolongada para la administración intrauterina de interferón tau (IFN-t) bovino, para el control del ciclo reproductivo en vacunos, que incluye partículas que comprenden IFN-t bovino y quitosano al 0,5% p/v; y una base de hidrogel deshidratado que comprende almidón al 8% p/v.

En una modalidad preferida de la invención, la forma farmacéutica comprende entre 500 - 700 pg IFN-t bovino.

En otra modalidad preferida de la invención, las partículas incluidas en la forma farmacéutica comprenden IFN-t bovino recombinante, y preferentemente quitosano de peso molecular entre 50 y 190 kDa. Dichas partículas tienen, preferentemente, una distribución de tamaño entre 30 nm - 1 miti de diámetro.

En otra modalidad preferida de la invención, la forma farmacéutica es un comprimido o tableta, que tiene una dimensión preferente entre 6 a 7 cm de largo y 0,3 a 1 ,2 cm de diámetro.

La presente invención también comprende un método para preparar una forma farmacéutica de liberación prolongada para la administración intrauterina de interferón tau (IFN-x) bovino, para el control del ciclo reproductivo en vacunos, que comprende los pasos de:

- obtener partículas que comprenden IFN-t bovino y quitosano al 0,5% p/v;

- dispersar dichas partículas de IFN-x bovino en una solución de tampón fosfato salino;

- obtener una base de hidrogel deshidratado que comprende almidón al 8% p/v;

- embeber dicha base de hidrogel deshidratado con la solución de tampón fosfato salino que contiene las partículas de IFN-x bovino hasta obtener un hidrogel hidratado; y

- liofilizar el hidrogel hidratado que comprende las partículas de IFN-x bovino.

En una modalidad preferida del método de la presente invención, las partículas que comprenden IFN-x bovino y quitosano se obtienen a partir de la mezcla de una solución de quitosano al 0,5% p/v en ácido acético al 1% v/v, y una solución de IFN-x bovino con una concentración de pg de IFN-x bovino por mi. Preferentemente, se mezclan 500 pg de IFN-x bovino por cada 10 mi de solución de quitosano. En otra modalidad preferida de la invención, el IFN-x bovino es IFN- x bovino recombinante. En otra modalidad preferida de la invención, el quitosano tiene un peso molecular entre 50 y 190 kDa. En otra modalidad preferida del método de la presente invención, las partículas que comprenden IFN-t bovino y quitosano se obtienen mediante electropulverización.

En otra modalidad preferida de la invención, la base de hidrogel deshidratado se obtiene a partir de una solución de almidón al 8% p/v en agua destilada que se calienta para inducir su gelificación. Para inducir dicha gelificación, la solución de almidón se calienta, preferentemente, a una temperatura de 121°C durante 20 minutos.

En otra modalidad preferida de la invención, luego de la gelificación de la solución de almidón, ésta se somete a varios ciclos de congelación/descongelación, previo a su deshidratación. Preferentemente, un ciclo de congelación/descongelación consiste en 12 horas de congelación y 12 horas de descongelación. Preferentemente, la deshidratación se realiza mediante liofilización.

En otra modalidad preferida de la invención, para incluir las partículas en la base de hidrogel deshidratado, dicha base de hidrogel deshidratado se embebe con la solución que contiene las partículas de IFN-t bovino durante 24 horas a temperatura ambiente.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

La FIG. 1 muestra una fotografía del inyector del equipo de electropulverización en el momento de la electroencapsulación de IFN-t con el polímero. Se muestra la formación del Cono de Taylor y del aerosol que da a lugar a las partículas.

La FIG. 2 muestra dos microfotografías del polvo recolectado que corresponden a las partículas de IFN-t y quitosano, capturada mediante microscopía electrónica de barrido (SEM).

La FIG. 3 muestra una fotografía de hidrogeles de almidón deshidratados conservados en un tubo de 50 mi, y la estructura microscópica interna, obtenida por microscopía electrónica de barrido a un corte del material seco. La barra blanca indica una longitud de 500 pm. La FIG. 4 muestra una microfotografía de la estructura microscópica interna de hidrogeles de almidón deshidratado, obtenida por microscopía electrónica de barrido a un corte del material seco. La barra blanca indica una longitud de 100 pm. Las flechas blancas indican la longitud de algunos de los canales del hidrogel.

La FIG. 5 muestra el proceso de corte y rehidratación del hidrogel de almidón deshidratado en una solución de PBS con las partículas de IFN-t y quitosano dispersas. La FIG. 5A muestra trozos de hidrogel deshidratado. La FIG. 5B muestra el corte de dichos trozos en fragmentos iguales. La FIG. 5C muestra un fragmento de hidrogel hidratándose en la solución de PBS con partículas.

La FIG. 6 muestra dos microfotografías de hidrogeles de almidón deshidratado con partículas de IFN-t y quitosano, capturadas mediante microscopía electrónica de barrido. Las flechas blancas indican agregados de partículas en el interior de los canales de los hidrogeles.

La FIG. 7 muestra un gráfico con los perfiles de liberación de proteína desde los hidrogeles, in vitro. IFNt encaps: partículas de IFN-t y quitosano; IFNt sin encaps: IFN-x sin quitosano; PBS: Tampón fosfato salino como control negativo.

La FIG. 8 muestra un gráfico con los resultados del efecto antiviral del IFN-x en cultivos de células HEp2 utilizando diluciones de 112. Grupo 1 : representa muestras de hidrogeles con partículas de IFN-x y quitosano; Grupo 2: representa los hidrogeles con IFN-x sin encapsular; C- cel muertas: control negativo de células muertas; C+ cel vivas: control positivo de células vivas; C+ IFNh: control positivo con interferón alfa humano. Los datos se analizaron estadísticamente mediante análisis de varianza unidireccional y post-test de Dunnet ( ^*** p< 0,001 , ^** p< 0,01 , ^* p< 0,05).

