SHAVVA ALEXANDR GRIGORIEVICH (RU)
MOROZKINA SVETLANA NIKOLAEVNA (RU)
WO2004074309A1 | 2004-09-02 |
GLUZDIKOV I A : "New Analogs of D-Homoequilenine with Substituents inthe D Ring / Novye analogi D-gomoekvilenina, soderzhaschie zamestiteli v koltse D", ZHURNAL ORGANICHESKOI KHIMII, vol. 42, no. 11, 2006, pages 41687 - 1694, XP009528110, ISSN: 1070-4280
MOROZKINA S N : "Syntehsis and Sone Biological Properties of Sulfamates Derived from 8alpha-Analogs of Steroidal Estrogens / Sintez i issledovanie nekotorykh biologicheskikh svoistv sulfamatov 8 a- analogov steroidnykh estrogenov", ZHURNAL ORGANICHESKOI KHIMII, vol. 51, no. 3, 2015, pages 425 - 430, XP009528111, ISSN: 1070-4280
PARKIN D.M.BRAY F.FERLAY J.PISANI P., CA CANCER J. CLIN., vol. 55, 2005, pages 74 - 108
YUE W.YAGER J.D.WANG J.-P.JUPE E.R.SANTEN R.J., STEROIDS, vol. 78, 2013, pages 161 - 170
DIBBELT I.: "Biol. Chem.", vol. 372, 1991, pages: 173 - 185
STEIN C., J. BIOL. CHEM., vol. 264, 1989, pages 13865 - 13872
AHMED S., CURR. MED. CHEM., vol. 9, no. 2, 2002, pages 263 - 273
HOWARTH N.M.PUROHIT A.REED M.J., J. MED. CHEM., vol. 37, 1994, pages 219 - 221
SHIELDS-BOTELLA J. ET AL., J. STEROIDBIOCHEM. MOL. BIOL., vol. 84, 2003, pages 327 - 335
URUSOVA E.A.GLUZDIKOV I.A.SELIVANOV S.I.STAROVA G.L.NIKOLAEV S.V.SHAVVA A.G.: "Synthesis and study of equilenin derivatives and its modified analogs", RUSS. J. ORG. CHEM., vol. 40, no. 4, pages 506 - 512
AL SAFARZAKHARYCHEV A.V.ANANCHENKO S.N.TORGOV I.V.: "Synthesis of some 16,16-dimethyl-D-homosteroids", REPORTS OF ACADEMY OF SCIENCES OF THE USSR. SER. CHEM., 1968, pages 2326 - 2332
GLUZDIKOV I.A.EGOROV M.S.SELIVANOV S.I.STAROVA G.L.SHAVVA A.G.: "New analogues of D-homoequilenene with substituents in the D ring", RUS. J. ORG. CHEM., vol. 42, no. 11, 2006, pages 1675 - 1682
GLUZDIKOV I.A., PHD THESIS IN CHEMISTRY, 2007
MOROZKINA S.N.GLUZDIKOV I.A.DROZDOV A.S.SELIVANOV S.I.KOVALEV R.A.FILATOV M.V.SHAVVA A.G., RUSS. J. ORG. CHEM., vol. 51, no. 3, 2015, pages 425 - 430
"The Guide for Care and Use of Laboratory Animals", 1996, ILAR
See also references of EP 3878454A4
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Применение 3 -О-Сульфамат- 16,1 б-диметил-О-гомоэквиленина формулы в качестве противоонкологического агента при моно- и адъювантной терапии онкологических заболеваний, таких как: гепатокарцинома, карцинома желудка, рак легкого, хроническая миелогенная лейкемия, рак молочной железы, включая трижды негативную форму рака молочной железы. |
ЛЕЧЕНИЯ ОНКОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ
Область техники
Изобретение относится к области медицины и химико- фармацевтической промышленности и касается средств для лечения рака, в том числе рака молочной железы.
Предшествующий уровень техники
Рак молочной железы является ведущим онкологическим заболеванием у женщин [Parkin D.M., Bray F., Ferlay J., Pisani P., CA Cancer J. Clin., 2005, vol. 55, p. 74-108]. По данным ВОЗ, в мире 2.09 миллионов больных, а ежегодно умирают от рака молочной железы 627 тыс. женщин [htp://www.who.int/news- room/fact-sheets/detail/cancer] .
Значительная часть опухолей этой локализации прогрессирует под действием эстрогенов [Yue W., Yager J.D., Wang J.-P., Jupe E.R., Santen R.J., Steroids , 2013, vol. 78, p. 161- 170]. При иммуногистохимическом исследовании рака молочной железы определяются рецепторы эстрогенов (ER), прогестерона (PR) и her2neu («чувствительность к герцептину»). Значительная часть опухолей содержат рецепторы эстрогенов, прогестерона и/или HER2NEU 3+. Если опухоль не имеет рецепторов и не чувствительна к герцептину (ER0, PRO, HER2NEU 0-1) её рассматривают как трижды негативную (ER-/PR-/HER-2-). Это одна из самых смертоносных форм рака молочной железы по причине отсутствия мишеней для подавления её роста. На сегодняшний день в мире нет лекарственных препаратов для лечения этой формы рака.
Эстрогены циркулируют в крови и накапливаются в опухоли в виде сульфатов, не способных связываться с рецепторами эстрогенов, однако после превращения в свободные гормоны они активируют рост опухоли. Поэтому перспективной является стратегическая линия лечения, в основе которой лежит применение ингибиторов, блокирующих образование этой группы свободных гормонов в опухоли.
