Sistema de encapsulación y liberación controlada de piretroides de prolongada eficacia en el tiempo contra moscas de la fruta.

SECTOR DE LA TÉCNICA

La presente invención se refiere al campo de los compuestos insedicidas y repelentes de naturaleza piretroide, y más concretamente a sistemas de administración de dichos compuestos basado en partículas de sílice mesoporosa, que prolongan su eficacia una vez aplicados.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Las moscas de las frutas constituyen una de las plagas más dañinas que afectan a la agricultura Mediterránea. Esta plaga, endémica en el área mediterránea pero que afecta a los cultivos fruticolas de todo el mundo, afecta tanto a las frutas dulces que maduran a finales de primavera y durante el verano, como a las variedades tempranas y tardías de cítricos. Su incidencia se ha agravado todavía más en los últimos años como consecuencia de la expansión del cultivo de variedades extratempranas de cítricos, que se manifiestan extremadamente sensibles al ataque de este parásito, al alcanzar su plena maduración durante el periodo inicial del otoño, cuando frecuentemente se registran elevadas temperaturas. La European and Mediterranean Plant Protection Organization indicaba, en un articulo de 2011 “ Ceratitis capitata is the most serious pest for citrus and many other fruits in the majority of countries with a warm, Mediterranean, tropical or subtropical climate “[EPPO Bulletin [0250-8052] 2011 vol.:41 iss: 3 pág.: 340 Ceratitis capitata ]. Las pérdidas económicas que produce esta plaga son cuantiosas, ya que la fruta picada es totalmente inviable comercialmente, aparte de los problemas que causa, tanto en el almacén, como durante el transporte y la distribución. Por otra parte, la Ceratitis está considerada como plaga de cuarentena en algunos países terceros y, consecuentemente, la presencia de huevos o larvas en los frutos puede causar el rechazo de partidas enviadas a estos palees y provocar severas restricciones en nuestras exportaciones a los mismos. [Primo Millo, Eduardo. Agricultura [0002-1334] Año: 2004 lss: 867 pág.:790 -703. Plan Valendano de actuación contra la mosca de la fruta (Cerátitis capitatan Weidemann) campaña 2004]. La tendencia seguida para el control de esta plaga ha sido la de utilizar cada vez más cantidad de sustandas activas o sustituirlas por otras con mayor actividad. El uso indiscriminado de estas sustandas activas derivó en problemas ambientales y de resistencia a los prindpk» activos (Couso-Ferrer, F.; Arouri Rabah; Barniz, B.; Perora, N.; Corvara, A.; Navarro-Uopis, V.; Cata fiera, P; Hemández-C raspo, P and Griego F. (2011). Cross-Resistance to Insecticides in a Malathton-Resistant Strain of Ceratitis capitata (Díptera: Tephritidae). Journal of Economic Entomology. 104(4):1349-1358. doi: 10.1603/EC11082), lo que obligó a regular su empleo prevaleciendo la prevención frente a la erradicación. La escasa biodegradablidad de los plaguicidas, su alto poder de bloacu mutación en la cadena trófica, su taxiddad en aire, suelo y agua y la intoxicación humana por contacto epidérmico o por ingestión, han derivado en normativas estrictas de uso en muchos palees. Aún asi, la utilización de estos bioddas continúa siendo necesaria, lo que implica la búsqueda de nuevas moléculas con propiedades más respetuosas con el medio ambiente o el desarrollo de procesos o técnicas que permitan dirigir el impacto de estos bioddas sobre tas plagas, minimizando los efectos secundarios en el medio ambiente. Por todo ello, no es de extrañar que uno de los grandes retos sea la búsqueda de métodos alternativos asociados al control biológico de determinadas poblaciones sin interferir en el equilibrio natural de tas especies implicadas. Las nuevas técnicas de control de pobladones buscan ante todo la espedfiddad del tratamiento por lo que es fundamental diferenciar correctamente la especie de Insecto de otros.

Las moscas de la fruta estén entre los insectos más dificiles de combatir debido a:

- Su facilidad de adecuación al entorno. La mosca al encontrar una zona hábil y sin competencia de otros individuos de la misma espade, lo coloniza en plazos de tiempo muy pequeños.

- Su elevado potencial reproductor (de 75 a 150 huevos entre 5 o 6 veces a lo largo de su vida, aproximadamente 1 mes.) - Su capacidad de volar, que les facilita una segura vía de escape de las zonas tratadas.

- Su rápido desarrollo de resistencia a los plaguicidas.

• La reducción del número de materias activas autorizadas.

- La carencia de un formulado biocida adecuado para combatirla.

Por ello se ha desarrollado una nueva técnica denominada manejo integral de plagas (IPM), que combina diversos métodos de control: Controles físicos mediante barreras, trampas, etc., controles biológicos mediante uso de patógenos, microorganismos, hongos, nematodos, e insectos parasitoides entre otros, que actúan a modo de depredadores del agente causal de la plaga, y finalmente los controles químicos (Romero F. Manejo integrado de plagas. Las bases, los conceptos y su mercantilización, 2004, Universidad Autónoma Chapingo, México, pp. 1-37).