La FIG. 9 muestra un esquema del programa de sincronización de celo estándar para hembras bovinas a tiempo fijo. El día 0 corresponde al implante vaginal de progesterona (P4) y benzoato de estradiol. En el día 8 se retira el implante de progesterona, y se administra prostaglandina y Ciprionato de estradiol (PGF2a + ECP). El día 9 se implanta la forma farmacéutica que contiene las partículas de quitosano e IFN-x en el hidrogel de almidón deshidratado (implante IFN-x). La FIG. 10 muestra una secuencia de fotografías que muestran los pasos que se deben realizar para la aplicación de la forma farmacéutica que contiene las partículas de quitosano e IFN-t en el hidrogel de almidón deshidratado (implante IFN-t) por vía intrauterina. Las FIGs. 10A, 10B, y 10C muestran los pasos de extracción del implante IFN-t desde el envase estéril y su introducción dentro del inyector intrauterino. Las FIGs. 10D, 10E, y 10F muestran el aseo con antiséptico de la zona perivulvar de los bovinos hembra y la implantación del implante IFN-t por vía transvaginal hacia el cuerpo uterino con el inyector intrauterino.

La FIG. 11 muestra un gráfico con los resultados de la medición de los niveles de progesterona serológica en bovinos hembra con o sin implante IFN-t. C1 , C2, y C3 corresponden a las hembras controles que se utilizaron en el ensayo. A1 a A7 corresponden a las hembras a las que se les aplicó por vía intrauterina el implante IFN-x.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La presente invención comprende una nueva forma farmacéutica para la administración intrauterina de interferón en bovinos, preparada para la liberación prolongada de dicho interferón, que permite controlar el ciclo reproductivo en las hembras bovinas, mejorar la tasa de preñez y disminuir la muerte embrionaria. Esta nueva forma farmacéutica tiene la ventaja de que permite administrar el interferón en una sola dosis, sin la necesidad de aplicar constantemente de forma parenteral o intrauterina pequeñas dosis en los animales para lograr el mismo efecto deseado.

De esa manera, la administración de esta nueva forma farmacéutica junto con el uso de técnicas para la sincronización del celo y con métodos de reproducción asistida como la inseminación artificial, permite que aumente significativamente la probabilidad de gestación de los bovinos.

Todos los términos técnicos y científicos utilizados para describir la presente invención tienen el mismo significado entendido para una persona con conocimientos básicos en el campo técnico en cuestión. No obstante, para definir con más claridad el alcance de la invención, se incluye una lista de la terminología utilizada en esta descripción y su significado. La forma farmacéutica de la presente invención es un preparado para el control del ciclo reproductivo en vacunos. El término “vacuno” o “vacunos” para efectos de la presente invención se entiende como hembras de la especie Bos primigenius taurus o Bos taurus, también denominada vaca, vaquilla o novilla, de cualquier raza de dicha especie. No obstante, la presente invención no excluye el uso de la forma farmacéutica en hembras de bovinos o rumiantes tales como ovinos {Ovis orientalis), caprinos ( Capra aegagrus), bisontes ( Bison bisorí) u otros, preferentemente rumiantes domésticos relacionados con la ganadería.

La forma farmacéutica de la presente invención es una preparación de liberación modificada, específicamente una forma farmacéutica de liberación prolongada, retardada o lenta, la cual no libera el principio activo inmediatamente después de su administración, y dicha liberación es sostenida en el tiempo y lo suficientemente lenta como para extender el intervalo de dosificación en comparación a la forma farmacéutica de liberación convencional. La forma farmacéutica de la presente invención es un preparado para la administración del compuesto activo por vía intrauterina.

El término “partícula” se entenderá para efectos de la presente invención como partículas que tienen tamaños en la escala de los nanómetros y/o micrómetros. Preferentemente, estas partículas tienen sus tres dimensiones en la escala de los nanómetros y/o micrómetros. En una modalidad preferida de la invención, la forma farmacéutica incluye partículas con un diámetro entre 30 nm y 1 pm. La forma farmacéutica puede incluir partículas con una distribución de tamaño heterogéneo, es decir, que incluye una mezcla de partículas de diferentes diámetros entre 30 nm y 1 pm, o una distribución de tamaño homogéneo, es decir, que todas las partículas tienen diámetros similares, aunque de igual forma dentro del rango entre 30 nm y 1 pm.

Las partículas de la presente invención pueden tener cualquier forma, y tener una superficie regular o irregular. Además, las partículas pueden tener cualquier tipo de conformación, ya sea una nanocápsula o nanoesfera cuando dichas partículas tengan sus tres dimensiones en la escala de los nanómetros, o una microcápsula o microesfera cuando dichas partículas tengan sus tres dimensiones en la escala de los micrómetros. Se entiende que una nanocápsula o microcápsula consiste en una partícula que contiene un recubrimiento que envuelve un centro donde se encuentra la molécula de interés, y que una nanoesfera o microesfera consiste en una partícula que contiene la molécula de interés sin un recubrimiento o capas definidas. En una modalidad preferida de la invención, las partículas tienen un cuerpo esferoide, es decir, son esféricas o aproximadamente esféricas.

Las partículas de la presente invención comprenden preferentemente IFN-t bovino, llamado indistintamente en la presente invención interferón-tau, IFN-tau o IFN-t. No obstante, la presente forma farmacéutica también puede comprender IFN-t de cualquier otro mamífero rumiante tales como ovejas, cabras, bueyes, entre otros. El IFN-t utilizado en la presente invención puede ser aislado de la naturaleza, u obtenido mediante técnicas de producción de proteínas recombinantes. Preferentemente, el IFN-t de la presente invención es IFN-x recombinante. Esta proteína puede obtenerse en cualquier sistema de expresión conocido en el estado de la técnica tales como bacterias, levaduras, células de insectos, cultivos celulares, entre otros. Preferentemente, el IFN-x recombinante de la presente invención se obtiene en levaduras.

La forma farmacéutica comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de IFN-x. Dicha cantidad “terapéuticamente efectiva” se entiende como la dosis de compuesto activo necesaria para inducir el efecto terapéutico deseado cuando se administra apropiadamente en un individuo. En una modalidad preferida, la forma farmacéutica comprende entre 500 - 700 pg de IFN-x bovino, preferentemente 500 pg de IFN-x bovino recombinante. No obstante, la forma farmacéutica no está limitada a esta dosificación, y puede incluir una dosis mayor o menor en dependencia de lo requerido por los vacunos para obtener el efecto deseado.

