ANIMAL TRANSGENIQUE DONT L'EXPRESSION DES RECEPTEURS AUX OPIACES EST MODIFIEE

L' invention a pour objet un animal transgénique non humain dans lequel l'expression de l'un au moins des gènes codant pour les récepteurs aux opiacés est modifiée

Les opiacés - dont le prototype est la morphine - sont les analgésiques les plus puissants dont dispose la médecine aujourd'hui Leur utilisation est toutefois limitée par un ensemble d'effets secondaires dont les effets sur les fonctions autonomes (constipation, dépression respiratoire, hypotension, diurèse) et les effets psychotropes

L'ensemble des actions des opiacés est médiée par des récepteurs membranaires du système nerveux qui reconnaissent et fixent spécifiquement ces composes II y a 20 ans ces récepteurs ont été mis en évidence par des études pharmacologiques Trois récepteurs ont été identifiés les récepteurs mu, delta et kappa Les gènes codant pour ces trois récepteurs ont été clones et les séquences nucléotidiques des ADN complémentaires codant pour les trois récepteurs sont représentés à la figure 11 (mu), la figure 12 (delta) et la figure

13 (kappa) Il existe aujourd'hui des ligands sélectifs des 3 classes de récepteurs et l'étude de l'action de ces composés suggère

- que le récepteur mu constitue la cible privilégiée de la morphine-opiace prototypique et qui est l'analgésique le plus utilisé pour le traitement de douleurs sévères,

- le récepteur mu constitue également la cible principale de l'héroïne, l'un des narcotiques les plus redoutés dans le contexte de la toxicomanie,

- le récepteur delta serait également impliqué dans le contrôle de la douleur et l 'état affectif (bien-être), mais dans une moindre mesure, - le récepteur kappa, comme les deux autres récepteurs, jouerait un rôle dans l'action analgésique des opiacés Par contre, et contrairement à mu et delta, il aurait une action psychotrope dysphonsante, action qui a ete considérée comme un avantage pour la mise au point d'analgésiques puissants dépourvus de potentiel toxicomanogène Toutes les stratégies élaborées depuis 20 ans par les industries pharmaceutiques pour la mise au point d'un analgésique idéal sont basées sur ces données pharmacologiques Celles-ci comprennent l'analyse in vitro et in vivo de l'effet d'agomstes ou d'antagonistes opiacés L'interprétation des

résultats est tributaire de la sélectivité mu/delta/kappa des produits étudiés et de leurs propriétés pharmacocinétiques pour les études in vivo.

Un ensemble de résultats pharmacologiques semble indiquer l'existence de plusieurs récepteurs dans chacune des classes mu, delta ou kappa et qui 5 pourraient constituer des cibles distinctes pour les agonistes de chacune des classes de récepteurs. La question de savoir s'il existe trois récepteurs seulement ou plusieurs récepteurs mu (μ), delta (δ) et kappa (K) n'est pas résolue aujourd'hui.

Trois gènes codant pour ces récepteurs ont été clones très récemment.

10 Chacun d'eux correspond à l'une des classes de récepteurs précédemment définis par la pharmacologie. Ont donc été caractérisés au niveau moléculaire un gène mu, un gène delta et un gène kappa. L'implication de ces gènes dans l'action biologique des substances opiacées in vivo n'a pas été définie.

Les gènes codant pour les récepteurs aux opiacés ont été clones très 1.5 récemment (Kieffer B. (1995) Cellular and Molecular Neurobiology 15:615-

635).

Dans ce qui suit, on désigne par MOR, le gène du récepteur μ, par DOR le gène du récepteur δ et par KOR le gène du récepteur K.

L'un des aspects de l'invention est de fournir un modèle expérimental 20 permettant de cibler des médicaments présentant les propriétés d'analgésiques puissants, sans présenter les effets secondaires des opiacés du type morphine.

L'un des aspects de l'invention est de fournir des animaux mammifères transgéniques non humains dans lesquels l'un au moins des gènes des récepteurs aux opiacés n'est plus exprimé. 25 L'un des aspects de l'invention est de fournir des animaux mammifères transgéniques non humains dans lesquels le gène du récepteur μ n'est plus exprimé.

L'un des aspects de l'invention est de fournir des animaux mammifères transgéniques non humains dans lesquels le gène du récepteur δ n'est plus 30 exprimé.

L'un des aspects de l'invention est de fournir des animaux mammifères transgéniques non humains dans lesquels le gène du récepteur K n'est plus exprimé.

L'un des autres aspects de l'invention est de fournir un modèle animal 35 susceptible de cribler des médicaments actifs sur des pathologies impliquant l'un au moins des récepteurs aux opiacés.

L'invention a pour objet l'utilisation d'un animal mammifère transgénique non humain dont l'expression de l'un au moins des gènes codant pour les récepteurs aux opiacés est modifiée, notamment supprimée dans les

tissus ou cellules du cerveau, par rapport a une expression normale, notamment dans les tissus ou cellules du cerveau, pour la détermination d'un médicament actif sur les pathologies impliquant les récepteurs aux opiacés

Plus précisément, l'invention a pour objet l'utilisation d'un animal mammifère transgénique non humain dont l'expression du gène codant pour un récepteur aux opiacés est modifiée, notamment dans les tissus nerveux par rapport a une expression normale, notamment dans les tissus nerveux, pour la détermination d'un médicament actif sur les pathologies impliquant les récepteurs aux opiacés, notamment les douleurs sévères aiguës ou chroniques, la toxicomanie, ou la prévention ou le traitement des rejets de greffe

Le terme "mammifère" inclut tous les mammifères à l'exception des humains, avantageusement les rongeurs et notamment les souris

Par "animal transgénique" , on désigne non seulement un animal dans le génome duquel on a introduit un gène exogène, mais également un animal dans lequel on a délété l'expression d'un gène endogène, soit par interruption du gène endogène, soit par remplacement d'un gène endogène ou d'un fragment de celui-ci par une construction telle qu'elle ne permette plus l'expression du gène endogène On désignera de tels animaux par animaux "knock-out" ou déficients en susdit gène endogène. L'expression normale de l'un des récepteurs aux opiacés peut être définie par plusieurs méthodes-

1) Détermination de l'ARNm correspondant à l'un des gènes des récepteurs aux opiacés ceci est possible par la technique de transfert d'ARN

(Northern blot) dans laquelle les ARNm sont sépares sur gel d'agarose dénaturant par électrophorèse, puis les ARN sont transférés et fixés sur une membrane de type nitrocellulose ou Nylon Pour révéler la présence des ARN correspondant à l'un des gènes des récepteurs aux opiacés, on peut utiliser une sonde correspondant à la totalité ou à un fragment de l'ADNc du gène en question 2) Détermination de la quantité de protéine correspondant à l'un des récepteurs aux opiacés ceci est possible en étudiant la liaison d'un ligand opiacé (agoniste ou antagoniste) tel que diprénorphme non sélectif vis-a-vis des lécepteurs opiacés, DAGO (sélectif vis-à-vis de μ), naltπndole (sélectif vis-à-vis de δ) et CI977 (sélectif vis-à-vis de K) marquée, aux récepteurs présents dans un homogénat de tissu (cerveau) S 'agissant des définitions respectives de ces gands, elles sont indiquées dans la légende de la figure 2

En particulier, la constante de dissociation Kd de plusieurs hgands spécifiques de l'un des récepteurs aux opiacés est connue et est de l'ordre de

1 nanomolaire pour les hgands généralement utilisés On sait, par ailleurs,

que le Bmax pour les ligands ci-dessus est de l'ordre de 0, 1 picomole/mg de protéine membranaire pour les récepteurs μ et δ et 0,02 picomoles/mg de protéine membranaire pour le récepteur K s'agissant du cerveau de souris. On sait donc qu'une courbe de saturation avec ce ligand sur des extraits de membranes contenant les trois récepteurs aux opiacés préparés à partir de cerveau et l 'analyse par la méthode de Scatchard (détermination du nombre de sites du récepteur) des résultats obtenus à partir des courbes de saturation, doit donner des valeurs d'affinité de Bmax divisé par deux chez des hétérozygotes et des valeurs de Bmax nulles (non mesurables) chez des homozygotes.

Ceci permet donc de quantifier la quantité correspondant à l 'un des récepteurs aux opiacés.

Selon un mode de réalisation, l'invention concerne l 'utilisation d'un animal mammifère transgénique non humain qui n'exprime plus le gène du récepteur μ, ou du récepteur K ou du récepteur δ.

La modification et l'absence d'expression de l'un de ces gènes peut être déterminée de la façon suivante.

1) Des souris où le gène du récepteur aux opiacés a été modifié de telle sorte qu' il ne puisse plus être exprimé sont d'abord caractérisées relativement à l 'ADN par analyse avec la méthode de transfert d'ADN (Southern blot), à l 'aide d 'une sonde consistant en un fragment contenant tout ou partie de la région du récepteur aux opiacés, cette sonde étant définie dans les exemples.

L'hybridation de cette sonde montre clairement que la bande correspondant à l'un des récepteurs aux opiacés de type sauvage (c'est-à-dire normalement présent chez les animaux) n'est plus présente dans les animaux homozygotes vis-à-vis de la mutation, mais remplacée par une bande correspondant au génome modifié.

2) L'analyse par transfert d'ARN (Northern blot) des ARN extraits des tissus exprimant l'un des récepteurs aux opiacés, notamment cerveau, montre qu' il n'y a plus d'expression d'ARN correspondant au gène sauvage. La sonde utilisée dans ce cas est définie par la portion d'ADN complémentaire codant pour le récepteur opiacé μ de souris en aval du site BamHI unique de la région codante jusqu'au codon STOP.