Las piretrinas son uno de los uno de los insecticidas más seguros que existen, ya que ataca al sistema nervioso de los insectos, pero no afecta a los demás animales y plantas (Wandahwa P , Ranst EV., Damme PV. Pyrethrum (Chrysanthemum dnerariaefolium Vis.) cultivation ¡n West Kenya: origin, ecological conditions and management. Industrial Crops and Products, 1996; 5: 307-322). Sin embargo, las piretrinas se degradan fácilmente en presencia de la luz y por tanto pierden muy rápido la eficacia una vez se aplican. Los piretroides son compuestos orgánicos sintéticos derivados de las piretrinas antes mencionadas (Hill IR., Leahey JP, The pyrethroid insecticides, 1985, Taylor & Francis, Londres (U.K), pp.151-247). Debido a su baja toxicidad para mamíferos y humanos, los piretroides han tenido una gran aceptación y están teniendo gran aplicación mundial. Sin embargo, son tóxicos para algunos organismos como abejas, peces, y otros organismos acuáticos. En la actualidad, los insecticidas piretroides, que químicamente se clasifican como ésteres, son los más utilizados a nivel mundial, ya que presentan buenas propiedades insecticidas, con un amplio intervalo de aplicación. Siguen siendo bastante inestables al aire y a la luz, por lo cual su utilización en la agricultura tiene algunas limitaciones.

La introducción de procesos de microencapulación está permitiendo desarrollar productos más seguros para el trabajador y el medioambiente. La encapsulación se puede llevar a cabo en forma de moléculas, partículas sólidas o glóbulos líquidos, para dar lugar a partículas de tamaño micrométrico. De este modo, el producto resultante de este proceso tecnológico recibe la denominación de “micropartlculas" (sistema capsular), “microcápsulas" (sistema matricial) o "microesféras” (indistintamente, sólo se diferencian por su forma esférica), sistemas que se diferencian en su morfología y estructura interna, si bien todos ellos presentan como característica común su tamaño de partícula, el cual es siempre inferior a 1mm. Cuando las partículas poseen un tamaño inferior a 1 μm, el producto resultante del proceso de microencapsulación recibe la denominación de “nanoesferas", “nanoparticulas" o "nanocápsulas” La variedad de materiales que pueden emplearse en microencapsulación se va ampliando gradualmente a medida que surgen nuevos biomateriales y se perfilan nuevas aplicaciones (Zerrer R. Morschhauser R. Sustancias biológicamente activas, microencapsuladas, que contienen un polímero en forma de peine, soluble en agua o dispersable en agua. 2 237 668 T3. Patente Europea, 2005). Entre ellos se pueden citar:

Encapsulantes: Materiales inorgánicos (sílice, silicatos), lipidos (ceras, parafinas, aceites o grasas en forma de liposomas), proteínas (como gluten, caseína, albúmina, soja, caseinatos, gelatina), gomas (alginato de socio, goma arábiga), carbohidratos (almidón, dextrinas, celulosa, quitosano) y polímeros.

- Disolventes: Acetato de etilo, acetona, diclorometano, cloroformo, metanol, propilenglicol o acetonitrilo, que disuelven bien a las sustancias activas empleadas y son relativamente miscibles con agua.

Emulsionantes: Coloides poliméricos hidrofóbicos, surfactantes no iónicos, alcohol polivinílico o similares.

- Conservantes: Los habituales son los benzoatos sódicos o nitritos sódicos, entre otros, preventol® y proxel®.

- Atrayentes dependiendo de la plaga a tratar.

- Otros: sinergistas para incrementar la función biocida, antiespumantes (derivados de silanos, tales como poli(dimetil-siloxano) y estearato de magnesio), espesantes (xantano o ácidos silícicos), lampones (todos los ácidos débiles y sus sales, pero preferentemente se utiliza lampón fosfato, lampón carbonato y tampón citrato), estabilizadores frente al frío (entre los que cabe citar urea, glicerol y propilenglicol), agentes de neutralización, desodorizadores y polímeros de color.

En cuanto a la liberación del principio activo, el insecticida puede ser liberado de la microcápsula por dos mecanismos:

- Difusión a través de la pared de la cápsula o de una membrana que cubre la pared. La permeabilidad a través de la matriz y la solubilidad del componente de la pared de la cápsula influyen en la velocidad de difusión.

- Destrucción de la pared de la microcápsula, bien por procesos físicos (por una disolución normal en agua, por esfuerzos de cizalla), o por reacciones químicas (cambios de pH, o de presión osmótica, hidrólisis, degradación térmica o enzimática).

Recientemente ha comenzado a estudiarse la encapsulación de este tipo de compuestos en partículas mesoporosas de óxido de silicio como forma de administración alternativa.

Las partículas mesoporosas de óxido de silicio, o PMS, se consideran en la bibliografía como materiales biocompatibles, tal como se desprende por ejemplo del estudio realizado por Wehling et al. (“A critical study: Assessment of the effect of silica partides from 15 to 500 nm on bacterial viability". Environmental Pollution, 176, 292-299, 2013), en el que se investigó el efecto de partículas de óxido de silicio con un tamaño comprendido entre 15 y 500 nm sobre la viabilidad bacteriana. Los resultados establecieron que las partículas no mostraron propiedades inhibitorias independientemente de su tamaño de partícula.

