Login| Sign Up| Help| Contact|

Patent Searching and Data


Title:
TRANSFECTION METHOD COMPRISING NONVIRAL GENE DELIVERY SYSTEMS
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2018/019341
Kind Code:
A1
Abstract:
The invention relates to a transfection method for introducing nucleic acids in eukaryotic cells by means of a nonviral gene delivery system, wherein the cells are treated at least with at least one inhibitor for IKKe and/or TBK-1 and at least one inhibitor for nucleic-acid-detecting Toll-like receptors before and/or during the transfection. The invention further relates to a composition and to a modular system for such a method.

Inventors:
KARL ROSA (DE)
Application Number:
PCT/DE2017/200056
Publication Date:
February 01, 2018
Filing Date:
June 27, 2017
Export Citation:
Click for automatic bibliography generation   Help
Assignee:
KARL ROSA (DE)
International Classes:
A61K47/26; A61K47/68; A61K48/00; C12N15/09; C12N15/87
Domestic Patent References:
WO2010133369A12010-11-25
WO2009065618A22009-05-28
WO2010133369A12010-11-25
WO2009030890A12009-03-12
WO2010100431A12010-09-10
WO2012059171A12012-05-10
WO2012161877A12012-11-29
WO2012161879A12012-11-29
WO2013034238A12013-03-14
WO2013024282A22013-02-21
WO2013075785A12013-05-30
WO2013117285A12013-08-15
WO2014189806A12014-11-27
WO2014128486A12014-08-28
WO2014093936A12014-06-19
WO2015134171A12015-09-11
WO2016057338A12016-04-14
Foreign References:
EP1720864A12006-11-15
US20150352108A12015-12-10
US20160015709A12016-01-21
Other References:
KARPUS OLGA N ET AL: "Intracellular delivery of poly(I:C) induces apoptosis of fibroblast-like synoviocytes via an unknown dsRNA sensor", BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 477, no. 3, 22 June 2016 (2016-06-22), pages 343 - 349, XP029641765, ISSN: 0006-291X, DOI: 10.1016/J.BBRC.2016.06.104
DEVOLDERE JOKE ET AL: "Evading innate immunity in nonviral mRNA delivery: don't shoot the messenger", DRUG DISCOVERY TODAY, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 21, no. 1, 23 July 2015 (2015-07-23), pages 11 - 25, XP029388930, ISSN: 1359-6446, DOI: 10.1016/J.DRUDIS.2015.07.009
OU ET AL., MOLECULAR CELL, vol. 41, 2011, pages 458 - 470
Attorney, Agent or Firm:
SEIFERT, Ruth (DE)
Download PDF:
Claims:
Ansprüche:

1 . Transfektionsverfahren zum Einschleusen einer oder mehrerer

Nukleinsäuren in eukaryotischen Zellen mittels eines nicht-viralen

Genliefersystems,

dadurch gekennzeichnet, dass

die Zellen vor und/oder während der Transfektion zumindest mit mindestens einem Inhibitor für IKKe und/oder TBK-1 und mindestens einem Inhibitor für zumindest einen nukleinsäuredetektierenden Toll-like Rezeptor, TLR, behandelt werden.

2. Transfektionsverfahren nach Anspruch 1 , wobei als Inhibitor für den nukleinsäuredetektierenden Toll-like Rezeptor zumindest ein Inhibitor für TLR 9, den Toll-like Rezeptor 9, verwendet wird.

3. Transfektionsverfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei als Inhibitor für IKKe/TBK-1 ein Inhibitor mit einem ICso-Wert von weniger als 500 nM,

vorzugsweise weniger als 200 nM, am bevorzugtesten weniger als 100 nM, verwendet wird; und/oder

als Inhibitor für den nukleinsäuredetektierenden Toll-like Rezeptor ein Inhibitor mit einem ECso-Wert von weniger als 1000 nM, vorzugsweise weniger als 500 nM, am bevorzugtesten weniger als 200 nM, verwendet wird.

4. Transfektionsverfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei als Inhibitor für den nukleinsäuredetektierenden Toll-like Rezeptor zumindest eine Verbindung aus der Gruppe der der 4-Aminoquinoline,

einschließlich deren Salze, verwendet wird, wobei die Verbindung folgende Grundstruktur

aufweist, wobei R1 bis R7 beliebig wählbar ist.

5. Transfektionsverfahren nach Anspruch 4, wobei als Inhibitor für den nukleinsauredetektierenden Toll-like Rezeptor zumindest Chloroquin, einschließlich dessen Salze, verwendet wird mit R5 = Cl und R7 =

NHCHMe CH2)3NEt2 und dementsprechend folgender Struktur

und/oder als Inhibitor für den nukleinsauredetektierenden Toll-like Rezeptor zumindest eine Verbindung, einschließlich deren Salze, verwendet wird mit R5 Cl und R7 = NHCH2CH(C6H4OMe)(CH2)2NEt2 und dementsprechend folgender Struktur:

und/oder als Inhibitor für den nukleinsauredetektierenden Toll-like Rezeptor zumindest eine Verbindung, einschließlich deren Salze, verwendet wird mit R5 = NHCHMe(CH2)3NEt2, R1 = CeHs und dementsprechend folgend

6. Transfektionsverfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei als Inhibitor für den nukleinsäuredetektierenden Toll-like Rezeptor zumindest eine Verbindung aus der Gruppe der 9-Aminoacridine, einschließlich deren Salze, verwendet wird, wobei die Verbindung folgende Grundstruktur

aufweist, wobei R1 bis R4 beliebig wählbar sind.

7. Transfektionsverfahren nach Anspruch 6, wobei als Inhibitor für den nukleinsäuredetektierenden Toll-like Rezeptor zumindest Quinacrin, einschließlich dessen Salze, verwendet wird mit R1 = OMe, R2 = H, R3 = Cl, R4 =

NHCHMe CH2)3NEt2 und dementsprechend folgender Struktur

8. Transfektionsverfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei als Inhibitor für IKKe und/oder TBK-1 einer oder mehrere aus der Gruppe BX795 (N-(3-((5-lodo-4-((3-(2-thienylcarbonyl) amino) propyl) amino)-2- pyrimidinyl) amino) phenyl)-1 -pyrrolidinecarboxamide, CAS 702675-74-9); BX320 (N-(3-((5-bromo-2-(3-(pyrrolidine-1 -carbonylamino) anilino) pyhmidin-4-yl)amino) propyl)-2,2- dimethyl propanediamide, CAS 702676- 93-5);

Cay10576 (5-(5,6-Dimethoxybenzimidazol-1 -yl)-3-(2-methanesulfonyl- benzyloxy)-thiophene-2-carbonithle, CAS 862812-98-4);

Cay10575 (5-(5,6-Dimethoxybenzimidazol-1 -yl)-3-((4-methylsulfonyl) phenyl) methoxy)-2-thiophenecarboxamide, CAS 916985-21 -2);

Amlexanox (2-Amino-7-(1 -methylethyl)-5-oxo-5H-[1 ]Benzopyrano[2,3- b]pyridine-3-carboxylic acid, CAS 68302-57-8);

MRT-67307 (N-[3-[[5-Cyclopropyl-2-[[3-(4- morpholinylmethyl)phenyl]amino]-4-pyhmidinyl]amino]propyl]- cyclobutanecarboxamide, CAS 1 190378-57-4);

CYT387 (N-(cyanomethyl)-4-[2-[[4-(4-morpholinyl)phenyl]amino]-4- pyhmidinyl]-benzamide, CAS 1056634-68-4);

einschließlich deren Salze, gewählt werden.

