La présente invention a trait au traitement des maladies impliquant des cellules de la lignée B, lymphocytes B ou plasmocytes. Elle concerne en particulier l'utilisation d'oligonucléotides antisens (AON) capable d'induire un saut d'exon dans les régions variables ou constantes des chaînes lourdes ou légères des immunoglobulines pour traiter des maladies impliquant des cellules de la lignée B, ainsi que des mélanges de tels AON. Enfin, l'invention concerne une méthode de sensibilisation au traitement par la voie des inhibiteurs du protéasome dans le cadre du traitement du myélome multiple.

ART ANTERIEUR

Le myélome multiple

Le myélome multiple (MM) est un cancer incurable caractérisé par la présence dans la moelle osseuse d'un clone tumoral de cellules plasmocytaires. Il représente environ 1% des cancers et 10 % des hémopathies malignes, faisant de cette néoplasie B le second cancer d'origine hématopoïétique après les lymphomes (Kyle and ajkumar, 2009). L'incidence du MM présente une grande variation allant de 0,4 à 6,3 cas pour 100 000 personnes. Le risque de développer un MM augmente avec l'âge avec un âge médian au diagnostic > 65 ans. L'incidence du MM est également plus élevée chez l'homme que chez la femme. Les personnes exposées à des niveaux élevés de radiations (radiations ionisantes, nucléaires) et aux pesticides semblent également présenter des risques plus élevés de développer un MM. Chez la majorité des patients atteints de MM, la maladie débute par un stade asymptomatique appelé MGUS (Monoclonal Gammopathy of Undetermined Significance), avant de progresser vers le myélome (Landgren, 2013). Les manifestations cliniques communément rencontrées chez les patients atteints de MM sont : une hypercalcémie, une insuffisance rénale, une anémie et des lésions osseuses. D'autres symptômes tels que des douleurs osseuses, une grande fatigabilité, des infections récurrentes et une perte de poids sont fréquemment constatés (Bird et al, 2011 ; Rajkumar, 2011). Ces manifestations cliniques sont provoquées par la production anormale d'une Ig monoclonale (historiquement appelée protéine M) par le clone plasmocytaire. Bien que le MM demeure encore une maladie incurable, les récentes avancées en cancérologie et l'apparition de nouveaux agents thérapeutiques ont permis d'améliorer la survie globale des patients (Kumar et al, 2014).

Le diagnostic d'un MM est basé sur la détection et l'évaluation d'un composent monoclonal (protéine M) par électrophorèse et immunofixation sur sérum et/ou urine de patients, la caractérisation et la quantification des Ig (par exemple : IgM, IgG, IgA, chaînes légères IgK ou ^λ, taux chaînes légères « libres »...). Des biopsies de moelle osseuse sont réalisées pour évaluer l'infiltration plasmocytaire en tant que marqueur de progression et d'agressivité de la maladie. Les lésions osseuses sont évaluées par imagerie (radiographie, MN, tomographie). La concentration sérique d'autres facteurs biologiques ( 2-microglobuline, albumine, protéine C réactive, créatinine, hémoglobine, calcium, lactate déshydrogénase) permet de classifier le stade de la maladie et de pronostiquer son évolution. La recherche d'anomalies chromosomiques (translocation, délétion, hypo/hyperdiploïdie) permet également de classifier les risques de progression de la maladie. La majorité de ces critères sont utilisés dans les systèmes internationaux de classification du MM : « International Staging System : ISS » (Greipp et al., 2005) et « The Mayo Stratification of Myeloma and Risk-Adapted Therapy : mSMART (Mikhael et al., 2013).

Le traitement des patients atteints de myélome inclut souvent trois étapes :

Une phase d'induction : destinée à réduire la masse tumorale avant une autogreffe de cellules souches. Cette chimiothérapie inclut généralement des agents immunomodulateurs (comme le Thalidomide), des inhibiteurs du protéasomes (comme le Bortezomib commercialisé sous le nom de Velcade ^® ) et de la Dexaméthasone.

Une éventuelle autogreffe de cellules souches, réalisée chez les patients éligibles ayant répondu de façon satisfaisante à la phase d'induction.

Une phase de maintenance : consistant en une combinaison de chimiothérapie et d'agents immunomodulateurs pouvant inclure les agents alkylants et le Lenalidomide.

Ce traitement est maintenu jusqu'à la rechute des patients.

Différents traitements peuvent être ensuite administrés chez les patients en rechute (Dispenzieri et al., 2009).

Les agents utilisés dans le traitement du MM se divisent en 5 classes principales : les agents alkylants, les anthracyclines, les corticostéroides, les agents immunomodulateurs et les inhibiteurs du protéasome. La réponse immunitaire humorale

La réponse immunitaire humorale implique d'abord la forme membranaire des immunoglobulines (Ig) et repose ensuite sur la sécrétion d'Ig solubles : les anticorps. Les Ig sont des protéines hétérodimériques composées de 4 chaînes polypeptidiques dont 2 chaînes légères identiques et 2 chaînes lourdes identiques réunies entre elles par un nombre variable de ponts disulfures. Les Ig possèdent des régions variables porteuses de la spécificité antigénique et des régions constantes qui, pour les chaînes lourdes, déterminent la fonction effectrice des anticorps sécrétés. D'après la structure des régions constantes, on distingue deux types de chaînes légères (kappa ou lambda) et 5 types majeurs de chaînes lourdes (μ, δ, γ, ε ou α) définissant la classe des Ig. S'ils s'avèrent fonctionnels, les réarrangements successifs des gènes codant les régions variables (VJ pour les chaînes légères ; DJ, puis V(D)J pour les chaînes lourdes) forment un exon variable qui pourra être transcrit et épissé sur les gènes codant les régions constantes. Au niveau du locus des chaînes lourdes, cet exon s'exprime d'abord avec le gène constant Cμ situé immédiatement en aval. Ensuite, un second type de réarrangement appelé « commutation de classe » ou « commutation isotypique » peut intervenir. Il entraîne la délétion du gène Cμ et permet l'expression d'un nouveau gène constant (par exemple Cy) avec la même région variable réarrangée. Ces multiples étapes de recombinaison des gènes d'Ig sont finement régulées au cours du la maturation des lymphocytes B, allant du stade de progéniteurs lymphoïdes B à celui de plasmocytes sécréteurs d'anticorps.

Organisation des gènes d'Ig : Les gènes codant les différentes chaînes des immunoglobulines occupent 3 loci situés sur des chromosomes distincts. Ils présentent une structure générale commune et sont spécifiquement exprimés dans la lignée lymphocytaire B. Chacun est constitué de multiples segments de gènes codant pour la partie variable des récepteurs pour l'antigène et de un ou plusieurs gènes codant la partie constante. Dans leur disposition germinale, les gènes des chaînes lourdes et légères d'Ig ne sont pas directement fonctionnels. Pour devenir complètement fonctionnels, ces gènes doivent subir des modifications internes ou réarrangements intra-géniques. Ces réarrangements ont lieu aux stades précoces de l'ontogénie B, entre les segments codant la partie variable des chaînes lourdes et légères, on parle de recombinaisons V(D)J.