К препаратам из группы селективных модуляторов эстрогеновых рецепторов, которые блокируют эффекты эстрогена на гормонозависимые ткани, в том числе - на ткани молочной железы, относится тамоксифен. Тамоксифен является стандартом гормональной терапии для женщин в пременопаузе и постменопаузе. Наиболее характерными побочными эффектами, возникающими на фоне применения тамоксифена, являются: повышение риска развития тромбоза вен, усугубление течения заболеваний сердечно-сосудистой системы (включая приступы стенокардии), а также появление новообразований эндометрия (полипы, и рак эндометрия), а также фиброма матки. Также тамоксифен обладает гепатотоксичностью. По биофармацевтической классификационной системе (БКС), разработанной Gordon Amidon с соавторами в 1995 году, тамоксифен отнесён ко второму классу - препарат, который имеет низкую растворимость и высокую проницаемость.
Большую эффективность по сравнению с тамоксифеном показали ингибиторы ароматазы. В настоящее время нашли применение в данной области такие ингибиторы ароматазы как летрозол и анастразол, которые по системе БКС отнесены к первому классу - препараты, которые имеют высокую растворимость и высокую проницаемость. К побочным эффектам ингибиторов ароматазы является остеопороз, приливы, головные боли.
Кроме того, привлекает внимание стероидная сульфатаза в связи с локальным межтканевым образованием эстрогенов из обильного пула циркулирующего сульфата эстрона. Стероидная сульфатаза катализирует гидролиз сульфата эстрона до эстрона и сульфата DHEA до DHEA (Dibbelt 1., Biol. Chem., Hoppe-Seyler, 1991, 372, 173-185; Stein C., J. Biol. Chem., 1989, 264, 13865- 13872).
Самым известным ингибитором стероидной сульфатазы является ЕМАТЕ- сульфамат эстрона (Ahmed S., Сшт. Med. Chem., 2002, vol. 9, no. 2, p. 263-273). Однако он обладает существенным недостатком. Под действием ингибиторов сульфатазы эстрона, имеющих в своем составе сульфаматную группу, происходит необратимая дезактивация фермента с высвобождением свободного лиганда [Howarth N.M., Purohit А., Reed M.J. J. Med. Chem., 1994, vol. 37, p. 219-221]. В частности, сульфамат эстрона ингибирует сульфатазу эстрона, однако высвобождение свободного гормона приводит к появлению сильной утеротропной активности [Shields-Botella J. et al., J Steroid Biochem. Mol. Biol., 2003, vol. 84, p. 327-335].
Таким образом, при поиске новых противоонкологических агентов исследователи должны учесть, что носитель сульфаматной группы ингибитора сульфатазы эстрона не должен обладать гормональной (утеротропной) активностью.
В качестве средства профилактики карциномы молочной железы известно применение d-эквиленина, который не обладает канцерогенными свойствами. На основе производных эквиленина получены препараты с гипохолестеринемическим действием, лишенные утеротропной и гипертриглицеридемической активности [Урусова Е.А., Глуздиков И.А., Селиванов С.И., Старова Г.Л., Николаев С.В., Шавва А.Г. // Синтез и исследование производных эквиленина и его модифицированных аналогов. ЖОрХ. 2004. Т. 40. Вып. 4. С. 506-512].
Соединения эквиленинового ряда входят в состав терапевтических средств (Premarin®), используемых в гормонозаместительной терапии. Наличие указанных свойств желательно, так как использование ингибиторов метаболизма стероидных эстрогенов подразумевает их длительное применение. Раскрытие изобретения
Задачей настоящего изобретения является поиск и разработка эффективного синтеза соединений, которые могут быть использованы в качестве противоонкологических агентов при моно- и адъювантной терапии онкологических заболеваний, таких как гепатокарцинома, карцинома желудка, рак легкого, хроническая миелогенная лейкемии, рак молочной железы, в том числе при его самой смертоносной форме- трижды негативной (ER-/PR-/HER-2-).
Задача решается использованием соединения 3-0- сульфамат- 16,1 б-диметил-О-гомоэквиленина (3), который ингибирует сульфатазу эстрона.
Схема синтеза целевого соединения (3) представлена ниже.
Отличительной особенностью, в отличие от опубликованных данных, отработанная схема позволяет масштабировать получение целевого соединения в промышленных масштабах.
Реакция известной изотиурониевой соли [Аль Сафар, Захарычев А.В., Ананченко С.Н., Торгов И.В. // Синтез некоторых 16,16-диметил-0-гомостероидов. Изв. АН СССР. Сер. Хим. 1968. No 10. С. 2326-2332] с 2,4,4-триметилциклопентан-1,3- дионом приводит к образованию секостероида, циклодегидратация которого позволяет получить эстрапентаен (1). После обработки последнего Ni/Ra в условиях, предложенных ранее для синтеза близкого по структуре D- гомоаналога [Gluzdikov I.A., Egorov M.S., Selivanov S.I., Starova G.L., Shavva A.G. New analogues of D-homoequilenene with substitutents in the D ring. Russian J. Org. Chem., 2006, vol. 42, no. 11, pp. 1675-1682], выделили метиловый эфир 16,1 б-диметил-D- гомоэквиленин (2) [Глуздиков И. А. Дисс. на соискание степени канд. наук, 2007, Санкт-Петербург]. Сульфамат 3 получали по известной методике [Морозкина С.Н., Глуздиков И.А., Дроздов А.С., Селиванов С.И., Ковалев Р.А., Филатов М.В., Шавва А.Г. ЖОрХ, 2015, т. 51, N 3, с. 425-430]. Результаты моделирования связывания стероида показали, что структура этого стероида плохо совместима с геометрией лигандсвязывающего кармана рецептора. Расстояние между кислородом кетогруппы стероида и NH His524 составляет 4.9 А, что исключает образование водородной связи. Расстояние между гидроксильной группой при СЗ и кислородом карбоксильной группы Glu353, по расчетным данным, около 3.9 А, что намного больше, чем в комплексе с природным гормоном эстрадиолом (2.34 А).
Несоответствие между геометрией стероида и областью рецептора, ответственной за связывание лиганда, будет причиной низкого сродства рассматриваемого соединения к рецептору, в результате чего данный стероид практически не обладает утеротропной активностью.