Las partículas de la presente invención también comprenden quitosano. Este polímero es un polisacárido formado por unidades repetidas de glucosamina y N- acetil glucosamina. Es de origen natural, preparado mediante la desacetilación de la quitina presente principalmente en exoesqueletos de crustáceos e insectos. El término “quitosano” en la presente invención incluye todos los derivados de quitina o poli-N-acetil-D-glucosamina, incluyendo todas las poliglucosaminas y oligómeros de glucosaminas, quitosano de diferentes pesos moleculares y grados de desacetilación, y sales orgánicas o inorgánicas de quitosano farmacéuticamente aceptables. El grado de desacetilación del quitosano de la presente invención puede estar en el rango entre 40 y 97%, preferentemente entre 60 y 96%, más preferentemente en el rango entre 70 y 95%, aún más preferentemente en el rango entre 75 y 85%. El quitosano de la presente invención puede tener un peso molecular entre 10 y 400 kDa, preferentemente entre 30 y 300 kDa, más preferentemente entre 50 y 200 kDa. En una realización preferida de la invención, el quitosano es de bajo peso molecular (entre 50 y 190 kDa).

En una realización preferida de la invención, las partículas comprenden quitosano en una concentración entre 0,4 y 0,6% p/v, preferentemente en una concentración de 0,5% p/v.

La forma farmacéutica de la presente invención también comprende una base de hidrogel deshidratado. El término “hidrogel” se define como una red polimérica (donde el polímero puede ser natural o sintético) no fluida que se expande en todo su volumen por un fluido, donde dicho fluido es cualquier solución acuosa. Un polímero puede formar un hidrogel mediante, por ejemplo, agregación, coagulación, interacciones hidrofóbicas, entrecruzamientos, entre otros. El término “deshidratado” se refiere a la estructura del hidrogel a la cual se le removió el agua mediante cualquier procedimiento conocido en el estado de la técnica. Este término no es estricto y por tanto incluye hidrogeles parcialmente deshidratados. En consecuencia, un hidrogel deshidratado puede contener menos de 10% p/p de contenido de humedad por peso total del hidrogel deshidratado, preferentemente menos de 5% p/p, más preferentemente menos de 1% p/p, o aún más preferentemente menos de 0,1% p/p.

El hidrogel deshidratado de la presente invención comprende almidón. El almidón está compuesto por amilosa, que consiste en cadenas no ramificadas (o escasamente ramificadas) de a-D-glucopiranosas, y por amilopectina, que consiste en cadenas altamente ramificadas de a-D-glucopiranosas. La proporción entre estos ambos componentes varía según el origen del almidón. En una realización preferida, el almidón de la presente invención es preferentemente almidón derivado de la papa, que comprende aproximadamente entre 20 - 30% de amilosa. La forma farmacéutica de la presente invención comprende almidón en una concentración entre 7 y 9% p/v, preferentemente 8% p/v.

La forma farmacéutica de la presente invención puede tener cualquier forma, ya sea cúbica, cilindrica, cónica, esferoide, elipsoide, prismatoide, prismoide, o cualquier otra forma que se considere adecuada para su uso, con una superficie regular o irregular, sin limitación alguna, y de cualquier tamaño que se considere adecuado para su uso. En una modalidad preferida de la invención, la forma farmacéutica es sólida, como un comprimido o tableta con una forma cilindroide con una dimensión preferente entre 6 a 7 cm de largo y 0,3 a 1 ,2 cm de diámetro. Este rango de dimensiones es preferente para incorporar una de las dosis preferidas de la presente invención, pero no debe considerarse como una característica limitante de la forma farmacéutica de la presente invención.

Como la forma farmacéutica de la presente invención es sólida (base de hidrogel deshidratado), es de fácil manipulación para que pueda ser implantada en el útero de los vacunos mediante cualquier dispositivo que se utilice en medicina veterinaria para introducir sustancias por vía intrauterina. Por ejemplo, la forma farmacéutica puede introducirse con una aguja, varilla o inyector intrauterino como las que se utilizan para realizar la inseminación artificial. Una vez que la forma farmacéutica se introduce en el útero, el hidrogel se adhiere a las mucosas de la pared uterina, comienza a hidratarse y a liberar lentamente las partículas de IFN-t y quitosano al medio. A su vez, las partículas de quitosano también tienen propiedades mucoadhesivas y liberan al medio el IFN-t.

La forma farmacéutica de la presente invención también puede comprender otros excipientes farmacéuticamente aceptables. El término “excipiente” se refiere a cualquier sustancia accesoria que puede estar presente en la forma farmacéutica final. El término “excipiente” incluye vehículos, aglutinantes, diluyentes, disgregantes, lubrificantes, preservantes, entre otros.

La presente invención también comprende un método para preparar una forma farmacéutica como la que se describió previamente en este documento. Este método comprende los pasos de: a) obtener partículas que comprenden IFN-t bovino y quitosano al 0,5% p/v; b) dispersar dichas partículas de IFN-t bovino en una solución de tampón fosfato salino; c) obtener una base de hidrogel deshidratado que comprende almidón al 8% p/v; d) embeber dicha base de hidrogel deshidratado con la solución de tampón fosfato salino que contiene las partículas de IFN-x bovino hasta obtener un hidrogel hidratado; y e) liofilizar el hidrogel hidratado que comprende las partículas de IFN-x bovino. Las etapas a) y c) aquí mencionadas no requieren que se realicen como etapas consecutivas y pueden realizarse en cualquier orden de forma intercambiable, es decir, no es indispensable que primero se obtengan las partículas y luego se obtenga el hidrogel.

Para la etapa de obtención de las partículas que comprenden IFN-x bovino y quitosano, se utiliza una solución de quitosano en una concentración entre 0,4 y 0,6% p/v, preferentemente una concentración de 0,5% p/v en ácido acético al 1% v/v, y una solución que comprende IFN-x bovino que incluye, preferentemente, 500 pg de IFN-x bovino por mi. Luego, preferentemente, se agregan 500 pg de IFN-x por cada 10 mi de solución de quitosano y se agita esta mezcla. El quitosano que se utiliza en la solución tiene cualquiera de las características previamente descritas, aunque preferentemente se utiliza quitosano de bajo peso molecular (entre 50 y 190 kDa). En otra modalidad preferida de la invención, el IFN-x es IFN- x recombinante.