3) Enfin on peut démontrer aussi que la liaison de ligands spécifiques à l 'un des récepteurs aux opiacés, notamment à l'aide des ligands DAGO

(sélectif vis-à-vis de μ), naltrindole (sélectif vis-à-vis de δ) ou CI977 (sélectif vis-à-vis de K), est complètement absente dans ces souris.

Les tissus dans lesquels l 'expression d'un gène codant pour un récepteur opiacé est modifiée sont essentiellement les tissus nerveux et en particulier les cellules neuronales.

Dans le cadre de l 'invention, on n'exclui pas la modification de l 'expression du susdit gène dans d'autres types de cellules, telles que les cellules immunitaires.

Concernant les pathologies douloureuses traitées par les opiacés concernés par l' invention on peut citer ;

1 . douleurs aiguës ou chroniques : douleurs par excès de nociception avec lésions tissulaires, incluant les douleurs cancéreu.ses, les douleurs postopératoires, les douleurs infectieuses el les douleurs chroniques de type rhumatismes inflammatoires et rhumatismes inflammatoires dégénératifs,

2. douleurs chroniques : douleurs par lésion du système nerveux ou douleurs neuropathiques comprenant (1 ) les déafférentations (exemple : amputation) et les déafférentations avec nociception (exemple : lombosciatalgie résiduelle postopératoire).

Par ailleurs, les antagonistes opiacés peuvent avoir des propriétés immuno-suppressives qui peuvent être mises à profit dans la prévention ou le traitement des greffes, mais le mécanisme de cette action biologique n'est pas connu.

A cet égard, le natrindole a un effet suppressif sur la réaction mixte lymphocytaire (Mixed lymphocyte reaction, MLR en anglais) in vitro et empêche le rejet de greffe in vivo (Arakawa, K. , Akami, T. , Okamoto, M. , Nakai, L , Oka, T. , Nagase, H. Transplantation proceedings (1993) 25:738- 740). Les protocoles expérimentaux concernant l'étude du rejet de greffe se trouvent dans cette référence. Les souris transgéniques de l 'invention permettent d'évaluer la composante mu (vs delta et kappa) dans la réponse des souris aux drogues en développement, par exemple des composés dérivés du natrindole (antagoniste delta) pour la mise au point d'un agent bloquant le rejet de greffe.

Il a été montré par ailleurs que les alcaloïdes opiacés ont une activité immunosuppressive sur d'autres fonctions immunitaires: ils bloquent/inhibent la production d'anticorps et l'activité tueuse ("Natural Killer"), deux composantes essentielles des réponses immunitaires contre les infections. Les souris délétées pour l'expression des récepteurs opioïdes seront donc également utilisées en tant que modèle animal pour tester l 'action des drogues immunosuppressives de types opiacées mises au point pour l'application ci- dessus, pour toutes les composantes de la réponse immunitaire.

Dans ce qui précède et ce qui suit, par "gènes μ du récepteur aux opiacés" , on désigne également les isoformes générées par épissage alternatif qui se situent au niveau de la jonction spécifique au gène mu (entre exon 3 et 4) : Zimprich, A. , Simon, T. and Hôllt, V. (1995) Cloning and expression of an isoform of the rat μ-opioid receptor (rMORlB) which differs in agonist- induced desensitization from RMOR1. FEBS 3. J ⁾ : 142-146 and Bare, LA. , Mansson, E. and Yang, DM. (1994) Expression of two variants of the human μ-opioid receptor mRNA in SK-N-SH cells and human brain. FEBS 354:213- 216. L'invention concerne également l'utilisation d'un animal mammifère transgénique non humain tel que décrit ci-dessus qui n'exprime plus l'un au moins des récepteurs suivants : le récepteur aux opiacés de type mu, le récepteur aux opiacés de type kappa et le récepteur aux opiacés de type delta.

L'invention concerne également un animal mammifère transgénique non humain ou cellules de mammifères contenant le gène du récepteur aux opiacés de type mu, dans lequel un fragment du gène du récepteur contenant un exon, notamment l'exon 2 est

- soit remplacé par tout ou partie d'un gène marqueur sous le contrôle d'un promoteur approprié, - soit interrompu par l'insertion entre deux nucléotides contigus par tout ou partie d'un gène marqueur sous le contrôle d'un promoteur approprié, notamment le gène de résistance à la néomycine (neo) sous le contrôle du promoteur phosphoglycérate kinase-1 (PGK-1), l'expression du gène de type mu étant supprimée. Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, l'animal mammifère transgénique ou les cellules de mammifère dans lequel le gène μ n'est plus exprimé sont tels qu'il y a interruption du gène μ, notamment d'un exon et en particulier de l'exon 2, par insertion entre deux nucléotides contigus par tout ou partie d'un gène marqueur sous le contrôle d'un promoteur approprié, notamment le gène de résistance à la néomycine (neo) sous le contrôle du promoteur phosphoglycérate kinase-1 (PGK-1), l'expression du gène de type mu étant supprimée.

L'invention concerne également un animal mammifère transgénique non humain ou cellules de mammifères contenant le gène du récepteur aux opiacés de type delta, dans lequel un fragment du gène du récepteur contenant un exon, notamment l'exon 1 est

- soit remplacé par tout ou partie d'un gène marqueur sous le contrôle d'un promoteur approprié,

- soit interrompu par l'insertion entre deux nucléotides contigus par tout ou partie d'un gène marqueur sous le contrôle d'un promoteur approprié, notamment le gène de résistance à la néomycine (neo) sous le contrôle du promoteur phosphoglycérate kinase -1 (PGK-1), l'expression du gène de type delta étant supprimée.

Selon un mode de réalisation avantageux de l 'invention, l 'animal mammifère transgénique ou les cellules de mammifère dans lequel le gène delta n'est plus exprimé sont tels qu'il y a remplacement d'un fragment du gène 6 contenant un exon, notamment l'exon 1 par tout ou partie d'un gène marqueur sous le contrôle d'un promoteur approprié.

L'invention a également pour objet un animal mammifère transgénique non humain ou cellules de mammifères contenant le gène du récepteur aux opiacés de type kappa, dans lequel un fragment du gène du récepteur contenant un exon, notamment l'exon 1 est - soit remplacé par tout ou partie d'un gène marqueur sous le contrôle d'un promoteur approprié,

- soit interrompu par l'insertion entre deux nucléotides contigus par tout ou partie d'un gène marqueur sous le contrôle d'un promoteur approprié, notamment le gène de résistance à la néomycine (neo) sous le contrôle du promoteur phosphoglycérate kinase -1 (PGK-1), l'expression du gène kappa étant supprimée.

Selon un mode de réalisation avantageux de l' invention, l'animal mammifère transgénique ou les cellules de mammifère dans lequel le gène kappa n'est plus exprimé sont tels qu'il y a remplacement d'un fragment du gène K contenant un exon, notamment l'exon 1 par tout ou partie d'un gène marqueur sous le contrôle d'un promoteur approprié.

L'invention concerne également des cellules cultivées à partir des animaux mammifères transgéniques non humains décrits ci-dessus.

Selon un mode de réalisation avantageux, l'invention concerne des cultures cellulaires contenant l'une des susdites constructions transgéniques.

Ces cultures cellulaires peuvent être obtenues soit à partir de cellules prélevées sur des animaux transgéniques tels que définis ci-dessus ou soit à partir de lignées cellulaires en utilisant les susdites constructions transgéniques, cette deuxième possibilité pouvant être effectuée à l'aide de techniques standard de transfection cellulaire.

L'invention concerne également un mammifère transgénique non humain tel qu'obtenu par introduction dans un blastocyte de cellules souches embryonnaires (cellules ES) comportant dans leur génome l'une des susdites constructions transgéniques, obtenue par recombinaison homologue, sélection

d'animaux chimères mâles selon un critère correspondant à la lignée ES, croisement des animaux sélectionnés avec des souris, notamment des souris C57 Black 6, pour obtenir des animaux hétérozygotes par rapport à l'une des susdites constructions et éventuellement croisement de deux hétérozygotes pour obtenir un animal homozygote par rapport à l'une des susdites constructions.

L'homozygote présente un fond génétique 129/C57 Black 6 50/50. On peut revenir sur un fond génétique C57 Black 6 par croisement homozygote avec des souris C57 Black 6 sur 12 générations au moins. On choisit de façon avantageuse les souris C57 Black 6, car ce fond génétique est plus favorable pour certaines expériences de comportement.