9. Zusammensetzung für ein Transfektionsverfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche dadurch gekennzeichnet, dass die

Zusammensetzung zumindest mindestens einen Inhibitor für IKKe und/oder TBK-1 und mindestens einen Inhibitor für zumindest einen nukleinsauredetektierenden Toll-like Rezeptor umfasst.

10. Zusammensetzung nach Anspruch 9, wobei die Zusammensetzung weiterhin umfasst:

a. ein nicht-virales Genliefersystem, und/oder

b. eine oder mehrere modifizierte oder unmodifizierte Nukleinsäuren.

1 1 . Zusammensetzung nach Anspruch 9 oder 10, wobei der mindestens eine Inhibitor für den nukleinsäuredetektierenden Toll-like Rezeptor ein Inhibitor für TLR 9, den Toll-like Rezeptor 9, ist.

12. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 9 bis 1 1 , wobei der Inhibitor für IKKe/TBK-1 einen ICso-Wert von von weniger als 500 nM,

vorzugsweise weniger als 200 nM, am bevorzugtesten weniger als 100 nM, aufweist; und/oder

der Inhibitor für den nukleinsauredetektierenden Toll-like Rezeptor einen ECso- Wert von weniger als 1000 nM, vorzugsweise weniger als 500 nM, am

bevorzugtesten weniger als 200 nM, aufweist.

13. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 9 bis 12, wobei der Inhibitor für den nukleinsauredetektierenden Toll-like Rezeptor zumindest eine Verbindung aus der Gruppe der der 4-Aminoquinoline, einschließlich deren Salze, umfasst, die folgende Grundstruktur

aufweist, mit R1 bis R7 beliebig wählbar.

14. Zusammensetzung nach Anspruch 13, wobei der Inhibitor für den nukleinsauredetektierenden Toll-like Rezeptor zumindest Chloroquin,

einschließlich dessen Salze, umfasst mit R5 = Cl und R7 = NHCHMe(CH2)3NEt2 und dements rechend folgender Struktur

und/oder der Inhibitor für den nukleinsauredetektierenden Toll-like Rezeptor zumindest eine Verbindung, einschließlich dessen Salze, umfasst, mit R5 = Cl und R7 = NHCH2CH(C6H4OMe)(CH2)2NEt2 und dementsprechend folgender Struktur:

und/oder der Inhibitor für den nukleinsauredetektierenden Toll-like Rezeptor zumindest eine Verbindung, einschließlich dessen Salze, umfasst, mit R5 = OMe, R7 = NHCHMe CH2)3NEt2, R1 = CeHs und dementsprechend folgender Struktur:

15. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 9 bis 14, wobei der Inhibitor für den nukleinsauredetektierenden Toll-like Rezeptor zumindest eine Verbindung aus der Gruppe der 9-Aminoacridine, einschließlich dessen Salze, umfasst, die folgende Grundstruktur

aufweist, wobei R1 bis R4 beliebig wählbar sind.

16. Zusammensetzung nach Anspruch 15, wobei der Inhibitor für den nukleinsauredetektierenden Toll-like Rezeptor zumindest Quinacrin, einschließlich dessen Salze, umfasst mit R1 = OMe, R2 = H, R3 = Cl, R4 = NHCHMe(CH2)3NEt2 und dementsprechend fol ender Struktur

17. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 9 bis 16, wobei der Inhibitor für IKKe und/oder TBK-1 einen oder mehrere aus der Gruppe

BX795 (N-(3-((5-lodo-4-((3-(2-thienylcarbonyl) amino) propyl) amino)-2- pyrimidinyl) amino) phenyl)-1 -pyrrolidinecarboxamide, CAS 702675-74-9); BX320 (N-(3-((5-bromo-2-(3-(pyrrolidine-1 -carbonylamino) anilino) pyrimidin-4-yl)amino) propyl)-2,2- dimethyl propanediamide, CAS 702676- 93-5);

Cay10576 (5-(5,6-Dimethoxybenzimidazol-1 -yl)-3-(2-methanesulfonyl- benzyloxy)-thiophene-2-carbonitrile, CAS 862812-98-4);

Cay10575 (5-(5,6-Dimethoxybenzimidazol-1 -yl)-3-((4-methylsulfonyl) phenyl) methoxy)-2-thiophenecarboxamide, CAS 916985-21 -2);

Amlexanox (2-Amino-7-(1 -methylethyl)-5-oxo-5H-[1 ]Benzopyrano[2,3- b]pyridine-3-carboxylic acid, CAS 68302-57-8);

MRT-67307 (N-[3-[[5-Cyclopropyl-2-[[3-(4- morpholinylmethyl)phenyl]amino]-4-pyrimidinyl]amino]propyl]- cyclobutanecarboxamide, CAS 1 190378-57-4);

CYT387 (N-(cyanomethyl)-4-[2-[[4-(4-morpholinyl)phenyl]amino]-4- pyrimidinyl]-benzamide, CAS 1056634-68-4);

einschließlich deren Salze, umfasst.

18. Baukastensystem für ein Transfektionsverfahren nach einem der

Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Baukastensystem

zumindest eine erste Inhibitorenteilzusammensetzung, die mindestens einen Inhibitor für IKKe und/oder TBK-1 umfasst, und eine zweite Inhibitorenteilzusammensetzung, die mindestens einen Inhibitor für zumindest einen nukleinsäuredetektierende Toll-like Rezeptor umfasst, aufweist

oder, dass das Baukastensystem

eine Inhibitorenzusammensetzung, die mindestens einen Inhibitor für IKKe und/oder TBK-1 und zugleich mindestens einen Inhibitor für zumindest einen nukleinsäuredetektierenden Toll-like Rezeptor umfasst, aufweist.

19. Baukastensystem nach Anspruch 18, wobei die

Inhibitorenzusammensetzung oder mindestens eine der

Inhibitorenteilzusammensetzungen eine Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 1 bis 17 ist.

20. Baukastensystem nach einem der Ansprüche 18 bis 19, wobei das Baukastensystem weiterhin umfasst:

a. eine Genliefersystemzusammensetzung mit mindestens einem nichtviralen Gen lief ersystem, und/oder

b. eine Nukleinsäurezusammensetzung mit mindestens einer modifizierten oder un modifizierten Nukleinsäure.

21 . Baukastensystem nach einem der Ansprüche 18 bis 20, wobei eine oder mehrere der Zusammensetzungen oder Teilzusammensetzungen eine

Kombinationszusammensetzung mit einer oder mehreren anderen

Zusammensetzungen oder Teilzusammensetzungen bilden.

Description:
Transfektionsverfahren mit nicht-viralen Gen liefers vstemen

Umfeld der Erfindung

[0001 ] Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Verbesserung der Transfektionseffizienz von nicht-viralen Genliefersystemen, sowie eine

Zusammensetzung dafür und ein zugehöriges Baukastensystem.