Соединение полностью ингибирует пролиферацию опухолевых клеток MCF-7.
Препарат относится к 4 классу опасности (LD 5 o>300-2000 мг/кг). Полученные данные позволяют оценить дозы для исследования противоопухолевой активности как безопасные.
При изучении связывания с рецепторами эстрогенами, показано, что сульфамат не обладает гормональным действием в концентрациях -0.001 и 0.01, 0.1 и 1.0 микромоль.
На животных моделях, с привитой человеческой опухолью трижды негативного рака молочной железы заявленный препарат более эффективен по сравнению с использующимися в клинической практике тамоксифеном и ингибитором ароматазы летрозолом.
Таким образом, область применения соединения - лечение рака молочной железы, включая трижды-негативную форму.
Проведены доклинические исследования специфической активности на моделях РМЖ выполнены в параллельном сравнении с противоопухолевым препаратом ТФ (препарат сравнения). Сравнительное исследование препаратов in vivo выполнено на мышах-самках Balb/c Nude с п/к трансплантированными опухолевыми клетками. Длительность исследования составила 29 суток после первого введения препарата (введение препаратов начинали на 5-е сутки после трансплантации опухолевого штамма).
Препарат и препарат сравнения вводили многократно внутрижелудочно в дозах 30 мг/кг и 10 мг/кг ежедневно в течение 21 дня.
Группе плацебо вводили 1% раствор крахмала внутрижелудочно в эквивалентных объемах и аналогичном режиме. Измерение опухолевых узлов проводили 2 раза в неделю. О противоопухолевой активности судили по стандартному показателю торможения роста опухоли (ТРО). После окончания лечения проводили последнее измерение опухоли, животных взвешивали и подвергали эвтаназии.
Все необходимые манипуляции с животными (тесты, взвешивание, измерение, вскрытие животных) выполнялись с 9 до 12 часов дня. Взвешивание животных проводили на первые сутки эксперимента, и затем 2 раза в неделю в течение всего эксперимента, согласно временному протоколу.
Измерение опухолевого узла проводили после введения опухоли 2 раза в неделю в течение всего эксперимента. Объем опухолевого узла определяли по формуле:
V = /6*L* W*H, где L,W,H— линейные размеры опухоли.
Определение противоопухолевой активности
Критерием эффективности исследуемого препарата служил показатель торможения роста опухоли (ТРО), который вычисляли по формулам:
где V k и 1 - средний объем опухоли (мм3) в контрольной и опытной группах соответственно.
После курса лечения животным проводили эвтаназию путем цервикальной дислокации шейных позвонков.
Статистическую обработку данных проводили с помощью пакета SPSS 21 (лицензия JN 20130626-3). В качестве описательных статистик в работе приведены: среднее арифметическое, стандартное отклонение (SD), ошибка среднего (SE), медиана, квартили, межквартильный размах. Для сравнения количественных признаков в группах применяли критерий Манна-Уитни-Вилкоксона без поправок на множественные сравнения. Результаты считали статистически значимыми при р<0,05.
Опухоли молочной железы (МЖ) у мышей самок линии FBV/N, трансгенных по HER-2/neu представляют собой аденокарциномы, которые характеризуются низким содержанием рецепторов эстрогена (ЭР) (Рис. 1) и отсутствием рецепторов прогестерона (ПР). Можно выделить два подтипа, а именно ЭР+, PR-, и ЭР-, ПР- [2]. При иммуногистохимическом исследовании ERa в опухолях МЖ только в 10 образцах из 45 обнаружены единичные позитивно окрашенные ядра (Фиг. 1).
Модель чувствительна к схеме CAF (циклофосфамид, адриамицин, 5-фторурацил), при этом отмечается торможение роста опухоли, приводящее к стабилизации среднего объема опухолей (Фиг. 2). Торможение роста опухоли составило 63% на 14 сутки и 46% на 21 сутки опыта.
Поскольку у животных возможно развитие множественных опухолей, то представляется целесообразным анализ среднего суммарного объема опухолей у мышей (Фиг. 3) и его относительное изменение к началу опыта (Фиг. 4). На графике относительного прироста объема опухоли видно, что происходит линейное изменение этого показателя в контрольной группе, что свидетельствует о целесообразности использования данного показателя для оценки биологического ответа опухоли на лечение. Так при воздействии схемы CAF наблюдается отсутствие изменения этого показателя на протяжении почти 3-х недель, свидетельствующее о стабилизации заболевания. Частота стабилизаций отдельных опухолей составляет около 60% к 21 суткам.
Исследование проведено на мышах-самках линии FVB трансгенных по HER-2/neu конвенциональной категории, линия получена из питомника Charles River Laboratories (Италия). Возраст животных к началу исследования составлял 21-41 неделю, вес - 25-30 г.
Для исследования была использована лекарственная форма препарата Тамоксифен Гексал (Гексал АГ, Германия, 83607 Хольцкирхен, серия НА1575 от 01/17), представляющая собой таблетки, покрытые оболочкой белого или слегка желтоватого цвета, круглые, двояковыпуклые, с однородной гладкой поверхностью, содержащие 20 мг действующего вещества.
Условия содержания соответствуют стандартам, указанным в руководстве The Guide for Care and Use of Laboratory Animals (ILAR publication, 1996, National Academy Press, 1996).
Животных содержали в отдельном помещении группами (не более 5 особей) в индивидуальных клетках для лабораторных грызунов типа Т2. Размеры 268 х 215 х 141 мм (площадь основания 370 см ). Ванна из поликарбоната, крышка из нержавеющей стали с бункером для корма, разделителем для поилки.
Подстил - стружка древесная обеспыленная.
Животные имели неограниченный доступ к комбинированному полнорационному гранулированному корму для лабораторных грызунов.
