本发明涉及^：泡在超声激励下的止血治疗新� �途， 可以应用于肝实质 性脏器的创伤后止血治疗， 属于非创伤性超声治疗的技术领域。

技术背景

肝脏是腹部创伤中最容易受到损伤的器官， 其创伤后出血是腹部创伤 后最常见并发症， 导致的出血性休克是死亡的主要原因。 肝的血供丰富且 质地柔软的实质性器官， 肝中破裂出血和慢性渗血中约 50 %最后仍然需要 手术止血 ^[1 — ^2] , 复杂的肝创伤不易手术修补缝合， 而且手术创伤性大 ^[3] 。 目 前， 尽管目前已经发展出超声造影引导下止血剂注 射、 微波或射频热凝固 止血、 高强度聚焦超声术中止血、 介入性血管栓塞等方法， 但是以上止血 方法可能存在止血范围局限、 设备复杂、 需要精确影像导航、 耗时长等局 限性， 这些治疗手段往往不能满足患者的治疗要求， 故寻找一种非创伤性 的腹部创伤后止血方法十分必要。

高强度聚焦超声 （H igh intens i ty focused ul t rasound, HIFU )利用 超声的热效应进行肝脏创伤止血。 但是， 目前看来 HIFU肝脏止血需要在开 腹直视下的进行， 而深部出血则需要准确的影像引导聚焦超声能 量。 该方 法需要较大的超声设备， 手术过程中均需要麻醉， 操作复杂。 如果不开腹 在体外实施， 则存在肋骨或者肠道等声阻抗界面阻挡、 热效应聚集差、 传 导不均匀等情况， 可能烧伤皮肤、 肋骨及肠道等周围重要器官， 产生严重 的副作用， 故体外治疗试验从未实施过。 其止血作用主要限于肝表面， 治 疗时间偏长，在治疗中受到很大程度的限制， 目前尚未在临床推广应用 ^[4 _ ^7] 。

超声空化效应 ( cav i ta t ion ), 注： 空化效应是指液体中^:气泡在超声 作用下产生震荡、 膨胀、 收缩以及内爆等一系列动力学过程， 伴随瞬态高 温、 高压、 冲击波、 放电和微射流等多种能量释放行为） ^[8] 是热效应之外另 一种超声的主要物理效应。

近年来， 泡超声造影剂增强的超声空化效应在非创伤性 超声治疗领域 中的基础研究十分活跃， 但是大多数相关研究主要涉及微泡作为载体进 行 药物释放和基因转染， 对其空化本身的机械性损伤效应研究较少。 生物体 内的声空化效应的发生和强度影响因素较多， 但最重要的因素是超声峰值 负压强度， 一般在峰值负压大于 0. 6MPa时就会发生显著的空化效应。 欧美 仅有 Hwang、 Ca in, Mi l ler和刘政等少数几个课题组进行过该领域的探 讨 "― ^13] , 他们的研究仅涉及到正常血管壁的空化物理损 伤和离体组织标本的超 声空化消融， 釆用的治疗方法也不尽相同。 Hwang等釆用经静脉注射^：泡联 合聚焦超声空化损伤实现了对兔耳缘静脉血管 内皮的损伤， 但是需要局部 管腔内注射小剂量凝血酶， 才可能造成血管栓塞； Ca in ^[ "的空化研究中没有 釆用静脉注射微泡， 而是利用超声激发生物体内自身潜在的微泡发 生空化 进行组织消融， 釆用的是离体正常心肌等组织作为研究对象； Mi l ler等主 要研究微泡诱导的超声空化对于正常心肌或者 肾脏等器官微血管的空化损 伤副作用， 他们的空化研究中均没有釆用肿瘤新生血管作 为消融破坏对象。 国内吴巍等 ^[14 — ^15] 釆用的是低频 ( 20-50KHz )低功率 ( 1-l OOW/cm ² )超声联合 微泡进行微血管栓塞， 不仅与本项目要求的 300KHZ-3. 0MHz、峰值负压大于 2. OMPa的脉冲式超声完全不同， 而且该研究文献中实验结果， 经反复重复 无栓塞阻断^：血管效果。 诊断超声虽然峰值负压也可以达到 2MPa以上， 但 是其脉冲宽度极短（约为 1个周期）， 不能诱导高强度的超声空化效应。 发明内容

本发明提出一种微泡在制备联合超声产生空化 作为肝创伤出血症止血 药物的用途， 是一种新型非创伤性的超声空化止血用途。

所述微泡是一种在循环中在一定能量的超声脉 冲激励下能够产生高强 度声空化的微泡； 所述空化可以机械性破坏局部肝脏的微小血管 ， 形成血 管周围出血、 血肿和血管内血栓； 空化效应产生的声孔效应还导致肝细胞 肿胀， 挤压肝窦， 导致局部肝组织暂时性的 循环阻断， 从而在肝创伤时 产生止血。

上述微泡选自超声造影剂微泡或者治疗型微泡 ， 选自声诺维 ( SonoVue )、 Def ini ty 、 O t i son™ 、 Sonazoid™ 、 Imagent、 全氟丙坑 人血白蛋白微球和全氟显； 微泡釆用经外周静脉注射方式进入人体， 微泡 注射液使用剂量在但不限于每公斤体重 0. 01—1. 0毫升范围。