Hintergrund der Erfindung

[0002] Das Einschleusen von Nukleinsäuren (DNA, RNA, etc.) in eukaryotische Zellen, auch als Transfektion bezeichnet, stellt eine Schlüsseltechnologie in der modernen Biotechnologie dar, da sie den Zugriff auf den zentralen

Steuerungsapparat einer Zelle und damit beispielsweise die Herstellung oder das Ausschalten bestimmter Proteine erlaubt. Die Transfektion mit DNA oder mRNA erlaubt beispielsweise die Expression (Herstellung) eines beliebigen Proteins, die Transfektion mit siRNA, Ribozymen oder Antisense Molekülen erlaubt, beispielsweise durch RNA-Interferenz, den„Knockdown" (Ausschalten) eines Gens bzw. eines Proteins. Aber auch microRNA kann in Zellen eingeschleust werden und es kann auf diese Weise Einfluss auf regulatorische Funktionen ausgeübt werden. Diese Schlüsseltechnologie findet sowohl in

Forschungslaboratorien, in der Medizin und bei der industriellen Erzeugung von Proteinen Anwendung. Nicht zuletzt sei auf die grundlegende Anwendung der Transfektion bei dem "Genome Editing" nach der CRISPR/Cas9 Methode erwähnt, welches erlaubt sehr gezielt das Genom einer Zelle zu verändern, hingewiesen.

[0003] Insbesondere ermöglicht diese Schlüsseltechnologie in humanen Zellen durch Mutation zerstörte Gene zu ersetzen und somit Fehlfunktionen zu heilen. Auch können beispielsweise Krebszellen durch entsprechende Suizidgene zum „Selbstmord" gezwungen werden. Der„Knock-down" eines Gens stellt eine weitere Möglichkeit dar, heilend zu wirken, z.B. indem wichtige Gene für

Angiogenese in Krebsgeschwüren stillgelegt werden. Unter Knock-down wird eine Abschwachung oder Ausschaltung der Translation einer mRNA zu einem Protein bei der Proteinbiosynthese verstanden. Viele Krankheiten werden durch eine Fehlsteuerung von Zellen ausgelöst, die mittels microRNA aufgehoben werden könnte.

[0004] Wie erfolgreich eine solche Transfektion ist, wird unter anderem über die sogenannte Transfektionseffizienz definiert. Unter einer Transfektionseffizienz versteht man dabei die Menge einer Proteinexpression einer Zellpopulation in Folge von Transfektionsprozessen mit genetischem Material, welches unter anderem dieses exprimierte Protein codiert, oder auch das Ausmaß eines Knockdowns einer Proteinexpression einer Zellpopulation in Folge von

Transfektionsprozessen mit genetischem Material, welches einen solchen Knockdown auslösen kann. Als genetisches Material findet insbesondere siRNA, Antisense-RNA, Ribozyme, Antisense-DNA oder DNA, die für siRNA oder Ribozyme codiert, Verwendung. Häufig wird die Transfektionseffizienz auch durch den Anteil der Zellen einer Gesamtpopulation von Zellen, die die biologische Wirksamkeit des eingeschleusten genetischen Materials in Folge von

Transfektionsprozessen zeigt, definiert.

[0005] Um Nukleinsäuren in Zellen einschleusen zu können, braucht man in der Regel Genliefersysteme, die zumindest die Membranbarriere der Zellen für die Nukleinsäure passierbar macht. Im Folgenden wird deshalb unter Transfektion eine Behandlung von eukaryotischen Zellen durch ein Genliefersystem und Nukleinsäuren verstanden.

[0006] Üblicherweise werden die vorhandenen Genliefersysteme in zwei Hauptgruppen unterteilt, nämlich virale Systeme und nicht-virale Systeme. [0007] Bei den insbesondere in der Gentherapieforschung bevorzugten viralen Systemen, werden Viren als Genliefersysteme angewendet. Da das Einbringen von Nukleinsäuren, insbesondere DNA oder RNA, in Fremdzellen ein integraler Bestandteil des Vermehrungszyklus der Viren ist, wurde diese Fähigkeit durch einen natürlichen, evolutiven Prozess in der Entwicklungsgeschichte der Viren soweit verfeinert, dass es ein äußerst effektives Genliefersystem darstellt. Die eingesetzten Viren werden dabei durch Genmanipulation so verändert, dass sie keine pathogenen Eigenschaften mehr besitzen und sich nicht mehr reproduzieren können.

[0008] Nachteilig an den viralen Systemen ist jedoch, dass die Viren dem

Immunsystem eine große Angriffsfläche bieten, da das Immunsystem in einem ebenso evolutionären Anpassungsprozess Strategien entwickelt hat, sich den Viren zur Wehr zu setzen. Die Immunabwehr und die Aktivierung von Onkogenen durch zufällige Integration von genetischem Material in das Genom sind ungelöste Probleme, sodass es trotz jahrzehntelanger Forschung weltweit nur vereinzelt zugelassene Gentherapien gibt. In der Grundlagenforschung werden zwar auch häufig Viren eingesetzt, aber aufgrund des Sicherheitsrisikos und der aufwendigen Handhabung werden die viralen Systeme nur dort eingesetzt, wo es im

Wesentlichen keine Alternativen gibt.

[0009] Bei nicht-viralen Genliefersystemen werden allgemein keine natürlich vorkommenden Viren eingesetzt und sie werden nicht durch Rekombination genetischen Materials von natürlich vorkommenden Viren erzeugt. Diese nichtviralen Systeme können wiederum in zwei Untergruppen unterteilt werden, die auf chemischen Methoden basierenden Systeme und die auf physikalischen

Methoden basierenden Systeme.

[0010] Die auf chemischen Methoden basierenden nicht-viralen Genliefersysteme beruhen entweder auf einer chemischen Veränderung oder Derivatisierung der Nukleinsäuren selbst, die sie zellgängig machen, oder umfassen Stoffe, die, beispielsweise über elektrostatische Kräfte oder

Wasserstoffbrückenverbindungen, Nukleinsäuren binden und einen Transport durch die Zellmembran vermitteln können. Der Transport der Nukleinsäure durch die Zellmembran erfolgt in der Regel durch einen aktiven Transportmechanismus der Zelle, der sogenannten Endozytose.

[001 1 ] Stoffe, die eine Bindung der Nukleinsäuren ermöglichen, enthalten beispielsweise kationische Lipide, kationische Polymere, kationische Peptide. Diese kationischen Lipide und kationischen Polymere bilden in Anwesenheit von DNA oder RNA aufgrund der gegenläufigen Ladungsverhältnisse spontan sogenannte Lipoplexe oder Polyplexe. Die DNA wird dabei durch die

Kompensation der negativen Ladung am Phosphatrest kondensiert, also in ihrer Größe minimiert. Diese Komplexe können durch die Zellen durch Endozytose aufgenommen werden. Auch werden manchmal Mischformen angewendet, bei welchen die Nukleinsäure durch kationische Polymere„vorkondensiert" wird und anschließend durch kationische Lipide zu einer Mischform aus Lipoplexen und Polyplexen komplexiert werden. Häufig werden dazu beispielsweise Polylysin, Polyarginin oder Polyethylenimin angewendet. Selbstverständlich können auch andere dem Fachmann bekannte kationische Lipide, Polymere und Peptide verwendet werden.