Las partículas de la presente invención pueden prepararse mediante cualquier metodología conocida en el estado de la técnica como, por ejemplo, mediante coacervación, nanoprecipitación, electropulverización, entre otros, sin limitarse a estas técnicas mencionadas. En una realización preferida de la invención, las partículas se obtienen mediante electropulverización, también llamada electrospray o atomización electrodinámica. Esta técnica consiste en la aplicación de un campo eléctrico alto a la aguja o boquilla a través de la cual se pulveriza la solución polimérica con el compuesto a encapsular, para obtener micro o nanopartículas. En este procedimiento el solvente se evapora y se obtiene un aerosol o polvo de partículas unitarias del tipo deseado. En el caso de la presente invención, la mezcla de la solución de quitosano con IFN-x se introduce en el equipo de electropulverización para obtener las partículas. Dichas partículas tienen un aspecto de tipo material fino en polvo.

Para la obtención de la base de hidrogel deshidratado, se utiliza una solución de almidón en una concentración entre 7 y 9% p/v, preferentemente al 8% p/v en agua destilada. Esta solución se calienta para inducir la gelificación del almidón. El término “gelificación” se refiere a la fase de transición que experimenta un polímero cuando aumenta su viscosidad y se transforma de un estado fluido a un material semisólido o gel. En una modalidad preferida de la invención, la solución de almidón se calienta a una temperatura entre 110 y 130°C, preferentemente a 121 °C, durante un periodo de tiempo entre 15 a 25 minutos, preferentemente 20 minutos.

Luego de la gelificación del almidón, ésta se somete a varios ciclos de congelación/descongelación, previo al proceso de deshidratación. Preferentemente, un ciclo de congelación/descongelación consiste en 12 horas de congelación y 12 horas de descongelación. La temperatura de congelación es entre -20°C y -30°C, y la temperatura de descongelación es a temperatura ambiente, entre 20°C y 25°C. Preferentemente, se realizan 3 ciclos de congelación/descongelación.

En una modalidad preferida de la invención, posterior al último ciclo de congelación/descongelación, al hidrogel hidratado se le retira el exceso de líquido y se congela el material nuevamente para realizar el proceso de deshidratación final. Esta etapa de congelación se realiza a una temperatura aproximada de -80°C ± 5°C, por un periodo de tiempo de al menos 1 hora, preferentemente al menos 2 horas. El proceso de deshidratación puede realizarse mediante cualquier técnica de deshidratación conocida en el estado de la técnica para este fin, aunque preferentemente la deshidratación se realiza mediante liofilización (secado en frío). En una modalidad preferida de la invención, el secado en frío del hidrogel se realiza durante un periodo de 48 horas.

Luego de obtener las partículas de IFN-t y quitosano, y el hidrogel de almidón deshidratado, se procede a dispersar dichas partículas en tampón fosfato salino para embeber dicho hidrogel deshidratado con esta solución. De esta forma, el hidrogel se rehidrata e incorpora las partículas dentro de su red polimérica. En una realización preferida, el hidrogel deshidratado se pone en contacto con la solución durante un periodo entre 16 y 48 horas, preferentemente 24 horas, a temperatura entre 20 y 28°C, preferentemente a temperatura ambiente (entre 20 y 25°C). Posteriormente, la solución no absorbida por el hidrogel se retira, y el hidrogel hidratado que incluye las partículas se deshidrata nuevamente. Dicha deshidratación se puede realizar mediante cualquier técnica conocida en el estado de la técnica. En el método de la presente invención se utiliza preferentemente liofilización para realizar el procedimiento de deshidratación final. En una modalidad preferida de la invención, el secado en frío del hidrogel que incluye las partículas se realiza a una temperatura de -65°C aproximadamente durante un periodo de al menos 18 horas, preferentemente 24 horas.

A continuación, se presentan ejemplos de realización de la invención, los cuales se han incluido con el objetivo de ilustrar la invención, sus modalidades preferidas y ejemplos comparativos, pero en ningún caso deben considerarse para restringir el alcance de la solicitud de patente, el cual solo está delimitado por el contenido de las reivindicaciones que aquí se adjuntan.

EJEMPLOS DE REALIZACIÓN

EJEMPLO 1. Encapsulación de IFN-t bovino recombinante

Se obtuvo el IFN-t bovino recombinante con el kit Pichia Expression Kit de Invitrogen™ para la expresión de proteínas recombinantes en la levadura Pichia pastoris. El IFN-t obtenido se purificó mediante cromatografía de Intercambio Catiónico utilizando una matriz Giga Cap S 650s y tampón de equilibrio con tampón citrato de sodio 50 mM a pH entre 4,3 y 4,6. Luego de la purificación, la muestra que se obtuvo como resultado de la elución se concentró 6 veces con un filtro de centrífuga Amicon ^® utilizando una membrana de 5 kDa de cut off. Posteriormente, se determinó la concentración de IFN-t mediante densitometría y se determinó que presentaba aproximadamente una concentración de 500 pg/ml de IFN-t. Esta muestra (60 mi aproximadamente) se utilizó para las pruebas de encapsulación.

El proceso de encapsulación se realizó mediante la técnica de electropulverización, utilizando el equipo Professional Lab Device, Doxa Microfluidics, España. Las condiciones de encapsulación, los parámetros utilizados y las concentraciones de los reactivos se determinaron mediante un proceso de estandarización en el equipo de electropulverización. Se fijaron las condiciones que garantizaran la obtención de un Cono de Taylor estable en el tiempo, con la correspondiente formación de aerosol y partículas, con la existencia de un goteo mínimo (FIG. 1).

Para la encapsulación de IFN-t se probaron los siguientes polímeros: polivinilpirrolidona (PVP), quitosano, y una mezcla PVP-quitosano. Para las partículas de PVP se utilizó PVP40 (Sigma-Aldrich, peso molecular promedio 40.000), disuelto a concentraciones entre 8 a 15% p/v en etanol o agua destilada, lo que permitió probar diferentes soluciones en el equipo de electropulverización. Se exploraron diversos parámetros para estandarizar el equipo para la formación de partículas tales como diferencias de voltaje entre 10-30 kV, y flujos de inyección entre 0,5 - 2 ml/h. En todas las condiciones y parámetros analizados las partículas de PVP obtenidas se disolvieron instantáneamente en contacto con PBS o agua destilada. Por tanto, la rápida hidratación de las partículas con este polímero hacía que el IFN-t se liberara en un tiempo menor al deseado.

Para obtener las partículas de PVP-quitosano se utilizó quitosano al 1% p/v en ácido acético 1 % v/v y PVP40 entre 5-10% p/v en agua destilada. Se exploraron diversos parámetros para estandarizar el equipo para la formación de partículas tales como diferencias de voltaje entre 10-30 kV, y flujos de inyección entre 0,5 - 2 ml/h. En todas las condiciones y parámetros analizados no se pudo obtener un modo cono-jet estable en el equipo de electropulverización, y por tanto las partículas no pudieron obtenerse de manera reproducible con esta técnica.

