Beschreibung

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Verbindung, umfassend mindestens eine chelatbildende Gruppe, mindestens einen Linker und mindestens einen Fluorophor, und Verfahren zur Erhöhung der Auflösung in der Fluoreszenzmikroskopie, für Multi- plexing in der Fluoreszenzmikroskopie und zum quantitativen Nachweis von Metallionen unter Verwendung dieser Verbindung.

Bislang nutzt die hochauflösende Einzelmoleküllokalisationsmikroskopie meist Licht-getriebene, also fotophysikalische Prozesse, die durch Einstrahlung einer zusätzlichen Wellenlänge oder Erhöhung der Bestrahlungsleistung kontrolliert werden. Die wichtigsten Prozesse sind Fotoaktivierung, wie bei der Photo Activation Localiza- tion Microscopy (PALM), oder reversible Fotoaktivierung/-deaktivierung, wie bei der Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (STORM). Zur Verbesserung der Schaltkinetik, von der die Qualität der Bilder abhängt, wird die Aktivierung der Fluoreszenzsonden auch thermisch erreicht (direct STORM - dSTORM), z.B. durch Zugabe von Puffern, die Reduktions- und Oxidationsmittel enthalten und den Farbstoff aus dem Auszustand (d.h. inaktiven Zustand) wieder in den Anzustand (d.h. aktiven Zustand) zurücktreiben.

In einem anderen Verfahren werden Proteine mit einer Antigenbindungsstelle modifiziert, die den Farbstoff Malachitgrün reversibel binden kann. Die Fluoreszenzemission des Farbstoffs ist in wässriger Lösung aufgrund der schnellen Diffusion und der Flexibilität seiner Struktur unterdrückt und wird erst sichtbar, wenn er an die Bindungsstelle bindet. Die Nutzung der reversiblen Bindung zur hochauflösenden Einzelmole- küllokalisationsmikroskopie konnte bereits experimentell gezeigt werden. In ähnlicher Weise funktioniert eine Methode, die auf der transienten Bindung fluoreszenzmar- kierter Oligonukleotide basiert (DNA-Paint). Hier werden die Zielproteine mit kurzen Oligonukleotiden markiert und die fluoreszenzmarkierten komplementären Stränge zugegeben. Hybridisiert ein markierter Gegenstrang an ein Oligonukleotid, erreicht man einen An-Zustand, während die frei diffundierenden Oligonukleotide nur zur Hintergrundfluoreszenz beitragen.

Weitere Sonden nutzen die Umlagerung eines bestimmten Fluoreszenzfarbstoffs zu einer spirozyklischen Verbindung, die keine Fluoreszenz aufweist. In diesem Zusammenhang konnte gezeigt werden, dass die Zyklisierung bei neutralem pH-Wert reversibel abläuft und zur Bildgebung mit hochauflösender Einzelmoleküllokalisati- onsmikroskopie geeignet ist.

Der Nachteil der herkömmlichen hochauflösenden Mikroskopie liegt in den fotophysikalischen Prozessen, die zusätzliche Lichtquellen und/oder höhere Bestrahlungs- leistungen erfordern. Hierdurch entstehen höhere technische Anforderungen: Die Bestrahlungsintensitäten müssen soweit optimiert werden, dass die Schaltkinetik der Fluoreszenzsonden im richtigen Bereich liegt und gleichzeitig soll die Photonenausbeute maximiert werden, um die Lokalisationsgenauigkeit und somit die erreichte Auflösung des Bildes soweit wie möglich zu erhöhen. Häufig liegen die zusätzlichen Anregungslinien im blauen oder ultravioletten Spektralbereich und führen zur Fotoschädigung der Proben, was bis zur Fixierung der lebenden Zellen führen kann.

Des Weiteren wird Multiplexing (d.h. parallele Detektions-/Abbildungskanäle) in der Fluoreszenzmikroskopie zurzeit standardmäßig über spektrale Eigenschaften der Farbstoffe erreicht. Am häufigsten wird in der Fluoreszenzmikroskopie das spektrale Multiplexing auf Basis unterschiedlicher Anregungs- und Detektionswellenlängen genutzt. Daneben nimmt auch die Bedeutung der Fluoreszenzlebensdauer, also der Lebensdauer des angeregten Zustande, immer mehr zu. Andere Eigenschaften, wie die Polarisationsanisotropie, sind eher von untergeordneter Bedeutung. Beim spektralen Multiplexing werden unterschiedliche Anregungswellenlängen genutzt, so dass unterschiedliche Lichtquellen, vor allem Laser, benötigt werden. Zusätzlich wird das von der Probe emittierte Licht mithilfe von dichroitischen Strahlteilern oder Prismen in Detektionsarme mit unterschiedlichen Wellenlängenbereichen geteilt. Aufgrund der Unvollkommenheit von Strahlteilern und Filtern und wegen der breiten Anregungsund Emissionsspektren der Farbstoffe kommt es allerdings immer wieder zu einem Übersprechen in die anderen Detektionskanäle (Crosstalk), das nur zum Teil durch Kalibrierung nachträglich korrigiert werden kann. Um Bilder unterschiedlicher Wellenlängen überlagern zu können, müssen diese zunächst auf chromatische Abberationen korrigiert werden. Mit spektralem Multiplexing erreicht man derzeit bis zu fünf verschiedene Kanäle. Das Multiplexing basierend auf der Fluoreszenzlebensdauer kann bei der gleichen Anregungs- und Emissionswellenlänge erfolgen - erfordert aber entweder gepulste oder intensitätsmodulierte Anregungsquellen (meist Laser) und eine zur Messung von Zeitspannen auf der Pico- bis Nanosekundenzeitskala ausgerichtete Detektionstechnik. Da die Fluoreszenzlebensdauer einer exponentiel- len Abnahme folgt und die charakteristischen Fluoreszenzlebensdauern von organischen Farbstoffen zwischen einer bis vier Nanosekunden (Zerfallskonstante) liegen, können damit maximal zwei, allerhöchstens drei verschiedene Kanäle abgebildet werden. Das Übersprechen zwischen den unterschiedlichen„Zeitkanälen" ist sehr groß und muss in jedem Fall korrigiert werden. Multiplexing-Varianten erlauben die simultane Abbildung der verschiedenen Kanäle und sind auch in lebenden Zellen einsetzbar. Sie können auch miteinander kombiniert werden.

Wesentliche Nachteile der herkömmlichen Multiplexingmethoden sind somit der Crosstalk und der höhere technische Aufwand bei den Anregungsquellen und der Detektionseinheiten.

Angesichts der oben dargelegten Probleme der herkömmlich verwendeten Methoden in der Fluoreszenzmikroskopie liegt der vorliegenden Erfindung demnach die Aufgabe zugrunde, eine Verbindung bereitzustellen, die eine Verbesserung der Auflösung in der Einzelmoleküllokalisationsmikroskopie in zielgerichteter Weise (Targeting) ermöglicht und mit der eine Erhöhung der bildgebenden Kanäle (Multiplexing) in der Fluoreszenzmikroskopie erreicht werden kann, ohne dass ein höherer technischer Aufwand erforderlich ist und Crosstalk verhindert werden kann. Diese Aufgabe wird durch die in den Ansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung gelöst.

Gemäß eines ersten Aspekts der vorliegenden Erfindung wird insbesondere eine Verbindung bereitgestellt, die mindestens eine chelatbildende Gruppe, mindestens einen Linker und mindestens einen Fluorophor, dargestellt durch die Formel (1 ), umfasst:

Formel (1 ),

wobei

jeweils eine der Gruppen R ¹ und R ² mindestens einen Fluorophor umfasst und die jeweils andere der Gruppen R ¹ und R ² mindestens einen Linker umfasst;

R ³ aus einer Gruppe, bestehend aus H, einer Ci- bis C3-Alkylgruppe, einer haloge- nierten Ci- bis C3-Alkylgruppe, einer Carboxygruppe, einer Carbonylgruppe, einer

Aminogruppe, einer Hydroxygruppe und einem Halogen, ausgewählt ist;

n eine natürliche Zahl von 0 bis 6 ist;

X eine Einfachbindung oder ein Substituent gemäß der Formel (X-1 ) ist;

Formel (X-1 ), wobei mehrere R ⁴ unabhängig voneinander vorliegen können und jeweils aus einer Gruppe, bestehend aus H, einer Ci- bis C3-Alkylgruppe, einer halogenierten Ci- bis C3-Alkylgruppe, einer Carboxygruppe, einer Carbonylgruppe, einer Aminogruppe, einer Hydroxygruppe und einem Halogen, ausgewählt sind; und

Y eine chelatbildende Gruppe gemäß Formel (Y-1 ) oder Formel (Y-2) ist

Formel (Y-1 ) Formel (Y-2), wobei

mehrere R ⁵ und R ⁶ unabhängig voneinander vorliegen können und R ⁵ und R ⁶ unabhängig voneinander aus einer Gruppe, bestehend aus H, einer Ci- bis C3-Alkylgruppe, einer halogenierten Ci- bis C3-Alkylgruppe, einer Carboxygruppe, einer Carbonylgruppe, einer Aminogruppe, einer Sulfonatgruppe, einer Phosphatgruppe, einer Hydroxygruppe und einem Halogen, ausgewählt sind; und

R ⁷ und R ⁸ unabhängig voneinander aus einer Gruppe, bestehend aus einem Pyridyl-, Pyrimidinyl-, Pyrazinyl-, Pyridizinyl-, Isoquinolinyl-, Imidazolyl-, Quinolyl-, Bis(phenantrolin)yl-, Carboxy-, Carboxyester-, und Kronenether-Rest, ausgewählt sind.