[0012] Die für eine chemisch-basierte nicht-virale Genliefermethode geeigneten Stoffe können aber auch Moleküle mit zumindest einer ersten und einer zweiten Domäne/Molekülteil sein. Dabei ist die erste Domäne als nukleinsäurebindende Domäne/Molekülteil ausgebildet. Unter einem nukleinsäurebindenden Molekülteil versteht man einen Bereich in einem Molekül, der eine Nukleinsäure,

insbesondere DNA und/oder RNA, kovalent oder über nicht kovalente

Wechselwirkungen, insbesondere elektrostatische Kräfte und

Wasserstoffbrückenbindungen bindet. Die zweite Domäne/Molekülteil enthält vorzugsweise einen Liganden. Dieser Ligand kann beispielsweise von einem Rezeptor auf der Zelloberfläche erkannt werden und durch diesen

Erkennungsprozess die Endozytose auslösen.

[0013] Alternativ kann dieser Ligand in der Lage sein, einen Membrantransfer auszulösen, d.h. einen Transport auf die andere Seite der Membran zu vermitteln. Unter Membrantransfer versteht man, dass ein Molekül von einer Seite der Membran auf die andere Seite gelangen kann. Die Liganden, die eine rezeptorvermittelte Endozytose oder einen Membrantransfer auslösen können, können aber auch kovalent an das genetische Material gebunden werden, wenn dadurch die biologische Wirkung nicht oder nur wenig beeinträchtigt wird.

[0014] Die Stoffe können auch besonders formuliert sein, insbesondere als Micellen oder Liposomen, oder auch mehrere Komponenten mit unterschiedlichen Funktionen umfassen.

[0015] Nicht-virale Genliefersysteme, die auf physikalischen Methoden basieren, lokalisieren das genetische Material in der Nähe der Zelle und nutzen Energie insbesondere in Form von thermischer, kinetischer, elektrischer oder sonstiger Energie um einen Transport des genetischen Materials durch die Zellmembran zu vermitteln. Als ein wichtiges Beispiel einer nicht-viralen Methode, die auf einem physikalischen Verfahren beruht sei die Elektroporation genannt. Bei diesem Verfahren werden die zu transfizierenden Zellen zwischen zwei Elektroden verbracht, an die ein geeigneter Spannungsverlauf angelegt wird. Auf diese Weise werden die Zellen einem elektrischen Puls ausgesetzt, der zur einer reversiblen Öffnung (Poren) der Zellmembran führt. Durch diese Poren können Nukleinsäuren in die Zelle eindringen.

[0016] Weitere wichtige physikalische Methoden sind Mikroinjektion,

hydrodynamische Methoden, ballistische Methoden (Genegun) oder Methoden, die Ultraschall benutzen. Darunter fallen auch Methoden, bei welchen die

Nukleinsäure nackt in verschiedene Organe bzw. Muskeln injiziert wird, was in Sonderfällen zu einer geringen Expression der entsprechenden Gene führen kann.

[0017] Kombinationsverfahren wie die Magnetofektion vereinen chemische und physikalische Methoden. Hier werden Nukleinsäuren chemisch auf magnetischen Nanoteilchen immobilisiert um sie durch einen magnetischen Feldgradienten auf der Oberfläche von Zellen anzureichern und Endozytose auszulösen. [0018] Nachteilig an allen nicht-viralen Systemen ist jedoch, wie oben bereits bemerkt, dass ihre Effizienz nicht an die der viralen Systeme heranreicht. Da jedoch die virale Methode aufgrund der vielen Nachteile nur sehr eingeschränkt zur Gentherapie einsetzbar ist, wird unter den nicht-viralen Methoden nach entsprechend leistungsfähigen Alternativen gesucht.

[0019] Im Stand der Technik, beispielsweise der WO2009/065618 oder der WO2010/133369 wurde bereits festgestellt, dass das angeborene Immunsystem eine Barriere für eine erfolgreiche Transfektion darstellen kann, da die Zellen in der Lage sind über endosomale und cytosolische Rezeptoren Nukleinsäuren zu detektieren und daraufhin ihr physiologisches Verhalten zu ändern, mit dem Zweck einen mikrobiellen Angriff abzuwehren. Es ist deshalb im Stand der Technik vorgeschlagen worden, gezielt auf das Immunsystem einzuwirken und so die Transfektionseffizienz zu erhöhen.

[0020] Problematisch bei diesem Vorschlag ist jedoch, dass das angeborene Immunsystem in großen Bereichen einen redundanten Aufbau besitzt, das eine immense Anzahl an miteinander wechselwirkenden Mechanismen umfasst, die zum Teil noch nicht erforscht und deren Zusammenhänge noch nicht geklärt sind. Die Redundanz begründet sich in dem evolutionären Schlagabtausch

insbesondere zwischen Bakterien und Viren einerseits und den Eukaryonten andererseits. Sollte ein Signalstrang als Angriffsstrategie durch ein Pathogen unterbrochen werden, so ist die Zelle aufgrund des redundanten Aufbaus des angeborenen Immunsystems nicht schutzlos ausgeliefert. Als Konsequenz liefert die Unterbrechung eines Signalstranges in der Regel nur moderate Steigerungen der Transfektionseffizienz.

[0021 ] Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es deshalb, basierend auf einem Immunsystemsuppressionsmechanismus ein auf einem nicht-viralen

Genliefersystem beruhendes Transfektionsverfahren bereitzustellen, das eine Erhöhung der Transfektionseffizienz ermöglicht.

Beschreibung der Erfindung [0022] Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren gemäß Patentanspruch 1 , eine Zusammensetzung gemäß Patentanspruch 9, sowie ein Baukastensystem gemäß Patentanspruch 18 gelöst.

[0023] Erfindungsgemäß wird ein Transfektionsverfahren zum Einschleusen einer oder mehrerer Nukleinsäuren in eukaryotische Zellen mittels eines nicht-viralen Genliefersystems vorgeschlagen, bei dem das nicht-virale Genliefersystem in seiner Leistungsfähigkeit dadurch verbessert wird, dass die Zellen vor und/oder während der Transfektion zumindest mit mindestens einem Inhibitor für IKKe und/oder TBK-1 und mindestens einem Inhibitor für zumindest einen

nukleinsäuredetektierenden Toll-like Rezeptor behandelt werden.