La carga de compuestos biocidas en el interior de los poros de las partículas mesoporosas de óxido de silicio se ha estudiado ampliamente. Por ejemplo, en el articulo de Liu et al (“Porous hollow silica nanopartides as controlled delivery system for water-soluble pesticide". Materials Research Bulletin 41 (2006) 2268-2275), se encapsuló el insecticida soluble en agua validamicina, y se obtuvo un perfil de liberación en diferentes fases debido a que parte del insecticida fue adsorbido en la superficie. En otro trabajo Chen et al. (“Slow-Release Formulation of a New Biological Pesticide. Pyoluteorin, with Mesoporous Silica .J. Agrie. Food Chem., 2011 , 59 (1), pp 307-311) desarrollaron un sistema de encapsulación del insecticida biológico

Pyouteroyn en sílice mesoporosa, consiguiendo un perfil de liberación continua del 85% en 28 dias.

En la mayoría de los casos se busca no sólo controlar el perfil de liberación sino también aportar una protección a los insecticidas que son inestables y se degradan fácilmente. Así por ejemplo Wang et al. (“Construction and evaluation of controlled- release delivery system of Abamectin using porous silica nanoparticles as carriers". Nanoscale Research Letters, December 2014, 9:655) consiguieron mejorar el problema de inestabilidad frente a la luz de abamectina.

La patente W02017091096A2 (2016) muestra un proceso de encapsulación de aceites esenciales biocidas en sistemas de sílice mesoporosa a partir de precursores silicato, y siloxano. En esta patente la aplicación final es la liberación de dichos aceites esenciales como bioestimulantes de plantas Passifíora incamata L. and Momordica charanda L.

La patente europea EP2662069A2 (2013) se refiere a un material mesoporoso en el que al menos algunos de los poros están cargados con aceites esenciales. Sin embargo, la finalización del proceso de encapsulación se realiza cubriendo los poros con una película de polímero biodegradable, y la degradación en el tiempo de la película de recubrimiento de los mesoporos determina la variación en el tiempo de la tasa de liberación de aceite esencial. Sin embargo, aunque la encapsulación de compuestos activos en el interior de partículas mesoporosas proporciona ventajas por ejemplo en cuanto a la liberación controlada y sostenida del compuesto, estas técnicas no resultan completamente satisfactorias. Por ejemplo, una desventaja que presenta este tipo de técnica es que los compuestos activos, una vez liberados de las partículas mesoporosas, quedan libres en el entorno y por tanto presentan los mismos inconvenientes que dichos compuestos aplicados de manera individual (por ejemplo, en cuanto a la solubilidad, volatilidad con disminución de la eficacia frente a plagas por la baja persistencia, sabor desagradable, etc.). Por otro lado, al dispersarse en el entorno los compuestos liberados, no se obtiene una concentración sustancial de los mismos en una zona concreta de interés. Adicionalmente, la introducción de los citados compuestos en el interior de los poros no siempre es posible, debido a relaciones de polaridad y relación de tamaños de poro y compuesto. Por otro lado, el uso de sustancias porosas con poros de gran diámetro dificulta su cerrado y por lo tanto la encapsulación efectiva del compuesto adicionado.

En la patente WO/2018/096098 se presentó un sistema de encapsulación de aceites esenciales antimicrobianos basado en partículas de sílice mesoporosa cubiertas con sacáridos (ej. almidón, maltodextrina, maltosa y glucosa). Dicha invención muestra un sistema de liberación inducido por los enzimas exógenos de los hongos Aspergillus niger. En ausencia de dichos hongos se produce liberación muy baja de los aceites antimicrobianos, y por el contrario la presencia de los hongos activa la liberación alcanzándose niveles muy altos de dichos aceites antimicrobianos. Esta patente es un ejemplo de liberación controlada que permite una concentración sustancial de compuesto activo durante un periodo más prolongado pero se ha diseñado para luchar específicamente contra Aspergillus niger

Sigue existiendo en la técnica la necesidad de un sistema de liberación de insecticida contra las moscas de la fruta (tefritidos y drosophilidos) que permita una concentración sustancial del compuesto insecticida durante un mayor periodo de tiempo. Por ello en la presente patente se reivindica un método para conseguir que los insecticidas queden ocluidos dentro de las partículas y sólo se liberen por contacto directo con las moscas. Esto será posible gracias a la funcionalización de la superficie de las partículas con moléculas de proteina que cierran el poro y sólo permiten la abertura cuando la mosca por contacto libera proteasas y otras sustancias de digestión que degradan dicha cubierta proteica protectora.

EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un nanodispositivo basado en un sistema de encapsulación y liberación controlada de insecticidas para luchar contra moscas de la fruta. Dicho nanodispositivo consiste en partículas de sílice mesoporosa (como por ejemplo MCM-41, SBA-15) en las que se encapsula el insecticida, y sólo activa la liberación de dichas moléculas por el contacto directo con las moscas. Dicho nanodispositivo, además de controlar la liberación del insecticida, aporta a éste protección contra los procesos de fotolisis. La presente invención se refiere a un material mesoporoso especifico para luchar contra insectos basado en el uso de moléculas con actividad insecticida encapsuladas en nanopartículas de sílice mesoporosa funcionalizadas con proteínas. Este material permite la liberación controlada del principio activo exclusivamente en presencia de un estímulo especifico, como el insecto. La liberación de la carga se activa por la presencia de proteasas y sustancias digestivas excretadas por el insecto.