Вода питьевая, давалась ad libitum в стандартных поилках объемом 190 мл, производства TECNIPLAST из высокотемпературного полисульфона с силиконовым кольцом и металлической крышкой из нержавеющей стали AISI 316.
Температура в помещении поддерживалась на уровне 20- 26°С, относительная влажность - 50-70%. Фотопериод установлен 12 часов ночь - 12 часов день при искусственном освещении лампами дневного света.
На клетке содержания устанавливали идентификационную карточку, на которой указывали номер карточки/клетки, номер опытной группы, индивидуальные номера животных, их количество и пол, номер исследования, фамилия, имя, отчество руководителя исследования. Каждому животному проводили установку на ушную раковину металлического метчика для мелких лабораторных грызунов из никелевого сплава Kent- Scientific, США (на метчиках имеются проштампованные производителем трехзначные номера). В конце опыта мышей подвергли эвтаназии углекислым газом. Все трупы животных подвергали аутопсии с макроскопическим описанием.
Проведено определение LD50 препарата у мышей линии FVB трансгенных по HER-2/neu по тесту OECD 423 (OECD guideline for testing of chemicals. Acute Oral Toxicity - Acute Toxic Class Method).
Использованы 12 мышей-самок.
На первом шаге 3 мышам вводили препарат в дозе 300 мг/кг. Исследуемый препарат вводили внутриже луд очно (в/ж) с помощью металлического атравматического зонда (в соответствии с пероральным путем применения в клинике). Для в/ж введения субстанцию препарата смешивали с оливковым маслом для получения суспензии необходимой концентрации для введения из расчета 0,1 мл суспензии на 10 г массы тела животного. Лекарственная форма для введения готовилась ех tempore.
В связи с отсутствием гибели животных при введении препарата в дозе 300 мг/кг, этот же уровень дозы препарата был использован для введения еще 3 животным. Гибель животных также отсутствовала, поэтому далее препараты вводили в дозе 2000 мг/кг в 2 шага по 3 животных на каждом шаге.
Вели клиническое наблюдение и регистрацию массы тела в соответствие с Таблицей 1. Животных осматривали ежедневно 2 раза в день, клинически обследовали индивидуально после введения дозы первые 60 минут, с особым вниманием в течение первых 4 часов, периодически в течение первых 24 часов, на 2 сутки и еженедельно до 14 дней. Выполняли подробный осмотр животного в клетке содержания, в руках. Фиксировали общее состояние животных: особенности их поведения, интенсивность и характер двигательной активности, состояние волосяного и кожного покрова.
Регистрировали массу тела животных с помощью поверенных быстродействующих электронных лабораторных весов Ohaus Scout Pro (США), с максимально нагрузкой 2000 г, шагом измерения 0,1 г.
На 15 сутки выполняли эвтаназию и аутопсию с регистрацией макроскопических изменений. Данные заносили в специальный индивидуальный бланк вскрытия.
Патоморфологическому исследованию подлежали все экспериментальные животные в конце исследования. После эвтаназии животные были тщательно обследованы на предмет внешних патологических признаков. Проведено исследование состояния грудной и брюшной полостей и макроскопическое исследование внутренних органов. Микроскопический анализ органов и тканей лабораторных животных не проводился, так как гибель животных не зафиксирована в течение всего периода наблюдения, кроме того, макроскопический анализ внутренних органов не выявил патологических изменений. Таблица 1.
Схема наблюдения и взвешивания животных при оценке острой токсичности
Исследуемый препарат вводили в/ж с помощью металлического атравматического зонда (в соответствии с предполагаемым пероральным путем применения в клинике). Препарат вводили в однократной суточной дозе (20 мг/кг массы тела) и 5-ти кратной суточной дозе - 100 мг/кг массы тела. Для введения ex tempore готовили раствор препаратов в оливковом масле (рафинированное оливковое масло с добавлением нерафинированного Extra Virgen марки Global Village «Clasico» серия L: 183351116, срок годности до 26.04.2020, BAIEO, Испания). Объем введения составил ОД мл на 10 г массы тела мыши (0,2 мл готовой формы для мыши массой 20 г). Начало введения препарата через 24 часа после рандомизации. Курс введения составил 27-28 дней.
Препарат сравнения - тамоксифен - вводили также с помощью металлического атравматического зонда (в соответствии с пероральным путем применения в клинике), суточная доза составила 4 мг/кг и была определена при пересчете клинических доз [5]. Эта доза соответствует суточной дозе для человека 20 мг/кг. Таблетку тамоксифена измельчали в ступке, из полученного порошка готовили суспензию в 40 мл оливкового масла, объем введения составил 0,08 мл на 10 г массы тела мыши, длительность введения соответствовала длительности введения опытных препаратов и составила 27-28 дней.
В контрольных группах вводили оливковое масло (плацебо).
Критериями оценки были данные клинического наблюдения, масса тела животных, сроки гибели (в случае таковой), рост опухоли в динамике, данные патоморфологического исследования (верификация новообразования при аутопсии, оценка токсического действия по макроскопической картине изменений внутренних органов).
Массу тела животных регистрировали перед первым введением препаратов и далее два раза в неделю с помощью поверенных быстродействующих электронных лабораторных весов Ohaus Scout Pro (США), с максимально нагрузкой 2000 г, шагом измерения 0,1 г.
Один раз в неделю во время взвешивания у животных измеряли макроскопически определяемые опухолевые узлы. Для каждого узла измеряли два линейных размера: наибольший и больший перпендикулярный к нему. Наибольший размер принимали за длину (а) и второй размер за ширину (Ь) опухолевых узлов. Объем опухоли рассчитывали по формуле:
V=(axb)2/2, Эффективность терапии оценивали по изменению среднего объемы опухолей, торможению роста опухоли (ТРО), динамике среднего суммарного объема опухолей у каждой мыши и его относительного изменения.