L'invention concerne également un mammifère transgénique tel que produit par croisement d'animaux transgéniques exprimant l'une des constructions transgéniques définies ci-dessus. L' invention concerne également un procédé d'obtention d'un modèle transgénique pour l'étude des pathologies impliquant les récepteurs aux opiacés de type mu, ou les récepteurs aux opiacés de type delta ou les récepteurs aux opiacés de type kappa, et de leur traitement, comprenant

- le remplacement du gène endogène du récepteur aux opiacés de type μ, ou du gène endogène du récepteur aux opiacés de type delta ou du gène endogène du récepteur aux opiacés de type kappa, dans des cellules, notamment embryonnaires souches de souris (ES), cellules par une construction comprenant le gène du récepteur aux opiacés de type mu, ou le gène du récepteur aux opiacés de type delta ou le gène du récepteur aux opiacés de type kappa, dans lequel respectivement

* l'exon 2 du gène du récepteur aux opiacés de type mu est interrompu entre deux nucléotides contigus par une portion d'un gène marqueur sous le contrôle d'un promoteur approprié, notamment une cassette contenant le gène neo sous le contrôle du promoteur PGKI, ou

* un fragment contenant l'exon 1 du gène du récepteur aux opiacés de type delta est remplacé par un gène marqueur sous le contrôle d'un promoteur approprié, notamment une cassette contenant le gène neo sous le contrôle du promoteur PGKI, ou * un fragment contenant l'exon 1 du gène du récepteur aux opiacés de type kappa est remplacé par un gène marqueur sous le contrôle d'un promoteur approprié, notamment une cassette contenant le gène neo sous le contrôle du promoteur PGKI,

et en particulier dans lequel le gène du récepteur aux opiacés de type mu est interrompu au site BamIII de l'exon 2 par l'insertion de la cassette PGK-neo, ou le fragment génomique Sma I-Sma I de 600 pb, contenant l'exon 1 du gène du récepteur aux opiacés de type delta est remplacé par la cassette PGK-neo, ou le fragment génomique de 235 pb de l 'exon 1 du gène du récepteur aux opiacés de type kappa contenant l'ATG initiateur de l'exon 1 et 232 paires de bases en aval du susdit ATG est remplacé par la cassette PGK-neo, et

- l ' introduction des susdites cellules dans des embryons, notamment des blastocytes de mammifères non humains,

- la sélection d'animaux chimères mâles selon un critère correspondant à la lignée ES,

- le croisement des animaux sélectionnés avec des souris, notamment des souris C57BL/6, pour obtenir des animaux hétérozygotes par rapport à l'une des constructions selon l' invention et

- éventuellement le croisement de deux hétérozygotes pour obtenir un animal homozygote par rapport à l'une des constructions selon l ' invention.

Le critère utilisé est par exemple la couleur des poils (Agouti).

L' invention concerne un procédé de criblage de médicaments actifs sur des pathologies impliquant les récepteurs aux opiacés, notamment les pathologies suivantes : douleurs sévères aiguës ou chroniques, toxicomanie, prévention ou traitement de rejet de greffes, comprenant :

- l'administration à un mammifère non humain transgénique ou à des cellules de mammifères non humains transgéniques contenant à la place du gène endogène du récepteur aux opiacés de type mu, ou du gène endogène du récepteur aux opiacés de type delta, ou du gène endogène du récepteur aux opiacés de type kappa, une construction contenant le gène du récepteur aux opiacés de type mu, ou le gène du récepteur aux opiacés de type delta ou le gène du récepteur aux opiacés de type kappa, dans lequel respectivement

* l'exon 2 du gène du récepteur aux opiacés de type mu est interrompu entre deux nucléotides contigus par une portion d'un gène marqueur sous le contrôle d'un promoteur approprié, notamment une cassette contenant le gène neo sous le contrôle du promoteur PGKI, ou

* un fragment contenant l'exon 1 du gène du récepteur aux opiacés de type delta est remplacé par un gène marqueur sous le contrôle

d'un promoteur approprié, notamment une cassette contenant le gène neo sous le contrôle du promoteur PGKI, ou * un fragment contenant l'exon 1 du gène du récepteur aux opiacés de type kappa est remplacé par un gène marqueur sous le contrôle d'un promoteur approprié, notamment une cassette contenant le gène neo sous le contrôle du promoteur PGKI , et en particulier dans lequel le gène du récepteur aux opiacés de type mu est interrompu au site BamIII de l 'exon 2 par l 'insertion de la cassette neo, ou le fragment génomique Sma I-Sma I de 600 pb, contenant l'exon 1 du gène du récepteur aux opiacés de type delta est remplacé par la cassette PGK-neo, ou le fragment génomique de 235 pb de l 'exon 1 du gène du récepteur aux opiacés de type kappa contenant l'ATG initiateur de l 'exon 1 et 232 paires de bases en aval du susdit ATG est remplacé par la cassette PGK-neo ;

- la détermination des seuils nociceptifs par le test de l' immersion de la queue et de la plaque chaude après injection des drogues à tester,

- la détermination de la réponse aux drogues à tester pour les animaux dans lesquels on a produit une douleur chronique induite par l' injection de produits irritants, carrhagénane et adjuvant de Freund et produisant des monoarthrites ou polyarthrites ou le test de section du nerf sciatique ou le test de ligature du nerf sciatique dans le cas de douleurs neuropathiques,

- ou la détermination des propriétés psychotropes des drogues à tester par les tests de préférence de place ou d'auto-administration, ou la détermination du niveau de dépendance physique par l'induction d'une dépendance sévère et la provocation d'un sevrage dans le cas de la toxicomanie,

- ou la détermination de la réaction mixte lymphocytaire et de la durée de vie des greffons (Arakawa, K. , Akami, T. , Okamoto, M. , Nakai, L , Oka,

T. , Nagase, H. Transplantation proceedings (1993) 2-- .738-740) dans le cas de la prévention ou du traitement du rejet de greffes.

L'invention concerne également une construction transgénique contenant le gène du récepteur aux opiacés de type mu, ou le gène du récepteur aux opiacés de type delta ou le gène du récepteur aux opiacés de type kappa, dans lequel respectivement

- l 'exon 2 du gène du récepteur aux opiacés de type mu est interrompu entre deux nucléotides contigus par une portion d'un gène marqueur sous le

contrôle d 'un promoteur approprié, notamment une cassette contenant le gène neo sous le contrôle du promoteur PGKI, ou

- un fragment contenant l 'exon 1 du gène du récepteur aux opiacés de type delta est remplacé par un gène marqueur sous le contrôle d'un promoteur approprié, notamment une cassette contenant le gène neo sous le contrôle du promoteur PGKI, ou

- un fragment contenant l'exon 1 du gène du récepteur aux opiacés de type kappa est remplacé par un gène marqueur sous le contrôle d'un promoteur approprié, notamment une cassette contenant le gène neo sous le contrôle du promoteur PGKI, et en particulier dans lequel le gène du récepteur aux opiacés de type mu est interrompu au site BamHI de l'exon 2 par l 'insertion de la cassette neo, ou le fragment génomique Sma I-Sma I de 600 pb, contenant l 'exon 1 du gène du récepteur aux opiacés de type delta est remplacé par la cassette PGK-neo, ou le fragment génomique de 235 pb de l'exon 1 du gène du récepteur aux opiacés de type kappa contenant l'ATG initiateur de l 'exon 1 et 232 paires de bases en aval du susdit ATG est remplacé par la cassette PGK-neo.

Description des figures : - Figure 1 :

Interruption du gène du récepteur opioïde μ . a) Stratégie de préparation des souris n'exprimant plus le gène μ. L'organisation génomique et les cartes de restriction sont représentées de la façon suivante : pour la construction (sommet), gène sauvage (milieu) et gène recombinant (bas). Les boîtes noires représentent les régions codantes et la boite blanche représente le gène Néo. La ligne renforcée indique la sonde en 5 ' utilisée pour identifier les événements de recombinaison homologue. E,exon; Néo, gène de résistance à la néomycine ; sites de restriction : B, BamH I ; S, Sal I ; Sp, Spe 1. b) Analyse génomique par transfert d'ADN (Southern blot) réalisé avec de l 'ADN digéré par BamH I à partir de cellules ES électroporées, en utilisant la sonde 5 ' . Les fragments du gène sauvage et du gène recombinant sont respectivement de 6,3 kb et 7,6 kb. c) Analyse génomique par transfert d'ADN (Southern blot) réalisé avec de l'ADN de queues de souris. Les souris hétérozygotes sont croisées, l'ADN génomique de leur progéniture est soumis à une digestion par BamH I et analysé en utilisant la sonde 5 ' . Les génotypes sont décrits au-dessus de chaque bande : + / + , sauvage; + /-, hétérozygote; -/- homozygote.

- Figure 2 :

Analyse des sites de liaison des récepteurs μ, δ et K dans les cerveaux de souris sauvages +/ + , hétérozygotes +/- et homozygotes -/- déficients en gène du récepteur μ. 5 a) Une analyse de Scatchard vis-à-vis de la liaison avec [-1H] DAGO (μ),

[ ³ H] NTI (δ) et H] CI977 (K) est représentée pour chaque génotype de souris. Un essai représentatif est montré. Les valeurs de Bmax et de Kd (± SEM = écart type moyen) à partir d'au moins trois expériences distinctes sont indiquées. o

Kd Bmax Kd Bnux Kd Bmax

0 -t / + 1 343 0 099 0.068 0.095 0 214 0.019

(0.104) (0 005) (0.005) (0.010) (0 019) (0 001)

5

Λ f / 1 133 0 040 0 075 0 103 0 198 0 021

(0 105) (0 004) (0 011) (0 010) (0 025) (0 001)

m -/- und uπd 0.082 0124 0211 0022 0 (0.014) (0 008) (0 025) (0 002) und = indétectable b) Autoradiogrammes colorés par ordinateur des sections coronaires de cerveaux de souris coupés au niveau du caudate putamen. Les panneaux supérieurs montrent les récepteurs μ marqués avec f ³ II] DAGO, les panneaux 5 du milieu montrent les récepteurs δ marqués avec l*1H] DELTI et les panneaux inférieurs montrent les récepteurs K marqués avec H] CI977. La liaison est exprimée en fmol/mg de section de tissu et la liaison spécifique est > 85% pour le marquage de μ et δ et > 75 % pour le marquage de K . Les souris sauvages, hétérozygotes et homozygotes sont traitées en parallèle pour la 0 liaison et pour le développement des autoradiogrammes. c) Comme dans b), à l'exception du fait que les sections coronaires sont montrées au niveau de l'hippocampe.

METHODES.