La obtención de partículas mesoporosas de sílice está bien definida en el estado del arte por diferentes métodos sol-gel a partir de precursores de siloxano mediante diferentes técnicas en las que se usan tensioactivos como moléculas directoras de la estructura mesoporosa. Dichas partículas de sílice mesoporosa pueden contener poros de diámetro 0,5 a 10 nm, preferiblemente 1,5 a 3,5 nm, y un diámetro de partícula de

10 nm a 250 nm, 250 nm a 500 nm, 500 nm a 1 miera, preferiblemente de 25 nm a 150 nm. Las partículas mesoporosas pueden presentar una superficie especifica BET entre 10 m ² /g y 1500 m ² /g, preferiblemente entre 200 m ² /g y 700 m ² /g.

El insecticida se puede introducir en el interior de la estructura mesoporosa de las partículas de sílice mediante procedimiento de impregnación de dichas partículas preformadas, o bien se puede introducir en el mismo proceso de formación de las partículas mediante un proceso sol-gel en miniemulsión. En ambos casos la cantidad de insecticida a liberar que se puede encapsular es de 0,01 a 0,50 g por g de soporte. Se pueden encapsular diferentes piretroides sintéticos contra las moscas de la fruta como el aletrina, el fenvalerato, fiuvalinato, ciflutrina, bifentrina, fenpropatrina, resmetrina, sumitrina, permetrina, esfenvalerato, cipermetrina, lambda-cihalotrina, deltametrina, teflutrina, tetrametrina y tralometrina y/o cualquiera de sus mezclas.

La principal innovación de la invención es la funcionalización química con proteínas de la superficie de las partículas de sílice. Las proteínas tienen una doble función, por una parte son sustancias atrayentes de las moscas y por otra cierran los poros y sólo permiten la abertura cuando la mosca por contacto libera proteasas que degradan dicha cubierta proteica. Las formulaciones con piretroides encapsulados en dichos sistemas de sílice mesoporosa funcionalizada con proteínas conservan actividad insecticida después de los 35 dias.

Las partículas de sílice presentan en la superficie de los poros grupos hidroxilo susceptibles de unirse covalentemente a los grupos funcionales de la protelna atrayente. Se usa N-(3-Dimethylaminopropyl)-N ^, -ethylcarbodiimide (EDC) para la activación de los grupos carboxílicos de los aminoácidos de las proteínas. La concentración de proteina en la emulsión de partículas puede variar entre 5-30 %, preferiblemente 10-15 %.

La presente invención presenta las siguientes ventajas: proporciona una liberación más especifica y controlada,

- la liberación se produce selectivamente en presencia de moscas de la fruta que excretan proteasas.

- Las proteasas excretadas producen la hidrólisis de la cubierta proteica de la partícula y de esta forma el poro queda abierto y se libera el insecticida. Un primer aspecto de la presente invención se refiere a un nanodispositivo para la liberación controlada de sustancias que comprende un soporte mesoporoso recubierto por proteínas, donde dichas proteínas son atrayentes para determinadas familias de insectos, como los tefritidos o los drosofilidos

Un segundo aspecto de la presente invención se refiere al procedimiento de obtención del nanodispositivo que comprende las etapas de: a) síntesis del soporte mesoporoso de sílice b) suspensión del soporte en una disolución de la sustancia a liberar c) adición a la suspensión anterior un exceso de la protelna.

Opcionalmente se pueden llevar a cabo de forma simultánea las etapas a y b mediante procesos en miniemulsión en una sola etapa.

Un tercer aspecto de la presente invención se refiere a una composición que comprende nanodispositivos tal y como se han descrito anteriormente.

Un cuarto aspecto de la presente invención se refiere al uso del nanodispositivo tal y como se ha descrito anteriormente, para la elaboración de un insecticida. Un quinto aspecto de la presente invención se refiere al uso del nanodispositivo tal y como se ha descrito anteriormente para la elaboración de un insecticida para la eliminación de insectos que excreten proteasas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Para complementar la descripción que se está realizando y con objeto de ayudar a una mejor comprensión de las características de la invención, se acompaña como parte integrante de dicha descripción, un juego de dibujos en donde con carácter ilustrativo y no limitativo, se ha representado lo siguiente:

Figura 1,- Esquema de liberación del insecticida desde el material de sílice mesoporoso recubierto de proteínas en presencia de la mosca de la fruta. Figura 2.- A) Difractogramas de rayos X de las nanopartlculas mesoporosas de sílice post-síntesis (a) y calcinadas (b); B) Imágenes de Microscopía Electrónica de Transmisión (TEM) de los nanodispositivos de la invención, nanopartlculas mesoporosas de sílice (a) y el sólido cargado y funcionalizado (b); C) Isotermas de adsorción-desorción de nitrógeno del material mesoporoso calcinado (a) y del sólido final cargado y funcionalziado (b).

Figura 3. - Imagen de microscopía electrónica de barrido del soporte de sílice poroso alternativo de partícula de sílice, obtenido por miniemulsión.