- Locus humain des chaînes lourdes d'Ig (chr. 14) : les gènes des chaînes lourdes comprennent de très nombreux segments V (variables) et D (ces segments dits « de diversité » sont propres au locus de chaînes lourdes) et un groupe de 6 segments J, on trouve ensuite 9 gènes codant des régions constantes. Chaque gène constant est composé de multiples exons codant les domaines structuraux propres à chaque chaîne lourde. Lors des recombinaisons V(D)J, un segment est associé au hasard avec un des 6 segments J, puis le réarrangement de cette association D-J H s'effectue avec un segment V. La partie variable est associée à la région constante par épissage de TARN messager. Le passage de la forme membranaire à la forme sécrétée des Ig s'effectue par épissage alternatif d'un même transcrit primaire de chaîne lourde.

- Locus des chaînes légères kappa (chr. 2) : les gènes des chaînes légères κ comprennent de nombreux segments V et 5 segments J fonctionnels, on trouve ensuite un seul gène constant CK. Lors des réarrangements des gènes des chaînes légères, un segment V est accolé au hasard à un des 5 segments J. - Locus des chaînes légères lambda (chr. 22) : les gènes de chaînes légères λ présentent une architecture relativement différente des deux autres locus, dite groupée. On dénombre de nombreux segments V (29-33) et 4-5 segments J et C fonctionnels.

Différenciation des lymphocytes B en plasmocvtes

L'origine du clone plasmocytaire est un lymphocyte B post-centre germinatif. La différentiation des lymphocytes B s'effectuent selon deux phases : une phase indépendante de l'antigène dans la moelle osseuse et une phase dépendante de l'activation antigénique dans les organes lymphoïdes secondaires (rate, ganglions lymphatiques...). Au cours de la phase indépendante de l'antigène, les précurseurs B subissent des réarrangements de leurs gènes d'Ig. Ces recombinaisons se font par un assemblage ordonné des segments V (variable), D (diversité) et J (jonction) pour les chaînes lourdes d'Ig et des segments V et J pour les loci des chaînes légères. Ces jonctions V(D)J sont hautement diversifiées et permettent l'expression d'une multitude d'Ig capables de reconnaître un nombre quasi infini d'antigènes. Chaque cellule B synthétisant une Ig unique, généralement dépourvue de réactivité vis-à-vis des antigènes du soi, est sélectionnée positivement. Après différentes étapes de prolifération, cette cellule B donnera naissance à des clones exprimant la même Ig. La reconnaissance de l'antigène par l'immunoglobuline de surface aboutit ensuite à l'entrée des lymphocytes B activés dans les centres germinatifs où plusieurs processus de modifications génétiques se produisent. Les lymphocytes B activés peuvent notamment subir des réarrangements au niveau des gènes constants de chaînes lourdes. Ces recombinaisons génétiques sont influencées par de nombreuses cytokines et permettent l'expression de classes nouvelles d'immunoglobulines autres qu'IgM. Les mécanismes de commutation de classe sont fondés sur l'accolement des régions Switch situées en 5' des segments constants et l'élimination des régions intervenantes, sous forme d'ADN circulaire extrachromosomique. Dans les centres germinatifs, des mutations somatiques, qui correspondent à des modifications nucléotidiques ponctuelles ou à de courtes insertions ou délétions situées essentiellement au niveau des segments variables, permettent d'augmenter l'affinité du récepteur des cellules B pour l'antigène et de constituer un pool de cellules B mémoire de haute affinité. Les lymphocytes B activés peuvent également se différencier en plasmocytes qui synthétisent et sécrètent dans le sérum des quantités très importantes d'immunoglobulines. Les plasmocytes peuvent ensuite rejoindre la moelle osseuse où ils reçoivent des signaux de survie tels que l'interleukine-6 produite par les cellules stromales. Ces plasmocytes à longue durée ce vie peuvent persister plusieurs mois voire plusieurs années dans l'organisme. En accord avec leur statut post-centre germinatif, les cellules de myélome produisent des IgG et IgA, plus rarement des IgD et IgE, et présentent des taux élevées d'hypermutations somatiques au niveau de leur gènes d'immunoglobuline (Anderson et Carrasco, 2011).

La synthèse massive d'Ig par les plasmocytes doit être finement régulée afin d'éviter une surcharge du réticulum endoplasmique (RE) préjudiciable à la survie des plasmocytes.

Les inventeurs ont maintenant obtenu des résultats innovants soulignant la toxicité des Ig tronquées au cours de la différenciation physiologique des plasmocytes (Srour et al., J Exp Med, 2015, publication acceptée). De façon intéressante, la production d'Ig tronquées par les plasmocytes induit un stress cellulaire et provoque l'apoptose de ces plasmocytes.

Sur la base de ces résultats, les inventeurs ont mis au point une nouvelle approche thérapeutique qui consiste à induire la production d'Ig tronquées pour éliminer les plasmocytes pathologiques à l'aide d'oligonucléotides antisens (AON « ou OAS en français »). Ces AON sont capables de provoquer un saut d'exon au niveau de l'ARN des chaînes lourdes ou légères des Ig, se traduisant par l'expression d'Ig tronquées.

DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION La présente invention a pour objet une méthode de traitement des maladies impliquant des cellules de la lignée B comprenant l'administration chez un patient d'au moins un AON capable d'induire un saut d'exon dans l'une des régions variables ou constantes de l'une des chaînes lourdes ou légères des immunoglobulines.

Par « cellules de la lignée B », on entend les lymphocytes B et les plasmocytes. Dans un premier mode de réalisation, la présente invention concerne l'utilisation d'un AON permettant l'élimination de la région variable des chaînes légères ou lourdes des Ig. Les résultats de la partie expérimentale illustrent une telle approche, notamment à l'Exemple 3. En particulier, les inventeurs ont montré qu'en transfectant une lignée myéloïde avec un AON capable de s'hybrider spécifiquement avec la séquence du site donneur d'épissage de l'exon VJ de la chaîne légère exprimée par ce clone, les cellules produisent des Ig tronquées qui provoquent leur mort par apoptose. Ce résultat constitue la preuve de concept de la présente invention. Les inventeurs ont également validé une méthodologie permettant d'étudier l'efficacité des traitements AON en absence de transfection. La présente invention concerne donc l'utilisation d'un AON ciblant la partie variable VJ des chaînes légères des Ig pour éliminer un clone de la lignée B. Une telle approche est illustrée à l'Exemple 4.1. Dans un mode préféré de réalisation, l'invention consiste à utiliser un AON dirigé contre le site donneur d'épissage de l'exon variable situé sur la chaîne légère λ. Un AON préféré pour cette utilisation est l'AON de séquence SEQ ID NO.5.