35 Pour l'analyse de saturation, la liaison est effectuée en utilisant des protéines de membranes de cerveau entier (Ilien et al. Biochemical Pharmacology (1988). 3.1:3843-3851) à raison de 100 μg incubées dans Tris-IICl 50 mM pH 7.4, EDTA 1 mM 25 °C pendant 1 h avec [ ³ HJ DAGO (Amersham), [ ³ H] NTI (don de A. Borsodi) ou [ ³ HJ CI977 (Amersham) en

40 utilisant des domaines de concentration de 0.05-6,4 nM, 0.005-0.64 nM et

0.01 - 1.28 nM respectivement. De la naloxone (Sigma) est utilisée à une

concentration de 2 μM pour déterminer la liaison non spécifique. Les expériences sont réalisées en triple en utilisant au moins deux préparations de membranes distinctes, chacune faite à partir de trois cerveaux. Les données de liaison sont analysées en utilisant le programme EBDA-LIGAND (Biosoft). Pour la cartographie par autoradiographie, les souris sont tuées par décapitation et les cerveaux intacts enlevés et immédiatement congelés dans l'isopentane à -20°C. Des sections coronaires gelées de 20 μm sont coupées dans un cryostat (Zeiss Microm 505E) et sont montées en étant dégelées sui ^¬ des lamelles pour microscope pré-traitées avec de la gélatine et séchées en utilisant CaSO-j. anhydre pendant 1 semaine à -20 °C. Un ensemble additionnel de sections est coupé de façon adjacente à celles-ci pour la détermination de liaisons non spécifiques qui est déterminée pour tous les ligands avec la naloxone (1 μM pour DAGO, CI-977 et 10 μM pour DELT I). Des lamelles sont préincubées dans Tris-HCl 50 mM, pli 7.4, plus 0.9% NaCl pendant 30 minutes pour éliminer les opioïdes endogènes. Une concentration d'environ

3 à 4 fois les Kd est utilisée pour le marquage des récepteurs ([ H] DAGO,

4 nM; [ ³ H] DELT I, 7 nM; [ ³ H] CI977, 2.5 nM). La liaison est effectuée dans Tris-HCl 50 mM, pH 7.4 (1 ml pour chaque lamelle) à température ambiante pendant 60 minutes pour tous les ligands, lavée trois fois avec du tampon Tris-HCl refroidi à 4°C (5 minutes), rapidement séché à l'air frais et dessiqué pendant 3 jours avant de l'apposer à des films autobiographiques l H]-Hyperfilm (Amersham) pour une période de trois semaines (μ et δ) et quatre semaines. Toutes les lamelles des cerveaux +/ + , + /-et -/- sont déposées sur le même film, développées (en utilisant 50% Kodak D19 developer, 3 minutes) et analysées en utilisant un analyseur d'image MCID

(Imaging Research, Canada). Ligands : CI977 (enadoline ou (-)-(5b,7b,8a)- 3,4-dichloro-N-méthyl-N[7-(l-pyrrolidinyl)-l-oxaspiro[4,5]- dec-8-yl]benzo[bJ furan-4-acétamide), DAGO, f ³ H]-D-Ala ² MePhe ⁴ Gly-ol ⁵ enképhaline ; DELT I, D-Ala-^deltorphine I; NTI, naltrindole.

- Figure 3 :

Analyse de l'hybridation in situ de gènes de peptides opioïdes endogènes dans les cerveaux mutants et sauvages. a) Les sections coronaires au niveau du striatum (PENK et PDYN, grossissement xl5) et au niveau de l'hypothalamus (POMC, grossissement x40) des cerveaux +/ + , + /- et -/- sont représentées sous l'illumination en champ sombre avec le grain du signal apparaissant en blanc. Le marquage en utilisant les sondes d'ARN antisens de la proenképhaline (PENK) et de la prodynorphine (PDYN) est détecté dans le noyau accumbens (ACB), caudate

putamen (CPU), le tubercule olfactif (OTU) et le cortex piriforme (PIR) et le marquage en utilisant la ribosonde antisense POMC est détecté dans le noyau arqué (AN). b) Le fort grossissement (x lOO) des sections à travers l ' hypothalamus et à travers la glande pituitaire de cerveaux de souris + /-+ et -/- hybrides à la ribosonde antisens proopioimelanocortine (POMC) est photographié sous illumination en champ clair (les grains du signal apparaissent comme taches noires). Les cellules contenant le transcript POMC sont représentées dans le noyau arqué et le marquage du lobe intermédiaire (IL) de la glande pituitaire est aussi représenté.

METHODES.

Des sections (10 μM) sont préparées au cryostat à partir de cerveaux congelés et hybridées avec des ribosondes antisens spécifiques marquées au **\S comme décrit (Decimo et al. , (1995) In situ hybridization of nucleic acid probes to cellular RNA. In Gène Probes 2, A practical approach, Kd . Hames

B.D. et Hiddins S. , 183-210 Oxford University Press, Oxford). La sonde

PENK est synthétisée à partir d'un fragment d'ADNc de 800 pb Pvu II-Xba I clonée dans pBluescript, la sonde PDYN à partir d'un fragment de restriction de 1700 pb Pst I-EcoR I sous-cloné dans pSP64 et la sonde POMC à partir d'un fragment de 400 pb Not I-Nco I clone dans pBluescript. Les ADNcs sont un don de E. Borrelli. Les ribosondes sont synthétisées en parallèle, les cerveaux des trois génotypes sont traités et hybrides dans la même série d'expériences, et exposés sous émulsion Kodak NTB-2 pendant la même période de temps.

- Figure 4 :

Activité locomotrice spontanée de souris mutantes dépourvues de récepteurs opioïdes μ (-/-), et de leurs congénères de type sauvage (+/ + ). Les boites consistent en des surfaces rectangulaires plastique (25.5 cm x 20.5 cm) avec deux photocellules croisées, isolées dans un cadre insonorisé avec une illumination légère (lux). L'activité locomotrice est mesurée à 14 h pendant trois jours consécutifs. La mesure dure 15 minutes. Aux jours 5 et 6, l'activité locomotrice est enregistrée à 14 h et 2 h respectivement. Toutes les expériences sont faites par un observateur aveugle. Les valeurs sont analysées par le système statistique ANOVA. Les comparaisons individuelles sont faites par le test de Dunnett. Le nombre d'animaux: 24 sauvages et 23 mutants. Les carrés noirs correspondent aux souris homozygotes et les carrés blancs correspondent aux souris sauvages. Les étoiles noires indiquent la comparaison à différents temps de mesure pour le même groupe d'animaux :

a. schéma de gauche : entre le premier et le troisième jour, b. schéma de droit : entre 14 h et 2 h.

Les étoiles blanches montrent ia comparaison entre les groupes sauvages et mutants au même moment de mesure (test de Dunnett bilatéral). Une étoile correspond à p < 0.05 et deux étoiles correspondent à p < 0.01 .

- Figure 5 :

Réponses antinociceptives à l'administration de morphine dans les souris mutantes dépourvues de récepteur opioïde μ (-/-) et leurs congénères de type sauvage ( + / + ). Pour évaluer la repon.se à la douleur, on a effectué : a) test de l'immersion de la queue ; b) test de la plaque chaude.

Le test de l'immersion de la queue (54 °C) et le test de la plaque chaude sont effectués 10 minutes et 20 minutes respectivement après injection de solution saline ou de morphine. Le temps maximal observé est de 15 secondes pour le test de l'immersion de la queue, et de 30 et 180 secondes respectivement pour la réponse au léchage et au saut dans le test de la plaque chaude. Les tests pharmacologiques et le soin aux animaux est fait selon les normes éthiques standard (NIH, 1985). Les valeurs sont analysées par ANOVA (mutation et traitement) entre les sujets. Les comparaisons individuelles sont faites par le test de Dunnett. Le nombre d'animaux par groupe est de 7 à 11.

Les carrés noirs correspondent aux souris homozygotes et les carrés blancs correspondent aux souris sauvages. Les étoiles noires indiquent les comparaisons entre les animaux traités avec une solution saline (animaux témoins) du même génotype et les étoiles blanches montrent la comparaison entre les groupes sauvages et mutants qui reçoivent le même traitement (test de Dunnett bilatéral).

Une étoile correspond à p < 0.05 et deux étoiles correspondent à p < 0.01.

- Figure 6 :

Pour évaluer le caractère euphorisant des drogues, on effectue le test de la place de préférence à la place conditionnée, induite par la morphine dans les souris dépourvues de récepteur opioïde μ (-/-), et leurs congénères de type sauvage ( + / + ). Le paradigme de la préférence de place est effectué en utilisant les mêmes conditions expérimentales que celles données dans (Valverde et al. , 1996), à l'exception du temps de conditionnement ( 18 minutes) et de la taille des compartiments (15 cm x 15 cm x 15 cm) . En

bref, le schéma de conditionnement consiste en 3 phases. Pendant la phase de préconditionnement, les animaux sont placés sur une surface neutre et le temps passé dans chaque compartiment est enregistré. La phase de conditionnement consiste en 6 jours consécutifs de morphine (3 mg/kg, sous-cutanée) ou de solution saline. Les portes situées sur les murs des compartiments permettent de confiner les souris immédiatement après l' injection. Les souris reçoivent la morphine aux jours 1 , 3 et 5, et la solution saline aux jours 2, 4 et 6. Les animaux témoins reçoivent la solution saline chaque jour. La phase de test est réalisée exactement comme la phase de préconditionnement (libre accès de chaque compartiment), 24 h après l'étape de conditionnement finale. Les données sont exprimées en résultats calculés comme différence entre le temps de postconditionnement et de préconditionnement passé dans le compartiment associé avec le médicament. Les valeurs sont analysées par ANOVA (mutation et traitement) entre les sujets. Le nombre d'animaux par groupe est de 9 à 14. Les étoiles noires indiquent les comparaisons entre les animaux traités avec une solution saline (animaux témoins) du même génotype et les étoiles blanches montrent la comparaison entre les groupes sauvages et mutants qui reçoivent le même traitement (test de Student "t bilatéral). Deux étoiles correspondent à p < 0.01 .