Die erfindungsgemäße Verbindung kombiniert die drei oben genannten Funktionen: Fluorophor, Linker und chelatbildende Gruppe. Über die chelatbildende Gruppe kann ein Metallion komplexiert werden, das die Fluoreszenz des Fluorophors beeinflusst, wodurch dieser entweder aktiviert oder deaktiviert werden kann. Somit erfolgt durch die Komplexbildung der erfindungsgemäßen Verbindung mit einem Metallion, abhängig von der Wahl des Metallions und des Fluorophors, eine intramolekulare Aktivierung oder Deaktivierung der Fluoreszenz. Zudem erlaubt der Linker eine direkte, zielgerichtete Markierung einer Probe mit der erfindungsgemäßen Verbindung. Des Weiteren ändert sich durch die Bindung des Metallions die Ladung der Sonde, was z.B. zur Erhöhung/Erniedrigung der Affinität spezifischer und unspezifischer Bindungen mit anderen Molekülen führen kann.

In der vorliegenden Erfindung wird die erfindungsgemäße Verbindung auch als„Fluoreszenzsonde" bezeichnet.

Erfindungsgemäß umfasst jeweils eine der Gruppen R ¹ und R ² mindestens einen Fluorophor und die jeweils andere der Gruppen R und R ² mindestens einen Linker. Dies bedeutet, wenn die Gruppe R ¹ mindestens einen Fluorophor umfasst, umfasst die Gruppe R ² mindestens einen Linker. Im umgekehrten Fall umfasst die Gruppe R ¹ mindestens einen Linker und die Gruppe R ² mindestens einen Fluorophor.

Unter dem Begriff „Fluorophor" wird erfindungsgemäß eine fluoreszierende Verbindung verstanden, die Lichtenergie einer bestimmten Wellenlänge absorbieren und darauf Licht mit einer längeren Wellenlänge emittieren kann. Der in der erfindungsgemäßen Verbindung verwendete Fluorophor unterliegt hierbei keiner besonderen Einschränkung. Dabei kann der Fluorophor aus einer Gruppe, bestehend aus Derivaten von Xanthen, Acridin, Cyanin, Cumarin, Rhodamin, Silizium-Rhodamin, Car- bopyronin, Bordipyrromethen, Perylen und Oxazin, ausgewählt sein. Bevorzugt sind Oxazin, Rhodamin und Carbopyronin aufgrund ihrer guten photophysikalischen Eigenschaften.

In der erfindungsgemäßen Verbindung liegt mindestens ein Fluorophor vor. Dabei kann bei einer Mehrzahl von Fluorophoren jeder Fluorophor aus der oben definierten Gruppe unabhängig von den anderen Fluorophoren ausgewählt werden. Beispielsweise können zwei Fluorophore eingesetzt werden, von denen einer von einem Metallion beeinflusst werden kann und der andere von diesem Metallion unabhängig ist. In diesem Fall kann der vom Metallion unabhängige Fluorophor für eine ratiometrische quantitative Analyse des Metallions eingesetzt werden. Gemäß einer spezifischen Ausführungsform weist die Verbindung der vorliegenden Erfindung genau einen Fluorophor auf. Darüber hinaus ist der Begriff „Linker" gemäß der vorliegenden Erfindung nicht besonders eingeschränkt und umfasst Molekülfragmente beziehungsweise funktionelle Gruppen, die die erfindungsgemäße Verbindung an mindestens eine andere Verbindung oder mindestens eine funktionelle Gruppe einer Verbindung koppelt. Dies dient dazu, die Fluoreszenzsonde an einen spezifischen Bestandteil einer Probe zu binden. Dabei kann der Linker beispielsweise über Aminreaktionen, Thiolreaktionen, Car- boxylatreaktionen, Hydroxyreaktionen, Aldehyd- oder Ketonreaktionen, Reaktionen von aktivem Wasserstoff, photochemische Reaktionen oder Cycloadditionen in die erfindungsgemäße Verbindung eingeführt sein (vgl.„Bioconjugation Techniques" von Greg T. Hermanson, 2. Edition, Academic Press 2008).

Die in einer Aminreaktion verwendeten Verbindungen oder funktionellen Gruppen zur Bereitstellung von Linkern sind nicht besonders eingeschränkt und können beispielsweise Isothiocyanate, Isocyanate, Acylazide, NHS-Ester, Sulfonylchloride, Aldehyde, Glyoxale, Epoxide, Oxirane, Carbonate, Aryliermittel, Imidoester, Car- bodiimide, Anhydride, Fluorphenylester, Hydroxymethylphosphinderivate oder guani- dinierte Amine sein.

Beispiele für funktionelle Gruppen oder Verbindungen, mit denen ein Linker durch eine Thiolreaktion bereitgestellt werden kann, sind Halogenacetyle, Alkylhalogenid- derivate, Maleimide, Aziridine, Acryloylderivate, Arylierungsmittel, Thioldisulfidaus- tauschmittel, wie beispielsweise Pyridyldisulfid, TNB-Thiol oder Disulfidreduktions- mittel, oder Vinylsulfonderivate. Zudem kann ein Linker mittels Thiolreaktion im Rahmen einer dativen Metall-Thiol-Bindung, von nativer chemischer Ligation oder von Cisplatin-Modifizierung von Methionin und Cystein in die erfindungsgemäße Verbindung eingeführt sein.

Zudem unterliegen die in einer Carboxylatreaktion verwendeten funktionellen Gruppen oder Verbindungen für die Bereitstellung eines Linkers keiner besonderen Einschränkung und können aus Diazoalkanen, Diazoacetylverbindungen, Car- bonyldiimidazolen oder Carbodiimiden ausgewählt sein. Die in einer Hydroxyreaktion benutzten funktionellen Gruppen oder Verbindungen zur Bereitstellung von Linkern sind nicht besonders eingeschränkt und können beispielsweise Epoxide, Oxirane, Carbonyldiimidazole, N.N'-Disuccinimidylcarbonate oder N-Hydroxysuccinimidylchlorformate, Halogenkohlenwasserstoffe oder Isocya- nate sein. Zusätzlich kann der Linker mittels Hydroxyreaktion durch Oxidation mit Periodat oder enzymatische Oxidation eingeführt sein.

Die durch Aldehyd- oder Ketonreaktionen bereitgestellten Linker unterliegen auch keiner besonderen Einschränkung und können mittels Reaktion von Hydrazinderiva- ten, Schiff-Base-Formation, reduktiver Aminierung oder Mannich-Kondensation bereitgestellt werden.

Zudem kann der Linker beispielsweise durch Reaktionen von aktivem Wasserstoff mit Diazoniumderivaten oder im Rahmen von Mannichkondensationen oder lodierungs- reaktionen erhalten werden.

Des Weiteren kann der Linker zum Beispiel durch photochemische Reaktionen von Arylaziden und halogenierten Arylaziden, Benzophenonen, Anthraquinonen, Dia- zoverbindungen, Diazirinderivaten oder Psoralen-Verbindungen bereitgestellt werden.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann der Linker durch Verwendung von Cycloadditionsreaktionen erhalten werden, wobei zum Beispiel eine Diels-Alder-Reaktion, eine Komplexbildung mit Boronsäurederivaten oder Klick-Chemie durch Cu ¹ -geförderte Azid-Alkin [3+2]-Cycloaddition verwendet werden kann.

Einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung entsprechend ist der Linker aus einer Gruppe, bestehend aus Biotin, Propargyl, Tetrazin, Methyl-Tetrazin, Halogen-Alkan (Halo-Tag-Ligand), Benzylguanin (SNAP-Tag-Ligand) und Derivaten davon, ausgewählt. In der erfindungsgemäßen Verbindung liegt mindestens ein Linker vor. Dabei kann bei einer Mehrzahl von Linkern jeder Linker aus der oben definierten Gruppe unabhängig von den anderen Linkern ausgewählt werden. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform weist die Verbindung der vorliegenden Erfindung genau einen Linker auf.

Die Probe, die mit dem Linker der erfindungsgemäßen Verbindung markiert werden kann, ist nicht besonders eingeschränkt. Beispielsweise kann sie ein Protein oder ein Antikörper sein. Die Bindung zwischen Linker und Probe kann dabei über eine kova- lente oder eine starke Affinitätsbindung, wie z.B. Biotin/Streptavidin, Antikörper, Fab-Fragmente oder Nanobodies, erfolgen.

Erfindungsgemäß ist der Substituent R ³ aus einer Gruppe, bestehend aus H, einer Ci- bis C3-Alkylgruppe, einer halogenierten Ci- bis C3-Alkylgruppe, einer Carboxyg- ruppe, einer Carbonylgruppe, einer Aminogruppe, einer Hydroxygruppe und einem Halogen, ausgewählt. Durch die Wahl des Substituenten R ³ lässt sich die Reaktivität der benachbarten Amino- und Carboxylgruppe steuern. Daher kann je nach erwünschter Reaktivität ein entsprechender Substituent aus der oben aufgeführten Liste verwendet werden. Bevorzugt ist R ³ aus H oder einer Ci- bis C3-Alkylgruppe ausgewählt. Gemäß einer spezifischen Ausführungsform ist R ³ H.