Para las partículas de quitosano, se preparó una solución de quitosano de bajo peso molecular (Sigma-Aldrich ^® ) al 0,5% p/v en ácido acético al 1% v/v, y se mantuvo en agitación a 400 rpm durante 2 horas. Luego, se agregaron 500 pg de IFN-t por cada 10 mi de solución de quitosano y se mantuvo en agitación a 400 rpm durante 30 minutos. Se cargó esta mezcla en una jeringa de 10 mi, y se llevó a la bomba para jeringas en el equipo de electropulverización, para la obtención de las partículas. Los parámetros utilizados en el equipo de electropulverización fueron: flujo de inyección 0,5 ml/h, distancia inyector-colector 28 cm, voltaje 20 kV. Se utilizó un colector plano y se permitió que las partículas se depositaran durante 6 horas. El material final en polvo se recolectó con una brocha. En la FIG. 2 se muestra una microtomografía del polvo obtenido, tomada por microscopía electrónica de barrido (SEM), que permitió observar la forma y tamaño de las partículas de quitosano que encapsulan el IFN-t. Se observa que dichas partículas son esféricas, con una dispersión de tamaños entre 30 nm y 1 pm de diámetro.

EJEMPLO 2. Síntesis de hidrogeles

Para la selección del hidrogel adecuado para la forma farmacéutica, se ensayaron 3 variantes de hidrogeles basados en polímeros: 1 ) almidón, 2) quitosano, y 3) almidón-quitosano. Además, se evaluó diferentes concentraciones de cada polímero.

Para la obtención del hidrogel de almidón, se preparó una solución de almidón al 8% p/v en agua destilada, que se sometió a calentamiento a 121°C durante 20 minutos aproximadamente para inducir la gelificación. La solución caliente se dejó enfriar sobre la mesa, y una vez que la solución estuvo tibia se depositó en moldes (placas de 96 pocilios de 6 mm de diámetro), que permanecieron al menos 1 hora a temperatura ambiente (25 ± 2°C). Luego, se procedió a realizar 3 ciclos de congelación/descongelación (temperatura de congelación entre -20 y -30°C, y temperatura de descongelación entre 20 y 25°C) de 12 horas por 12 horas, para garantizar la formación de la estructura tridimensional del hidrogel. Posterior al último ciclo de congelación/descongelación, se retiró el exceso de líquido en los hidrogeles y se congeló el material nuevamente, para proceder a su liofilización. Luego de dos horas de congelación, los hidrogeles fueron llevados a un equipo liofilizador para el secado en frío del material, durante 48 horas aproximadamente. Los hidrogeles secos fueron conservados en condiciones de baja humedad hasta su uso.

Para la obtención de los hidrogeles de quitosano, se disolvió quitosano de bajo peso molecular (Sigma-Aldrich ^® ) en concentraciones entre 1 y 2,5% p/v en ácido acético entre 0,5 y 1% v/v en agua destilada, durante 12 horas en agitación. Se procedió a calentar esta solución de forma similar a la descrita para la obtención del hidrogel de almidón. Posteriormente, la solución fue vertida en moldes y sometida a 3 ciclos de congelación-descongelación de 12 horas por 12 horas.

Para la obtención del hidrogel de almidón-quitosano, se usó quitosano de bajo peso molecular (Sigma-Aldrich ^® ) al 2% p/v, diluido en ácido acético 0,5% v/v en agua destilada. La relación quitosano-almidón se seleccionó en base a condiciones experimentales exploradas anteriormente y a las observaciones realizadas con los hidrogeles de cada polímero por separado. La solución de quitosano se mezcló con una solución de almidón al 5% p/v en agua destilada. El proceso de gelificación y congelación/descongelación se realizó de la misma forma a la descrita previamente.

Con el hidrogel de quitosano no fue posible obtener una estructura de red tridimensional, en ninguna de las concentraciones evaluadas. En el caso del hidrogel de almidón-quitosano, se obtuvo estructura de red tridimensional, no obstante, era más rígido que el hidrogel de almidón, lo cual no sería adecuado para una formulación cuya administración sería por vía intrauterina.

Respecto a los hidrogeles de almidón, estos mostraron una buena estructura de red tridimensional y una menor rigidez que el hidrogel de almidón-quitosano. En la FIG. 3 se puede observar los hidrogeles de almidón deshidratados conservados en un tubo de 50 mi, los cuales son de color blanco, y la estructura microscópica interna, obtenida por microscopía electrónica de barrido a un corte del hidrogel seco. En la FIG. 4 se observa lo mismo, pero con un aumento mayor que permitió medir algunos de los canales que se forman dentro del hidrogel deshidratado. Se pueden observar los canales de diámetros entre 100 - 200 pm, donde serán absorbidas e incorporadas las partículas de IFN-t y quitosano.

Finalmente, se decidió utilizar el hidrogel de almidón ya que mostró mayor resistencia a la deformación y mayor capacidad de absorción de fluidos.

EJEMPLO 3. Incorporación de las partículas de IFN-t y quitosano al hidrogel de almidón. Para la incorporación de las partículas de IFN-t y quitosano a loshidrogeles de almidón, se procedió a dispersar las partículas en PBS, mediante agitación suave. Los hidrogeles de almidón deshidratados se cortaron en fragmentos de 3 mm x 1 ,5 mm x 1 ,5 mm y se colocaron en contacto con la solución de PBS con las partículas dispersas durante 24 horas a temperatura ambiente (25 ± 2°C). De esta forma, el hidrogel deshidratado se rehidrató con esa solución, absorbiendo las partículas y capturándolas dentro de su red tridimensional. Pasadas las 24 horas, la solución no absorbida se retiró con una pipeta y los hidrogeles húmedos se liofilizaron durante 24 horas.

La FIG. 5 muestra el proceso de corte y rehidratación de los hidrogeles de almidón para la absorción de las partículas de IFN-t y quitosano. En la FIG. 5A se muestran dos trozos de hidrogel los cuales se cortaron en fragmentos iguales (FIG. 5B). En la FIG. 5C se observa la rehidratación del fragmento de hidrogel con la solución de PBS que contenía las partículas. En la FIG. 6 se puede apreciar las partículas de IFN-t y quitosano depositadas sobre las paredes de uno de los canales del hidrogel de almidón. Estas microfotografías se tomaron a los hidrogeles que absorbieron las partículas, después de ser deshidratados mediante liofilización.