Figura 4 - Detalle de la aplicación de las formulaciones sobre las hojas.

Figura 5.- Mortalidad en % provocada por hojas de clementino tras una hora de exposición en función del tiempo de envejecimiento de las hojas.

Figura 6.- Mortalidad en % provocada por hojas de clementino tras tres horas de exposición en función del tiempo de envejecimiento de las hojas.

Figura 7.- Mortalidad en % provocada por hojas de clementino tras 24 horas de exposición en función del tiempo de envejecimiento de las hojas. Figura 8.- Atracción de las distintas formulaciones en función del tiempo de envejecimiento. REALIZACIÓN PREFERENTE DE LA INVENCIÓN

A continuación, se describen algunos ejemplos que recogen los diferentes estudios que han dado lugar a la presente invención en los que también se hace referencia a las Figuras numeradas desde la 1 a la 8.

Ejemplo 1. Síntesis de material mesoporoso de sílice.

La fase hexagonal MCM-41 será utilizada como material de sílice mesoporosa nanoparticulada. Su metodología de sintesis se basa en la condensación de pre- cursores de sílice (silicato sódico, tetraetilortosilicato o silicato de tetrametilamonio) en presencia de surfactantes catiónicos en condiciones básicas. Para la síntesis del soporte inorgánico mesoporoso nanoparticulado tipo MCM-41 se emplea tetraetilortosilicato (TEOS) como precursor inorgánico hidrolitico, y bromuro de hexadeciltrimetilamonio (CTABr) como surfactante. Se pesa 1 g (2,74 mmol) de CTABr y se disuelven en 480 mi de agua desionizada. A continuación, se adicionan 3,5 mi de una disolución de NaOH 2M y se ajusta la temperatura de la mezcla a 80°C bajo agitación suave. A continuación, se añaden 5 mi de TEOS (25,7 mmol) rápidamente, agitando fuertemente. Esta mezcla se deja agitando a 80°C durante dos horas. El polvo resultante se centrifuga y se lava con agua. Finalmente, el sólido se seca a 70°C. Para preparar el material poroso final (nanoparticulas tipo MCM41) y eliminar el surfactante, el sólido mesoestructurado se calcina siguiendo el siguiente programa de temperatura: se pasa de una temperatura de 25 a 550°C en un intervalo de tiempo de 3 h y 30 minutos y luego permanece a 550°C durante 5 h 30 minutos.

Ejemplo 2. Sintesis del sistema de encapsulación y liberación controlada de insecticidas para luchar contra moscas de la fruta. (Figura 1).

En un vidrio de reloj se distribuyen homogéneamente 100 mg de nanoparticulas de tipo MCM-41 debidamente molturadas. Por otro lado, en un vial se pesan 36 mg de λ- cyhalotrhin que se disuelve en 1 mi de CH ₂ CI ₂ . Este volumen se vierte gota a gota sobre el vidrio de reloj que contiene la MCM-41 para llevar a cabo el proceso de encapsulación mediante el método de impregnación. El vidrio de reloj con el sólido y la disolución de piretroide se deja durante toda la noche en la estufa de 37°C para eliminar el disolvente mediante la evaporación de este.

Una vez tenemos el sólido con el piretroide encapsulado (S1), en un matraz de fondo redondo de 100 mi se pesan 72,4 g de N-(3-Dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodi¡mide (EDC) para la activación de los grupos carboxilicos de los aminoácidos de las proteínas y 50 g del hidrolizado de proteina de maíz. Agitamos ambos reactivos en 37 I de H ₂ O destilada durante 30 minutos. Transcurrido este tiempo se adicionan los 135,7 g del sólido S1. La suspensión se deja en agitación y a temperatura ambiente durante toda la noche hasta la desaparición de grumos. Ejemplo 3. Caracterización del material. (Figura 2).

Para caracterizar los nanomateriales mesoporosos de sílice sintetizados en el presente estudio, se utilizan las siguientes técnicas: difracción de rayos X de polvo (PXRD), microscopía electrónica de transmisión (TEM), adsorción-desorción de N ₂ .

En la figura 2A, se pueden observar los difractogramas de rayos X de polvo (PXRD) de ios sólidos de la MCM-41 sintetizada y MCM-41 calcinada. El PXRD a ángulos bajos, de la MCM-41 sintetizada, antes de la calcinación, curva a, muestra los cuatro planos de reflexión representativos de la estructura hexagonal, que pueden ser asignados a los planos de Bragg (100), (110), (200) y (210), con un parámetro de celda aO con valor de 43,83 A (distancia entre planos d100= 38 A). En la figura 2 se puede observar en el PXRD de la muestra MCM-41 calcinada, curva b, un desplazamiento significativo de la reflexión (100). Este desplazamiento es debido a una contracción de la celda de aproximadamente 6-8 A. El desplazamiento y ensanchamiento de los picos (110) y (200) es debido, probablemente, a la condensación de los silanoles de la superficie del material durante el proceso de calcinado. La estructura mesoporosa de los sólidos MCM-41 sintetizada y MCM-41 calcinada también se puede observar mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM). Las imágenes de TEM de los sólidos MCM-41 sintetizada y MCM-41 calcinada (figura 2B) muestran la típica porosidad desordenada hexagonal de la matriz MCM-41.