In der erfindungsgemäßen Verbindung ist n eine natürliche Zahl von 0 bis 6, beispielsweise 1 bis 4. Nach einer spezifischen Ausführungsform ist n 1 oder 4.

Der Substituent X ist in der erfindungsgemäßen Verbindung eine Einfachbindung oder ein Substituent gemäß der Formel (X-1 ).

Formel (X-1 ) Dabei können mehrere R ⁴ unabhängig voneinander vorliegen. Erfindungsgemäß ist R ⁴ aus einer Gruppe, bestehend aus H, einer Ci- bis C3-Alkylgruppe, einer haloge- nierten Ci- bis C3-Alkylgruppe, einer Carboxygruppe, einer Carbonylgruppe, einer Aminogruppe, einer Hydroxygruppe und einem Halogen, ausgewählt. Die Wahl des Substituenten R ⁴ ist bedingt durch die erwünschte Reaktivität der Verbindung. So können beispielsweise Substituenten verwendet werden, die einen Einfluss auf die Elektronendichte in der chelatbildenden Gruppe nehmen und damit die Bindungsaffinität, -kinetik und -Spezifität beeinflussen. Zu diesen Substituenten gehören z.B. eine Carboxygruppe, eine Carbonylgruppe, ein Halogen oder eine halogenierte Ci- bis C3-Alkylgruppe. Weiterhin kann über die Wahl des Substituenten die Löslichkeit der Fluoreszenzsonde beeinflusst werden. So kann beispielsweise eine Carboxygruppe, eine Aminogruppe oder eine Hydroxygruppe gewählt werden, wenn die Fluoreszenzsonde in einem polaren Lösemittel gelöst werden soll. Wird hingegen ein unpolares Lösemittel verwendet, so kann der Substituent zum Beispiel eine Ci- bis C3-Alkylgruppe sein. Zudem ist die Verwendung von Substituenten möglich, die zusätzliche Bindungsstellen für Metallionen bieten und somit die Zähnigkeit erhöhen wie z.B. eine Carboxygruppe oder eine Aminogruppe. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist R ⁴ aus H oder einer Ci- bis C3-Alkylgruppe ausgewählt. Gemäß einer spezifischen Ausführungsform ist R ⁴ H.

Der erfindungsgemäß verwendete Ausdruck„chelatbildende Gruppe" bezeichnet einen mehrzähnigen Liganden, der mindestens zwei Koordinationsstellen eines Metallions einnimmt. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kann die Verbindung mit einem Metallion einen Komplex bilden. Bevorzugt ist das Metallion aus einer Gruppe, bestehend aus Na ⁺ , K ⁺ , Mg ²⁺ , Ca ²⁺ , Zn ²⁺ , Cu ²⁺ , Ni ²⁺ , Fe ³⁺ , Mn ²⁺ und Co ⁺ , ausgewählt. Die Position, mit der die erfindungsgemäße Verbindung einen Komplex mit einem Metallion bilden kann, ist nicht besonders eingeschränkt, solange zumindest ein Teil der chelatbildenden Gruppe mit dem Metallion einen Komplex bildet.

Durch die Komplexierung eines Metallions mit der chelatbildenden Gruppe kann die Fluoreszenz des Fluorophors der erfindungsgemäßen Verbindung beeinflusst werden, wodurch dieser entweder aktiviert oder deaktiviert werden kann. Somit erfolgt durch die Komplexbildung der Verbindung mit einem Metallion, abhängig von der Wahl des Metallions und des Fluorophors, eine intramolekulare Aktivierung oder Deaktivierung der Fluoreszenz.

In der Verbindung der vorliegenden Erfindung ist Y eine chelatbildende Gruppe gemäß Formel (Y-1 ) oder Formel (Y-2).

Formel (Y-1) Formel (Y-2)

In Formel (Y-1) können mehrere R ⁵ und R ⁶ unabhängig voneinander vorliegen und sind unabhängig voneinander aus einer Gruppe, bestehend aus H, einer Ci- bis C3-Alkylgruppe, einer halogenierten Ci- bis C3-Alkylgruppe, einer Carboxygruppe, einer Carbonylgruppe, einer Aminogruppe, einer Sulfonatgruppe, einer Phosphatgruppe, einer Hydroxygruppe und einem Halogen, ausgewählt. Die Wahl der Substi- tuenten R ⁵ und R ⁶ ist bedingt durch die erwünschte Reaktivität der Verbindung. So können beispielsweise Substituenten verwendet werden, die einen Einfluss auf die Elektronendichte in der chelatbildenden Gruppe nehmen und damit die Bindungsaffinität, -kinetik und -Spezifität beeinflussen. Zu diesen Substituenten gehören z.B. eine Carboxygruppe, eine Carbonylgruppe, ein Halogen oder eine halogenierte Ci- bis C3-Alkylgruppe. Weiterhin kann über die Wahl des Substituenten die Löslichkeit der Fluoreszenzsonde beeinflusst werden. So kann beispielsweise eine Carboxygruppe, eine Aminogruppe, Sulfonatgruppe, Phosphatgruppe oder eine Hydroxygruppe gewählt werden, wenn die Fluoreszenzsonde in einem polaren Lösemittel gelöst werden soll. Wird hingegen ein unpolares Lösemittel verwendet, so kann der Substituent zum Beispiel eine Ci- bis C3-Alkylgruppe sein. Zudem ist die Verwendung von Substituenten möglich, die zusätzliche Bindungsstellen für Metallionen bieten und somit die Zähnigkeit erhöhen wie z.B. eine Carboxygruppe oder eine Aminogruppe. Gemäß einer spezifischen Ausführungsform der Formel (Y-1 ) sind R ⁵ und R ⁶ unabhängig voneinander aus H oder einer Ci- bis C3-Alkylgruppe ausgewählt.

In der obenstehenden Formel (Y-1 ) kann ein Komplex mit einem Metallion entweder über einen der Substituenten R ⁵ und R ⁶ und/oder über mindestens eins der Stickstoffatome des Bipyridylrings gebildet werden. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Komplexierung über die Stickstoffatome des Bipyridylrings. Einer alternativen Ausführungsform entsprechend wird eine Komplexbildung durch die Substituenten R ⁵ und R ⁶ an das Metallion erreicht. Insbesondere kann im Falle der Verwendung einer Carboxygruppe als R ⁵ und/oder R ⁶ Ca ²⁺ oder Zn ²⁺ durch die erfindungsgemäße Verbindung komplexiert werden.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform entspricht Y der Formel (Y-1-1 ).

Formel (Y-1-1 )

In einer spezifischen Ausführungsform der Erfindung hat Y eine Struktur der Formel (Y-1-1 ), ist n 1 , R ³ H und X eine Einfachbindung, so dass die erfindungsgemäße Verbindung eine Struktur gemäß der folgenden Formel (2) aufweist:

Formel (2)

In der erfindungsgemäßen Verbindung, welche die alternative Struktur der chelatbil- denden Gruppe mit der Formel (Y-2) aufweist, sind R ⁷ und R ⁸ unabhängig voneinander aus einer Gruppe, bestehend aus einem Pyridyl-, Pyrimidinyl-, Pyrazinyl-, Pyridizinyl-, Isoquinolinyl-, Imidazolyl-, Quinolyl-, Bis(phenantrolin)yl-, Carboxy-, Carboxyester-, und Kronenether-Rest oder Derivaten davon, ausgewählt. Dabei unterliegt die Auswahl von R ⁷ und R ⁸ aus der oben aufgeführten Gruppe keiner Einschränkung, insofern die beiden Substituenten R ⁷ und R ⁸ einen mehrzähnigen Liganden bilden können. R ⁷ und R ⁸ können dabei gleich oder voneinander verschieden sein. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind R ⁷ und R ⁸ gleich. Besonders bevorzugt sind R ⁷ und R ⁸ jeweils ein Pyridylrest.

Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung entspricht die cheiatbildende Gruppe Y der Formel (Y-2-1 ). Formel (Y-2-1)

In einer spezifischen Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verbindung entspricht Y der Formel (Y-2-1 ), ist n 1 oder 4, R ³ H und X eine Einfachbindung, so dass die Verbindung eine Struktur gemäß der folgenden Formel (3) oder (4) aufweist:

Formel (3) Formel (4)

Einer weiteren Ausführungsform entsprechend stellt die Erfindung einen Komplex bereit, der die zuvor genannte Verbindung und mindestens ein Metallion umfasst. Dabei ist das Metallion nicht besonders eingeschränkt, solange es mit der chelatbil- denden Gruppe der erfindungsgemäßen Verbindung einen Komplex bilden kann. Dabei soll die Bindung zwischen Metallion und chelatbildender Gruppe bevorzugt reversibel erfolgen. Durch eine solche Reversibilität kann ein schnelles An- und Ab- schalten der Fluoreszenzsonde erfolgen, was eine verbesserte Auflösung in der Fluoreszenzmikroskopie ermöglicht. Dabei kann die Fluoreszenzsonde anhand ihrer Fluoreszenzaktivität folgendermaßen unterteilt werden: Turn-On Sonden werden durch die Komplexbildung mit dem Metallion aktiviert und Turn-Off Sonden durch die Komplexbildung mit dem Metallion deaktiviert.