De même, la présente invention peut être mise en œuvre en utilisant un AON capable d'induire un saut d'exon de sorte que l'Ig produite soit dépourvue de la partie variable VDJ des chaînes lourdes. Une telle stratégie est illustrée à l'Exemple 4.2.2.

Par « AON capable d'induire un saut d'exon », on entend tout AON se liant spécifiquement à la région ciblée de sorte que l'A Mm mature obtenu après épissage ne permette pas la traduction du domaine protéique que l'on souhaite éliminer. Par « domaine à éliminer », on entend soit la région variable d'une chaîne lourde ou légère, soit au moins une partie de la région constante d'une chaîne lourde. La séquence ciblée par l'AON peut contenir le site donneur d'épissage, le site accepteur d'épissage ou des séquences régulatrices d'épissage, par exemple activatrices (dites « enhancer »), situées dans les régions introniques ou exoniques. De plus, un AON selon l'invention est capable d'induire un saut d'exon en s'hybridant avec une séquence qui comprend un site donneur d'épissage, un site accepteur d'épissage ou des séquences régulatrices d'épissage situées dans les régions introniques ou exoniques des régions variables ou constantes des chaînes des immunoglobulines. Cet AON peut être utilisé dans le traitement des maladies impliquant des cellules de la lignée B.

L'approche thérapeutique visant à faire produire par les cellules de la lignée B une Ig dépourvue de domaine variable peut être mise en œuvre dans le cadre d'une médecine personnalisée. Une fois que le clone B responsable de la maladie a été identifié, un séquençage de la région variable est effectué et un AON capable de s'hybrider spécifiquement à cette séquence peut être sélectionné et administré en tant que médicament. Par exemple, dans le cas du MM, l'Ig monoclonale produite par le clone tumoral (par exemple : IgG, IgA, chaînes légères IgK ou ^λ) est recherchée par électrophorèse et immunofixation sur sérum de patients. Des biopsies de moelle osseuse permettent ensuite d'évaluer l'infiltration plasmocytaire, et de caractériser les réarrangements V(D)J du clone tumoral par amplification spécifique des transcrits d'Ig (Van Dogen JJM et al, Leukemia 2003 ; Bridoux et al, Am J Kidney Dis 2005). Après identification des réarrangements V(D)J portés par le clone tumoral, un AON spécifique du réarrangement ciblé est utilisé pour produire une Ig tronquée dépourvue de domaine variable.

Une même approche préalable, par amplification des transcrits d'Ig, est applicable à la caractérisation des réarrangements V(D)J de toute cellule B tumorale. Ainsi, de manière générale, le type d'Ig produite par le clone pathologique peut être déterminé à partir d'un échantillon sanguin ou d'un tissu lymphoïde du patient. Il s'agit alors de déterminer le type de la chaîne légère ou lourde du clone incriminé. De plus, dans le cadre d'une approche de médecine personnalisée du traitement d'un cancer myéloïde, la séquence variable spécifique du clone tumoral peut être obtenue à partir d'une biopsie médullaire du patient. Après identification des réarrangements V(D)J portés par les gènes de chaînes lourdes et légères d'Ig du clone tumoral, l'élimination de l'exon variable est réalisée à l'aide d'un AON dirigé, par exemple, contre le site donneur d'épissage du segment J impliqué dans le réarrangement.

Ainsi, dans le cadre d'une approche de médecine personnalisée, l'utilisation d'un AON selon l'invention comprend les étapes suivantes : a. Identification du clone cellulaire B responsable de la maladie à partir d'un échantillon d'un patient : identification des isotypes de chaînes lourdes et légères de l'Ig monoclonale produite par ce clone;

b. Caractérisation du réarrangement particulier de la région variable des chaînes lourdes ou légères, exprimée par ledit clone cellulaire B ;

c. Fourniture d'au moins un AON capable d'induire un saut d'exon dans l'une des régions variables de l'une des chaînes des immunoglobulines dudit clone ;

d. Administration dudit AON ou mélange d'AON au patient.

Ces approches thérapeutiques de médecine personnalisée permettant l'élimination du domaine variable sont basées sur l'identification du réarrangement V(D)J d'une cellule tumorale. Ces stratégies tiennent donc compte des éventuelles mutations somatiques introduites sur les exons variables au cours du processus de maturation d'affinité des Ig. Ainsi, une approche thérapeutique consistant en l'administration d'un AON capable d'induire un saut d'exon dans la région variable des chaînes légères ou lourdes des Ig est particulièrement adapté dans le cadre du traitement du myélome multiple, de l'amylose AL, des lymphomes non Hodgkiniens, de la leucémie lymphoïde chronique, de la maladie de Waldenstrom et de tout autre type de cancers touchant les cellules de la lignée B et impliquant la production d'une Ig monoclonale.

Cette approche personnalisée a l'avantage de permettre d'éliminer spécifiquement le clone tumoral en épargnant les cellules B saines et par conséquent en préservant les défenses immunitaires du patient. Cette approche thérapeutique ciblée représente donc une innovation majeure, contrastant avec les thérapies « lourdes » actuellement utilisées dans les cancers de la lignée B.

Dans un second mode de réalisation, la présente invention concerne l'utilisation d'un AON permettant l'élimination d'au moins un exon de la région constante des chaînes lourdes des Ig pour traiter des maladies impliquant des cellules de la lignée B.

Les inventeurs ont mis en évidence que la production d'une Ig tronquée par une cellule de la lignée B entraine un stress au niveau du RE qui conduit à la mort de ladite cellule par apoptose. Ainsi, l'une des hypothèses expliquant la toxicité de ces Ig tronquées est que la cellule serait sensible à la production de protéines mal repliées (du fait de l'absence de certains domaines). Dans ce contexte, on peut prédire qu'une cellule de la lignée B produisant des Ig dépourvues d'au moins une partie de leur domaine constant présentera le même phénotype qu'une cellule exprimant des Ig dépourvues de leur domaine variable.

Ainsi dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne un AON capable d'induire un saut d'exon dans la région constante de la chaîne lourde pour éliminer au moins l'un des exons CH1, CH2 ou CH3. L'approche visant à faire produire des Ig dépourvues d'au moins une partie de leur domaine constant est illustrée à l'Exemple 4.2.3. Cette stratégie thérapeutique permettant l'élimination d'un exon constant des chaînes lourdes d'Ig présente un spectre d'action plus large que la médecine personnalisée précédemment décrite pour l'élimination du domaine variable, basée sur l'identification du réarrangement V(D)J d'une cellule tumorale. En effet, l'élimination d'un exon constant permet de cibler spécifiquement les lymphocytes B exprimant soit des IgM, des IgG, des IgA ou des IgE. Pour la différencier l'approche de type « médecine personnalisée », on appellera « médecine générique » l'approche qui permet de traiter une pathologie en fonction de critères indépendants des réarrangements des régions variables. Le choix de la région à cibler dépendra alors des isotypes de chaînes lourdes ou légères d'Ig produites par les cellules B pathologiques.