[0024] Unter einem Toll-like (ähnliche) Rezeptor (kurz TLR, von engl, toll-like receptor) versteht man Proteine des angeborenen Immunsystems. Sie gehören zu einer Gruppe von Rezeptoren, die der Erkennung von pathogenen Strukturen dienen und entsprechende Aktivierungen von Genen steuern. Hierdurch wird insbesondere die Aktivierung des antigen-spezifischen erworbenen

Immunsystems eingeleitet und moduliert. Durch die Toll-like Rezeptoren vermag das angeborene Immunsystem zwischen„selbst" und„nicht selbst" zu

unterscheiden. Genauer gesagt handelt es sich bei den TLRs um

Transmembranproteine mit einer extrazellulären,„leukin-reichen repeat" Domäne (LRR) und einer zytoplasmatischen Domäne, die derjenigen der IL-1 R Familie homolog ist. Die verschiedenen TLRs reagieren selektiv auf verschiedene molekulare virale und bakterielle Komponenten und steuern über eine

Signaltransduktionskaskade eine entsprechende Aktivierung von Genen. Dies geschieht zunächst über so genannte Adaptermoleküle und darauf folgend über Kinasen, die schließlich Transkriptionsfaktoren (z.B. NF-kappaB und die IRF- Familien) durch Phosphorylierung derselben oder entsprechende intrazelluläre Inhibitoren dieser Transkriptionsfaktoren aktivieren. Letztendlich werden neben einer Vielzahl spezifischer Gene, die eine antimikrobielle Wirkung haben, sogenannte Zytokine produziert. Zytokine sind wiederum notwendige Stimulatoren für das erworbene Immunsystem und damit auch ein Bindeglied zwischen dem angeborenen und erworbenen Immunsystem.

[0025] Bisher sind 13 verschiedene TLRs bekannt (davon 10 beim Menschen), wovon wiederum nur drei beim Menschen momentan als nukleinsauredetektierend gelten: TLR3 (lange dsRNA), TLR7 (ssRNA/dsRNA z.B. von RNA-Viren) und TLR9 (bakterielle/virale DNA).

[0026] IKKe und TBK-1 sind Kinasen, die eine wesentliche Rolle bei einer Signaltransduktionskaskade im angeborenen Immunsystem spielen, die einer Vielzahl von cytosolischen Rezeptoren nachgelagert ist und in der Aktivierung der Transkriptionsfaktoren IRF3 und IRF7 endet. Die Kinase IKKe wird auch als IKKepsilon, IKappa Kepsilon, Ikappa Kinase epsilon oder IKK-3 bezeichnet. TBK-1 wird auch als TANK binding Kinase 1 bezeichnet. Da IKKe und TBK-1 zwei eng verwandte Kinasen sind, wirken Inhibitoren gegen IKKe in der Regel auch gegen TBK-1 und umgekehrt.

[0027] Unter einem Inhibitor wird erfindungsgemäß ein Molekül verstanden, das die biologische Wirkung eines anderen Moleküls, insbesondere eines Proteins verringern oder inhibieren kann. Dabei sind die Inhibitoren selbst Proteine, modifizierte oder un modifizierte Nukleinsäuren oder kleine organische Moleküle, wobei auch geeignete siRNA, die die Expression eines Proteins unterbinden, als Inhibitoren aufgefasst werden können. In diesem Fall muss die siRNA

gegebenenfalls durch das Gen lief ersystem eingeschleust werden. Auch kann die inhibierende Wirkung dadurch zustande kommen, dass ein Molekül maskiert wird, das normalerweise durch ein Protein erkannt wird und dadurch eine biologische Wirkung auslöst. Die Wirksamkeit eines Inhibitors wird mittels des sogenannten IC5o-Wertes oder ECso-Wertes angegeben. Der ICso-Wert gibt die Konzentration eines Inhibitors an, die nötig ist um ein Target (z.B. Enzym, Zelle, Zellrezeptor, Mikroorganismus etc.) in vitro zu 50% zu blockieren. Der ECso-Wert, die effektive Konzentration, gibt diese benötigte Konzentration in vivo an. [0028] Zwar sind beide, die IKKe/TBK1 Kinase und die TLRs, als beeinflussende Faktoren für die Wirksamkeit des Immunsystem bekannt. Es hat sich jedoch völlig unerwarteter weise herausgestellt, dass Zellen, die mit einer Kombination aus einem Inhibitor für die Kinase IKKe und/oder die Kinase TBK-1 und einem Inhibitor für nukleinsäuredetektierende Toll-like Rezeptoren behandelt werden, also bei denen die Wirkung von IKKe/TBK1 Kinasen und TLRs ausgeschaltet wird, eine synergistische Steigerung der Transfektionseffizienz bei der Anwendung nichtviraler Genliefersysteme zeigen. Dabei ist die Steigerung durch die Kombination größer, als die Summe der Steigerungen bei den einzelnen Komponenten.

[0029] Gemäß einem weiteren vorteilhaften Ausführungsbeispiel wird die

Transfektionseffizienz dieses Verfahren insbesondere dadurch gesteigert, dass ein Inhibitor für den Toll-like Rezeptor 9 (TLR9) verwendet wird. TLR9 ist ein Rezeptor für bakterielle DNA, bzw. für nicht methylierte CpG Motive, die in bakterieller DNA gehäuft (20 x häufiger als in Säugerzellen) auftritt. Das CpG Motiv ist in Säugerzellen stark methyliert, wodurch es unterschieden werden kann. Ähnliches wie für bakterielle DNA gilt auch für virale DNA, die auch von TLR9 detektiert wird.

[0030] Gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel wird als Inhibitor für

IKKe/TBK-1 ein Inhibitor mit einem ICso-Wert von weniger als 500 nM,

vorzugsweise weniger als 200 nM, am bevorzugtesten weniger als 100 nM, verwendet und/oder als Inhibitor für den nukleinsäuredetektierenden Toll-like Rezeptor ein Inhibitor mit einem ECso-Wert von weniger als 1000 nM,

vorzugsweise weniger als 500 nM, am bevorzugtesten weniger als 200 nM, verwendet. Inhibitoren mit einem derartigen ICso-Wert bzw. ECso-Wert ermöglichen eine besonders gute Inhibition, die die Transfektionseffizienz signifikant steigert.

[0031 ] Gemäß einem weiteren vorteilhaften Ausführungsbeispiel wird als Inhibitor für den nukleinsäuredetektierenden Toll-like Rezeptor eine Verbindung aus der Gruppe der 9-Aminoacridine und/oder der 4-Aminoquinoline, einschließlich derer Salze, verwendet. [0032] Unter der Gruppe der 4-Aminoquinolin werden Verbindungen und ihre Salze zusannnnengefasst die folgende Grundstruktur zeigen, wobei R1 bis R7 beliebige Substituenten sein können.

[0033] Unter der Gruppe der 9-Aminoacridine werden Verbindungen und ihre Salze zusannnnengefasst, die folgende Grundstruktur zeigen, wobei R1 bis R4 wiederum beliebige Substituenten sein können.

[0034] Gemäß einem bevorzugten Ausführungsbeispiel wird als Inhibitor für mindestens einen Toll-like Rezeptor Quinacrin aus der Gruppe der 9

Aminoacridine und/oder Chloroquin aus der Gruppe der 4-Aminoquinoline verwendet.

Quinacrin:

Chloroquin:

[0035] Zwar wurde Chloroquin schon früher zur Steigerung der

Transfektionseffizienz bei Transfektionsprozessen verwendet, zeigte aber in der bisher untersuchten solitärer Verwendung ein sehr inkonsistentes Verhalten, so dass die Transfektionseffizienz nicht zuverlässig gesteigert werden konnte. Erst durch die erfindungsgemäße Kombination mit einem Inhibitor der IKKe/TBK-1 Kinase konnte eine zuverlässige und signifikante Steigerung der

Transfektionseffizienz erreicht werden.