Die Ratenkonstanten für den Zerfall des Komplexes aus Metallion und Fluoreszenzsonde ist nicht besonders eingeschränkt, solange ein schnelles An- und Abschalten der Fluoreszenzsonde ermöglicht wird. Gemäß einer spezifischen Ausführungsform zerfällt der Komplex einer Turn-Off Sonde mit einer Ratenkonstanten von kd< 20 s ^_1 , bevorzugt von kd< 15 s und besonders bevorzugt von kd < 10 s ^_1 .

Bei einer Turn-On Sonde hingegen kann der Komplex mit einer Ratenkonstanten von kd = 0,01 bis 20 s ¹ , bevorzugt von kd = 0,05 bis 15 s ^_1 und besonders bevorzugt von kd= 0,1 bis 10 s ^_1 zerfallen. Sowohl bei Turn-Off als auch bei Turn-On Sonden kann die Assoziationsrate durch Wahl der Metallionenkonzentration willkürlich kontrolliert bzw. optimiert werden, die von den Eigenschaften der jeweiligen Sonden abhängen. Ein Vorteil von Turn-On Sonden besteht darin, dass der Anteil der ausgeschalteten Sonden leichter kontrolliert werden kann. Turn-Off-Sonden besitzen den Vorteil, dass die Schaltung lediglich spezifisch durch die Metall-Komplexierung erfolgen kann. Bei Turn-On-Sonden kann auch durch spontane thermisch getriebene Konformationsänderung eine kurzzeitige Schaltung in die fluoreszierende Form erfolgen.

Bevorzugt ist das Metallion aus der Gruppe, bestehend aus Na ⁺ , K ⁺ , Mg ²⁺ , Ca ²⁺ , Zn ²⁺ , Cu ²⁺ , Ni ²⁺ , Fe ³⁺ , Mn ²⁺ und Co ²⁺ , ausgewählt. Dabei führt die Komplexierung von Na ⁺ , K\ Mg ²⁺ , Ca ²⁺ und Zn ⁺ bevorzugt zu einem Anschalten, also Aktivieren, der Fluoreszenzsonde und die Komplexierung von Cu ²⁺ , Ni ²⁺ , Fe ³⁺ , Mn ²⁺ und Co ²⁺ zu einem Ausschalten, also Deaktivieren, der Fluoreszenzsonde. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist das Metallion aus Ca ²⁺ , Zn ²⁺ , Cu ²⁺ , Ni ²⁺ , Fe ³⁺ , Mn ²⁺ oder Co ²⁺ ausgewählt. Der Vorteil dieser Metallionen besteht unter anderem darin, dass sie einen stabilen Komplex mit beispielsweise EDTA bilden können. EDTA kann somit zu einer Lösung, die den Komplex gemäß der vorliegenden Erfindung enthält, hinzuge- geben werden, so dass das Metallion aus dem Komplex entfernt und in einem EDTA-Komplex gebunden wird, wodurch ein Schalten der Sonde ermöglicht wird. Wird also die Fluoreszenzsonde durch das Metallion aktiviert, d.h. ist sie im„angeschalteten" Zustand, wird sie durch die Zugabe von einem Komplexbildner, wie z.B. EDTA, deaktiviert, d.h.„ausgeschaltet", da der Komplexbildner das Metallion binden kann. Wird hingegen die Fluoreszenzsonde durch das Metallion deaktiviert, d.h. ist sie im„ausgeschalteten" Zustand, wird sie durch die Zugabe von einem Komplexbildner, wie z.B. EDTA, aktiviert, d.h.„angeschaltet", da der Komplexbildner das Metallion binden kann. Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das Metallion Cu ²⁺ , da dieses die Fluoreszenz der erfindungsgemäßen Verbindung besonders effizient deaktivieren kann.

Gemäß eines zweiten Aspekts stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung der Auflösung in der Fluoreszenzmikroskopie bereit, umfassend die Schritte:

(i) Bereitstellen einer zu untersuchenden Probe;

(ii) Markieren der Probe mit der vorstehend definierten erfindungsgemäßen Verbindung;

(iii) Einstellen von reversibler Komplexbildung zwischen einem Metallion und der chelatbildenden Gruppe der in Schritt (ii) verwendeten Verbindung durch Einstellen einer geeigneten Metallionenkonzentration;

(iv) Aufnehmen einer Vielzahl von Fluoreszenzbildern;

(v) Nachbearbeitung der Fluoreszenzbilder (Lokalisation einzelner Punktabbildungsfunktionen); und

(vi) Erzeugen eines hochaufgelösten Fluoreszenzbildes durch Kombination der Fluoreszenzbilder aus Schritt (v).

Unter dem Begriff „Anschalten" wird erfindungsgemäß„Aktivieren" einer Fluoreszenzsonde verstanden. Hingegen bedeutet der Begriff „Ausschalten" erfindungsgemäß„Deaktivieren" der Fluoreszenzsonde.

Der erfindungsgemäß verwendete Begriff „Markierung" oder„Markieren" kennzeichnet ein zielgerichtetes Binden der Fluoreszenzsonde an die zu untersuchende Probe mittels des Linkers.

Die zu untersuchende Probe ist nicht besonders eingeschränkt. Beispielsweise können Proteine oder Antikörper mit der erfindungsgemäßen Verbindung markiert werden.

Das Verfahren gemäß eines zweiten Aspekts der Erfindung kann beispielsweise für hochauflösende Einzelmoleküllokalisationsmikroskopie verwendet werden.

Im Schritt (ii) des Verfahrens wird die Fluoreszenzsonde unter Auswahl eines geeigneten Linkers zur spezifischen Markierung von Probenbestandteilen genutzt, z.B. durch kovalente Kopplung an Zielstrukturen, wie beispielsweise Proteine. Ein Beispiel für eine Markierung einer Zielstruktur mit der erfindungsgemäßen Fluoreszenzsonde ist in Figur 1 gezeigt.

Die Probe kann auf ein Mikroskop gebracht werden, das mit einem rauscharmen, bildgebenden Detektor, z.B. einem CCD- oder CMOS-Sensor, ausgestattet ist, mit dem die Punktabbildungsfunktionen einzelner Moleküle abgebildet werden können.

In Schritt (iii) des Verfahrens wird der zuvor definierte, erfindungsgemäße Komplex gebildet. Dabei wird die Metallionenkonzentration, bspw. die Cu ²⁺ -Konzentration, so eingestellt, dass die Fluoreszenzsonden durch reversible Reaktion mit den Metallionen zufällig an- und ausgeschaltet werden, wobei sich die Mehrzahl der Fluoreszenzsonden im Auszustand befindet, so dass sich die Punktabbildungsfunktionen der verbliebenen Sonden nur wenig überlagern.

Alternativ kann die Metallionenkonzentration auch so eingestellt werden, dass die Mehrzahl der Sonden angeschaltet ist. Dann besteht die Möglichkeit, die Intensitätsfluktuationen der einzelnen Sonden mit einer korrelativen Methode (SOFI - su- per-resolution fluctuation imaging) zu analysieren, die wiederum zu höher aufgelösten mikroskopischen Abbildungen führt. Das Prinzip dieser Schaltbarkeit ist für eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung in Figur 2 gezeigt.

Die Erzeugung der hochaufgelösten Aufnahme der Schritte (iv) bis (vi) kann beispielsweise nach bereits publizierten Verfahren (vgl. zum Beispiel M. Schwering et al., Angewandte Chemie International Edition, 2011 , 50, 2940-2945) erfolgen: Durch Anregung bei geeigneter Wellenlänge wird die Fluoreszenz der Sonden angeregt und das reversible Schalten der einzelnen Fluoreszenzsonden zeitaufgelöst in Bildstapeln aufgezeichnet. In jedem Bild werden die einzelnen Punktabbildungsfunktionen mittels bekannter Algorithmen mit hoher räumlicher Präzision lokalisiert und die Daten zur Rekonstruktion eines hochaufgelösten Bildes verwendet. Bei diesem Verfahren spielt der Abbildungsmodus keine Rolle, so dass beliebige in der hochauflösenden Ein- zelmoleküllokalisationsmikroskopie etablierte Verfahren genutzt werden können, angefangen mit der einfachen Abbildung einer Ebene, wie in der Tota- Ien-Internen-Reflektion-Fluoreszenz-Mikroskopie (TIRFM) oder der Lichtblattmikroskopie, oder Verfahren zur dreidimensionalen Abbildung, wie die Zwei-Ebenen-Abbildung (dual plane imaging), die Astigmatismus-Methode oder das Doppelhelix-Verfahren, um die wichtigsten Beispiele zu nennen.

Durch die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindung in dem Verfahren zur Erhöhung der Auflösung in der Fluoreszenzmikroskopie kann der Schaltprozess von der Anregung entkoppelt werden, weil dieser Prozess durch die Konzentration der Metallionen kontrolliert wird. Daher kann die Anregung auf die Maximierung der Photonenausbeute und/oder auf die Kompatibilität mit lebenden Zellen optimiert werden. Zudem sind in der erfindungsgemäßen Verwendung die technischen Anforderungen an die Mikroskope erheblich geringer als beispielsweise STORM oder PALM, da lediglich die Anregung der Fluoreszenzsonde und ein geeigneter Detektor erforderlich sind.