Otra técnica utilizada para la caracterización del sistema de poros de la MCM-41 es el análisis de las isotermas de adsorción-desorción de N ₂ (figura 2C). Dicha técnica permite obtener a la temperatura del nitrógeno líquido (-196°C) el área superficial, el tamaflo y el volumen de poro del material. Las isotermas de adsorción-desorción de N ₂ de la fase calcinada de MCM-41 muestra un salto característico de los mesoporos de MCM-41 a valores de presión intermedios (0,2<P/P0<0,4) que corresponde a una isoterma del tipo IV. Este salto es debido a la condensación de nitrógeno por capilaridad dentro de los mesoporos. La ausencia de ciclo de histéresis en este intervalo y la forma de la curva sugiere la existencia de mesoporos uniformes y cilindricos con un diámetro de poro, calculado mediante el uso del método Barret- Joyner-Halenda (BJH), de 2,4 nm y un volumen de poro de 0,47 cm ³ g ^-1 · La aplicación del modelo de Brunauer-Emmett-Teller (BET) dio un valor para la superficie total especifica de 368 m ² g ^-1 .

Ejemplo 4. Escalado de material mesoporoso de sílice basado en surfactante CTAC.

Se sintetiza el soporte inorgánico mesoporoso tipo MCM-41 sustituyendo el surfactante CTABr por CTAC, cloruro de hexadeciltrimetilamonio. Se disuelve 100 g de CTAC en 48 I de H2O destilada. Se añade 350 mi de NaOH 2M a la disolución de CTAC en agua y se calienta a 80"C bajo agitación suave (200 rpm). Se añade 500 mi de TEOS por goteo. Se agita 2 horas a 600 rpm hasta obtener un precipitado blanco. Se centrifuga el precipitado y se introduce en una mezcla de etanol y HCI 37 % (proporción Etanol:HCI, 9Ί v/v) que se mantiene a 80°C durante 10 horas con el objetivo de eliminar el tensioactivo. El sólido se filtra y se seca a 70°C durante 18 horas.

Ejemplo 5. Síntesis del sistema de encapsulación y liberación controlada de insecticidas para luchar contra moscas de la fruta. (Formulación ATAECINA)

En una amasadora de acero inoxidable se distribuyen homogéneamente 1 ,66 g de nanopartlculas de MCM-41 del ejemplo 4. Por otro lado, se pesan 0,6 g de λ- cyhalotrhin que se disuelve en 33,2 mi de CH2CI2. Este volumen se vierte gota a gota sobre la amasadora que contiene las nanoparticulas de MCM-41 para llevar a cabo el proceso de encapsulación mediante el método de “kneading". El sólido resultante se seca en extractor rotativo a vacio y temperatura de 40°C. Una vez tenemos el sólido con el piretroide encapsulado se introducen en un reactor junto con 614 g de agua destilada, 1,2 g de N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide (EDC) y 0,83 g del hidrolizado de proteína de maíz. La mezcla se deja en agitación durante 10 horas. Ejemplo 6. Escalado de material mesoporoso de sílice basado en surfactante CETRIMIDE.

Se sintetiza el soporte inorgánico mesoporoso nanoparticulado tipo MCM-41 usando el surfactante Cetrimide, un doruro de hexadeciltrimetilamonio de grado industrial. Se disuelve 1 kg de Cetrimide en 480 I de H ₂ O destilada. Se añade 3.5 I de NaOH 2M a la disolución de Cetrimide en agua y se calienta a 80°C bajo agitación suave (200 rpm). Se añade 5 I de TEOS por goteo. Se agita 2 horas a 600 rpm hasta obtener un precipitado blanco. Se centrifuga el precipitado y se introduce en una mezda de etanol y HCI 37 % (proporción Etanol:HCI, 9:1 v/v) que se mantiene a 80"C durante 10 horas con el objetivo de eliminar el tensioactivo. El sólido se filtra y se seca a 70°C durante 18 horas.

Ejemplo 7. Síntesis del sistema de encapsulación y liberación controlada de insecticidas para luchar contra moscas de la fruta (Formulación Form 1 )

En una amasadora de acero inoxidable se distribuyen homogéneamente 0,28 g de nanoparticulas de sílice mesoporosa obtenidas en el ejemplo 6. Por otro lado, se pesan 0,1 g de λ-cyhalotrhin, que se disuelve en 2,78 mi de CH ₂ CI ₂ . Este volumen se vierte gota a gota sobre la amasadora que contiene las nanoparticulas de MCM-41 para llevar a cabo el proceso de encapsulación mediante el método de “kneading". El sólido resultante se seca en extractor rotativo a vacio y temperatura de 40°C. Una vez tenemos el sólido con el piretroide encapsulado se introducen en un reactor junto con 102,5 g de agua destilada, 0,2 g de N-(-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide (EDC) y 0,14 g del hidrolizado de proteina de maíz. La mezda se deja en agitación durante 10 horas.

Ejemplo 8. Sistema de encapsulación de extracto natural de piretro (insecticida natural) para luchar contra las moscas de la fruta obtenido por miniemulsión (Formulación Form 2).