[0036] Gemäß einem weiteren bevorzugten Ausführungsbeispiel werden als Inhibitoren folgende Verbindungen aus der Gruppe der 9-Aminoacridine und 4- Amino uinoline verwendet:

[0037] Auch diese Verbindungen zeigen in Kombination mit einem Inhibitor der IKKe/TBK-1 Kinase eine deutliche Steigerung der Transfektionseffizienz.

[0038] Alternativ kann als Inhibitor für einen Toll-like Rezeptor auch ein

Oligonukleotid verwendet werden, dessen Sequenz geeignet ist, Toll-like Rezeptoren zu inhibieren, oder es können auch Antikörper verwendet werden, die gegen Toll-like Rezeptoren gerichtet sind. Eine Inhibition lässt sich natürlich auch mit einer Kombination der genannten Ausführungsbeispiele erreichen.

[0039] Dabei können auch hier weitere Inhibitoren für nukleinsauredetektierende Toll-like Rezeptoren vom Rahmen der Erfindung umfasst sein, die erst später als solche erkannt werden. Zudem können zusätzlich zu der Kombination eines Inhibitors für IKKe/TBK-1 und eines Inhibitors für einen Toll-like Rezeptor auch weitere Inhibitoren verwendet werden.

[0040] In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird als Inhibitor für IKKe/TBK-1 einer oder mehrere der folgenden Inhibitoren,

einschließlich deren Salze, verwendet:

BX795 (N-(3-((5-lodo-4-((3-(2-thienylcarbonyl) amino) propyl) amino)-2- pyrimidinyl) amino) phenyl)-1 -pyrrolidinecarboxamide, CAS 702675-74-9); BX320 (N-(3-((5-bromo-2-(3-(pyrrolidine-1 -carbonylamino) anilino) pyrimidin-4-yl)amino) propyl)-2,2- dimethyl propanediamide, CAS 702676- 93-5);

Cay10576 (5-(5,6-Dimethoxybenzimidazol-1 -yl)-3-(2-methanesulfonyl- benzyloxy)-thiophene-2-carbonitrile, CAS 862812-98-4);

Cay10575 (5-(5,6-Dimethoxybenzimidazol-1 -yl)-3-((4-methylsulfonyl) phenyl) methoxy)-2-thiophenecarboxamide, CAS 916985-21 -2);

Amlexanox (2-Amino-7-(1 -methylethyl)-5-oxo-5H-[1 ]Benzopyrano[2,3- b]pyridine-3-carboxylic acid, CAS 68302-57-8);

MRT-67307 (N-[3-[[5-Cyclopropyl-2-[[3-(4-morpholinylmethyl)phenyl]amin o]- 4-pyrimidinyl]amino]propyl]-cyclobutanecarboxamide, CAS 1 190378-57-4); CYT387 (N-(cyanomethyl)-4-[2-[[4-(4-morpholinyl)phenyl]amino]-4- pyrimidinyl]-benzamide, CAS 1056634-68-4).

[0041 ] Bei der vorteilhaften Verwendung dieser Inhibitoren ist eine Steigerung der Transfektionseffizienz deutlich zu sehen. [0042] Als weitere bekannte Inhibitoren für IKKe/TBK-1 können SU6668 (Sugen Inc.), MPI-0485520 (Myraid Pharma), MCCK1 , und der Amgen TBK 1 inhibitor (Compound II) (Ou et al.; Molecular Cell; 201 1 ; 41 ; 458-470) verwendet werden. In EP 1720864, WO 2009030890, WO 2010100431 , WO 2012059171 ,

WO002012161877, WO002012161879, WO002013034238, WO002013024282, WO002013075785, WO0020131 17285, WO002014189806, WO002014128486 WO002014093936, WO002015134171 , WO002016057338, US020150352108 und US020160015709 sind weitere IKKe/TBK-1 Inhibitoren aufgeführt, die ebenfalls Verwendung finden können.

[0043] Dabei können auch andere Inhibitoren verwendet werden, die nicht oben aufgeführt sind, falls sie eine inhibierende Wirkung auf IKKe und/oder TBK-1 aufweisen. Ebenfalls sind Inhibitoren umfasst, deren Wirkung auf IKKe und/oder TBK-1 erst zu einem späteren Zeitpunkt erkannt wird.

[0044] Gemäß einem weiteren vorteilhaften Ausführungsbeispiel des

erfindungsgemäßen Verfahrens handelt es sich bei der durch die Transfektion eingeschleusten Nukleinsäure insbesondere um modifizierte und/oder

unmodifizierte ssDNA, modifizierte und/oder unmodifizierte dsDNA, modifizierte und/oder unmodifizierte ssRNA, modifizierte und/oder unmodifizierte dsRNA. Dabei hat sich als besonders bevorzugt dsDNA und ssRNA erwiesen. Dabei können auch verschiedene Typen von Nukleinsäuren kombiniert angewendet werden, wie es beispielsweise beim "Genome Editing" nach der CRISPR/Cas9 Methode häufig notwendig ist.

[0045] Dabei versteht man unter einer Nukleinsäure eine Ribonukleinsäure oder eine Desoxyribonukleinsäure, die insbesondere aus zwei wenigstens teilweise komplementären Strängen (doppelsträngig = ds) bestehen, z.B. dsDNA und dsRNA, oder die aus einem Strang (einzelsträngig = ss) besteht, z.B. ssDNA und ssRNA, der teilweise komplementäre Bereiche aufweisen kann. Das genetische Material dient im Falle von DNA zur Erzeugung von RNA und/oder Proteinen. Im Falle von ssRNA dient es zur Erzeugung von Proteinen. Im Falle von dsRNA dient das genetische Material dazu einen Knockdown eines Gens durch RNA- Interferrenz zu erreichen oder als microRNA zu wirken. Als Antisense-DNA oder Antisense-RNA dient die Nukleinsäure der Inhibition der Translation von mRNA.

[0046] Als modifizierte Nukleinsäuren bezeichnet man natürliche Nukleinsäuren, die durch Modifikation in ihren Eigenschaften verändert wurden. Dabei können diese Modifikationen insbesondere chemische Veränderungen sein, die das Phosphatgerüst, und/oder die Zucker und/oder die Basen betreffen, was insbesondere die Stabilität der Nukleinsäuren gegen Nukleasen und

Ribonukleasen erhöht und deren Erkennbarkeit durch nukleinsäuredetektierende Rezeptoren verringern soll.

[0047] Des Weiteren können Moleküle (Labels) an die Nukleinsäuren kovalent oder nicht-kovalent angeheftet werden, die zu neuen Eigenschaften der

Nukleinsäuren führen, insbesondere zu optischer Verfolgbarkeit durch

Fluoreszenzlabels oder Labels, die die Nukleinsäuren zu einen bestimmen Ort in der Zelle dirigieren (Lokalisationselemente) oder Labels, die den Durchtritt von Nukleinsäuren durch Membranen vermitteln und so Nukleinsäuren beispielsweise zellgängig machen. Beispiele für Modifikationen sind der Austausch von

Sauerstoff gegen Schwefel im Phosphatgerüst, im Falle von RNA die Methylierung von 2'-OH Gruppen der Ribose, oder die Methylierung der Basen. Ein weiteres Beispiel, ist die vollständige Substitution von 2ΌΗ Gruppen der RNA durch Fluor, um die Stabilität gegen Nukleasen zu erhöhen. Noch ein weiteres Beispiel ist das Anheften von FITC (fluorescein isothiocyanate) als Fluoreszenzlabel, um den Weg des genetischen Materials in der Zelle mikroskopisch verfolgen zu können oder das Anheften von sogenannten NLS (Nuclear localisation Signals, zB.