Gemäß eines dritten Aspekts stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren für Multi- plexing in der Fluoreszenzmikroskopie bereit, umfassend die Schritte:

(i) Bereitstellen einer zu untersuchenden Probe; (ii) Markieren der Probe mit der vorstehend definierten erfindungsgemäßen Verbindung (Marker A);

(iii) Markieren der Probe mit einem fluoreszenzfähigen Marker B;

(iv) Aufnahme von mindestens einem Fluoreszenzbild, wobei einer der Marker aktiviert ist und der jeweils andere Marker deaktiviert ist;

(v) Deaktivierung des aktivierten Markers und Aktivierung des deaktivierten Markers;

(vi) Aufnahme von mindestens einem Fluoreszenzbild; und

(vii) Überlagerung der Aufnahmen der Schritte (iv) und (vi).

In dem vorstehend definierten Verfahren gemäß eines dritten Aspekts der Erfindung kann die erfindungsgemäße Verbindung als Marker A zunächst zur spezifischen Markierung von Probenbestandteilen genutzt werden, z.B. durch kovalente Kopplung an Zielstrukturen wie beispielsweise Proteine.

Im Schritt (iii) dieses Verfahrens wird außerdem mindestens ein anderer Probenbestandteil mit einem fluoreszenzfähigen Marker B markiert. Dieser Marker B ist nicht besonders eingeschränkt. Er kann z.B. mit dem gleichen oder einem spektral ähnlichen Fluoreszenzfarbstoff wie der Marker A ausgestattet sein, der aber über einen anderen Mechanismus im Vergleich zur erfindungsgemäßen Verbindung geschaltet wird. Das Markieren der Probe mit diesem Marker B kann beispielsweise über eine kovalente Bindung erreicht werden. Der Schaltmechanismus des Markers B ist nicht besonders eingeschränkt und kann aus Fotozerstörung, Aktivierung der Fluoreszenz durch ein Metallion, Löschung der Fluoreszenz durch andere Reagenzien oder Aktivierung der Fluoreszenz durch andere Reagenzien ausgewählt sein. Durch die Kombination der erfindungsgemäßen Verbindung als Marker A, dessen Fluoreszenz chemisch durch das Einstellen der Metallionenkonzentration eingestellt werden kann, mit dem Marker B, dessen Fluoreszenz über einen anderen Mechanismus gesteuert werden kann, ist es möglich, die Anzahl der Abbildungskanäle im Multiplexing zu erhöhen.

In dem erfindungsgemäßen Verfahren für Multiplexing in der Fluoreszenzmikroskopie kann die Markierung der Probe mit den Markern A und B auch in umgekehrter Reihenfolge durchgeführt werden.

Zudem können zusätzliche Teile der Probe mit mindestens einem weiteren fluoreszenzfähigen Marker markiert werden, dessen Fluoreszenz, wie bei Marker B, über einen anderen Mechanismus als die des Markers A gesteuert werden kann. Dabei unterliegt dieser Marker denselben Einschränkungen wie Marker B hinsichtlich seiner Eigenschaften. Durch den Einsatz weiterer Marker kann die Anzahl der Abbildungskanäle erhöht werden.

Im Schritt (iv) wird mindestens ein Bild der Bestandteile aufgenommen, die mit dem aktivierten Marker A oder mit dem aktivierten Marker B markiert sind. Dabei kann der Marker A oder der Marker B bereits vor der Markierung der Probe aktiviert worden sein oder aktiviert werden, wenn er die Probe bereits markiert.

Die Fluoreszenzaktivität bzw. -inaktivität der erfindungsgemäßen Verbindung wird über die Bildung des zuvor definierten, erfindungsgemäßen Komplexes gesteuert. Dabei kann die Metallionenkonzentration so eingestellt werden, dass alle Marker A zunächst ausgeschaltet sind und keine Fluoreszenz zeigen, während die Marker B angeschaltet sind. Alternativ kann der Marker A zunächst aktiviert und der Marker B deaktiviert sein. Die Fluoreszenzdeaktivierung des Markers B kann z.B. durch Fotozerstörung oder durch Zugabe eines geeigneten Reagenzes erfolgen.

Nach der Bildaufnahme im Schritt (iv) erfolgt im Schritt (v) die Deaktivierung des aktivierten Markers und die Aktivierung des deaktivierten Markers.

Anschließend kann im Schritt (vi) bei identischer Anregung und Detektion mindestens ein zweites Bild aufgenommen werden, in dem der im Gegensatz zu Schritt (iv) andere Marker aktiviert ist.

Die beiden Bilder aus Schritt (iv) und (vi) der markierten Strukturen können vorteilhafterweise ohne Korrektur auf chromatische Aberrationen direkt zu einem„Mehr- farbenbild" im Schritt (vii) des erfindungsgemäßen Verfahrens überlagert werden.

Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens für Multiplexing in der Fluoreszenzmikroskopie sind unter anderem die Unabhängigkeit dieses Verfahrens von der Anregung und der Detektion und die Verwendbarkeit in jedem beliebigem Fluoreszenzmikroskop, auch in hochauflösenden Techniken, wie der strukturierten Beleuchtung (structured Illumination microscopy - SIM) oder Stimulier- ten-Emissions-Depletions-(STED-)Mikroskopie, mit denen höhere Auflösungen erreicht werden können.

Spektrales Multiplexing ist nahezu konkurrenzlos in der herkömmlichen Fluoreszenzmikroskopie. Allerdings ist die Implementierung in der STED-Mikroskopie eher aufwendig. Hier erreicht man zurzeit maximal drei spektral verschiedene Kanäle. Ein Vorteil der erfindungsgemäßen Fluoreszenzsonden ist, dass diese in Kombination mit dem spektralen Multiplexing eingesetzt werden können. Für herkömmliche Fluoreszenzmikroskope mit bis zu fünf spektralen Kanälen ist somit die serielle Abbildung von bis zu zehn Kanälen möglich, wenn lediglich ein Schaltprozess mit fünf verschiedenen Farbstoffen eingesetzt wird. Werden weitere Schaltprozesse hinzugenommen (z.B. mit anderen Metallionen), so kann pro Schaltprozess (ein Satz Fluoreszenzsonden mit fünf verschiedenen Farbstoffen) eine Steigerung um fünf weitere Abbildungskanäle erfolgen. Für die hochauflösende Methode der STED-Mikroskopie ist die Rechnung ähnlich: Ein Schaltprozess verdoppelt die Anzahl verschiedener Kanäle, jeder weitere Schaltprozess erhöht die Anzahl um die entsprechende Anzahl spektraler Kanäle. Insbesondere bei der STED-Mikroskopie können die schaltbaren erfindungsgemäßen Fluoreszenzsonden zur einfachen Implementierung von Multiplexing verwendet werden.

Gemäß eines vierten Aspekts stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum quantitativen Nachweis von Metallionen bereit, das die folgenden Schritte umfasst:

(i) Bereitstellen einer Lösung eines Metallions;

(ii) Zugabe der erfindungsgemäßen Verbindung;

(iii) Messen der Fluoreszenzaktivität; und (iv) Bestimmung der Metallionenkonzentration aufgrund der im Schritt (iii) gemessenen Fluoreszenzaktivität.

Im Schritt (ii) des oben definierten Verfahrens wird der erfindungsgemäße Komplex gebildet und dessen Fluoreszenzverhalten zur Bestimmung der Metallionenkonzentration genutzt. Dabei kann die erfindungsgemäße Fluoreszenzsonde als Indikator im Schritt (ii) direkt einer Lösung zugegeben werden. Durch Messen der Farbstoffabsorption und der Fluoreszenzintensität (Schritt (iii)) kann die Metallionenkonzentration anhand einer Kalibrierkurve der Intensität oder alternativ durch ratiometrische Messungen bei Sonden, die mehr als ein Fluorophor enthalten, im Schritt (iv) bestimmt werden (Homogene Analyse). Außerdem kann die erfindungsgemäße Fluoreszenzsonde an bestimmte Probenbestandteile kovalent über den Linker gekoppelt werden (Heterogene Analyse). Hierdurch kann die lokale Änderung der Metallionenkonzentration an diesen Bestandteilen verfolgt werden. Beide Verfahren funktionieren auch zeitaufgelöst - können also zur Bestimmung der Änderung der Metallionenkonzentration eingesetzt werden.

Gemäß eines fünften Aspekts stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindung zur Erhöhung der Auflösung in der Fluoreszenzmikroskopie, insbesondere für hochauflösende Einzelmoleküllokalisationsmikrosko- pie, für Multiplexing in der Fluoreszenzmikroskopie oder für den quantitativen Nachweis von Metallionen bereit. Dabei können die erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden.

Die Figuren zeigen:

Figur 1 : Beispiel für eine Markierung einer Zielstruktur mit der erfindungsgemäßen Verbindung unter Verwendung der etablierten Streptavidin-Biotin-Bindung.

Figur 2: Schematische Darstellung der Komplexierung von Kupferionen durch ein Ausführungsbeispiel der erfindungsgemäßen Verbindung und das reversible„Schalten" der Fluoreszenz im Ensemble-Experiment durch Zugabe von Cu ²⁺ bzw. EDTA. Figur 3: Synthesebeispiel einer künstlichen Aminosäure, die beispielsweise als Grundgerüst der erfindungsgemäßen Verbindung dienen kann.