EJEMPLO 4: Obtención de la forma farmacéutica para ensayos in vitro e in vivo.

Se realizó el proceso de obtención de partículas mediante el procedimiento descrito en el Ejemplo 1 . Las partículas cargadas con el IFN-t se acumularon hasta contar con un total de partículas con el equivalente de 2.500 pg de IFN-x, lo que permitiría utilizar una dosis de 500 pg de IFN-x en cada animal a tratar. La cantidad de partículas control negativo (sin IFN-x) se definió de manera equivalente al peso total de aquellas con IFN-x. Si bien la distribución de tamaños de las partículas no resulta altamente homogénea (FIG. 2), no influye en la vía de administración propuesta para los animales a nivel de absorción en mucosas. Esta heterogeneidad incide en la cantidad de material encapsulado por partícula, pero no influye en la dosis final a administrar a cada animal, ya que esta se calculó en base al polvo de partículas total obtenido para el mismo volumen de IFN-x en la mezcla. Para el experimento en animales se decidió sintetizar hidrogeles de almidón de aproximadamente 6 - 7 cm de largo y un diámetro de aproximadamente 1 cm, con el fin de que admitieran en su estructura la cantidad de partículas a administrar, y que pudieran ser introducidos sin dificultad a través del cuello uterino bovino. Antes de utilizarlos, se ajustó el diámetro de dichos hidrogeles de almidón al diámetro interior del inyector intrauterino (0,52 cm aproximadamente). El procedimiento utilizado fue el mismo descrito en el Ejemplo 2, para la obtención de hidrogeles de almidón al 8% p/v, con la diferencia del tipo de molde empleado. Una vez que se obtuvieron los hidrogeles, estos fueron liofilizados y conservados a temperatura ambiente (25 ± 4°C).

Los hidrogeles con la forma y tamaño necesarios se sometieron posteriormente a un proceso de absorción de las partículas de quitosano (con y sin IFN-t), para ser utilizados posteriormente en el experimento in vivo. Se prepararon un total de 10 hidrogeles por condición: 1) hidrogeles sin partículas; 2) hidrogeles con partículas de quitosano sin IFN-t; 3) hidrogeles con partículas cargadas con IFN-t. Las condiciones 2) y 3) se dejaron con las partículas en PBS durante 24 horas y luego se sometieron al proceso de liofilización. El material seco se conservó a temperatura ambiente (25 ± 2°C).

EJEMPLO 5. Cinética de liberación del IFN-t de las partículas de quitosano e incorporado al hidrogel de almidón, in vitro.

Para la realización de este experimento se prepararon tres grupos de hidrogeles:

- Grupo 1 : hidrogeles de almidón cargados con las partículas de IFN-t y quitosano;

- Grupo 2: hidrogeles cargados con IFN-t no encapsulado; y

- Grupo 3: hidrogeles cargados sólo con PBS (control negativo).

Los tres grupos se prepararon de la misma manera: los fragmentos de hidrogel deshidratado se sumergieron en PBS + partículas, PBS + IFN-t, o PBS solo, durante 24 horas. Después, se retiró el líquido en exceso y se liofilizaron los hidrogeles durante 24 horas.

Posteriormente, los fragmentos de hidrogel deshidratado obtenidos se sumergieron nuevamente en PBS, para estudiar la liberación del IFN-t retenido en el tiempo. Para simular las condiciones de estrés fisiológico, los tubos que contenían los fragmentos se colocaron en una incubadora a 37°C en agitación a 150 rpm, durante 23 días. Cada dos días se tomaron muestras que se centrifugaron a 10.000 rpm por 30 min y se cuantificó la concentración de proteína liberada en el sobrenadante mediante la técnica de microBCA.

Como resultado de la cuantificación de la proteína libre en el sobrenadante, se pudo constatar que la adsorción del IFN-t sin encapsular en los hidrogeles de almidón tiene un patrón de liberación continuo que comienza desde el día 0 y se extiende hasta el día 12, en el que se alcanza el valor máximo de proteína liberada. Sin embargo, en el caso del IFN-t encapsulado y adsorbido en el hidrogel, este patrón de liberación, aunque es similar, desplaza el inicio de liberación al día 4, y se extiende hasta el día 18, en el que se alcanza el máximo de IFN-t liberado (FIG. 7). Estos resultados evidencian que la forma farmacéutica que comprende partículas de IFN-t y quitosano incorporadas al hidrogel de almidón, permite prolongar o retrasar hasta 18 días la liberación del IFN-t, siendo superior al sistema que incorpora el IFN-t sin encapsular.

EJEMPLO 6. Evaluación de la actividad biológica del IFN-t liberado desde los hidrogeles, in vitro.

Se determinó el efecto antiviral o de protección del INF-t recombinante en las partículas de quitosano y liberado desde los hidrogeles de almidón. Esto realizó mediante el método de inhibición de efecto citopático provocado por el Mengovirus utilizando la línea celular HEp-2 (células de carcinoma laríngeo humano).

Primeramente, se cultivaron aproximadamente 40.000 células de la línea celular HEp-2 en placas de 96 pocilios en medio de cultivo DMEM suplementado con suero fetal bovino al 10%. Una vez lograda una confluencia celular del 80%, las células se cultivaron con distintos tiempos de liberación del IFN-t de las partículas con quitosano y distintas diluciones de estos utilizando como control el INF alfa humano comercial (utilizado como estándar), en medio DMEM suplementado con suero fetal bovino al 2% por 24 horas. Posteriormente, se adicionó el mengovirus, cuya dilución se realizó en DMEM sin suero en función de la cantidad total de células por el coeficiente infectivo del virus en la línea celular HEp-2 versus el título viral del lote utilizado. Las células con el virus se incubaron por un periodo de tiempo de aproximadamente de 15 a 20 horas en condiciones de cultivo hasta que un 100% del control positivo (con virus y sin interferón) presentó efecto citopático. Después, se realizaron 3 lavados con PBS (pH 7,4, NaC1 136 mM, Na2FIP04 7,8 mM, KH2PO4 1 ,5 mM) y luego se fijaron las células con metanol (100%) por 10 minutos. Posteriormente, se agregó el colorante cristal violeta 0,5% por 15 minutos en agitación a 200 rpm y se retiró el colorante residual con abundante agua destilada. Finalmente, se agregó 100 pL de ácido acético al 10% y se dejó en agitación por 30 min para realizar la lectura de la placa a una longitud de 590 nm.