Cette stratégie générique est applicable pour le traitement des cancers de la lignée lymphoïde B (alternativement à l'approche de médecine personnalisée telle que définie précédemment) mais aussi pour traiter un grand nombre de pathologies impliquant des cellules B non cancéreuses.

Ainsi, dans une mise en œuvre particulière, la présente invention consiste à utiliser des AON médicaments ciblant les gènes constants de chaînes lourdes d'Ig ; cette approche thérapeutique pourrait s'appliquer à de nombreuses pathologies telles que: l'allergie immédiate en ciblant les cellules B produisant des IgE,

des pathologies immunologiques impliquant des IgA

certaines pathologies immuno-allergiques impliquant des dépôts d'IgA (néphropathie à IgA, purpura rhumatoïde...) ou des propriétés immunopathologiques spécifiques des IgA (dermatite herpétiforme, maladies cutanées à dépôts linéaires d'IgA, ...) en ciblant les cellules B produisant des IgA,

les maladies auto-immunes impliquant des auto-anticorps et/ou spécifiques de tissus en ciblant les cellules productrices d'une classe d'auto-anticorps ayant une pathogénicité directe démontrée (par exemple thyroïdite auto-immune, maladie de Biermer, cytopénie auto-immune, etc..)

les pathologies liées à des dépôts tissulaires (rénaux, cardiaques, hépatiques, ou autres...) de chaînes d'immunoglobulines monoclonales (amylose, syndrome de Fanconi, syndrome de Randall, cryoglobulinémies, etc..)

en transplantation (rejet aigu impliquant des allo-anticorps de classe IgG).

La présente invention a pour autre objet un AON capable d'induire un saut d'exon au niveau de l'ARN des chaînes lourdes ou légères des immunoglobulines, pour son utilisation dans le traitement des maladies impliquant des cellules de la lignée B. Ainsi, un AON selon l'invention est capable d'induire la production d'une immunoglobuline dépourvue de région variable sur les chaînes lourdes ou légères ou d'au moins une partie de sa région constante sur les chaînes lourdes, pour son utilisation dans le traitement des maladies impliquant des cellules de la lignée B. La présente invention concerne également l'utilisation d'un AON capable d'induire la production d'une immunoglobuline dépourvue de région variable sur les chaînes lourdes ou légères ou d'au moins une partie de sa région constante sur les chaînes lourdes, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des maladies impliquant des cellules de la lignée B.

Au regard de ce qui précède, les applications thérapeutiques des AONs ciblant les transcrits d'Ig pour provoquer un saut d'exon et la production d'Ig tronquées peuvent couvrir la quasi-totalité des maladies touchant les cellules de la lignée B.

Dans le cadre d'une approche générique telle que définie précédemment, la présente invention peut être mise en œuvre en proposant les mélanges d'AON en tant que médicaments.

Ainsi, la présente invention a pour autre objet un mélange d'OAN capable d'induire spécifiquement la production d'une Ig tronquée. Des mélanges d'AON peuvent être fournis pour élargir le spectre d'action et/ou augmenter la toxicité de ces approches thérapeutiques. Les combinaisons sont multiples, ci-après une présentation de quelques mélanges présentant un grand intérêt thérapeutique et/ou un fort potentiel en tant que médicaments génériques « industrialisâmes ».

Mélange d'AON ciblant les segments J impliqués dans les réarrangements V(D)J de chaînes lourdes et légères d'un clone B

Un tel mélange serait particulièrement intéressant dans le cadre d'une approche de médecine personnalisée pour augmenter la toxicité du traitement, donc son efficacité.

Mélange d'AON ciblant tous les segments J de chaînes légères kappa

Un tel mélange permettrait de détruire sélectivement la population IgK qui représente environ 60% des cellules de la lignée B. L'avantage d'une telle approche générique est qu'elle permet d'éliminer le clone tumoral tout en préservant les lymphocytes B exprimant des (soit environ 40% de la population B totale). Il est utile pour traiter les maladies dans lesquelles l'Ig incriminée est une IgK.

Mélange d'AON ciblant tous les segments J de chaînes légères lambda

Un tel mélange permettrait de détruire sélectivement la population qui représente environ 40% des cellules de la lignée B. L'avantage d'une telle approche générique est qu'elle permet d'éliminer le clone tumoral tout en préservant les lymphocytes B exprimant des IgK (soit environ 60% de la population B totale). Il est utile pour traiter les maladies dans lesquelles l'Ig incriminée est une ^λ.

Mélange d'AON ciblant tous les segments J de chaînes lourdes Une telle approche permettrait de détruire l'ensemble des lymphocytes B, c'est-à-dire de réaliser une immunosuppression.

Ainsi, il est à noter que dans le cadre de l'invention, le terme « un AON » peut être remplacé par « un mélange d'AON » sans que cela n'affecte les utilisations et méthodes décrites. Le choix de ΓΑΟΝ permettant le ciblage des séquences décrites précédemment est à la portée de l'homme du métier. De tels AON peuvent être obtenus auprès de sociétés commerciales spécialisées dans la préparation d'AON à façon.

La présente invention a également pour objet une méthode de sensibilisation pour le traitement du MM par la voie des inhibiteurs du protéasome, consistant à administrer un AON capable d'induire la production d'une immunoglobuline dépourvue de région variable sur les chaînes lourdes ou légères ou d'au moins une partie de sa région constante sur les chaînes lourdes, au sein du clone B responsable du MM.

L'invention concerne également un AON capable d'induire la production d'une immunoglobuline dépourvue de région variable sur les chaînes lourdes ou légères ou d'une partie de sa région constante sur les chaînes lourdes, pour son utilisation dans le traitement du myélome multiple en combinaison avec un inhibiteur de la voie du protéasome.