Figur 4: Funktionalisierung der in Figur 3 dargestellten künstlichen Aminosäure mit einem Fluorophor und einem Linker. Die linke Spalte zeigt beispielhaft das Prinzip der Funktionalisierung, während die mittlere Spalte verschiedene Fluorophore und die rechte Spalte unterschiedliche Linker aufführt, die für die Funktionalisierung der künstlichen Aminosäure benutzt werden können.

Figur 5: Beispielhafte Syntheseroute auf dem Weg zu einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verbindung. Die Synthese geht von kommerziell erhältlichen Aminosäuren aus und liefert verschieden funktionalisierte Derivate, i) Picolylbro- mid-Hydro-bromid, 5 M Natronlauge, Raumtemperatur, 5 Stunden; ii) R-NFfe, HBTU, DIPEA, DMF, Raumtemperatur, 12 Stunden; iii) Trifluoressigsäure, Raumtemperatur, 5 Stunden.

Figur 6: Beispielhafte Syntheseroute zum fertigen, mit Atto565 und Biotin markierten Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Fluoreszenzsonde: i) Atto565-Azid, Natriumascorbat, CuS04, DMF, 40 °C, 3 Stunden; ii) Trifluoressigsäure, Raumtemperatur, 5 Stunden; iii) Biotinamidohexansäure-NHS, DIPEA, DMF, 40 °C, 3 Stunden. Die Aufreinigung nach Schritt i) und iii) erfolgt mittels HPLC.

Figur 7: Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Fluoreszenzsonde markiert mit Atto565-Azid und Biotinamidohexansäure.

Figur 8: TIR-Fluoreszenzaufnahmen (561 nm Anregung) einer HeLa-Zelle, deren Mikrotubuli über Anti-a-Tubulin mit einer Verbindung des Synthesebeispiels 1 unter Verwendung des Fluorophors Cy3B und dem Linker PEGe-Biotin markiert wurden. Figur 8a) zeigt die Summierung der Bildfolgen der Zelle und Figur 8d) einen Ausschnitt daraus. Figuren 8b) und 8e) zeigen entsprechende hochaufgelöste Bilder, die auf der Basis der Bildfolge mit dem Programm rapidSTORM 2.21. (vgl. Experimen- talteil) rekonstruiert wurden. In der Überlagerung des Mikrographen und der Rekonstruktion (Figur 8c)) und in dem Intensitätsquerschnitt (Figur 8f)) lässt sich eine Verbesserung der Auflösung um das ca. Vierfache erkennen.

Figur 9: Fluoreszenzspektren von Verbindung 1b des Synthesebeispiels 2 bei steigender Kupferkonzentration (Figur 9a)). Zeitaufgelöste Messung der Fluoreszenzintensität. Nach Zugabe von CuSÜ4 erfolgt eine sehr schnelle Fluoreszenzlöschung. Zugabe von EDTA stellt die Fluoreszenz wieder vollständig her (Figur 9b).

Figur 10: Mit Verbindung 1a des Synthesebeispiels 2 markierte menschliche He- La-Zellen. Verwendet wurden anti-Tubulin Primärantikörper, anti-Maus-Biotin Sekundärantikörper, Streptavidin und 1a (Figur 10a)). Wiederholte Zugabe von CuSÜ4 und EDTA ermöglichte mehrere Schaltzyklen (Figur 10b)).

Figur 11 : Markierung von T-Zell-Rezeptorclustern mit 1a des Synthesebeispiels 2. Oben: Fixierte Jurkat T-Zelle, gefärbt mit Atto488-Phalloidin (Figur 11a)) und mit an- ti-pZAP70-Biotin, Streptavidin und 1a (Figur 11b)); Mitte (Figur 11c)): Zeitserie der markierten Zelle in Anwesenheit von CuSÜ4. Die Sonden 1a sind nicht alle zur gleichen Zeit angeschaltet, sondern„blinken" dynamisch; Unten (Figur 11d)): Überlagerung des herkömmlichen Summenbildes (nebelartige Strukturen) mit dem hochaufgelösten Bild aus der Software rapidStorm 2.21 (punktförmige Strukturen). Die Strukturen des hochaufgelösten Bildes (die Punkte in Figur 11d)) sind deutlich feiner. Entlang der Linie eingezeichnet in Figur 11 d) ist das Intensitätsprofil dargestellt (Figur 11e; die punktförmigen Strukturen entsprechen der inneren Kurve und die nebelartigen Strukturen der äußeren Kurve)). Zu erkennen ist die deutlich gesteigerte Auflösung durch Verwendung der„blinkenden" Sonden und der Lokalisationssoftware anhand der Kurven in Figur 11e): Die schmale Kurve des Intensitätsprofils resultiert aus dem hochaufgelösten Bild, welches mithilfe der vorliegenden Erfindung erhalten wurde, und die breite Kurve ergibt sich mittels einer konventionellen Methode.

Figur 12: Immunofluoreszenz-Aufnahmen von regulär markierten Mikrotubuli in fixierten Heia-Zellen. Färbung durch regulär fluoreszenzmarkierte Anti-a-Tubulin Anti- körper (ohne schaltbare Sonde). Figur 12a): Einzelbild und zugehöriger Intensitätsquerschnitt durch ein Filament; Figur 12b): Summenbild über eine Zeitserie von 2000 Aufnahmen; Figur 12c): Rekonstruiertes Bild der rapidSTORM-Software aus der gleichen Zeitserie - mangels Schaltprozess kann keine hochauflösende Information generiert werden.

Figur 13: Chemisches Multiplexing: menschliche HeLa-Zellen wurden wie in Figur 10 beschrieben mit anti-Tubulin, anti-Maus-Biotin, Streptavidin und 1a des Synthesebeispiels 2 markiert. Zusätzlich wurde mit Atto565-Phalloidin markiert. Zugabe von CuS04 schaltet 1a aus, so dass nur das mit Phalloidin markierte Aktin sichtbar ist (Figur 13a)). Nach Photozerstörung der ersten Struktur und Zugabe von EDTA kann die mit 1a markierte Struktur wieder„angeschaltet" und abgebildet werden (Figur 13b)). Aus beiden Bildern kann ein Falschfarbenbild erzeugt werden, obwohl beide Strukturen mit demselben Farbstoff markiert waren (Figur 13c)).

Die nachstehenden Beispiele dienen als weitere Erläuterungen der vorliegenden Erfindung, ohne dass diese darauf beschränkt ist.

Beispiele

Die Implementierung der drei funktionellen Gruppen, d.h. des Fluorophors, des Linkers und der chelatbildenden Gruppe, kann zum Beispiel auf der Basis einer künstlichen Aminosäure gelöst werden. Alternativ können auch kommerziell erhältliche Aminosäuren als Ausgangsverbindung für die Synthese der erfindungsgemäßen Verbindung dienen.

I. Synthese der Fluoreszenzsonde

1 ) Svnthesebeispiel 1 ausgehend von einer künstlichen Aminosäure

Als Basis für die erfindungsgemäße Verbindung kann eine künstliche Aminosäure dienen, welche bereits eine Bindungsstelle für ein Metallion, insbesondere Cu ²⁺ , trägt und an der Carboxy- und der Aminofunktion jeweils mit einem Fluorophor bzw. einem Linker funktionalisiert werden kann. Als künstliche Aminosäure kann zum Beispiel BpyAla benutzt werden, deren Synthese in Drienovskä et al., Chem. Sei. 2015, 6, 770-776, aufgezeigt ist. Die Reaktion ist in Figur 3 dargestellt.

Die in Figur 3 gezeigte künstliche Aminosäure enthält bereits eine chelatbildende Gruppe und kann, wie in Figur 4 dargestellt, zudem mit einem Fluorophor und einem Linker funktionalisiert werden. Die linke Spalte der Figur 4 zeigt beispielhaft das Prinzip der Funktionalisierung, während die mittlere Spalte verschiedene Fluorophore und die rechte Spalte unterschiedliche Linker aufführt, die beispielsweise für die Funktionalisierung der künstlichen Aminosäure benutzt werden können.

2) Synthesebeispiel 2 ausgehend von einer kommerziellen Aminosäure

Alternativ zu künstlichen Aminosäuren können auch kommerziell erhältliche Aminosäuren als Basis für die erfindungsgemäße Verbindung dienen. Ein Beispiel für die Synthese von Ausführungsbeispielen der erfindungsgemäßen Verbindung ist in den Figuren 5 bis 7 dargestellt. Wie in Schema 1 der Figur 5 gezeigt, können zwei kommerziell erhältliche, an der α-Aminogruppe BOC-geschützte, Aminosäuren (BOC-Lysin, BOC-Amino-Alanin) verwendet werden, um daran Bis(pyridin-2-ylmethyl)amin) als chelatbildende Gruppe aufzubauen (Verbindung 2a,b). Dies erfolgt in 5M Natronlauge mit 2-(Bromomethyl)pyridin-Hydrobromid für fünf Stunden bei Raumtemperatur mit nachträglicher Aufreinigung auf Kieselgel. Daraufhin wird die freie Carboxygruppe verwendet, um verschiedene Funktionalitäten einzuführen, wie z.B. eine Propargylgruppe (3a,b), ein H-Tetrazin (4a,b) sowie ein Chloralkan-Linker (Halo-Tag, (synthetisiert nach Los et al., ACS Chemical Biology 2008, 6, 373-382.), 5a,b). Die Funktionalitäten werden jeweils als Amine eingesetzt und durch //7-s/ ^' fi/-Aktivierung der Carbonsäure mittels HBTU in trockenem DMF mit DIPEA als Base für 12 Stunden bei Raumtemperatur eingeführt. Die Propargylgruppe kann beispielsweise zur Farbstoffmarkierung via kupferkatalysierter Click-Reaktion mit Azid-markierten Farbstoffen oder Azid-markierten Linkern benutzt werden, Tetra- zin- sowie Chloralkan können der spezifischen Markierung von Zielstrukturen in Zel- len dienen.