- Figure 7 :

Incidence de l'abstinence mesurée pendant le syndrome de manque de morphine provoqué par la naloxone dans des souris mutantes dépourvues de récepteurs opioïdes μ (-/-), et leurs congénères de type sauvage ( + / + ). a) Signes somatiques. Les carrés noirs correspondent aux souris homozygotes et les carrés blancs correspondent aux souris sauvages, b) Signes végétatifs.

Les résultats sont exprimés comme moyennes ± SEM. La dépendance aux opiacés est induite dans les souris par des injections intrapéritonéales répétées de morphine, à intervalle de 12 heures pendant 6 jours. La dose de morphine est progressivement augmentée comme suit: premier jour, 20 mg/kg; deuxième jour: 40 mg/kg; troisième jour: 60 mg/kg; quatrième jour: 80 mg/kg; cinquième jour: 100 mg/kg; sixième jour (seulement une injection le matin) 100 mg/kg. Les souris témoins sont traitées avec de la solution saline dans les mêmes conditions. Le manque est provoqué dans chaque animal en injectant de la naloxone (1 mg/kg, sous-cutanée) seulement une fois 2 heures après la dernière administration de morphine. Trente minutes avant l' injection de naloxone, les animaux sont placés individuellement dans des chambres de test consistant en des boîtes rondes transparentes (30 cm de diamètre x 50 cm

de hauteur) avec un sol blanc. Pendant les 15 minutes précédant l ' injection de naloxone, les souris sont observées afin de vérifier la présence d'un comportement normal . Les signes somatiques de manque sont évalués immédiatement après l ' injection de l 'antagoniste opiacé pendant une période de 30 minutes. Le nombre d'ébrouements, de sauts, de tremblements de la patte et de reniflage sont comptés. Le claquement de dents, les diarrhées, tremblements et ptôses sont évalués pendant des périodes de 5 minutes, un point pour la présence de chaque signe étant donné pendant chaque période. Le nombre de périodes montrant le signe est ensuite compté (score maximum : 6). Le poids corporel et la température rectale sont déterminés 2 minutes avant et

30 minutes après l ' injection de naloxone. La température rectale est également mesurée 60 minutes après la naloxone. Voir légende de la figure 5 pour l 'analyse statistique. Le nombre d'animaux par groupe va de 9 à 14.

Les carrés noirs correspondent aux témoins homozygotes ayant reçu une injection de solution saline. Les carrés blancs correspondent aux témoins sauvages ayant reçu une injection de solution saline.

Les carrés comportant des diagonales serrées correspondent aux témoins homozygotes ayant reçu une injection de morphine. Les carrés comportant des diagonales espacées correspondent aux témoins sauvages ayant reçu une injection de morphine.

Les étoiles noires indiquent les comparaisons entre les animaux traités avec une solution saline (animaux témoins) du même génotype et les étoiles blanches montrent la comparaison entre les groupes sauvages et mutants qui reçoivent le même traitement (test de Student "t bilatéral). Une étoile correspond à p < 0.05 et deux étoiles correspondent à p < 0.01 .

- Figure 8 : Criblage ES : Interruption du gène mu par recombinaison homologue : A. Représentation d'un fragment BamH I-BamH I (environ 14 kb) du gène mu de souris pour lequel la recombinaison homologue a eu lieu. Le gène néo avec son promoteur et son signal de polyadénylation sont insérés dans l 'exon 2 (nucléotides 6375 à 7989). La position des sondes externes 5 ' et 3' , ainsi que la sonde néo est indiquée en gras sous le fragment de gène schématisé.

B. Taille des fragments attendus lors du criblage par Southern de l'ADN génomique de cellules ES. Digestion de l'ADN par BamH I et hybridation du Southern avec la sonde I ( = sonde 5 '). WT = fragment sauvage; Rec = fragment muté.

C. Taille des fragments attendus lors du criblage par Southern de l'ADN génomique de cellules ES. Digestion de l'ADN par BamH I et hybridation du Southern avec la sonde II ( = sonde néo. WT = fragment sauvage; Rec = fragment muté. D. Taille des fragments attendus lors du criblage par Southern de l 'ADN génomique de cellules ES. Digestion de l'ADN par EcoR I -f Neo I et hybridation du Southern avec la sonde III ( = sonde 3 '). WT = fragment sauvage; Rec = fragment muté.

Légende : - le trait correspond au génome,

- le rectangle blanc correspond à l ' intron mMOR,

- le rectangle noir correspond à l'exon mMOR,

- le rectangle comportant les diagonales espacées correspond au promoteur PGK, - le rectangle comportant les diagonales serrées correspond au gène neo.

- Figure 9 : Construction δ

Interruption du gène delta par recombinaison homologue.

A. Carte de restriction d'un fragment Sac I-EcoR I d'environ 14.5 kb du gène delta de souris contenant l'exon 1 codant pour les acides aminés 1 à 77 du récepteur delta.

B. Portion du gène delta Sac I-EcoR I utilisé pour réaliser le vecteur de recombinaison homologue. Le fragment de 1.9 kb contenant le gène néo a été inséré dans les sites Sma I présents de part et d'autre de l'exon 1 . C. Résultat de la recombinaison homologue: la totalité de l 'exon I est remplacée par le gène néo. La position des sondes 5' et 3' externes utilisées pour le criblage est indiquée sous forme de traits gras sous le fragment de gène schématisé. La sonde 5' (= sonde 1) correspond à un fragment Sac I-Sac I de 700 pb. La sonde 3' (•= sonde 2) a été obtenue par PCR avec les oligos indiqués sur le schéma et a une taille de 300 pb.

Légende :

- les carrés comportant des diagonales correspondent au gène néo,

- les carrés comportant des losanges correspondent à l'exon 1. A = Apal S = SacI B = BamHI Sa! = Sali

E = EcoRI Sc ≈Sca l

K =KpnI Sm = SmaI

N ≈Notl Sp=SpeI

- Figure 10 : Construction K :

Interruption du gène kappa par recombinaison homologue.

A. Carte de restriction d'un fragment EcoR I-EcoR I d'environ 16 kb du gène kappa de souris contenant les exons 1 et 2 codant respectivement pour les acides aminés 1 à 86 et 87 à 102 du récepteur kappa. Le sites EcoR I. Sac I et

BamH I sont présents naturellement dans le gène; les deux sites Sma I ont été créés par mutagénèse dirigée. Les tailles des fragments BamH I-BamH I et EcoR 1-EcoR I sont indiquées.

B. Portion du gène kappa BamH I-BamH I utilisé pour réaliser le vecteur de recombinaison homologue.

C. Résultat de la recombinaison homologue: la plus grande partie de l 'exon 1 est remplacée par le gène néo. La position des sondes 5 ' et 3' externes utilisées pour le criblage est indiquée sous forme de traits gras sous le fragment de cène schématisé.

- Figure 11 :

La figure 11 représente la séquence nucléotidique, ainsi que la séquence en acides aminés déduite du gène codant pour le récepteur mu de souris, flanquée de séquences nucléotidiques 5' et 3' non traduites.

- Figure 12 :

La figure 12 représente la séquence nucléotidique, ainsi que la séquence en acides aminés déduite du gène codant pour le récepteur delta de souris, flanquée de séquences nucléotidiques 5' et 3 ' non traduites.

- Figure 13 :

La figure 13 représente la séquence nucléotidique, ainsi que la séquence en acides aminés déduite du gène codant pour le récepteur kappa de souris, flanquée de séquences nucléotidiques 5 ' et 3' non traduites.

EXEMPLE 1 :

Création d'une lignée de souris mutantes pour laquelle le gène codant pour le récepteur opioïde mu n'est plus exprimé.

Méthodes. Une banque génomique de souris dérivée de la souche 129/sv est criblée en utilisant une sonde d'ADNc du récepteur opioïde δ de souris

(Kieffer B. et al. ( 1992) PNAS £9_: 12048) dans des conditions faiblement stringentes. Un fragment génomique codant le récepteur μ contenant les exons 2 et 3 est obtenu et un fragment Sal I/Spe I de 6,8 kb est excisé et sous-cloné dans pBlueScript (Stratagene). Une cassette Bgl II de 1 .6 kb contenant le gène

de résistance à la néomycine sous le contrôle du promoteur PGK (Lufkin, T. , Dierich, A. , LeMeur, M. , Mark, M. and Chambon, P. (1991 ) Cell 66: 1 105) est insérée dans un site unique BamH I présent dans l'exon 2, éliminant ainsi les sites endogènes BamH I et interrompant la séquence codante au niveau de la seconde boucle intracellulaire (acide aminé 193). Le vecteur cible est linéarisé et électroporé dans des cellules (Pl)-ES (Lullcin, T. , Dierich. A. , LeMeur, M. , Mark, M. and Chambon, P. (1991 ) Cell 66: 1 105). Les clones résistants à la néomycine sont criblés par transfert d'ADN en utilisant une sonde en 5' marquée au 32p générée par PCR sur les fragments génomiques provenant de la digestion par BamH I. Les mêmes transferts sont ensuite hybrides avec une sonde en 3' générée par PCR, ainsi que la sonde Néo constituée par le fragment de 536 pb BamH I-Pvu II de l'ADNc codant pour la néomycine (Lufkin, T. , Dierich, A., LeMeur, M. , Mark, M. and Chambon, P. (1991) Cell 66: 1105) pour confirmation de recombinaison homologue. S 'agissant des sondes, elles ont été générées par PCR à partir de l'ADN génomique dans la région située entre les sites BamH I et Sal I pour la sonde 5' et proche du site Neo I pour la sonde en 3 ' . Les oligonucléotides qui ont permis de les obtenir sont les suivants : sonde 5' : oligo sens: 5'CTGGATAATAATGGAGAAATACAGAC3' oligo antisens: 5ΑGAGGGAGCCTGTAAGCATGAAG3'

Taille: 463 pb sonde 3' : oligo sens: 5 GTGGCTCCGCΛGGTTCTAGCA3 ' oligo antisens: 5 GCACTTGACAACACAGΛGTTTA3' Taille: 1010 pb. Un clone positif est micro-injecté dans des blastocytes C57BL/6 (Lufkin,

T. , Dierich, A. , LeMeur, M. , Mark, M. and Chambon, P. (1991) Cell 66: 1105) et donne naissance à des descendants chimériques qui à leur tour sont croisés avec des souris C57BL/6. Des souriceaux de couleur Agouti sont caryotypés par analyse par transfert d'ADN de biopsie de queues et les mâles transmettant la lignée sont utilisés pour fonder une colonie.