PKKKRKVG) um einen Transport in den Zellkern zu erreichen.

[0048] Als nicht virales Genliefersystem kann jedes dem Fachmann bekannte Genliefersystem gewählt werden. Insbesondere ist bevorzugt, wie ein weiteres Ausführungsbeispiel zeigt, wenn als nicht-virales Genliefersystem ein

Genliefersystem verwendet wird, das:

ein kationisches Lipid, ein kationisches Polymer, oder ein kationisches Protein umfasst; und/oder eine Verbindung umfasst, die eine DNA und/oder RNA-bindende Domäne aufweist und eine rezeptorvermittelte Endozytose oder einen

Membrantransfer auslösen kann; und/oder

eine Verbindung umfasst, die kovalent an DNA und/oder RNA gebunden ist und eine rezeptorvermittelte Endozytose oder einen Membrantransfer auslösen kann.

[0049] Alternativ oder zusätzlich kann das nicht-virale Gen lief ersystem auch auf einer physikalischen Methode wie Elektroporation, Mikroinjektion, Magnetofektion, Ultraschall oder einer ballistischen oder hydrodynamischen Methode beruhen.

[0050] Gemäß einem weiteren Aspekt vorliegender Erfindung wird ferner eine Zusammensetzung aus zumindest mindestens einem Inhibitor für IKKe und/oder TBK-1 und mindestens einem Inhibitor für zumindest einen

nukleinsäuredetektierenden Toll-like Rezeptor bereitgestellt. Vorzugsweise kann die Zusammensetzung weiterhin zumindest ein nicht-virales Genliefersystem, und/oder eine oder mehrere modifizierte oder unmodifizierte Nukleinsäuren aufweisen.

[0051 ] Dabei können in der Zusammensetzung vorzugsweise einer oder mehrerer der oben diskutierten Inhibitoren, Genliefersysteme und/oder

Nukleinsäuren umfasst sein.

[0052] Gemäß einem weiteren Aspekt vorliegender Erfindung wird ferner ein Baukastensystem zur Durchführung des oben diskutierten Transfektionsverfahren mit zumindest einer ersten Inhibitorenteilzusammensetzung, die mindestens einen der oben diskutierten Inhibitoren für IKKe und/oder TBK-1 umfasst, und einer zweiten Inhibitorenteilzusammensetzung, die mindestens einen der oben diskutierten Inhibitoren für zumindest einen nukleinsäuredetektierende Toll-like Rezeptor umfasst, bereitgestellt.

[0053] Alternativ kann gemäß diesem Aspekt der Erfindung das

Baukastensystem auch eine Inhibitorenzusammensetzung bereitstellen, die mindestens einen Inhibitor für IKKe und/oder TBK-1 und zugleich mindestens einen Inhibitor für zumindest einen nukleinsauredetektierenden Toll-like Rezeptor umfasst.

[0054] Zusätzlich kann das Baukastensystem eine

Genliefersystemzusammensetzung mit mindestens einem nicht-viralen

Genliefersystem, und/oder eine Nukleinsäurezusammensetzung mit mindestens einer modifizierten oder un modifizierten Nukleinsäure bereitstellen.

[0055] Die Inhibitorenzusammensetzung oder mindestens eine der

Inhibitorenteilzusammensetzungen ist dabei eine Zusammensetzung aus

Inhibitoren, wie oben diskutiert.

[0056] Gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel können in dem

Baukastensystem eine oder mehrere der Zusammensetzungen oder

Teilzusammensetzungen eine Kombinationszusammensetzung mit einer oder mehreren anderen Zusammensetzungen oder Teilzusammensetzungen bilden.

[0057] Das heißt, bei dem erfindungsgemäßen Baukastensystem können alle Komponenten getrennt voneinander vorliegen, oder in allen kombinatorisch möglichen Kombinationen als Zusammensetzung gemeinsam vorliegen. So können die Komponenten entweder getrennt voneinander z.B. in Glas- oder Plastikbehälter vorliegen, die gemeinsam verpackt sind, oder die Komponenten können zu zweit oder zu mehreren als Zusammensetzung in entsprechenden Behältern bereitgestellt werden.

[0058] Die erfindungsgemäße Zusammensetzung und/oder das

erfindungsgemäße Baukastensystem können zur Durchführung des

erfindungsgemäßen Verfahrens eingesetzt werden. Ferner kann die

erfindungsgemäße Zusammensetzung als pharmazeutische Zusammensetzung vorliegen. Weiterhin kann eine erfindungsgemäße Zusammensetzung oder ein Baukastensystem zur Behandlung einer Krankheit durch Gentherapie, zum "Genome Editing" z.B. mittels CRISPR-Cas9 oder auch zur repetitiven

Transfektion von Zellen verwendet werden.

[0059] Weitere Vorteile und vorteilhafte Ausführungsbeispiele sind in den Ansprüchen, der Beschreibung und den Zeichnungen definiert. Weiterhin können die beschriebenen Merkmale einzeln oder in Kombination vorliegen. Zudem können, sofern nicht anders angegeben, Merkmale, die in Kombination beschrieben sind, als Einzelmerkmale oder in anderen Kombinationen als der angegebenen Kombination vorliegen.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

[0060] Im Folgenden soll die Erfindung anhand von in den Figuren gezeigten Ausführungsbeispielen näher beschrieben werden. Dabei sind die

Ausführungsbeispiele rein exemplarischer Natur und sollen nicht den

Schutzbereich der Anmeldung definieren. Dieser ist allein durch die anhängigen Ansprüche definiert.

Es zeigen:

Fig. 1 : eine graphische Darstellung von Transfektionseffizienzen gemäß einem ersten Ausführungsbeispiel; und

Fig. 2: eine graphische Darstellung von Transfektionseffizienzen gemäß einem zweiten Ausführungsbeispiel.

Detaillierte Beschreibung der Zeichnungen

[0061 ] Fig. 1 und Fig. 2 zeigen schematisch vergleichende Darstellungen von Transfektionseffizienzen, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren und ohne das erfindungsgemäße Verfahren erzielt werden.