Ausgehend von Verbindung BOC-3a,b wird die Synthese von Verbindung 1a,b durchgeführt (vgl. Schema 2 in Figur 6). Dazu wird zuerst die Alkingruppe in Gegenwart von CuSO4 und Natriumascorbat mit einem Äquivalent des Azid-Derivats eines Farbstoffs in DMF bei 40 °C für drei Stunden zur Reaktion gebracht und mittels HPLC aufgereinigt (Gerät„HP Series 1100" der Firma Agilent, Säule„Hypersil ODS" der Firma Säulentechnik Knauer, Laufmittel 1 : H2O, 10 mM Triethylammoniumacetat, Laufmittel 2: 75% Acetonitril, 25% H2O, 10 mM Triethylammoniumacetat; linearer Gradient in 30 Minuten von 100% LM1 nach 100% LM2). Danach wird das Amin mit Trifluoressigsäure für fünf Stunden bei Raumtemperatur entschützt und mit einem Biotinaminohexansäure-NHS-Aktivester in trockenem DMF mit DIPEA als Base für drei Stunden bei Raumtemperatur gekoppelt. Nach Aufreinigung mittels HPLC liegt die fertige Verbindung vor (vgl. Schema 3 in Figur 7).

Verwendete Chemikalien:

BOC-Lysin-OH Sigma-Aldrich 5456

(A/-BOC-yß-amino)-Alanin-OH Sigma-Aldrich 662836

2-(Bromomethyl)pyridin-Hydrobromid Sigma-Aldrich 491047

HBTU Sigma-Aldrich 12804

DMF, wasserfrei Sigma-Aldrich 227056

DIPEA Sigma-Aldrich 387649

Natriumhydroxid pSigma-Aldrich 221465

Ascorbinsäure Sigma-Aldrich A5960

Propargylamin Sigma-Aldrich P50900

Tetrazin-Amin, HCO2H-Salz SICHEM SC-1190

CuSO4-Lösung 0.1 M Sigma-Aldrich 35185

Trifluoressigsäure Carl Roth P088.1

Biotin-Amidohexansäure-NHS Sigma-Aldrich B2643

Atto565-Azid Atto-Tec ad565-101

Acetonitril Sigma-Aldrich 34998

Triethylamin Sigma-Aldrich T0886 Essigsäure Sigma-Aldrich A6283

II. Anwendunqsbeispiele in der Fluoreszenzmikroskopie 1 ) Hochauflösende Fluoreszenzmikroskopie Beispiel 1 :

Die Bildfolgen in a) bis f) in Figur 8 zeigen beispielhaft TIR-Fluoreszenzauf nahmen (561 nm Anregung) einer HeLa-Zelle, deren Mikrotubuli mit einer Verbindung gemäß des Synthesebeispiels 1 markiert wurden. Die Zellen wurden in Kammerdeckgläsern mit 8 Kammern (LabTek der Firma Nunc) mit 150 pm dickem Glasboden über Nacht zu je 10000 Zellen/cm ² anwachsen gelassen. Danach wurden sie mit 3.7% Formaldehyd und 0.05% Triton X-100 in PBS für 10 Minuten bei 37 °C fixiert und permeabi- lisiert und danach viermal gründlich mit PBS gewaschen. Danach erfolgte eine Blockierung mit Inkubationspuffer (eine Lösung von 2% BSA in PBS) für eine Stunde, gefolgt von der Inkubation der Antikörpers, verdünnt in Inkubationspuffer zu etwa 10 pg/mL. Nach jedem Inkubationsschritt wurde viermal gründlich mit PBS gewaschen. Nach Inkubation von 10 pg/mL Streptavidin in Inkubationspuffer für 20 Minuten wurde dreimal gründlich mit PBS gewaschen und mit BpyAla (Synthesebeispiel 1 ) gekoppelt an Cy3B und Biotin (siehe Figur 4), in einer Konzentration von 10 ⁹ M in Inkubationspuffer für 30 Minuten inkubiert. Nach viermaligem Waschen mit PBS wurden die Zellen an einem TIRF/Weitfeld-Mikroskop (Nikon „TiE" Mikroskop, Nikon „TIRF-Illuminator", Nikon „Apo TIRF 100x Oil 1.49" Objektiv, TOPTICA „MLE-LFA" Laserquelle, Anregung bei 561 nm, Cairn Research„OptoSplit III" Strahlteiler, Andor„iXon+ 897 Ultra" emCCD-Kamera, Filter von AHF Analysentechnik) im TIRF-Modus untersucht. Die fixierten und markierten Zellen befanden sich in einem PBS-Puffer, der 16 μΜ CuS04 enthielt, so dass die Sonden durch reversible Bindung und Dissoziation von Cu ²⁺ Ionen in unregelmäßigen Abständen zwischen einem flu- oreszenten und einem gelöschten Zustand schalteten. Die Bildfolgen (4000 Bilder, 25 ms/Bild, Anregungsleistung 1 ,1 mW) wurden einerseits summiert, um ein herkömmliches TIR-Fluoreszenzbild (Figur 8a)) der Zelle bzw. einen Ausschnitt (Figur 8d)) daraus zu erhalten. Außerdem wurde die Bildfolge mit dem Programm rapidSTORM 2.21 aus der Arbeitsgruppe Sauer (Wolter et al. Nature Methods, 9 1040-1041 (2012); http://www.super-resolution.biozentrum.uni-wuerzburg.de/rese arch_topics/rapidstorm, 12.7.2016) analysiert, um daraus entsprechende hochaufgelöste Bilder zu rekonstruieren (Figur 8b) und 8e)). In der Überlagerung des Mikrographen und der Rekonstruktion (Figur 8c)) und in dem Intensitätsquerschnitt (Figur 8f)) lässt sich eine Verbesserung der Auflösung um das ca. Vierfache erkennen.

Die Bildverarbeitung erfolgte mit Origin 9.1 und mit den frei verfügbaren Programmen ImageJ Ver. 1.50g und InkScape Ver. 0.91.

Verwendete Reagenzien und Antikörper:

CuSO4-Lösung, 0.1 M Sigma-Aldrich 35185

EDTA, Dinatriumsalz Sigma-Aldrich E4884

Paraformaldehyd Sigma-Aldrich 158127

Triton X-100 Fluka 93426

PBS, ohne CaCb und MgCb, steril Sigma-Aldrich D8537

Rinderserumalbumin (BSA) Fluka 05471 anti-a-Tubulin, monoklonal, Maus Sigma Aldrich T8203 anti-Maus-Biotin, polyklonal, Ziege Sigma-Aldrich B7264

Streptavidin, rekombinant Sigma-Aldrich S0677

Beispiel 2: Fluoreszenzverhalten von 1b bei Zugabe von CuSO4-Lösung

Fluoreszenzspektren von Verbindung 1b des Synthesebeispiels 2 bei steigender Kupferkonzentration (Figur 9a)). Es wurden die Fluoreszenzspektren einer 500 nM Lösung von 1b in PBS (schwarz) und nach Zugabe kleiner Äquivalente einer Cu- SO4-Lösung bis zu einer Konzentration von 8.3 μΜ (grau) aufgenommen (Spektro- meter„Cary Eclipse" der Firma Agilent). In einer zeitaufgelösten Messung der Fluoreszenzintensität wurde eine 500 nM Lösung von 1b in PBS vermessen. Nach Zugabe von einem Äquivalent CuSO4 erfolgt eine schnelle Vermischung mittels Pipette, was zu einer sehr schnellen Fluoreszenzlöschung führt. Zugabe von einem Äquivalent EDTA stellt die Fluoreszenz wieder vollständig her (Figur 9b)). Die Verbindung 1b des Synthesebeispiels 2 zeigt gute Fluoreszenzlöschung durch Cu ²⁺ -lonen. Die Löschung erfolgt sehr schnell und reversibel. Durch Zugabe eines Komplexbildners wie EDTA kann die ursprüngliche Fluoreszenz wiederhergestellt werden (vgl. Figur 9).