En un vaso de precipitados se adidona la fase acuosa que consiste en 150 mi de agua destilada y 6 ml de (3-aminopropil)trietoxisilano (ARTES) y se agita a 600 rpm para permitir la hidrólisis del ARTES y obtener una solución homogénea. Por otra parte se mezcla en otro vaso de precipitados la fase aceite, 8 g de extracto natural de piretro y 18 mi de metiltrimetoxisilano (MTMS) hasta conseguir una solución homogénea. La fase aceite se vierte poco a poco sobre la fase acuosa y se deja agitar 10 minutos. La solución resultante se centrifuga durante 5 minutos a 5000 rpm y se repite el proceso lavando con agua destilada un par de veces más para asegurar que el sólido está limpio de reactivos de partida. Finalmente se deja secar a temperatura ambiente.

Una vez tenemos el aceite de piretrina encapsulado, se introduce en un vaso de precipitados 111 mi de agua destilada, se adicionan 0,15 g de proteina de maíz y 0,22 g de EDC, a la media hora se adicionan 0,3 g de cápsulas y se dejan en agitación primero a 800 rpm y una vez pierden la hidrofobia se dejan en agitación a 500 rpm durante 10 horas.

Ejemplo 9. Ensayo en campo. (Figuras 5, 6, 7 y 8).

En el CEQA-IAM de la UPV se ha realizado un ensayo de distintas formulaciones para estudiar la actividad insecticida de las mismas. Los ensayos se han realizado en condiciones reales de campo durante el periodo de maduración de la fruta en el que es más sensible al ataque de la mosca del Mediterráneo y cuando las poblaciones de mosca son más elevadas. Los ensayos se han realizado sobre hojas de mandarino, variedad clemennules. Para los ensayos de medida en hojas de la actividad insecticida, se han ensayado las siguientes formulaciones:

Cada una de las formulaciones se ha diluido al 5% en agua salvo la formulación de A- Cihalotrin que contenia un 1.5% de Nulure (v:v) y 0.12% de λ-Cihalotrin en la formulación Karate Zeon (Syngenta). Las formulaciones se pulverizaron utilizando pulverizador manual a presión (Matabi) sobre hojas de clementino (Figura 4). Las hojas tratadas se marcaron y se dejaron envejecer en las condiciones reales de campo durante 4 semanas. Semanalmente se recogió una muestra de 18 hojas de cada tratamiento y se llevaron al laboratorio para ensayar su actividad insecticida. Para ello estas hojas se ofrecieron a las moscas, colocando 2 hojas en cada jaula. Las jaulas de 10x10x10 cm de metracrilato contenían 5 machos y 5 hembras adultos, maduros sexualmente, de Ceratitis capitata que hablan permanecido en ayunas 24 horas. De esta forma nos asegurábamos la avidez por la ingestión de los cebos. Las hojas se introdujeron en las jaulas, donde permanecen 1 horas a disposición de las moscas y se realiza un conteo de las moscas que acuden a las hojas para estudiar la capacidad atrayente de los cebos. A la hora se retiran las hojas y se introduce en las jaulas la dieta de mantenimiento con azúcar, proteínas y agua.

En cada ensayo se ha estudiado la atracción, medida como moscas que son atraídas durante 1 hora a los cebos ensayados, y la actividad insecticida medida como mortalidad y efecto knock-down a la hora, 3 y 24 horas tras ofrecer los cebos tratados a las moscas.

Cada tiempo de envejecimiento y cada formulación se ensayó cada vez en 4 jaulas. Como se puede observar en la figura 5 la formulación con Karata y proteínas es la que más rápidamente mata a las moscas cuando está recién aplicado. Sin embargo, a los siete dias desde su aplicación este efecto ya no se observa y la actividad insecticida se ve muy reducida. La Ataecina es la única formulación que mantiene ese efecto insecticida rápido (solo 1 hora de exposición a las hojas) durante 14 dias.

Si observamos la mortalidad a las tres horas de la exposición (Figura 6) podemos ver que de nuevo la Ataecina es la formulación que más actividad presenta a los 14 dias de envejecimiento, incluso presentando una buena actividad residual con hojas envejecidas 21 días en campo. Cabe destacar que si bien la formulación 1 tiene una actividad muy baja a los 14 dias de envejecimiento esta parece recuperarse a los 21 dias por lo que podemos decir que la formulación 1 tiene un buen comportamiento frente al envejecimiento. No se encuentra una explicación a esta reducción a los 14 días con la recuperación a los 21 por lo que este valor debería tomarse con precaución.

Finalmente, si observamos la mortalidad que se considera definitiva (a las 24 horas de la exposición) en la Figura 7, podemos observar que Ataecina es la única formulación que mantiene actividad incluso un mes después de su aplicación.

En la comparación de las dos formulaciones alternativas, de nuevo la formulación 1 resulta más activa que la formulación 2 siendo la formulación 1 la más activa a los 7 días de envejecimiento, incluso ligeramente por encima de la formulación de Ataecina. Respecto a la atracción que obtienen las distintas formulaciones los resultados se muestran en la Figura 8. Los resultados muestran que, si bien la formulación 1 tiene una buena atracción recién aplicada, esta atracción disminuye paulatinamente y a los 14 días la atracción es prácticamente nula. La única formulación que mantienen valores de atracción por encima del control durante los 27 dias de envejecimiento es la Ataecina. Este valor demuestra que el atrayente de la Ataecina sigue disponible para las moscas incluso 4 semanas después de aplicado y no parece provocar repelencia por contener insecticida en ningún caso.