Résultat : Génération de souris déficientes en MOR. Le gène du récepteur opioïde μ (MOR) est inactivé dans des cellules souche embryonnaire 129/Sv par insertion d'une cassette Néo dans la région codante du gène (figure 1 a). Les événements de ciblage du gène sont identifiés par transfert d'ADN (figure 1 b) et 7 clones parmi 90 résistants à la néomycine se sont révélés positifs, représentant une fréquence de ciblage de l/13ème. L'analyse par transfert d'ADN en utilisant une sonde en 3' générée par PCR et la sonde Néo confirme l'intégration précise d'une copie unique du fragment de gène MOR interrompu (non représenté). Un clone positif ES est

utilisé pour établir une souris mutante (figure 1 c). L'analyse par saturation de liaison (3H) DAGO ([ ³ H]-D-Ala ² -MePhe ⁴ Gly-ol ⁵ ) sur des homogénats de cerveaux entiers confirme une réduction de 50% des sites de liaison du récepteur μ dans les animaux hétérozygotes et une perte totale de liaison du ligand μ dans les mutants homozygotes (figure 2a). Les éludes autoradiographiques de liaison (3H) DAGO montrent l 'absence de site de liaison du récepteur μ dans toutes les coupes de cerveau examinées chez les souris homozygotes et une diminution de moitié chez les souris hétérozygotes. Ces résultats démontrent l'inactivation complète du gène MOR. RESULTATS .

Le génotype des souris montre que les descendants hétérozygotes suivent la fréquence attendue de Mendel, indiquant l 'absence de mortalité in utero d'animaux déficients en gène MOR sur les deux allèles. Aucune anomalie morphologique évidente n'a pu être détectée dans les souris mutantes homozygotes et l 'anatomie générale de leur cerveau apparaît normale, suggérant l'absence d'implication majeure du gène MOR dans le développement. Les souris déficientes en gène MOR ne diffèrent pas de leurs congénères en santé et en croissance. Les souris homozygotes sont fertiles, sont élevées normalement et aucune incidence de comportement maternel n'a pu être observée.

Expression des peptides opioïdes endogènes et des sites de liaison du récepteur opioïde :

Pour déterminer si l'absence du récepteur μ peut altérer l'expression des récepteurs δ et K, on a quantifié le nombre de sites de liaison des récepteurs δ et K sur les homogénats de cerveau entier. L'analyse par le test de Scatchard en utilisant des ligands radiomarqués spécifiques de δ (NTI) et K (CI977) montre des courbes de liaison superposables pour les cerveaux des souris + / + , ^* +-/- et -/- (figure 2 a), et des valeurs de Kd et de B max (nombre de sites récepteurs) concordent avec celles rapportées dans la littérature (Boyle S.J. et al. (1990) Molecular Neuropharmacology .23-29 ; Fang R.J. et al.

(1994) Journal of Pharmacol. Exp. Therapeutics 268:836-846 et Robson L.E. et al. (1985) European Journal of Pharmacol. 112:65-71). Ces résultats montrent que le nombre total de récepteurs δ et K n'est pas modifié dans les animaux déficients en récepteur μ. Etant donné que la distribution des récepteurs peut néanmoins être modifiée, on a effectué une cartographie par autoradiographie complète à partir du bulbe olfactif dans les régions du cerveau frontales et médianes. Dans les souris de type sauvage, la distribution anatomiques des sites μ, δ et K est similaire à celui reporté dans les autres souris (Moskowitz. and Goodman, 1985 ; Dupin et ai , 1991 ; Sharif and

Hughes, 1989) et le rat (Mansour et al. , 1987 ; Boyle et ai , 1990). La liaison aux récepteurs δ et K est présente dans toutes les régions dans lesquelles la liaison est détectée dans les souris de type sauvage. Il y a cependant quelques différences quantitatives de région et un nombre plus faible de récepteurs a été détecté par la deltorphine 1 chez la souris -/-. On n'a pas encore déterminé si cette différence est d'ordre méthodologique ou réelle.

Trois précurseurs des peptides opioïdes ont été décrits dans le système nerveux central, le proencéphaline (PENK), la prodynorphine (PDYN) et la proopioïmelanocortine (POMC). La synthèse de POMC est réduite au noyau arqué de l'hypothalamus dans le cerveau, tandis que les transcripts PENK et

PDYN ont des distributions qui se recouvrent substantiellement dans les ganglions de base (Kachaturian et al. (1993) Handbook of Exp. Pharmacol. vol. 104/1, Opioids I. Ed. Λ. Herz). On a investigué l'effet de l'absence du récepteur μ sur l'expression de ces gènes en utilisant l'analyse par hybridation in situ. Il n'y a pas de modification dans le réseau d'expression de PENK dans le tubercule olfactif, le cortex piriforme, le noyau accumbens et le striatum parmi les génotypes de souris (figure 3a). Dans les ganglions de base, l'ARNm de PDYN est trouvé élevé dans accumbens et moins abondant dans caudate- putamen pour les trois cerveaux de souris +/ + , +/- et -/- (figure 3a). De plus, le radiomarquage des noyaux supraoptique et hypothalamiques paraventriculaires par la sonde PDYN est inchangé (pas représenté), l 'expression de POMC est limitée aux neurones arqués dans les trois souches de souris (figure 3a), avec un nombre similaire et une distribution de cellules contenant le transcript (figure 3b). Enfin, l'expression de POMC est aussi recherchée dans la glande pituitaire et un fort marquage du lobe intermédiaire est observé avec aucune différence significative dans les animaux déficients en récepteur μ (figure 3b). Par conséquent, les schémas de marquage paraissent non distingables parmi les génotypes, suggérant que les niveaux de distribution et d'expression des peptides opioïdes sont inchangés en l'absence de récepteurs μ.

POMC et PENK codent pour les β-endorphine et les enképhalines, peptides qui, de préférence, ciblent le récepteur μ. L'absence de diminution évidente de ces peptides en l'absence de leur récepteur suggère que l'expression du récepteur n'exerce pas de contrôle négatif sur la synthèse des ligands endogènes.

Comportement spontané :

L'activité locomotrice spontanée des souris mutantes est évaluée dans les boîtes d'activité locomotrice pendant trois sessions faites à 14 h dans des jours consécutifs. Lorsque les animaux sont exposés aux boîtes pour la première

fois, aucune différence significative dans l'activité locomotrice n'est observée entre les souris mutantes et leurs congénères de type sauvage. Cependant, une tendance à l'hypolocomotion est observée dans les deux premières sessions. L'activité locomotrice des souris est ensuite mesurée dans les mêmes boîtes s durant le jour (14 h) et la nuit (2 h). A la fois les souris mutantes et les souris de type sauvage montrent une augmentation significative de l'activité locomotrice pendant la nuit, suggérant que le rythme circadien n'est pas modifié dans les souris qui manquent de récepteur μ. Pendant les périodes du jour et de la nuit, l 'activité des animaux mutants est également plus faible dans

K) cet environnement familier, selon l'observation préliminaire faite pendant les deux premières sessions. Ainsi, l'activité locomotrice des animaux déficients en récepteur μ et homozygotes est légèrement décrue (22 % du degré des souris sauvages).

Réponse au traitement aigu et chronique à la morphine :

15 Les réponses pharmacologiques obtenues après une administration aiguë et chronique de morphine sont étudiées chez les souris déficientes en récepteur opioïde μ. Dans une première expérience, les effets antinociceptifs induits par une injection aiguë de morphine (2 et 6 mg/kg, sous-cutanée) sont évalués dans l'immersion de la queue (latence de retrait de la queue) et plaque chaude

20 (latence de léchage et de saut). Le seuil nociceptif des souris mutantes et de type sauvage est le même dans les différents paramètres évalués dans les deux tests, suggérant l'absence d'implication du récepteur μ dans la perception nociceptive de base. Dans les souris de type sauvage, l'administration de morphine induit des réponses antinociceptives significatives dans le test

25 d' immersion de la queue, et dans le léchage, et dans le saut du test de la plaque chaude. Dans les mutants, aucune réponse antinociceptive n'est induite par la morphine dans aucun de ces seuils nociceptifs (figure 5).

Dans une seconde expérience, les propriétés de renforcement de la morphine sont recherchées dans le même groupe d'animaux en utilisant le

30 paradigme de conditionnement à la plaque (Valverde et al. (1996)

Psychopharmacology 121: 119-126). L'administration de morphine induit une préférence de place conditionnée chez les souris de type sauvage, comme le montre une augmentation significative du temps passé dans le compartiment associé à la morphine pendant la phase de test. Ce comportement conditionné

35 n'est pas observé chez les souris mutantes, qui passent le même temps dans le compartiment destiné à la morphine dans les phases de conditionnement (figure 6). La réponse observée dans ce test est probablement due à une perte de propriétés d'auto-récompense de la morphine chez les souris dépourvues de récepteur opioïde μ.