Se utilizaron 6 diluciones del IFN humano comercial (1/2, 1/4, 1/8, 1/32, 1/64 y 1/128) para el ensayo al igual que para las muestras ensayadas de IFN-t liberado en el experimento del Ejemplo 5 antes descrito (Grupos 1 y 2). Estas diluciones del IFN alfa humano utilizado como estándar en el ensayo no fueron suficientes para observar una disminución en la protección de las células según las diluciones, manteniéndose protección hasta en la dilución 1/128. Por este motivo no se pudo en este experimento determinar el porcentaje de protección de las células HEp-2, en comparación del control de células sin virus y control de células con virus y sin interferón. No obstante, si se logró determinar que las muestras utilizadas en el método de inhibición de efecto citopático mostraron protección respecto a las células control negativo o células muertas para la dilución 1/2 (FIG. 8). En la FIG. 8, la línea negra en medio del gráfico representa el valor de absorbancia correspondiente a las células muertas (control negativo de células incubadas con el mengovirus o células muertas). Todo efecto por encima de este valor, corresponden a la inhibición del efecto citopático en las células provocado por la presencia de IFN-x en muestras, es decir, se observa protección. En este sentido, podemos notar que en todos los días ensayados se muestra un efecto protector del IFN-t sobre el cultivo respecto al control negativo de células muertas. Este efecto fue significativamente superior para el día 14 de liberación respecto al control de células muertas, observándose en el día 8 un aumento para la muestra del Grupo 2, respecto a la muestra del Grupo 1 (hidrogeles con partículas de IFN-t y quitosano) posiblemente debido a que se libera en mayor medida cuando el interferón no está encapsulado en los días iniciales. Sin embargo, a partir del día 14 se observa una tendencia a ser mayor el efecto en las muestras del Grupo 1 como era de esperar, aunque en los resultados se observa un efecto protector, pero sin diferencias significativas respecto al control de células muertas.

EJEMPLO 7: Inocuidad de la forma farmacéutica para la inseminación.

Para evaluar la inocuidad de la forma farmacéutica se realizó el siguiente protocolo experimental: se utilizaron 10 bovinos hembra de 3 años de edad, clínicamente sanas y no gestantes. Las hembras se sincronizaron 45 días previo a la utilización de la forma farmacéutica que contiene las partículas de quitosano e IFN-x en el hidrogel de almidón deshidratado (implante IFN-x), con la finalidad de determinar en este grupo el tiempo que transcurre en un ciclo estral con sincronización de celo y un ciclo estral sin sincronización de celo. Las hembras se sincronizaron con el protocolo estándar de Implante de Progesterona (Eazi-Breed ^® , Zoetis) con benzoato de estradiol (2 mi) al inicio (día 0), y el día 8 del protocolo se administró 0,5 mi de Cipionato de estradiol y 5 mi de prostaglandina (PGF2a), yse retiró el Implante de Progesterona. La manifestación del calor o estro en las hembras, se produjo 24 horas posterior al retiro del implante con una duración de 16 a 20 horas. El ciclo estral inmediato en las vacas sin haber desarrollado programa de sincronización (ciclo natural), tuvo una duración de 20 días con una manifestación del celo de 18 horas en promedio.

Luego de conocer para este grupo de hembras en estudio la duración de la fase del celo y el tiempo de ciclo estral, se procedió a desarrollar el programa de sincronización estándar para hembras bovinas en esquema a tiempo fijo. Este programa (FIG. 9), permitió la expresión del calor en las hembras el día 9, momento en el que se extrajo una muestra de sangre para la medición de progesterona sanguínea (nivel basal). Se utilizaron tres bovinos hembra como control sin uso de implante de IFN-t, y a las siete hembras restantes se les administró el implante IFN- t por vía intrauterina (cuernos uterinos). Dichos implantes tenían una dosis de 500 pg de IFN-x por vaquilla. Se realizaron extracciones seriadas de sangre para medición de progesterona sanguínea los días 7, 15, 19, 21 y 25 posterior al inicio del celo.

En la FIG. 10 se muestra la secuencia de utilización e implantación intrauterino del implante IFN-x el día 9 desde el inicio de la sincronización, que es coincidente con el celo de los animales. Este procedimiento es similar al que se utiliza para la inseminación artificial de los animales. En las FIGs. 10A, 10B, y 10C se muestra la inserción del implante IFN-x dentro del inyector intrauterino. En las FIGs. 10D, 10E y 10F se muestra la administración del implante IFN-x en los animales. Se observó que dichos implantes se administraron sin dificultad, utilizando el inyector intrauterino. Los animales control se sometieron al mismo proceso que se observa en las FIGs. 10D, 10E y 10F, pero no se insertó el implante con IFN-x. A todos los animales se les controlaron las variables fisiológicas y descarga vaginal durante las primeras 48 horas después de la aplicación del implante IFN-x. No se observó flujo inflamatorio en labios vulvares ni alteraciones de las variables fisiológicas de temperatura, frecuencia cardiaca y respiratoria en comparación a las hembras control. Esto demuestra la inocuidad de la forma farmacéutica que contiene las partículas de quitosano e IFN-x en el hidrogel de almidón deshidratado.

EJEMPLO 8. Evaluación del ciclo estral de bovinos hembra con el implante IFN-x.

Con el mismo protocolo descrito en el Ejemplo 7, se evaluó el ciclo estral de los bovinos hembra con implante con o sin partículas de IFN-x. La base del análisis para esta evaluación fue el tiempo requerido desde una expresión de calor o estro hasta la expresión siguiente y la relación de los niveles de progesterona medidos durante 25 días. Se debe tener en cuenta que una hembra no gestante debiera reducir sus niveles de progesterona a niveles básales, entre los días 15 a 17 de iniciado el estro, lo cual es determinante para la preparación de una nueva expresión de calor. Se tomaron muestras de sangre en los días 0, 15, 19, 21 , y 25, para evaluar los niveles de progesterona circulante. En el caso de las hembras control se observó manifestaciones de estro a los 20 días con un nivel de progesterona coincidente a un ciclo normal no gestante, donde el valor de referencia de progesterona el día 15 fue de 3,70 a 4,10 ng/ml (Tabla 1 ), que es un valor característico de hembras que han sufrido efectos luteolíticos y que presentarán un nuevo inicio de ciclo estral. El día 19 se determinó un nivel de 0,9 - 1 ,10 ng/ml que determina un nivel basal previo al calor en hembras, lo cual ocurrió el día 20 fenotípicamente, presentando el día 25 niveles ascendentes de progesterona que son característicos de un nuevo desarrollo de cuerpo lúteo activo que secreta progesterona en niveles ascendentes.