[0062] Wie den Figuren zu entnehmen ist kann durch die erfindungsgemäße Behandlung der Zellen vor und/oder während der Transfektion eine deutliche Steigerung der Transfektionseffizienz erreicht werden. Die Transfektionseffizienz wurde indirekt über ein Luziferaseenzym gemessen, das von der eingeschleusten Nukleinsäure codiert wurde. Es handelt sich dabei um ein sogenanntes

Reportergensystem. Diese sind etablierte Systeme zum Nachweis der

Transfektionseffizienz. Je höher also die Menge an Luziferase ist, die in einem Kulturgefäß nach Lyse der transfizierten Zellen nachgewiesen werden kann, desto größer ist die Transfektionseffizienz. Der Nachweis der Menge von Luziferase erfolgt über eine Enzym-Substratreaktion, bei der ein Lichtquant freigesetzt wird. Diese Lichtquanten können von geeigneten Messgeräten, sogenannten

Luminometern gemessen werden. Da die Anzahl der gemessenen Lichtquanten, insbesondere von dem Zeitintervall abhängig ist, indem die Messung stattfand, wird diese Lichtquantenmenge auch als„relative light units" bezeichnet. Für vergleichende Studien müssen die Messbedingungen demnach gleich sein.

[0063] In den Figuren sind auf der X-Achse die unterschiedlichen Behandlungen der Zellen aufgetragen und auf der y-Achse die für die jeweiligen Behandlungen erzielte Transfektionseffizienz in [%]. Dabei wurden die Messwerte auf die

Transfektion ohne Inhibitoren normiert indem diese 100% gleichgesetzt wurde. Dabei ist bei beiden Beispielen bei der Behandlung durch den IKKe/TBK-1 Inhibitor und einem Inhibitor für einen nukleinsäuredetektierenden Toll-like

Rezeptor eine signifikante Steigerung zu verzeichnen, die auch nicht durch bloße Addition der einzelnen Steigerungsraten für IKKe/TBK-1 Inhibitor und einem Inhibitor für einen nukleinsäuredetektierenden Toll-like Rezeptor allein zu erklären ist. Es handelt sich also klar um einen synergistischen Effekt.

[0064] Zu den Figuren im Einzelnen:

[0065] Als allgemeines Material wurde folgendes verwendet:

1 . HeLa Zellen; ATTC CCL-2

2. Rotifect Plus, Carl Roth; Kat-Nr.: CL21 .2

3. 48 Well Platten; Cellstar; Greiner BioOne; Kat-Nr.: 677180

4. DMEM; High Glucose; Biowest, w/stable Glutamine/Sodiumpyruvat, Kat- Nr.: L103-500

5. Serum FBS Gold; PAN Biotech; Lot.Nr. P130914; Kat-Nr.: P40-37500 6. pCMV-luc, Plasmid Factory, Kat-Nr.: PF461

7. Luciferase Assay Kit, Promega

8. Dimethylsulfoxid (DMSO für die Molekularbiologie), Fluka; Kat-Nr.: 41639

9. (N-(3-((5-lodo-4-((3-(2-thienylcarbonyl)amino)propyl)amino)- 2- pyrimidinyl)amino) phenyl)-1 -pyrrolidinecarboxamide (BX795),

Merck4Biosciences, Kat-Nr.: 204001

10. Chloroquin-diphosphat; Fluka; Kat.-Nr.: C6628

1 1 . Quinacrin Dichlorid Hydrat; TCI; Kat.-Nr.: Q0056

[0066] Beispiel 1 - Fig. 1

Das in Fig. 1 gezeigte, erste Ausführungsbeispiel betrifft eine Lipofektion von HeLa Zellen mit einem handelsüblichen Transfektionsreagenz (Rotifect Plus), die vor und während der Transfektion mit dem Inhibitor BX795 für IKKe und TBK-1 und mit Chloroquin als Inhibitor für TLR9 behandelt wurden.

Die Lipofektion der HeLa Zellen wurde während eines 3-tägigen Zeitraums durchgeführt:

1. Tag: Es wurden HeLa Zellen in eine 48 Well Platte ausgesät. Dabei wurde eine Zellzahl von 1 * 10 5 Zellen pro Well in 250 μΙ komplettem DMEM-Medium (10% FCS) ausplattiert. Anschließend wurde 24 h in einem CO2-lnkubator (10%) inkubiert.

2. Tag:

Von Chloroquin und BX795 wurden Stocklösungen in einem Gemisch aus DMSO und Wasser hergestellt. 2 Stunden vor der Transfektion wurden jeweils 4 Wells mit Chloroquin oder BX795 und 4 Wells mit beiden Substanzen bestückt. Mit einer entsprechenden Menge der beiden Stocklösungen wurde die Konzentration der Inhibitoren in dem Kulturmedium der Zellen dabei so eingestellt, dass Chloroquin in einer Konzentration von 10 μΜ und BX795 in einer Konzentration von 0,5 μΜ vorlag. Weiter wurde darauf geachtet, dass die DMSO Konzentration 1 % v/v nicht überschritt. Die Transfektion aller Zellen in der 48 Well Platte wurde mit 0,3 g pCMV-Luc und 1 ,2 μΙ Rotifect Plus entsprechend den Herstellerangaben für das Transfektionsreagenz durchgeführt. Anschließend wurde 24 h in einem CO2- Inkubator (10%) inkubiert.

3. Tag:

Die Effizienz der Transfektion wurde mit einem Luciferase Assay Kit bestimmt. Der Assay wurde entsprechend den Vorgaben des Herstellers durchgeführt.

Ergebnisse in RLU (Mittelwerte von drei Tests)

ST = Standardtransfektion ohne BX795 und Chloroquin

BX795: C = 0,5 μΜ

Chloroquin: C = 10 μΜ

Die Steigerung durch die einzelne Anwendung von Chloroquin respektive BX795 gegenüber der Standardtransfektion beträgt 19% bzw. 256%. Die Steigerung durch eine kombinierte Anwendung beträgt mit 474% weit mehr als die Summe der Steigerungen bei einzelner Anwendung, d.h. bei der kombinierten Anwendung zeigt sich ein synergistischer Effekt.

[0067] Beispiel 2 - Fig. 2

Das in Fig. 2 gezeigte, zweite Ausführungsbeispiel betrifft eine Lipofektion von HeLa Zellen, die vor und während der Transfektion mit dem Inhibitor BX795 für IKKe und TBK-1 und mit Quinacrin als Inhibitor für TLR9 behandelt wurden.

Die Lipofektion der HeLa Zellen wurde analog Beispiel 1 durchgeführt.

Ergebnisse in RLU/ g Protein (Mittelwerte) 100% 141 % 385% 732%

ST = Standardtransfektion ohne BX795 und Quinacrin

BX795: C =0,5 μΜ

Quinacrin: C = 2,5 μΜ

Die Steigerung durch die einzelne Anwendung von Quinacrin respektive BX795 gegenüber der Standardtransfektion beträgt 41 % bzw. 285%. Die Steigerung durch eine kombinierte Anwendung beträgt mit 632% weit mehr als die Summe der Steigerungen bei einzelner Anwendung, d.h. bei der kombinierten Anwendung zeigt sich ein synergistischer Effekt.

[0068] Im allgemeinen kann also resümiert werden, dass vorteilhafterweise durch die erfindungsgemäße Behandlung der Zellen vor und/oder während der

Transfektion zumindest mit mindestens einem Inhibitor für IKKe und/oder TBK-1 und mindestens einem Inhibitor für zumindest einen nukleinsäuredetektierenden Toll-like Rezeptor eine signifikante Steigerung der Transfektionseffizienz zu verzeichnen ist, die auf einem synergistischen Effekt beruht.