Le traitement de choix pour le MM est actuellement le Bortezomib (Bz), un inhibiteur du protéasome. Toutefois, ce traitement présente des effets secondaires importants et certains patients sont ou deviennent résistants. II est à noter que l'utilisation conjointe d'un inhibiteur de hsp90 et du Bortezomib (Bz) présente des effets synergiques, en provoquant respectivement une augmentation du taux de protéines mal repliées et une diminution de leur dégradation par le protéasome ( ichardson DG et al., Br J Haematol 2011). Par conséquent, des protocoles thérapeutiques visant à augmenter le stress cellulaire pour sensibiliser les cellules au traitement Bz semblent donc très prometteurs, et particulièrement adaptés aux patients résistants au Bz. Ces traitements combinés pourraient également permettre d'administrer aux patients atteints de MM des doses plus faibles de Bz ou d'espacer les périodes de traitements. Par « traitement combiné », on entend une administration concomitante de l'inhibiteur du protéasome et de ΓΑΟΝ ou d'un mélange d'AON selon l'invention, ou l'administration séquentielle de ces médicaments. Dans ce contexte, les inventeurs proposent d'utiliser l'approche thérapeutique basée sur l'utilisation d'AON telle que décrite dans la présente invention en combinaison avec un traitement au Bz chez les patients atteints de M M.

Cette approche combinée peut être réalisée avec du Bz mais aussi avec tout autre inhibiteur du protéasome.

Parmi les autres inhibiteurs de protéasome qui pourraient être utilisés en association avec un AON ou un mélange d'AON selon l'invention, on peut citer le carfilzomib (Kyprolis™), et d'autres molécules actuellement en développement telles que le marizomib, l'ixazomib (MLN-978), le delanzomib (CEP-18770) et l'ONX-912. Les avantages de la présente invention ressortent de l'exposé de ces modes de réalisation et de ses applications. En particulier, les approches thérapeutiques proposées sont non-invasives et permettent un ciblage précis de la population de cellules de la lignée B à détruire. Ainsi, les effets secondaires devraient être limités. De plus, l'efficacité peut être modulée en administrant des mélanges d'AON. Ces caractéristiques rendent cette approche très attractive par rapport aux traitements actuels, en particulier du fait qu'ils sont généralement lourds à supporter pour les patients et sans être satisfaisants d'un point de vue thérapeutique.

Les AON utiles dans la cadre de la présente invention peuvent être administrés sous toute forme galénique appropriée. Actuellement, de nombreuses approches thérapeutiques utilisant des AON sont en cours d'essais précliniques et/ou cliniques (Moreno et Pêgo, 2014).

Les exemples qui suivent ont pour but d'illustrer certains modes de réalisation de l'invention et ne doivent pas être considérés comme limitant sa portée.

LEGENDES DES FIGURES Figure 1: Mise en évidence du saut d'exon et analyse de l'impact des Ig tronquées dans des lignées B de souris. A) Constructions utilisées pour la transfection des lignées B de souris (S194, Sp2/0). Les différentes constructions permettent l'expression des transcrits de chaînes légères IgK fonctionnels (F) ou non-fonctionnels (V ^stop *, C ^stop *). B) Analyse par T-PC de l'expression des ARN messagers IgK, normaux ou dépourvus de l'exon variable (« AV-KLC : V domain-less κ light chains »). C) Analyse protéique (Western Blot anti-lgK de souris) des chaînes légères IgK normales (KLC : ~25 KD) et tronquées (AV-KLC : ~12 KD) réalisées sur les cellules SP2/0 transfectées ou non (NT), avec ou sans traitement par un inhibiteur du protéasome (MG132 : ΙμΜ, 8h). D) Index apoptotique des cellules S194 représentant l'augmentation des cellules S194 Annexin V positives (%) après traitement par du MG132 (ΙμΜ, 5h). E) L'expression relative de Chop a été analysé par PCR quantitative sur les cellules S194 traitées ou non au MG132 (ΙμΜ, 5h). « stop* : codon stop prématuré consécutif à un décalage du cadre ouvert de lecture lors de la jonction des segments V et J ». Figure 2: Génération et analyse du modèle de souris iTIE (« inducible Truncated-lg expression ») permettant l'expression inductible d'une Ig tronquée. A) Schéma représentatif du modèle permettant de produire une Ig tronquée (L : exon leader ; CK : exon constant CK). Les animaux ΠΊΕ/+ ont été croisés avec des souris exprimant la recombinase Cre pour éliminer le gène NeoR et permettre l'expression des transcrits courts L-CK sans exon variable. B) Mise en évidence des Ig tronquées (« AV-KLC : . V domain-less κ light chains ») uniquement dans les souris exprimant la recombinase Cre (Cre ^pos ). Analyse protéique (Western Blot anti-lgK de souris) des chaînes légères IgK normales (KLC : ~25 kD) et tronquées (AV-KLC : ~12 kD) par Western Blot (anti-lgK de souris). L'administration de Bortezomib (Bz) a été réalisée par voie intrapéritonéale chez les souris iTI E comme indiqué dans la partie « méthodes ». C) Analyse par cytométrie en flux des populations de cellules B (B220 ^pos ) et de plasmocytes (B220 ^neg CD138 ^pos ), réalisée sur des cellules de rate d'animaux homozygotes iTIE/iTI E exprimant ou non la recombinase Cre, 7 jours après immunisation par des globules rouge de mouton. D) Analyse des taux d' Ig réalisée sur sérum de souris âgées de 8 à 12 semaines, réalisée par ELISA comme indiqué dans la partie « méthodes ». E) Les plasmocytes ont été triés comme indiqué dans le panel C et l'analyse des transcrits a été réalisée par PCR quantitative après normalisation par rapport à l'expression de Gapdh.

Figure 3: Elaboration d'un AON ciblant le site donneur d'épissage du segment Ιλ2. Schéma représentant la séquence d'ADN des transcrits identifiés dans la lignée RPM I8226 (en majuscule : la séquence du segment iX2 ; en minuscule : la séquence intronique située en 3' de ϋλ2). Un AON (en gras) capable de s'hybrider sur les transcrits primaires, au niveau du site donneur d'épissage du segment iX2 (séquence soulignée) a été synthétisé. (L: exon « leader » ; VJ : exon variable ; C : exon constant). La séquence de cet AON correspond à la SEQ I D NO.5.

Figure 4: Administration d'un AON dans les cellules de myélome RPMI8226. A) Schéma représentant l'administration d'un AON capable de s'hybrider sur les transcrits primaires ^λ, en ciblant le site donneur d'épissage du segment iX2. Les AON de type « morpholino » (contrôle et spécifique de iX2) ont été synthétisés par l'entreprise Gene Tools, LLC. La position des amorces PCR est symbolisée par des flèches. (L: exon « leader » ; VJ : exon variable ; C : exon constant). B-D) Les expériences ont été réalisées 48h après la transfection des cellules RPMI8226 (3 x 10 ⁶ ) par ΓΑΟΝ. RT-PCR (B) et analyse protéique par Western Blot (C, anti-h^) mettant en évidence l'élimination de l'exon variable par saut d'exon D) Analyse par PCR quantitative des transcrits Chop et BiP normalisée par rapport à l'expression de Gapdh. E) Elimination de l'exon variable par administration passive d'AON, en absence de transfection. Les cellules RPMI8226 (1 x 10 ⁶ ) ont été incubées pendant 4h avec des AON (10 μΜ) de type « vivo-morpholino » (contrôle et spécifique de iX2) commercialisés par l'entreprise Gene Tools, LLC. Après lavage, les cellules sont cultivées pendant 48h et l'analyse du saut d'exon est réalisée par RT-PCR après 24h et 48h de culture. L'élimination de l'exon variable est visualisée par l'apparition d'une bande à 253 pb comme indiquée dans le panel B.