Процент торможения роста опухоли рассчитывали по формуле:
ТРО = (VK-VO)/VKx 100 (%),
где VK - средний объем опухоли в контрольной группе, а VO - средний объем опухоли в опытной группе.
Первичные данные с индивидуальных бланков перенесены в книги программы Microsoft Excel 2007. Для всех количественных данных вычислены групповое среднее арифметическое (М) и среднеквадратическое отклонение (т). Статистический анализ проведен с использованием статистической программы GraphPad Prism 6.0. Отличия между группами оценены с помощью регрессионного анализа ANOVA и точного критерия Фишера.
При оценке острой токсичности животные находились под непрерывным наблюдением первые 60 минут, затем осматривались ежечасно 3 часа, далее через 24 часа. На вторые сутки наблюдение осуществляли два раза в день. Затем наблюдения проводили раз в день. Клинический осмотр каждого животного проводили после введения субстанции, через сутки, далее еженедельно. Выполняли подробный осмотр животного в клетке содержания, в руках. Отмечали общее состояние животных: особенности их поведения, двигательной активности, состояние волосяного и кожного покрова. При введении препарата в дозе 300 мг/кг в ходе эксперимента не была зафиксирована гибель животных. Визуально, признаков интоксикации за весь период наблюдения отмечено не было ни у одного животного. Внешний вид и поведение животных были обычными. При взятии в руки реакция была стандартная низкая. Вокализация у животных не отмечена, в том числе непосредственно во время и сразу после введения.
Ежедневное наблюдение за общим состоянием животных, поведенческими реакциями показали, что однократное пероральное введение тестируемого объекта не оказало влияния на общее состояние и активность подвергнутых интоксикации экспериментальных животных.
Данные о массе тела приведены в Таблицах 2 и 3.
Таблица 2.
Динамика массы тела животных при введении препарата в стартовой дозе 300 мг/кг
Дегалмш; эффект (тазо/всего) _ j
Как следует из данных Таблицы 2, средняя массы тела равномерно увеличивалась в периоде наблюдения за животными, которые получали препарат в дозе 300 мг/кг. Поскольку гибель животных при введении дозы 300 мг/кг отсутствовала, перешли к введению препарата в дозе 2000 мг/кг. Препарат вводили в 2 приема с интервалом 3 часа, в объеме 0,1 мл на 10 г массы тела на прием при концентрации 100 мг/мл т.к. суспензия в масле при большей концентрации густая, что не позволяет ввести препарат через зонд. При введении дозы 2000 мг/кг клиническая картина интоксикации не наблюдалась. Ширина глазной щели животных, независимо от группы, практически не менялись в течение всего периода наблюдения. Патологических выделений из глаз не отмечалось. Нос розовый, умеренно влажный, патологические выделения отсутствовали. Шерсть у всех мышей была опрятной, блестящей, без очагов облысения. Отмечено снижение средней массы тела у животных на 1% на 2 сутки и на 2% на 7 сутки от исходной (Таблица 3). К концу периода наблюдения средняя масса тела была на 3% больше исходного значения.
Таблица 3.
Динамика массы тела животных при введении препарата в дозе 2000 мг/кг
Аутопсии подвергались все животные, подвергнутые запланированной эвтаназии на 15-е сутки опыта. При макроскопическом исследовании отклонений в состоянии внутренних органов не обнаружено.
Данные аутопсии были следующее:
Шерсть животных имела опрятный вид, была блестящей, без очагов облысения. Упитанность животных была удовлетворительной.
Патологических выделений из естественных отверстий не было.
Подчелюстные лимфатические узлы имели округлую форму, бледно-розовую окраску и умеренную плотность. Слюнные железы обычной формы, бледно-желтого цвета, умеренной плотности.
Брюшина гладкая, блестящая, свободной жидкости в полости нет. Селезенка не увеличена, плотная, капсула гладкая и блестящая. Поджелудочная железа бледно-розовая, дольчатой структуры.
Величина и форма печени не изменены, капсула печени блестящая. Ткань печени имела коричневатый цвет и умеренно плотную консистенцию.
Почки плотные, капсула гладкая, блестящая, вокруг почек умеренное разрастание жировой клетчатки.
Яичники не увеличены с блестящей поверхностью.
Желудок со складчатой блестящей слизистой оболочкой, небольшим количеством слизи и пищевого содержимого в просвете.
Плевра гладкая, блестящая, свободной жидкости в грудной полости нет. Тимус треугольной формы, беловатого цвета. Легкие светло-розового цвета, воздушные.
Таким образом, в соответствие с проведенным тестом ОЭСР 423 препарат может быть отнесен к 5-й или не классифицируемой категории с LD50 равной или более 5000 мг/кг, что соответствует классу малоопасных веществ.
Животные удовлетворительно переносили введение препарата, клинических признаков токсичности не наблюдалось. При этом шерсть животных, получавших препарат, была блестящей, в отличие от животных контрольной группы, у которых она была несколько взъерошенной. Также в контрольной группе были более выражены опухолевые узлы. При аутопсии в конце опыта специфических признаков токсического поражения внутренних органов не выявлено. Объем опухолевого поражения был значительно меньшим при введении препарата в дозе 20 мг/кг и особенно в дозе 100 мг/кг, чем у животных контрольной группы.
Масса тела животных увеличивалась в течение всего периода наблюдений во всех группах, прибавка массы тела может быть связана с увеличением объема опухолевых узлов у мышей (Таблица 4).
Таблица 4.
Динамика средней массы тела мышей (г) при оценке противоопухолевой активности препарата
При анализе динамики среднего объема опухолей было выявлено, что введение препарата в дозе 20 мг/кг и 100 мг/кг обладает статистически значимым противоопухолевым эффектом, так к 28 суткам опыта ТРО составил 27% для дозы 20 мг/кг и 42% для дозы 100 мг/кг, эффект был пропорционален дозе препарата. Следует отметить, что при введении 100 мг/кг средний объем опухоли за 28 дней наблюдения увеличился всего на 60% от исходного, а в контрольной группе - на 155% (Фиг. 5)·
Таблица 5.