Der Biotin-Linker von 1a,b kann zur Konjugation an biotinylierte Antikörper verwendet werden. Dazu wurden, wie in Figur 10 gezeigt, menschliche HeLa-Zellen mit an- ti-Tubulin, anti-Maus-Biotin, Streptavidin und 1a markiert. Die Zellen wurden in Kammerdeckgläsern mit 8 Kammern (LabTek der Firma Nunc) mit 150 pm dickem Glasboden über Nacht zu je 10000 Zellen/cm ² anwachsen gelassen. Danach wurden sie mit 3.7% Formaldehyd und 0.05% Triton X-100 in PBS für 10 Minuten bei 37 °C fixiert und permeabilisiert und danach viermal gründlich mit PBS gewaschen. Danach erfolgte eine Blockierung mit Inkubationspuffer (eine Lösung von 2% BSA in PBS) für eine Stunde, gefolgt von der Inkubation der Antikörper, verdünnt in Inkubationspuffer zu etwa 10 pg/mL. Nach jedem Inkubationsschritt wurde viermal gründlich mit PBS gewaschen. Nach Inkubation von 10 pg/mL Streptavidin in Inkubationspuffer für 20 Minuten wurde dreimal gründlich mit PBS gewaschen und 1b in einer Konzentration von 10" ⁹ M in Inkubationspuffer für 30 Minuten inkubiert. Nach viermaligem Waschen mit PBS wurden die Zellen an einem TIRF/Weitfeld-Mikroskop (Nikon„TiE" Mikroskop, Nikon „TIRF-Illuminator", Nikon „Apo TIRF 100x Oil 1.49" Objektiv, TOPTICA „MLE-LFA" Laserquelle, Anregung bei 561 nm, Caim Research„OptoSplit III" Strahlteiler, Andor„iXon+ 897 Ultra" emCCD-Kamera, Filter von AHF Analysentechnik) im Weitfeld-Modus untersucht. Deutlich sind die Mikrotubuli in der Zelle erkennbar. Wiederholtes Zugeben von CuS04 und EDTA schaltet 1a an und aus. Dieser Vorgang ist mehrmals wiederholbar. Für das Experiment wurde die Probe auf dem Mikroskop fixiert. Die Zugabe von CuS04 (100 μΜ) und EDTA (1 ni ) erfolgte mittels Eppendorf-Pipetten. Nach jedem Schaltzyklus (CuS04 und EDTA) wurde mit Hilfe von Spritzen die Flüssigkeit mehrmals vorsichtig entfernt und durch PBS ersetzt. Danach erfolgte der nächste Schaltzyklus. Die Bildverarbeitung erfolgte mit den frei verfügbaren Programmen ImageJ Ver. 1.50g und InkScape Ver. 0.91.

Verwendete Reagenzien und Antikörper:

CuS04-Lösung, 0.1 M Sigma-Aldrich 35185 EDTA, Dinatriumsalz Sigma-Aldrich E4884 Paraformaldehyd Sigma-Aldrich 158127 Triton X-100 Fluka 93426

PBS, ohne CaCfc und MgCfc, steril Sigma-Aldrich D8537 Rinderserumalbumin (BSA) Fluka 05471 anti-a-Tubulin, monoklonal, Maus Sigma Aldrich T8203 anti-Maus-Biotin, polyklonal, Ziege Sigma-Aldrich B7264 Streptavidin, rekombinant Sigma-Aldrich S0677

Beispiel 3:

In Figur 11 ist die Verwendung des chemischen Schalters für die hochaufgelöste Lokalisationsmikroskopie demonstriert. Sie zeigt die Markierung von T-Zell-Rezeptorclustern mit 1a des Synthesebeispiels 2. Hier wurde pZAP70 in Re- zeptorclustern fixierter Jurkat T-Zellen markiert. Die Zellen wurden in Kammerdeckgläsern (8 Kammern LabTek der Firma Nunc, 150 pm Glasdicke) zu je 5000 Zellen/cm ² auf die Glasoberfläche gesetzt, die vorher mit Poly-L-Lysin und an- ti-CD3-Antikörpern beschichtet wurden (siehe Abraham et al., J.lmmunol. 2012, 189, 1898-1910.). Nach fünf Minuten wurde vorsichtig mit 3.7% Formaldehyd und 0.05% Triton X-100 in PBS fixiert, mit PBS gewaschen und mit 10 pg/mL anti-pZAP70-Biotin Antikörpern in Inkubationspuffer (2% BSA in PBS) für eine Stunde inkubiert. Danach wurde dreimal mit PBS gewaschen und 10 pg/mL Streptavidin sowie 10 ^-10 M At- to488-Phalloidin in Inkubationspuffer für 20 Minuten inkubiert. Nach gründlichem Waschen mit PBS wurden 1a in Inkubationspuffer bei einer Konzentration von 10" ⁹ M für 30 Minuten inkubiert und erneut gründlich mit PBS gewaschen. Die Sonden blinken in Anwesenheit von 50 μΜ CuS04 in PBS. Von den so präparierten Zellen wurden Videos von 5000 Bildern bei einer Belichtungszeit von 20 ms bei 561 nm Anregung aufgenommen. Diese wurden mit dem Lokalisationsalgorithmus (rapidStorm 2.21) verarbeitet. In Figur 11 d) ist die Überlagerung des hochaufgelösten Lokalisa- tionsbildes (punktförmige Strukturen) mit dem herkömmlichen Summen-Fluoreszenzbild (nebelartige Strukturen) dargestellt. Zusätzlich ist die Kontur der betrachteten Zelle in weiß dargestellt. Ein Cluster ist hervorgehoben. Hier sieht man deutlich die etwa 3-4-fach höhere Auflösung des Lokalisationsansatzes in Figur 11 e). Die Bildverarbeitung erfolgte mit Origin 9.1 und mit den frei verfügbaren Programmen ImageJ Ver. 1.50g und InkScape Ver. 0.91.

Verwendete Reagenzien

poly-L-Lysin Sigma-Aldrich P8920 anti-Human-CD3 BD Biosciences 347340

PBS, ohne CaCfc und MgCte, steril Sigma-Aldrich D8537

Rinderserumalbumin (BSA) Fluka 05471 anti-Phospho-ZAP70-Biotin Bioss bs3479r

Streptavidin, rekombinant Sigma-Aldrich S0677

CuSO4-Lösung, 0.1M Sigma-Aldrich 35185

Atto488-Phalloidin Atto-Tec ad488-81

Verqleichsbeispiel ohne schaltbare Sonde

Immunofluoreszenz-Aufnahmen von regulär markierten Mikrotubuli in fixierten Heia-Zellen (vgl. Figur 12). Färbung durch regulär fluoreszenzmarkierten TMR-Anti-a-Tubulin Antikörper (ohne schaltbare Sonde). Präparation der Zellen, Mikroskopsetup, Analysesoftware analog zu Beispiel 1. Figur 12a): Einzelbild und zugehöriger Intensitätsquerschnitt durch ein Filament; Figur 12b): Summenbild über eine Zeitserie von 2000 Aufnahmen; Figur 12c): Rekonstruiertes Bild der ra- pidSTORM-Software aus der gleichen Zeitserie - mangels Schaltprozess kann keine hochauflösende Information generiert werden.

2) Multiplexinq Beispiel 4:

Chemisches Multiplexing wurde an einer doppelt markierten Zelle demonstriert (vgl. Figur 13). Dabei wurde das Aktin-Cytoskelett mit Atto565-Phalloidin und Mikrotubuli mit 1a des Synthesebeispiels 2 gefärbt. HeLa Zellen wurden zu 10000 Zellen/cm ² in ein Kammerdeckglas (LabTek, 8 Kammern der Firma Nunc) gesetzt und über Nacht anwachsen gelassen. Dann wurde mit 3.7% Formaldehyd und 0.05% Triton X-100 in PBS für 10 Minuten fixiert und danach gründlich viermal mit PBS gewaschen. Die Zellen wurden dann mit anti-a-Tubulin (10 g/mL) in Inkubationspuffer (2% BSA in PBS) für eine Stunde inkubiert und gründlich mit PBS gewaschen. Danach wurde anti-Maus-Biotin zu 10 pg/mL in Inkubationspuffer für eine Stunde inkubiert und danach wieder gründlich mit PBS gewaschen. Dann wurde Streptavidin (10 pg/mL) in Inkubationspuffer für 20 Minuten inkubiert, gefolgt von gründlichem Waschen mit PBS und Inkubation von 1a (10 ^-9 M) und Atto565-Phalloidin (10- ¹⁰ M) in Inkubationspuffer für 30 Minuten. Nach mehrmaligem Waschen mit PBS wurden die Zellen in 50 μΜ CuS04-Lösung in PBS an einem TIRF/Weitfeld-Mikroskop (vgl. Beispiel 2) bei Anregung mit 561 nm mikroskopiert. In Anwesenheit von CuSÜ4 ist 1a ausgeschaltet und nur das Aktin ist sichtbar und wird abgebildet (Figur 13 a)). Nach Photozerstörung und Zugabe von 200 μΜ EDTA in PBS sind die Mikrotubuli sichtbar (Figur 13 b)). Das daraus generierte Falschfarbenbild in Figur 13 c) ist bei nur einer Detektionsfarbe entstanden, es handelt sich beide Male um den Farbstoff Atto565. Die Bildverarbeitung erfolgte mit den frei verfügbaren Programmen ImageJ Ver. 1 .50g und InkScape Ver. 0.91.

Verwendete Reagenzien und Antikörper:

Paraformaldehyd Sigma-Aldrich 158127

Triton X-100 Fluka 93426

PBS, ohne CaCfe und MgCte, steril Sigma-Aldrich D8537

Rinderserumalbumin (BSA) Fluka 05471 anti-a-Tubulin, monoklonal, Maus Sigma Aldrich T8203 anti-Maus-Biotin, polyklonal, Ziege Sigma-Aldrich B7264

Streptavidin, rekombinant Sigma-Aldrich S0677

Atto565-Phalloidin Atto-Tec ad-565-81

CuS04-Lösung, 0.1 M Sigma-Aldrich 35185

EDTA, Dinatriumsalz Sigma-Aldrich E4884