Figure 5: Forcer le saut d'exon pour produire des Ig tronquées toxiques dans les plasmocytes.

Schéma représentant l'administration d'un oligonucléotide antisens (AON) ciblant le site donneur d'épissage du segment JK5. L'hybridation de ΓΑΟΝ sur les transcrits primaires IgK provoque l'élimination de l'exon variable VJ lors de l'épissage. Les transcrits courts permettent la synthèse massive d'une chaîne d'Ig dépourvue de domaine variable toxique dans la lignée lymphoïde B.

Figure 6: Expression d'une chaîne lourde μ et passage de la forme membranaire à la forme sécrétée. Dans les lymphocytes B et les plasmocytes, les Ig (ici une chaîne lourde μ) sont respectivement produites sous forme membranaire et sécrétée. Les Ig membranaire sont produites par utilisation du site donneur d'épissage interne au CH4 qui est épissé sur le premier exon de membrane (Ml), le site de polyadénylation (polyA) utilisé se situant ainsi après le deuxième exon de membrane (M2). Les plasmocytes quant à eux produisent essentiellement des Ig sous forme sécrétée. Dans le cas d'une chaîne lourde μ sécrétée, le site d'épissage interne au CH4 n'est pas utilisé, le transcrit comprend ainsi la partie 3' de cet exon (représentée en jaune) et utilise le site de polyA situé directement en aval (adapté de Lefranc et al., 1999).

Figure 7: Forcer le saut d'exon pour produire des chaînes lourdes tronquées dépourvues de domaine V. Schéma représentant l'administration d'un oligonucléotide antisens (AON) ciblant le site donneur d'épissage du segment J. L'hybridation de ΓΑΟΝ sur les transcrits primaires provoque l'élimination de l'exon variable VDJ lors de l'épissage. Les transcrits courts permettent la synthèse massive d'une chaîne d'Ig dépourvue de domaine variable.

Figure 8: Forcer le saut d'exon pour produire des chaînes lourdes tronquées au niveau d'un exon du domaine constant. Schéma représentant l'administration d'un oligonucléotide antisens (AON) ciblant le site donneur d'épissage d'un exon constant (CH1). L'hybridation de ΓΑΟΝ sur les transcrits primaires provoque l'élimination de l'exon constant (CH1) lors de l'épissage. Les transcrits courts permettent la synthèse massive d'une chaîne d'Ig dépourvue d'un des domaines constants (CH1). MATERIELS ET METHODES

Obtention et analyse des souris transgéniques iTIE

Le modèle de souris iTIE (inducible Truncated-lg expression) présente une modification génétique au locus des chaînes légères IgK, obtenue par recombinaison homologue comme décrit précédemment (Sirac et al., 2006). Les segments JK de souris ont été remplacés par une cassette contenant un promoteur (pVH), un exon leader (Ll-33) et un gène de résistance à la néomycine (NeoR) entouré de sites loxP. La transcription du gène NeoR, en orientation opposée, permet de bloquer la transcription et/ou l'épissage de l'exon leader (Figure 2A).

Des souris âgées de 2 ou 3 mois ont été utilisées dans toutes les expériences, réalisées conformément aux Directives du Comité d'éthique pour l'expérimentation animale du Limousin (enregistrées par le comité national sous le numéro C2EA-33) et approuvés en tant que partie du protocole enregistré sous le numéro CREEAL 6-07-2012. Les souris mutantes hétérozygotes (ΠΊΕ/+) ont été croisées avec des souris C57BL/6 (B6) pendant au moins 3 générations, et croisées ensuite avec des souris exprimant un Cre pour induire la délétion de la cassette NeoR. Les souris B6 CMV- Cre proviennent de la Clinique de la souris (lllkirch, France).

Pour analyser le développement tardif des lymphocytes B, les cellules ont été isolées à partir de rate de souris iTI E, 7 jours après leur immunisation par injection intra-péritonéale (200 μΙ/souris) de globules rouge de mouton (GR, BioMérieux ^® SA-France). Dans la figure 2B, les souris ont reçu des injections additionnelles de Bortezomib (Sillag), par voie sous-cutanée (0.5 mg/kg) aux jours 5 et 6. L'analyse des cellules B et des plasmocytes a été réalisée par cytométrie en flux, après marquage par des anticorps anti-GL7, anti-B220 et anti-CD138 (BD Biosciences).

Transfection cellulaire et administration passive des AON

Les lignées murines (A20, S194 and Sp2/0) ont été cultivées (10 ⁶ cellules/ml) dans un milieu RPMI complémenté avec 10% de sérum de veau fétal (Invitrogen), du pyruvate de sodium, des acides aminés non essentiels, du β-mercaptoethanol, 100 U/ml de pénicilline et and 100 μg/ml de streptomycine (Gibco). Les cellules (2xl0 ⁶ ) ont été transféctées de manière stable par éléctroporation conformément aux instructions du fabricant (Amaxa). Les réarrangements VKJK5 sont créés par jonction des segments et JK5. Lors de la jonction, des nucléotides sont intégrés pour créer un décalage du cadre de lecture mimant des réarrangements non-fonctionnels. Les transfections ont été réalisées en utilisant une construction plasmidique respectant le cadre de lecture (F), et les constructions non-productives V ^PTC et C ^PTC soit séparément, soit en mélange équimolaire de F et de V ^PTC ou C ^PTC comme décrit précédemment (Chemin et al., 2010). Les cellules transfectées (lxl0 ⁶ /ml) ont été traitées par un inhibiteur du protéasome le MG132 (Sigma-AIdrich) (ΙμΜ).

Les cellules (3x10 ^e ) de myélome (lignée PMI8226) ont été transfectées avec différentes concentrations d'oligonucléotide antisens (1, 5 ou 10 μΜ d'AON-^2 : 5'AGAAGAGACTCACGTAGGACGGTCA (SEQ ID NO.5); GeneTools, LLC), par électroporation conformément aux instructions du fabricant (Amaxa). Les analyses ont ensuite été réalisées 24 et 48h après la transfection.