TABLA 1. Resultados de niveles de progesterona medidos serológicamente para evaluar la duración del ciclo estral post sincronización de 10 hembras bovinas, considerando el inicio del ciclo el día de calor o estro (T0), día 7 (T1), día 15 (T2), día 19 (T3), día 21 (T4) y día 25. En la Tabla 1 se observa en todos los animales que en el día 0 presentan niveles inferiores a 0,5 ng/ml de progesterona que se asocia a la manifestación de estro en las hembras bovinas.

La FIG. 11 muestra un gráfico de los valores indicados en la Tabla 1. Se puede observar que el día 7 del ciclo muestra un ascenso de los niveles de progesterona en los animales, asociado a la maduración del cuerpo lúteo con un rango entre 8,99 a 12,66 ng/ml. En el día 15 y 19 del ciclo estral los niveles de progesterona se mantienen en los animales tratados con el implante IFN-t, en comparación con el descenso de los niveles de progesterona en los animales control al día 15 del ensayo. El animal A1 el día 21 presentó una mayor reducción de los niveles de progesterona en comparación con el resto de los animales (A2 al A7), expresando el estro o calor el día 24 del ciclo. Los bovinos A2 a A7 presentaron el estro el día 26 del ciclo estral, que representa más de 5 días sobre lo observado en los animales control.

En consecuencia, la administración de interferón tau intrauterino (cuerpo uterino), no genera alteraciones fisiológicas en lo animales que se trataron durante todo el tiempo de duración del ensayo por lo que se demuestra la inocuidad del implante IFN-t para la inseminación. Las hembras sincronizadas sin inseminación artificial a las que se les administró el implante IFN-x, presentaron niveles de progesterona superior a los 4 días en comparación a las hembras control y expresiones de una nueva manifestación de calor entre 4 a 5 días superior a los controles, lo que establece una adecuada señal de mantenimiento del cuerpo lúteo por parte del IFN-x tal como se esperaba, con lo que se demuestra el efecto hormonal de la liberación retardada y sostenida de la forma farmacéutica en el útero de bovinos. Además, quedó demostrada la actividad antiluteolítica de la forma farmacéutica.

EJEMPLO 9. Producción de nuevos lotes del implante IFN-x.

Luego de una nueva producción y purificación de IFN-x recombinante, se usó una muestra concentrada a 1 pg/mI para la obtención de nuevos lotes de la forma farmacéutica que comprende partículas de quitosano con IFN-x en hidrogeles de almidón deshidratado. Las mezclas y soluciones que se utilizaron se prepararon según lo descrito en el Ejemplo 1 , y las condiciones del procedimiento de la electropulverización se ajustaron ligeramente en función de las características fisicoquímicas del nuevo lote de IFN-t recombinante, de la siguiente manera: flujo de inyección 0,5 ml/h, distancia inyector-colector 28 cm, diferencia de voltaje entre inyector-colector de 34 kV. Se usaron jeringas de 10 mi y el proceso se realizó de forma continua durante 8-14 horas. Las partículas obtenidas se retiraron del colector utilizando una brocha fina de cerdas de origen natural, y se almacenaron en tubos estériles, alejadas de la humedad, hasta su uso. Se trabajó de manera continua en la obtención de partículas suficientes para la inoculación de 20 vaquillas, con una dosis de 700 pg de IFN-t encapsulada para cada una.

Se obtuvieron nuevos hidrogeles de almidón mediante el procedimiento descrito en el Ejemplo 2, en una cantidad suficiente para obtener la forma farmacéutica necesaria para administrárselo a 20 vaquillas.

La obtención de la forma farmacéutica se realizó de la misma forma que la descrita en el Ejemplo 3.

Con este nuevo lote de implante IFN-t se realizaron los mismos ensayos descritos en el Ejemplo 8, pero aumentando la cantidad de hembras bovinas a 20. Los resultados obtenidos fueron similares a los previamente descritos, lo que demuestra que esta forma farmacéutica mantiene elevados los niveles de progesterona serológica a los 16 días después de su administración, y mantiene el cuerpo lúteo por tiempos superiores a los 19 días posteriores a la administración de esta forma farmacéutica.

26 almidón deshidratado. Las mezclas y soluciones que se utilizaron se prepararon según lo descrito en el Ejemplo 1 , y las condiciones del procedimiento de la electropulverización se ajustaron ligeramente en función de las características fisicoquímicas del nuevo lote de IFN-t recombinante, de la siguiente manera: flujo de inyección 0,5 ml/h, distancia inyector-colector 28 cm, diferencia de voltaje entre inyector-colector de 34 kV. Se usaron jeringas de 10 mi y el proceso se realizó de forma continua durante 8-14 horas. Las partículas obtenidas se retiraron del colector utilizando una brocha fina de cerdas de origen natural, y se almacenaron en tubos estériles, alejadas de la humedad, hasta su uso. Se trabajó de manera continua en la obtención de partículas suficientes para la inoculación de 20 vaquillas, con una dosis de 700 pg de IFN-t encapsulada para cada una.

Se obtuvieron nuevos hidrogeles de almidón mediante el procedimiento descrito en el Ejemplo 2, en una cantidad suficiente para obtener la forma farmacéutica necesaria para administrárselo a 20 vaquillas.

La obtención de la forma farmacéutica se realizó de la misma forma que la descrita en el Ejemplo 3.

Con este nuevo lote de implante IFN-t se realizaron los mismos ensayos descritos en el Ejemplo 8, pero aumentando la cantidad de hembras bovinas a 20. Los resultados obtenidos fueron similares a los previamente descritos, lo que demuestra que esta forma farmacéutica mantiene elevados los niveles de progesterona serológica a los 16 días después de su administración, y mantiene el cuerpo lúteo por tiempos superiores a los 19 días posteriores a la administración de esta forma farmacéutica.