Динамика среднего объема опухолей (см3), имевшихся к началу опыта, при оценке противоопухолевой активности препарата в дозе 20 мг/кг и 100 мг/кг
М - среднее значение, ш - ошибка средней арифметической, N - число опухолей на начало лечения и включенных в анализ. # - группа препарата сравнения приведена из третьей серии опытов. * - р<0,05, по сравнению с контрольной группой, а - р<0,05, по сравнению с группой препарата сравнения.
Следует отметить, что торможение роста опухоли при введении препарата в обеих дозах увеличивалось к концу срока наблюдения, а при введении препарата сравнения было максимальным на 21 сутки опыта. Таким образом, можно ожидать что эффект препарата при увеличении продолжительности введения может быть выше.
При анализе частоты стабилизаций выявлено, что введение 100 мг/кг значительно увеличивает этот показатель, с 8% в контрольной группе до 27%. При этом средний объем новых опухолей, которые развились за период наблюдения и их количество были меньше, чем эти показатели в контрольной группе (Таблица 6). Таблица 6.
Частота стабилизаций опухолей, число и средний объем новых опухолей, развившихся к концу исследования, при оценке противоопухолевой активности препарата
% стабилизаций заболевания - показатель аналогичный критерию RECIST, отражающий частоту опухолей, объем которых не увеличился более чем на 20% к концунаблюдения по отношению к началу лечения. * - р<0,05, по сравнению с контрольной группой. # - группа препарата сравнения приведена из третьей серии опытов. Средний суммарный объем опухолей у мышей при введении препарата в дозах 20 мг/кг и 100 мг/кг был достоверно меньше, чем в контрольной группе с 14 по 28 сутки. А для в дозе 100 мг/кг на 28 сутки опыта этот показатель был статистически значимо меньше, чем в группе препарата сравнения (Таблица 7, Фиг. 6).
Таблица 7.
Средний суммарный объем опухолей (см ) у мышей при оценке противоопухолевой активности препарата.
# - группа препарата сравнения приведена из третьей серии опытов. * - р<0,05, по сравнению с контрольной группой а - р<0,05, по сравнению с группой препарата сравнения.
При оценке относительного изменения среднего суммарного объема опухолей также было показано, что эффект препарата зависел от его дозы и превосходил эффективность тамоксифена (Фиг. 7, Таблица 8). Таблица 8.
Относительное изменение среднего суммарного объем опухолей к 1 суткам (%) у мышей при оценке противоопухолевой активности препарата
Для оценки гормонального воздействия препарата была оценена масса тела матки без рогов на 28 сутки наблюдения (Таблица 9). Достоверных отличий этого показателя выявлено не было.
Таблица 9. Вес тела матки и масса тела мышей с опухолями молочной железы при изучении противоопухолевой активности препарата
* - включая 1 животное в фазе метаэструса; Э - эструс; Д - диэструс. Препарат в дозах 20 мг/кг и 100 мг/кг обладает выраженным противоопухолевым эффектом, так к 28 суткам опыта ТРО составил 27% для дозы 20 мг/кг и 42% для дозы 100 мг/кг, эффект был пропорционален дозе препарата (различия статистически значимы). Введение в дозе 100 мг/кг значительно увеличивает частоту стабилизаций опухолей, с 8% в контрольной группе до 27%. Препарат в дозе 100 мг/кг по эффективности к концу периода наблюдения на 28 сутки статистически значимо превосходит по эффективности препарат сравнения тамоксифен (4 мг/кг).
Исследования показали, что у препарата отсутствует утеротропная активность.
В соответствие с проведенным тестом ОЭСР 423 препарат может быть отнесен к 5-й или не классифицируемой категории с LD50 равной или более 5000 мг/кг, что соответствует классу малоопасных веществ согласно принятому ГОСТ. Краткое описание фигур чертежей
Изобретение иллюстрируется следующими фигурами:
Фиг. 1 - Окрашивание антителами к ERa опухоли молочной железы.
Визуализация пероксидаза хрена + диаминобензидин, ув. хЮО (А). Специфическое окрашивание ядер клеток протока молочной железы и ядер единичных опухолевых клеток (Б), ув. х400.
Фиг. 2 - Динамика среднего объема опухолей, имевшихся к началу опыта, у мышей при терапии схемой CAF.
Фиг. 3 - Динамика среднего суммарного объема опухолей, имевшихся к началу опыта, у мышей при терапии схемой CAF.
Фиг 4 - Относительное изменение среднего суммарного объема опухолей, имевшихся к началу опыта, у мышей при терапии схемой CAF.
Фиг. 5 - Динамика среднего объема опухолей у мышей при оценке противоопухолевой активности препарата
Фиг. 6 - Средний суммарный объем опухолей у мышей при оценке противоопухолевой активности препарата.
Фиг. 7 - Относительное изменение среднего суммарного объем опухолей у мышей при оценке противоопухолевой активности препарата. Лучший пример осуществления изобретения
Пример 1.
Работа проведена на перевиваемой культуре клеток человека MCF-7 (аденокарцинома молочной железы). В качестве отрицательного контроля использовали нормальные кожные фибробласты человека (КФЧ) ранних пассажей. Клетки культивировали во флаконах Карреля в среде DMEM/F12 (Биолот) с добавлением 1% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота (Биолот), без антибиотиков, в 5% С0 2 атмосфере, при 37°С.