Dans une troisième expérience, un degré de dépendance important est induit en donnant des doses augmentées de morphine, et la manifestation de symptômes (somaliques) de manque est évaluée après l 'administration de naloxone. Après traitement chronique à la morphine, les souris de type sauvage mais pas les mutantes montrent les signes classiques de rongeurs traités aux opiacés, tels que le réflexe de Straub et l 'activité locomotrice augmentée. L'administration de naloxone ne change pas le comportement dans les témoins auxquels on administre une solution saline et induit les différents symptômes comportementaux du manque dans les animaux sauvages traités par la morphine (figure 7). Dans les animaux mutants traités chroniquement à la morphine, l ' injection de naloxone n' induit aucune modification comportementale, montrant l'absence de dépendance à la morphine dans les souris déficientes en récepteur opioïde μ.

Le traitement aux opiacés chronique augmente la réponse de la voie de transduction du signal d'AMP cyclique spécifiquement dans les zones du cerveau impliquées dans la tolérance aux opiacés et la dépendance (locus coeruleus, amygdales, striatum) (Terwilliger, R.Z. , Beitner-Johnson, D. , Sevarino, K.A. , Crain, S. M. and Nestler, E.J . Brain Res. , 548: 100-1 10 (1991 ); Duman, R.S. , Tall an, J.F. and Nestler, E.J. J. Pharmacol . Exp. Ther. 246: 1033-1039 (1988)), un phénomène que l'on pense être impliqué dans le syndrome du manque (Nestler, E.J. , Hope, B.T. and Widnell, K.L. Neuron, 11:995-1006 (1993)). Pour fournir une base biochimique pour la dernière observation comportementale, on a quantifié l'activité de l 'adénylate cyclase de base et stimulée par la forskoline dans le striatum de souris sauvages et de souris déficientes après manque de morphine induite par la naloxone. L'analyse statistique montre une interaction significative (corrélation) entre le traitement à la morphine et le génotype +/ + pour à la fois l'activité d'adénylate cyclase de base (F(l ,12) = 7.15, p= 0.0203) et stimulée par la forskoline (F(l , 12) = 7.36, p=0.0189). Ainsi, l'administration de naloxone après traitement chronique à la morphine résulte dans une activité d'adénylate cyclase du striatum augmentée de 30% chez les souris sauvages selon les observations précédentes (Terwilliger, R.Z. , Beitner-Johnson, D. , Sevarino, K.A. , Crain, S. M. and Nestler, E.J. Brain Res. , 548: 100- 1 10 (1991 )). Au contraire, l'accroissement de l'activité de cyclase est absente chez les animaux déficients en récepteur μ. Comme témoin négatif, on a utilisé l'activité d'adénylate cyclase dans le cerebellum, une région naturellement dépourvue de récepteurs μ, et on a trouvé aucun changement significatif entre les différents groupes. Ce résultat suggère que l'absence de récepteur μ chez les animaux mutants homozygotes empêche le développement de l'activité de

1 adenylate cyclase et supporte l'hypothèse selon laquelle l 'augmentation de la voie de l 'AMP cyclique est impliquée dans l'abstinence aux opiacés

Tableau 1

Activité de l'adénylate cyclase stimulée par la forskoline et basale (FK, 100 mM) dans les homogénats du striatum et cervelet à partir de souris sauvages ( + / + ) et déficientes homozygotes (-/-) après manque à la morphine induit pai la naloxone Les résultats sont exprimés en pmoles d'AMP cyclique iυrme/minute/mg de protéine et représente la moyenne ± SEM de quatre expériences individuelles en triple L'étoile indique p < 0,05 compate au témoin (solution saline)

μ + / + μ -/-

Saline Morphine Saline Morphine

Basai 278 ± 23 401 ± 22* 304 ± 16 304 ± 28

STRIATUM

FK 1130 ± 71 1473 ± 43* 1196 ± 40 1 158 ± 108

Basai 235 ± 35 209 ± 30 236 ± 17 213 ± 42

CEREBELLUM

FK 1075 ± 115 966 ± 55 1068 ± 56 979 ± 73

METHODES

Les souris traitées de façon chronique (voir figure 7) soit avec la solution saline soit avec la morphine reçoivent une injection unique de naloxone et sont tuées 1 h après Les tissus sont homogénéisés dans 10 volumes d'un tampon refroidi à la glace contenant ^• Tris-HCl 20 mM, pH 8 0, EDTA 1 mM, DTT (dithiothreitol) 0 5 mM, PMSF (fluorure de phénylméthylsulfonyle) 0.5 mM

Les homogénats (40-100 μg de protéine) sont incubés à 37 °C pendant 10 minutes dans 60 μl d'un milieu test de composition suivante : Tris 50 mM, pH 7.6, MgCh 5 mM, ΛMPc 1 mM, ATP 100 μM conlenant 106 cpm (u-32p)-ATP, avec un système de régénération consistant en 5 mM de créatine phosphate et 250 mg/ml de créatine kinase. La quantité du α-^P-AMPc formé est mesurée après séparation d'AMPc à partir d'ATP sur des colonnes d'aluminium comme précédemment décrit (Hanoune, J. , Stengel, D. , Lacombe, M.L. , Feldmann, G. et Coudrier, E. (1977) J. Biol. Chem. 252:2039-2045). La protéine est déterminée en utilisant l 'essai Bio-Rad (Bio- Rad, FRG). L'analyse statistique est effectuée en utilisant l'ensemble général linéaire modèle du programme SAS (Cary, N.C. (1989) in SAS Institute Inc. : SAS/STAT User 's Guide Version 6 (SAS Institute Corporation), vol. 1).

CONCLUSIONS . Aucune anomalie morphologique évidente n'est détectée chez ces souris, qui grandissent et se reproduisent normalement et présentent une activité circadienne préservée.

On a étudié les sites de liaison des récepteurs opioïdes (μ, δ et K) par analyse par saturation et cartographie par autoradiographie sur des sections du cerveau et on a analysé les figures d'expression des gènes des peptides endogènes opioïdes (proenkephaline, prodynorphyne et proopiomélanocortine) par hybridation in situ. On montre une absence totale de sites de liaison des récepteurs opioïdes μ dans les souris -/-, sans changement marqué dans le nombre de sites δ et K dans ces animaux. On a analysé la distribution de l 'expression des peptides opioïdes et observé que l'on ne peut pas faire de distinction entre les souris de type sauvage et mutantes. Ces observations indiquent que des changements compensatoires sont intervenus dans le système opioïde endogène en l'absence du récepteur μ.

On dispose par conséquent d'un modèle animal pour étudier l'analgésie induite par les opiacés, l' auto-récompense et la dépendance physique. Des expériences pharmacologiques in vitro et in vivo réalisées antérieurement avaient montré que les trois sous-types de récepteurs opioïdes seraient impliqués dans la régulation du stimulus nociceptif. De plus, à la fois les récepteurs μ et δ sont impliqués dans les propriétés d'auto-récompense des opiacés et sont des candidats pour participer à l'expression de la dépendance physique aux opiacés. Le but de la présente étude est donc de déterminer la contribution des récepteurs μ en réponse aux opiacés in vivo et pour mesurer la réponse comportementale des animaux, nous avons utilisé la morphine comme médicament prototype opiacé.

On a étudié l'analgésie induite par la morphine en utilisant les tests d'immersion de la queue et de la plaque chaude, où la réponse nociceptive implique de façon prédominante des mécanismes respectivement spinaux et supraspinaux. En l'absence de médicament, les seuils de douleurs sont identiques entre les souris + / + et -/-, suggérant que le récepteur opioïde μ n'est pas impliqué dans le maintien d'une perception normale de la douleur ou que son rôle physiologique peut être compensé par d'autres mécanismes différents du système opioïde endogène. La morphine induit une analgésie dépendant de la dose dans les animaux de type sauvage, mais, la morphine est complètement sans effet chez les souris déficientes en récepteur μ. L'absence de réponse à la morphine dans le test de l'immersion de la queue est particulièrement intéressante et conduit à reconsidérer le rôle des autres récepteurs opioïdes dans l'analgésie spinale.

Les propriétés d'auto-récompense de la morphine dans le paradigme de la préférence de place sont également étudiées. Le phénotype des souris mutantes est clair: aucune préférence de place conditionnée n'est observée chez les souris mutantes, tandis que la morphine induit des effets ré-enforceants marqués chez les souris de type sauvage.

Une forte dépendance physique est également induite par l ' injection de doses croissantes de morphine (jusqu'à 100 mg/kg) et le syndrome manque induit en injectant l'antagoniste naloxone opioïde non spécifique. Dans les souris de type sauvage, la naloxone provoque les signes somatiques classiques de manque, de même que la perte de poids et l'hypothermie. Au contraire, les souris homozygotes déficientes en récepteur μ ne présentent aucun des signes comportemental ou végétatif d'abstinence observés chez les animaux de type sauvage. Afin de donner un support biochimique à ce dernier résultat, on a mesuré l'activité de I'adénylate cyclase dans le striatum des souris abstinentes. On a trouvé une augmentation de 30% de l'activité de I'adénylate cyclase de base et de celle induite par la forskoline chez les souris de type sauvage en manque de morphine, ainsi que précédemment décrit dans la littérature. Au contraire, aucune modification des niveaux de formation d'AMP cyclique n'est observée dans les souris mutantes.

Cet ensemble de résultats est d'un intérêt primordial pour la compréhension de l'action biologique des médicaments opiacés. Par la présente invention, on rapporte l'identification de la cible moléculaire de la morphine.