L'administration passive des AON a été réalisée avec des AON de type « vivo-morpholino » (contrôle et spécifique de iX2), commercialisés par l'entreprise Gene Tools, LLC. Ces AON présentent des modifications chimiques qui leur confèrent la capacité de pénétrer passivement dans les cellules. La mise au point de cette méthodologie applicable aux cellules de patients constitue une avancée majeure pour la réalisation d'études précliniques. Les cellules RPMI8226 (1 x 10 ⁶ ) ont été incubées avec des AON (10 μΜ en PBS) pendant 4h. Après lavage, les cellules sont cultivées en milieu complet et l'analyse du saut d'exon est réalisée par RT-PCR après 24h et 48h de culture. Des expériences d'administration passive d'AON de type « vivo-morpholino » ont également été réalisées sur des cellules B primaires de souris stimulées in vitro par du LPS.

Analyse protéique

Pour l'analyse Western Blot, des gels de polyacrylamide 4-20% (Biorad) ont été utilisés. Chaque échantillon a ensuite été dénaturé à 94 ° C pendant 3 minutes avant d'être chargé. Les gels ont été transférés sur des membranes de fluorure de polyvinylidène (Biorad) avec un appareil TransBIot ^® Turbo™. Le blocage des membranes a été réalisé dans un tampon PBST (137 mM de NaCI, 2,7 mM de KCI, là mM de Na2HP04, 2 mM de KH2P04, 0,1% de Tween ^® 20, pH 7,4) contenant 5% de lait écrémé en poudre. Le signal a été mesurée par chimioluminescence (ECL plus ; GE Healthcare). Des anticorps de lapin dirigés contre les protéines de souris H ERP (Santa Cruz Biotechnology), CHOP, BIP, IREloc (Cell Signaling Technology), de chèvre anti-lgK (Beckman Coulter) et anti-GAPDH (R & D Systems) de souris. L'intensité du signal GAPDH a été utilisée pour la normalisation entre les échantillons.

Les analyses par ELISA permettant de déterminer les taux d'Ig ont été réalisées à partir de sérum ou de surnageants de culture, en utilisant des anticorps de mouton dirigés contre les Ig de souris (IgM, IgGl, lgG3, lgG2b, IgK, and total IgG) (Southern Biotechnology) comme indiqué précédemment (Pinaud et al., 2001; Sirac et al., 2006). Après addition de p-nitrophenyl phosphate (Sigma-AIdrich) pour permettre la révélation enzymatique, les plaques ont été lues à une longueur d'onde de 405 nm.

PCR and RT-PCR

Pour analyser les réarrangements VJ, les amplifications ont été réalisées à l'aide de couples spécifiques des humaines (Sens Leader-consensus : 5' - ATG G CCTG G D YYVY DCTVYTYCT (SEQ I D NO. l) ; avec D = A ou G ou T, Y = C ou T, V = A ou C ou G, et antisens C -AS : 5'-CTCCCGGGTAGAAGTCACT (SQ I D NO.2)), ou spécifiques des IgK de souris (L^-S : 5'-TCGGTTACCATTGGACAAC (SEQ I D NO.3) et CK-AS : 5'-GCACCTCCAGATGGTTAACTGC (SEQ ID NO.4)). Après clonage des produits d'amplification dans le vecteur pCR2.1-TOPO (Invitrogen) et séquençage, les jonctions VJ ont été analysées en utilisant le logiciel V-QUEST (The international ImMunoGeneTics information System ^® ).

Les PCR quantitatives ont été réalisées sur un appareil ABI PRISM 7000 en utilisant des amorces et des sondes Taqman spécifiques de chaque gène, commercialisées par Life Technologies. La quantité relative des différents transcrits a été déterminée par la méthode standard 2 ^{" ct} après normalisation sur l'expression de Gapdh. Analyse statistique

La moyenne et l'écart type de la moyenne sont représentés. L'analyse statistique des différences entre les valeurs a été calculée à l'aide d'un test de Student en utilisant le logiciel Prism GraphPad (San Diego, CA).

RESULTATS

Exemple 1 : Impact de l'expression d'Ig tronquées dans des plasmocytes normaux. 1.1 Production d'Ig tronquées in vitro

Afin d'analyser les conditions du saut d'exon, des lignées cellulaires B de souris (S194 et Sp2/0) ont été transfectées avec des constructions permettant l'expression de différents types de transcrits de chaînes légères IgK (Figure 1A) : des transcrits IgK fonctionnels avec un réarrangement VJ en phase

des transcrits IgK non-fonctionnels avec des codons non-sens, soit à l'extrémité 3' de l'exon VJ (construction V ^stop* ), soit dans l'exon C (construction C ^stop* ), issus d'un décalage du cadre de lecture lors de la jonction des segments V et J.

L'analyse au niveau transcriptionnel (Figure 1B) et protéique (Figure 1C) montre que la délétion de la région V, consécutive à un « saut » de l'exon VJ lors de l'épissage, est effective principalement lorsque l'exon V lui-même contient un codon non-sens (construction V ^stop* ).

Il est connu que la survie des plasmocytes dépend de leur capacité à supporter la réponse au stress au niveau du RE associée à la synthèse massive d'Ig (Cenci et al., 2011). De ce fait, les inventeurs ont voulu vérifier si la production d'Ig tronquées, i.e. avec des structures et des repliements anormaux, pouvait impacter la survie des plasmocytes. A cette fin, ils ont analysé l'index apoptotique au regard de l'abondance des chaînes IgK tronquées (« Δν-KLCs : V-domain less κ light chains »). Ils ont ainsi montré que les cellules exprimant la construction V ^PTC présentent un niveau d'apoptose supérieur à celui des cellules non transfectées (NT) ou exprimant la construction C ^stop* (Figure 1D). De plus, la quantification des ARNm de Chop (C/EBP homologous protein), un facteur de transcription impliqué dans l'apoptose induite par un stress du RE (Figure 1E), révèle une augmentation de l'expression de cet ARNm d'un facteur de plus de 2 par rapport à la quantité présente dans les cellules non transfectées. Par conséquent, la présence de chaînes Δν-KLCs semble provoquer une augmentation du stress au niveau du RE qui sensibilise les plasmocytes à l'apoptose dépendante de CHOP. 1.2 Production d'Ig tronquées dans un modèle murin iTIE

Afin d'étudier l'impact de la production d'Ig tronquées sur le développement des lymphocytes B et la réponse humorale, un modèle animal présentant une modification génétique au locus des chaînes légères IgK a été utilisé. Celui-ci permet d'induire à dessein la synthèse d'Ig tronquées. La stratégie utilisée pour construire ce modèle animal iTIE (inducible Truncated-lg Expression) est présentée à la Figure 2A. L'activation de la transcription du locus IgK modifié à l'aide d'une recombinase Cre permet l'expression d'un A Nm dépourvu de la région V (Figure 2A) ainsi que celle d'une protéine tronquée correspondante (Figure 2B). Ce modèle a permis de mettre en évidence que l'expression d'Ig tronquées (Δν-KLCs) affecte la survie des plasmocytes normaux (Figure 2C) et la réponse humorale (Figure 2D). Des croisements du modèle iTIE avec des souris DH-LMP2A ont également été faits dans le but de générer des lymphocytes B et des plasmocytes exprimant uniquement des chaînes IgK tronquées (Casola S et al., Nat Immunol 2004 ; Bonaud A et al., Blood 2015). Ce nouveau modèle a permis de montrer que la simple expression d'IgK tronquées est suffisante pour provoquer un stress dans les plasmocytes et augmenter l'expression des protéines CHOP, BiP, IREla et HERP (résultats non montrés), révélant ainsi la toxicité intrinsèque des chaînes IgK dépourvues de domaine V. Cette toxicité peut être associée à l'expression de marqueurs du stress existant dans le RE, en particulier Chop, BiP, Herp et Xbpls, comme le montre la Figure 2E. Ces résultats in vivo confirment le fait que l'expression d'Ig tronquées provoque un stress au niveau du RE qui conduit à l'apoptose des plasmocytes.