Клетки высаживались на флаконы Карреля по 50 х 10 4 клеток на флакон. Для изучения пролиферативной активности клеток в условиях подавления сульфатазы через 24 часа после посева культуральную среду заменяли на среду, содержащую ингибиторы сульфатаз до конечной концентрации 50 мкг/мл, после чего инкубировали данные опухолевые клеточные линии в течение различных промежутков времени (от 24 до 72 ч). Ингибитор растворяют в ДМСО. Конечная концентрация ДМСО в культуральной среде не превышала 0.5%. Для исключения цитотоксического действия ДМСО ставили контроль с добавлением ДМСО без ингибиторасульфатаз. Для исключения неспецифического губительного действия веществ использовали нормальные кожные фибробласты человека. Далее клетки снимали раствором версена-трипсина (Биолот), рассеивали на флаконы Карреля, содержащие новую полную культуральную среду. Подсчет клеток проводили в момент достижения необработанными контрольными клетками максимальной плотности клеток на единицу площади поверхности культурального флакона (монослой), при этом их количество определялось как 100%. Пролиферативную активность всех исследованных клеточных культур при воздействии ингибиторов сульфатаз определяли не менее трех раз.
Исследование влияние полученного сульфамата на рост перевиваемой культуры клеток человека MCF-7 (аденокарцинома молочной железы) показало, что стероид (3) полностью блокирует рост опухолевых клеток при концентрации 20 мкг/мл, при этом он не влияет на рост кожных фибробластов человека, не имеющих рецепторов эстрогенов. Рост опухолевых клеток ингибируется в той же степени, что и под действием тамоксифена, применяемого в медицинской практике более 30 лет. Это весьма важно, поскольку сульфаматы и тамоксифен имеют разные механизмы действия, и есть перспективы их совместного применения.
В экспериментах на мышах линии FVB, трансгенной по HER-2/neu (ER-/PR-/HER2+), с опухолями молочных желез, стероид ингибирует рост опухолей сравнимо с применяемым в клинической практике тамоксифеном, что предполагает их совместное использование для лечения рака молочной железы.
На клеточной линии трижды негативного рака молочной железы MDA-MB-231 соединение ингибирует рост клеток на 83%, что сравнимо с применяющимся в клинической практике химиотерапевтическим препаратом этопозидом.
Препарат показал активность против клеток гепатокарциномы SK-Hep-1 (IC50 = 53.4 mM), рака легких А549 (IC50 = 29.6 mM), аденокарцинома желудка SNU638 (IC50 = 22.8 mM), а также против клеток хронической миелогенной лейкемии (К562).
Пример 2.
Группа Контроль. В группе 10 мышей, 10 опухолей. На момент начала терапии Vcp=l,5±0,4 мм . Без специфического лечения размеры опухоли к 33-м суткам после трансплантации достигли Vcp=233,2±86,5 мм 3 . Число павших мышей в группе до окончания периода наблюдения - 2 из 10.
Группа препарат, 10 мг/кг. В группе 7 мышей, 7 опухолей.
На момент начала терапии Vcp=l,0±0,4 мм без достоверных отличий от контрольной группы. На 7-е сутки после начала лечения зафиксировано недостоверное ТРО=74,3% (Vcp=5,l±2,3 мм 3 против Vcp=20,0±6,0 мм 3 в контроле, р<0,220). На 10-е сутки после начала лечения ТРО=68,0% (Vcp=24,8±12,2 мм 3 против Vcp=77,3±32,0 мм 3 в контроле, р<0,181). На 14-е сутки после начала лечения наблюдали максимальное достоверное ТРО, равное 94,3% (Vcp=6,9±2,2 мм 3 против Vcp=120,6±44,4 мм 3 в контроле, р<0,03), которое сохранялось примерно на том же уровне и составило 90,6% (Vcp=17,6±0,7 мм 3 против
Vcp=186,4±65,0 мм 3 в контроле, р<0,061) и 90,2% (Vcp=26,l±12,l мм 3 против Vcp=266,5±91,3 мм 3 в контроле, р<0,061) к 17-м суткам и 21 суткам, соответственно. Число павших мышей в группе до окончания периода наблюдения - 5 из 7.
Группа Тамоксифен, 30 мг/кг. В группе 7 мышей, 7 опухолей. На момент начала терапии Vcp=0,9±0,2 мм без достоверных отличий от контрольной группы. На 7-е сутки ТРО составило 12,6% (Vcp=18,8±7,4 мм 3 против Vcp=20,0±6, мм 3 в контроле, р<0,962) и до конца периода наблюдения не превышало этих значений. На 17-е и 21-е сутки после начала лечения отмечали отрицательное ТРО с максимальным значением на 21-е сутки ТРО=-44,2 (Vcp=384,8±103,2 мм 3 против
Vcp=266,5±91,3 мм в контроле, р<0,106). Число павших мышей в группе до окончания периода наблюдения - 6 из 7.
Группа Тамоксифен, 10 мг/кг. В группе 7 мышей, 7 опухолей. На момент начала терапии Vcp=0,7±0,l мм 3 без достоверных отличий от контрольной группы. На 7 -е сутки после начала лечения зафиксировано недостоверное ТРО=63,9% (Vcp=7,2±3,9 мм 3 против Vcp=20,2±6,0 мм 3 в контроле, р<0,364). На 10-е сутки после начала лечения зафиксировано ТРО=56,9% (Vcp=33,4±16,l мм 3 против Vcp=77,3±32,0 мм 3 в контроле, р<0,315). С 14-е по 17-е сутки наблюдали увеличение ТРО до 60,6% (Vcp=47,5±16,8 мм 3 против Vcp=120,6±44,4 мм 3 в контроле, р<0,193) и 68,9% (Vcp=58,0±18,2 мм 3 против Vcp=186,4±65,0 мм в контроле, р<0,070), соответственно. На 21- е сутки после начала лечения и до конца периода наблюдения ТРО ниже биологически значимых значений (<50%). Число павших мышей в группе до окончания периода наблюдения - 2 из 7.
Сводные результаты измерений и статистическая значимость отличий межгрупповых измерений приведены в Таблицах 10 и 11.
Таблица 10.
Объемы опухолей у мышей в группах среднее и его ошибка
(М±ш)
Таблица 11.