On démontre également que l'activité du gène MOR est absolument essentielle pour l'analgésie induite par la morphine, les effets d'auto-récompense et de dépendance physique. De plus, on montre également par la présente invention que les récepteurs δ et K n'interviennent pas dans les actions biologiques de la

morphine - même partiellement - en l'absence du récepteur μ, bien que ces recepteui s soient exprimés et se lient aux ligands opioïdes chez les souris mutantes Par conséquent, le produit du gène du lecepteur opioïde μ n'est pas seulement la cible préférée de la morphine, comme décrit, mais également un composant nécessaire a l'action des opiaces La présente approche génétique montre poui la première fois le iôle indispensable du récepteur opioïde μ dans de multiples actions des opiacés

EXEMPLE 2 : 0 Création d'une lignée de souris mutantes pour laquelle le gène codant pour le récepteur opioïde kappa a été interrompu par recombinaison homologue.

Le gène codant pour le récepteur opioïde kappa de souris a été obtenu pai criblage d'une banque d'ADN génomique de souris SVJ129 (commercialisée par Stratagene, USA), à l'aide d'une onde de 231 paires de base (pb) codant pour les acides aminés 6 à 82 du récepteui kappa Huit clones positifs ont été obtenus et la position du premier exon codant a ete cartographiéc en utilisant des techniques standards Un fragment de restriction BamH I de 6,8 kilopaires de base (kb, voir figure 10), contenant le 0 piemier exon codant, a été sous clone dans le vecteur pBluescupt

(Stratagene) dans lequel le site Sma I a été détruit piealablement Deux sites Sma I ont ensuite été créés par mutagenèse dirigée, l'un sur le site d'initiation de la traduction (CCATGG en CCCGGG), l'autre à l'extrémité 5' de l'exonl Ces deux sites ont ainsi permis de détruire le site d'initiation de la 5 traduction (ATG) et d'éliminer un fragment de 234 pb contenant la majorité de la séquence codante contenue dans l'exon 1 (voir figure 10) Ce fragment a été remplacé par une cassete néo contenant le gène de résistance à la néomycine, flanqué d'un promoteur en 5' et d'un signal de polyadenylation en 3' issus du gène PGK (phosphoglycérate kinase) Le vecteur final (von ^" *•() figure) contient 1 ,3 kb en 5' et 5,2 kb en 3' de séquences du gène kappa

Cette construction a été électroporée dans des cellules embryonnaires souches (ES) provenant de souris de la lignée SV129 Les cellules ont ensuite été sélectionnées au G418 et les clones résistants ont été sous clones L'ADN génomique de ces clones a été isolé et analysé par transfert d'ADN ^' >'> (Southern) en utilisant des sondes externes 5' et 3' (voir figure). Les cellules d'un des clones positifs ont été injectées dans des blastocystes de souris de la lignée C57/BL6 et des souris chimériques ont été obtenues Ces chimères, par croisement avec des souris C57/BL6, ont permis d'obtenir des souris hétérozygotes poui la mutation, puis le croisement de ces souris entre elles a

permis d'obtenir les animaux homozygotes. Le génotype des souris hétérozygotes et homozygotes a été déterminé par transfert d'ADN (Southern) génomique en utilisant les sondes externes 5' et 3' .

5 Les détails techniques sont les suivants :

La sonde externe 3' : correspond à un fragment de restriction BamIIl/SacI d'environ 700 pb situé à 5,2 kb en 3' de l'cxonl (voir figure 10)

La sonde externe 5' : correspond à un fragment de restriction

K) SacI/BamHl d'environ 600 pb situé à 1 ,3 kb de l'exonl . Le site BamHI de ce fragment est présent naturellement dans le gène du récepteur kappa (voir igure 10). Le site Sacl (non représenté sur la figure) correspond à un site de clonage présent dans le phage λ Fix II qui a été utilisé pour construire la banque d'ADN génomique de souris.

15 On a ensuite analysé les sites de liaison des récepteurs K , μ et δ dans les cerveaux de souris sauvages +/ + , hétérozygotes +/- et homozygotes -/- déficients en gène du récepteur kappa (voir tableau ci-dessous). L'anlayse par saturation de liaison (3H) CI977 (ligand kappa sélectif) sur des homogénats de cerveaux entiers indique une réduction de 50 % des sites de liaison du

20 récepteur kappa dans les animaux hétérozygotes et une perte totale de liaison du ligand kappa dans les mutants homozygotes. Par ailleurs, on n'observe pas de variation de la liaison des ligands mu (3H) DAGO) et delta (3H)NTI et (3II)Deltorphine I) chez les animaux mutants par rapport aux animaux sauvages, ce qui indique l'absence de phénomènes compensatoires au niveau

25 des récepteurs mu et delta.

CI977 DAGO Deltorphine 1 NTI Kd (nM) Bmax Kd Bmax Kd Bmax Kd Bmax

(pmole/mg de protéines)

+/+ 0, 137 0,040 1 ,26 0, 153 0,42 0,089 0, 108 0,204 (0,001) (0,002) (0,24) (0,024) (0,02) (0,001) (0,020) (0,023)

+/- 0, 173 0,020 1 ,36 0, 146 0,380 0,099 0, 109 0, 170 (0,004) (0,002) (0, 1 1) (0,003) (0,004) (0,01) (0,028) (0,03)

-/- indétec¬ indétec¬ 1 ,39 0, 139 0,319 0,090 0, 1 14 0, 190 table table (0, 12) (0,014) (0,07) (0,008) (0,010) (0,013)

Des études de cartographie autoradiographiques de liaison de (3H) CI977 réalisées sur des coupes de cerveau ont confirmé l'absence de sites de liaison du récepteur kappa à travers l'ensemble du cerveau chez les souris homozygotes et une diminution de 50% chez les souris hétérozygotes. De même, les études autoradiographiques de liaison de (311) Deltorphine I et de

(3H) DAGO ont montré que la distribution de ces sites n'est pas altérée, confirmant l 'absence de phénomènes compensatoires au niveau des récepteurs delt et mu. Pour déterminer si l'absence de récepteurs kappa peut altérer l 'expression des gènes codant pour les peptides opioïdes (enképhalines, dynorphincs et beta-endorphine), on a effectué sur le cerveau des animaux

+ / ^* + , + /- et -/-, une analyse du taux des messagers codant pour ces peptides, par hybridation in situ. Aucune modification n'a été observée dans toutes les régions analysées. Par ailleurs, on a montré que les souris homozygotes pour la mutation ne présentent plus d'analgésie suite à l'injection sous cutanée d'un agoniste kappa sélectif (le U50488-H, 6 et

20 mg/kg), ni lors du test de retrait de la queue, ni lors du test de la plaque chaude.

L'ensemble de ces résultats démontrent l' inactivation complète du gène codant pour le récepteur kappa. Les détails techniques sont les suivants :

Les protocoles utilisés pour réaliser les expériences de liaison sur homogénats de cerveau, les études autoradiagraphiques, les hybridations in situ, ainsi que les tests comportementaux, sont identiques à ceux utilisés pour l 'analyse des animaux pour lesquels le gène codant pour le récepteur mu a été interrompu (voir exemple 1).

EXEMPLE 3 :

Création d'une lignée de souris mutantes pour laquelle le gène codant pour le récepteur opioïde delta a été interrompu par recombinaison homologue.

Une banque génomique de souris (cellules ES SV 129/D3), clonée dans le vecteur EMBL3, a été criblée avec une sonde d'ADNc de souris. Plusieurs clones ont été obtenus. Le clone de phage 17.2, qui a une taille de 14.5 kb et qui contient le premier exon du gène codant pour le récepteur opioïde delta, a été utilisé pour la construction du vecteur pour la recombinaison homologue dans des cellules embryonnaires de souris. D'abord une carte de restriction a été réalisé autour du premier exon. La construction du vecteur a été fait en quatre étapes: (1) Un fragment EcoR I/Not I de 7.2 kb contenant le premier exon du gène du récepteur opioïde delta a été clone dans le vecteur

pBluescript. (2) Le premier exon a été enlevé en coupant ce plasmide par l 'enzyme Sma I. (3) Un fragment de 1.9 kb du vecteur pKJ- 1 (Lufkin. T. , Dierich. A. , LeMeur, M . , Mark, M. and Chambon, P. (1991 ) Cell, : 1 105) contenant le gène de résistance de la Néomycine sous contrôle du promoteur PGK est inséré à cet endroit. (4) Un fragment de 1 .3 kb Not I-Sac I du clone de phage 17.2 est ajouté en amont de cette construction. La construction finale est représentée dans la figure 9 et a été vérifié par séquençage.

S 'agissant de la sonde 5' , elle est représentée par sonde 1 sur la figure 9 et correspond au fragment Sac I-Sac I (représenté par sonde 1 sur la figure 9) indiqué sur la carte de restriction du gène.

S 'agissant de la sonde 3' , elle est représentée par le fragment obtenu par PCR situé entre les sites EcoR I (voir figure 9, sonde 2). Les oligonucléotides qui ont permis de l'obtenir sont respectivement: oligonucléotide sens: 5ΑGGAAGCCTGGGTCTCCTTC3 ' oligonucléotide antisens: 5'GTGCACCATGGGTGTGCAGC3 ^* .

Environ 800 lignées ES néomycine-résistantes ont été criblées par Southern blot en utilisant les sondes décrites. Une lignée a été trouvée positive pour la mutation (insertion du gène Néo au bon locus). Ces cellules ont été injectées dans 205 blastocystes de souris C57/Black6 et réimplantées- dans 15 femelles pseudogestantes. 8 gestations ont été menées à terme et ont donné lieu à 48 souris chimériques dont 12 mâles. Ceux-ci sont croisés avec des femelles C57/Black6 pour l'obtention de souris hétérozygotes pour la mutation.