La formulación de Karate no muestra diferencias con el control a tiempo 21 y 27 días, lo que se debe posiblemente a la degradación completa del formulado aplicado.

Ejemplo 10. Ensayo de eficacia de la formulación en campo

Se ha realizado un ensayo de campo para estudiar la actividad insecticida del formulado de Ataecina 4% y la duración de su efecto insecticida.

El ensayo se ha realizado en una parcela de cítricos variedad Clemenrubí. La parcela se ha dividido en 3 subparcelas de 6x7 árboles de forma aproximadamente cuadrada.

En cada una de estas subparcelas se ha realizado un tipo de tratamiento. En la parcela situada más al este (subparcela control en la figura 1) no se ha realizado ningún tratamiento químico. En la parcela central (subparcela Karate en la figura 1) se han realizado dos tratamientos estándar los días 20 de septiembre y 5 de octubre con Karate Zeon 10% p/v y Nulure como atrayente proteico. El Karate se utilizó a una dosis de 12.5 ml de dicho producto en 10 litros de caldo y el Nulure a 150 ml por 10 litros de caldo. El gasto de caldo fue aproximadamente de entre 100-150 mi por árbol. En la tercera subparcela, situada más al oeste (subparcela Ataecina en la figura 1) se ha realizado un único tratamiento con Ataecina 4% a una dosis del 5% v/v el día 20 de septiembre. La Ataecina utilizada tiene el código PS_NP_(10)_PMn(0,4)x16

En el centro de cada una de las parcelas se ha colocado una trampa Teprhi trap (Utiplas, Madrid, España) cebada con un atrayente de hembras Biolure (Suterra, Valencia) que se revisaron semanalmente. Se han realizado dos conteos de daño en fruta. El primero se realizó el 11 de octubre inspeccionando los frutos directamente de los 3 árboles centrales de cada parcela. Al final del ensayo, el día 17 de octubre se realizó la recolección de la fruta de los 3 árboles completos marcados en el centro de cada parcela y se llevó la fruta al laboratorio donde se revisó y se dejó evolucionar en una cámara durante una semana a 22°C. A la semana se determinó el porcentaje de frutos atacados y cuantos de ellos habían desarrollado larvas de Ceratitís capitata.

Respecto a la población de moscas capturadas en las trampas de seguimiento una única aplicación de Ataecina ha mantenido las poblaciones de mosca prácticamente a 0, de hecho no se ha capturado ninguna hembra desde la aplicación hasta la finalización del ensayo 27 dias después. En la parcela tratada con Karate la población de mosca se reduce durante 2 semanas, tras las cuales vuelve a subir. Al repetir el tratamiento de Karate la población vuelve a bajar. En la parcela control la población de mosca se mantiene alta durante todo el ensayo superando el umbral de 1 mosca por mosquero y día que se considera un nivel de población que provoca daños elevados en la cosecha.

Tabla 1: Capturas de machos y hembras (M/H) obtenidas en las trampas centrales de cada una de las parcela con cada tipo de tratamiento

La reducción en la parcela control de la población capturada puede ser debida a la proximidad de la parcela tratada con Karate. En cualquier caso se puede observar que la Ataecina ha mantenido a cero la población de mosca durante las 4 semanas de duración del ensayo. Respecto al daño en fruta los resultados de los dos conteos se pueden observar en la tabla 2: Tabla 2: Porcentaje de fruta atacada dependiendo del tratamiento realizado en el conteo del 11 de octubre

Este primer conteo se realizó sobre la totalidad de la fruta que tenían los tres árboles situados en el centro de cada parcela. La fruta solo se inspeccionaba visualmente ya que el estado fenológico de la fruta era de comienzo del envero y aun no se encontraba en un estado de maduración que permitiese su recolección.

La segunda prospección de fruta se realizó el 17 de octubre cuando se consideró la plena madurez de la fruta. Los resultados se pueden observar en la tabla 3: Tabla 3: Porcentaje de fruta atacada dependiendo del tratamiento realizado en el conteo del 17 de octubre

Porcentajes seguidos con letras diferentes en la misma columna difieren significativamente en el test Chi-cuadrado con P<0.05

Como puede observarse, tanto el tratamiento con Karate como el tratamiento con Ataecina reducen significativamente el daño provocado por la mosca del Mediterráneo. Sin embargo, esta reducción parece total en la Ataecina con un solo tratamiento ya que no se encontró ninguna fruta picada en ninguna de las dos prospecciones realizadas El tratamiento con Karate debió repetirse a las dos semanas del primer tratamiento ya que se observó que la actividad insecticida en hojas habla desaparecido y las capturas se Incrementaban. El porcentaje de frutos atacados en cosecha en la parcela tratada dos veces con Karate es aceptable para los niveles del mercado, aunque siguen siendo superiores que los obtenidos en las parcelas tratadas con Ataecina. Además, cabe destacar que un único tratamiento con Ataecina consiguió mantener las poblaciones prácticamente a cero y evitar el ataque de la mosca.