Влияние Препарата и Тамоксифена на торможение роста SKBR-3 за весь период наблюдения, ТРО%
Пример 3.
Группа Контроль. В группе 12 мышей, 12 опухолей. На момент начала терапии Vcp=3,8± 1,0 мм 3 . Без специфического лечения размеры опухоли к 30-м суткам после трансплантации достигли Vcp=299,l±100,5 мм . Число павших мышей в группе до окончания периода наблюдения - 6 из 12.
Группа Препарат, 10 мг/кг. В группе 10 мышей, 10 опухолей. На момент начала терапии Vcp=l,6±0,4 мм 3 без достоверных отличий от контрольной группы. На 7-е сутки после начала лечения зафиксировано достоверное ТРО=66,1% (Vcp=27,0±5,l мм против Vcp=79,6±14,2 мм в контроле, р<0,002). На 10-е сутки после начала лечения наблюдали ТРО=78,7% (Vcp=21,6±4,9 мм 3 против Vcp=101,2±22,5 мм 3 в контроле, р<0,007). На 14-е сутки после начала лечения наблюдали максимальное недостоверное ТРО, равное 83,1%
(Vcp=27,6±2,6 мм против Vcp=163,3±31,0 мм в контроле, р<0,06). На 17-е сутки после начала лечения ТРО снижалось до 76,1% (Vcp=46,3±5,3 мм 3 против Vcp=193,6±39,6 мм3 в контроле, р<0,04). Число павших мышей в группе до окончания периода наблюдения - 10 из 10.
Группа Тамоксифен, 30 мг/кг. В группе 10 мышей, 10 опухолей. На момент начала терапии Vcp=4,l±l,2 мм 3 без достоверных отличий от контрольной группы. На 7-е сутки и до конца периода наблюдения ТРО было ниже биологически значимого порога и не превышало 44,5% (Vcp=44,l±8,8 мм 3 против Vcp=79,6±14,2 мм 3 в контроле, р<0,10). Число павших мышей в группе до окончания периода наблюдения - 4 из 10.
Группа Тамоксифен, 10 мг/кг. В группе 10 мышей, 10 опухолей. На момент начала терапии Vcp=2,3±0,8 мм 3 без достоверных отличий от контрольной группы. В этой группе не выявлено ингибирование роста опухоли в течение всего периода наблюдения. Число павших мышей в группе до окончания периода наблюдения - 6 из 9.
Сводные результаты измерений и статистическая значимость отличий межгрупповых измерений приведены в Таблицах 12 и 13.
Таблица 12.
Объемы опухолей у мышей в группах среднее и его ошибка
(М±ш)
Таблица 13.
Влияние Препарата и Тамоксифена на торможение роста TNBC_Kad за весь период наблюдения, ТРО%
Проведенные сравнительные исследования противоопухолевой активности препарата при многократном введении бестимусным иммунодефицитным мышам Balb/c Nude на двух моделях подкожных ксенографтов рака молочной железы человека SKBR-3 и TNBC-Kad, отличающихся по фенотипу.
Пилотное исследование противоопухолевой активности препарата на модели SKBR3 в сравнении с Тамоксифеном (лекарственная форма) показало, что терапия препаратом в дозе 10 мг/кг была наиболее эффективной среди всех изученных режимов лечения: на 10-е сутки после начала терапии выявлен достоверный противоопухолевый эффект - максимальное ТРО=91,2% (Vcp=2,2±2,0 мм3 против Vcp=24,9±12,5 мм3 в контроле, р<0,018) на фоне относительно хорошей переносимости препарата. Тамоксифен в дозе 10 мг/кг был не эффективен: биологически значимое значение ТРО на протяжении всего периода наблюдения не достигнуто, напротив, с 10-17-е сутки после начала лечения зафиксирована стимуляция роста опухоли. Повторное исследование противоопухолевой активности препарата на той же модели SKBR3 в сравнении с Тамоксифеном (субстанция) показало, что препарат в дозе 10 мг/кг оказывает высокий противоопухолевый эффект с максимальным достоверным ТРО на 14-е (94,3%, р<0,03) и на 24-е (86,3%, р<0,04) сутки, что воспроизвело полученный в первом опыте результат.
Исследование противоопухолевой активности препарат на модели TNBC_Kad в сравнении с Тамоксифеном (субстанция) показало, что препарат в дозе 10 мг/кг на 7 и 10 сутки после начала лечения вызывает торможение роста опухоли на 66,1 и 78,7% (достоверные отличия от контрольной группы и группы с тамоксифеном 30 мг/кг). Эффект сохраняется в течение 10 дней примерно на том же уровне. Тамоксифен в дозе 30 мг/кг вызывает слабое недостоверное торможение роста опухоли на 44,5% на 7 сутки, которое уменьшается к концу наблюдения. Тамоксифен в дозе 10 мг/кг не эффективен на этой модели.
Промышленная применимость
Проведенные исследования показали, что заявленное применение соединения характеризуется:
- отсутствием утеротропного действия,
- широким спектром противоонкологической активности, включая активность против трижды негативного рака молочной железы,
- отсутствием токсичности, - гипохолестеринемическим действием и отсутствием влияния на содержание триглицеридов в сыворотке крови,
- отсутствием негативного влияния на эндометрий. Изобретение может быть применено при:
- моно- и адъювантной терапии раннего гормоноположительного рака молочной железы у женщин в постменопаузе.
- моно- и адъювантной терапии раннего гормоноположительного рака молочной железы у женщин в постменопаузе после 2-3 летнего применения тамоксифена.
- лечении распространенного рака молочной железы на поздних стадиях.
- лечении трижды негативного рака молочной железы.
- моно- и адьювантной терапии гепатокарциномы.
- моно- и адьювантной терапии карциномы желудка.
- моно- и адьювантной терапии рака легкого.
- моно- и адьювантной терапии хронической миелогенной лейкемии.