Exemple 2 : Augmentation de la sensibilité de lignées plasmocytaires exprimant une Ig tronquée vis-à-vis d'un traitement au Bz

Des travaux menés par l'équipe du Dr Sirac ont mis en évidence une grande sensibilité au Bz de plasmocytes exprimant une chaîne lourde d'Ig tronquée (Bonaud et al., Blood, 2015).

Les inventeurs ont maintenant montré que la présence d'Ig tronquées dépourvues de domaine variable, codées par des transcrits courts de chaînes légères Kappa sans exon variable, augmente l'apoptose des lignées plasmocytaires traitées par du MG132, un inhibiteur du protéasome (Figure 1C). En accord avec ces résultats, les Ig tronquées sont activement dégradées par le protéasome et leur quantité augmente considérablement après administration de Bz (par voie intrapéritonéale) chez les souris iTIE (Figure 2B).

Exemple 3 : Etude de faisabilité d'une stratégie par saut d'exon pour augmenter la synthèse d'Ig tronquée dans des plasmocytes tumoraux. Afin de valider le concept d'administration d'I AON pour induire la production d'Ig tronquées, un modèle cellulaire a été utilisé. Cette expérience a consisté à éliminer l'exon variable VJ et forcer la synthèse d'Ig aberrantes dans la lignée de myélome ( PMI 8226). Cette lignée de myélome exprime une ^λ. Par RT-PCR, nous avons amplifié les transcrits pour identifier le réarrangement VJ. Après clonage et séquençage du produit d'amplification, le réarrangement VJ a été analysé sur le site IMGT. La lignée RPMI-8226 exprime un réarrangement Vi l (IGLV2-14, IGLJ2). Ces cellules ont été transfectées avec un AON de type « morpholino » dirigé contre le site donneur d'épissage du segment Jλ2 (Figure 4A) et commercialisé par l'entreprise Gene Tools, LLC. Une représentation détaillée de l'hybridation de l'AON sur le transcrit primaire est présentée sur la Figure 3 et la séquence de l'AON utilisé correspond à la séquence SEQ ID NO.5. De façon intéressante, l'AON perturbe efficacement l'épissage et induit une forte augmentation des transcrits courts dépourvus de l'exon variable VJ (bande à 253 paires de bases ; Figure 4B). Au niveau protéique, l'administration d'AON induit la production des Ig tronquées sans domaine variable (Figure 4C). Les cellules transfectées avec l'AON présentent des taux élevés du facteur pro-apoptotique Chop et de la protéine chaperone BiP, soulignant ainsi le stress cellulaire consécutif à la production des Ig aberrantes (Figure 4D).

Une étude a également été réalisée dans laquelle les des AON sont administrés de manière passive, en absence cde transfection. Les cellules RPMI8226 ont été incubées avec des AON de type « vivo- morpholino » commercialisés par l'entreprise Gene Tools, LLC. Ces AON de type « vivo-morpholino » présentent des modifications chimiques qui leur confèrent la capacité de pénétrer passivement dans les cellules. Comme le montrent les résultats (Figure 4E), le saut d'exon est très marqué après administration passive d'AON de type « vivo-morpholino ». Une augmentation du saut d'exon a également été mise en évidence après administration passive d'AON de type « vivo-morpholino » sur des cellules B primaires de souris, stimulées in vitro par du LPS (résultats non montrés). La validation de cette méthodologie applicable aux cellules de patients constitue une avancée majeure pour la mise en place d'études précliniques.

Exemple 4 : Stratégies permettant l'obtention d'Ig tronquées à visée thérapeutique

4.1 Fourniture d'un AON capable d'induire un saut d'exon visant à produire des chaînes légères IgK ou Ig tronquées, sans domaine variable.

Les transcrits de chaînes légères d'Ig sont composés de 3 exons : L (« leader »), VJ (variable) et C (constant). Afin de produire une chaîne légère tronquée dépourvue du domaine variable, des oligonucléotides antisens (AON) ciblant le site donneur d'épissage de l'exon VJ peuvent être utilisés pour éliminer les exons VJ lors de l'épissage. D'un point de vue mécanistique, les inventeurs ont montré que les plasmocytes exprimant ces Ig aberrantes meurent par apoptose (Srour et al, J Exp Med, publication acceptée). Cette stratégie est représentée à la Figure 5.

4.2 Fourniture d'un AON capable d'induire un saut d'exon visant à produire des chaînes lourdes tronquées.

Une même stratégie peut être appliquée au ciblage des chaînes lourdes. Dans ce cas, les AON peuvent cibler soit l'exon variable VDJ, soit les exons constants (CH1, CH2 ou CH3).

4.2.1 Rappel du mécanisme de production des chaînes lourdes μ dans les lymphocytes B et les plasmocytes.

Le processus d'expression des chaînes lourdes μ, soit sous forme membranaire dans les lymphocytes B, soit sous forme sécrétée dans les plasmocytes, repose sur un épissage alternatif des A Nm, comme représenté à la Figure 6.

4.2.2 Fourniture d'un AON capable d'induire un saut d'exon visant à produire des chaînes lourdes tronquées, sans domaine variable.

La production d'Ig tronquées peut aussi être induite en forçant l'élimination du domaine variable des chaînes lourdes.

L'élimination des exons variables peut être obtenue à l'aide d'un AON dirigé contre le site donneur d'épissage du segment J impliqué dans le réarrangement, après avoir identifié le réarrangement VDJ porté par le clone tumoral. Ainsi, l'ARNm mature ne contient pas de domaine variable. Cette stratégie est illustrée à la Figure 7.

4.2.3 Fourniture d'un AON capable d'induire un saut d'exon visant à produire des chaînes lourdes tronquées, dépourvues d'un des domaines constants.

La production d'Ig tronquées peut aussi être obtenue en éliminant l'un des domaines constants des chaînes lourdes des Ig, comme cela est représenté à la Figure 8.