上述的肝创伤后出血症， 是指肝脏在各种创伤情况下产生的出血现象， 包括战伤及腹部各种创伤后常见的并发出血症 。

上述超声能量为脉冲式或者间歇脉冲式超声发 射， 具有较高的峰值声 压和较低的发射占空比。

上述超声能量形式： 其发射的频率范围在 300千赫兹 -3. 0兆赫兹； 包 括峰值正压和峰值负压的超声峰值声压在 1-9 兆帕； 每个超声脉冲宽度在 20个周期以上； 其每次脉冲式超声发射治疗总时间 30秒以上； 脉冲式超声 发生可以是连续式， 也可以呈间歇式， 间歇或暂停时间为 0-20秒不等； 超 声发射占空比变化在 0. 01-10%之间。

上述高强度声空化是指微泡在权利要求 5 中所述的超声能量形式照射 激发情况下所发生的强烈声空化效应。

实现上述发射超声的治疗装置是各种形式的平 面式发射或者聚焦式发 射的超声仪。

所述的^:泡增强的超声空化止血治疗作用， 在联合静脉使用凝血酶原 复合物或者纤维蛋白原时， 其止血作用可以得到进一步增强。

微泡的超声造影增强作用已经在临床诊断中被 批准， 在本发明中属于 新的治疗用途。 在本发明设计的超声能量靶向照射作用下， 经静脉进入血 液循环的微泡会发生高强度的声空化效应， 首先可以造成显著的肝微小血 管机械性破坏、 出血和血肿形成， 进而产生血液循环的暂时 （血流灌注） 阻断效应， 在此基础上， 阻断了出血的来源而止血。 其特点是阻断血流灌 注不论是表面或者深层组织。 本发明的超声能量是指一种脉冲式或者间歇 脉冲式、 较高峰值声压、 较低的发射占空比的超声能量形式， 其发射的频 率范围在 300KHZ-3. OMHz; 超声发射可以呈连续脉冲式或者间歇脉冲式， 间 歇（暂停）时间从 2-20秒不等； 超声峰值负压在 2-10MPa之间； 超声发射 的每次脉冲宽度在 20 个周期以上； 超声发射占空比多变化在 0. 01-10%之 间；因而平均声强（ I _SPTA )多低于 2W/cm ² ,热效应微小。每次治疗时间在 30-600 秒之间。 例如： 本研究使用的声学参数为超声发射频率 831KHz , 峰值声压 4. 47MPa , 脉冲宽度 400个周期， 脉冲重复频率 9Hz , 间歇脉冲式超声发射 (发射 6秒 /间歇 6秒）， 实际占空比 0. 22% ,平均声强仅 ( I _SPTA ) 0. 4 W/cm2 。 附图说明

图 1为止血过程的示意图；

图中 A:以尺子刻度为标， 用手术刀切割一个 2cm的切口。 B: 收集 10 秒出血量， 计算初始出血速度。 C: 治疗仪探头覆盖切割伤伤口， 进行肝脏 止血治疗。 D: 超声治疗组治疗后伤口出血止血。

图 2为视觉评估（A )及总出血量（B )在超声微泡组、 单纯超声组、 假 照组之间的比较图；

图 3. 超声下观察超声^:泡组及假照组肝脏（A D) , 治疗前造影图像下 显示两组肝实质充盈良好（B E) , 治疗后假照组造影前后无差别（B C) ,微泡 超声组止血治疗后出现超声造影的充盈缺损（ E F)；

图 4.止血后的肝组织结构示意图。

具体实施方式

(1)超声治疗仪声学测量

超声治疗仪器的其声学参数包括超声频率、 峰值负压、 脉冲宽度、 平 均声强 （I™)和占空比等， 一律以水听器法测量结果为准。 超声治疗仪信 号发出后，接收信号由距发射换能器 3cm处的针状水听器（NTR1000 , 美国） 接收， 经前置放大器（NTR, 美国）放大后由数字示波器（Ag i lent 55310, 美国）计算机釆样分析。 测量结果，

(2)肝脏创伤后止血实验

目的： 建立兔肝脏切割伤出血模型， 利用超声联合微泡空化效应进行 肝脏止血。

材料与方法：

(一）模型制备

健康新西兰大白兔 20只， 雌雄不限， 体重在 2000-2225g。 新西兰兔 以速眠新 II 0. 2mg/kg麻醉后，仰卧固定于自制木板上，建立耳 缘静脉通道， 2%戊巴比妥钠 （ 0. 2ml /kg )经耳缘静脉注射麻醉后， 剑突到肋弓下缘腹部 备皮， 按外科无菌程序消毒术区皮肤， 常规消毒铺洞巾， 无菌条件下开腹， 剑突下 1 cm 处沿腹白线作长 1 ~ 2 cm 的正中切口，逐层开腹， 经手术暴露 肝脏后轻轻将肝左中叶及右肝牵出腹腔， 以生理盐水浸润纱布固定。 以手 术刀片切 2 X 0. 5cm大小伤口（图 2 A) , 造成肝脏切割伤出血模型（图 2 B )。

(二） 实验分组

随机分为三组：即超声微泡组（ n=8 )、单纯超声组（ n=6 )、假照组（η=6) , 超声微泡组釆用超声照射联合经静脉微泡注射 ； 单纯超声组仅有超声照射； 假照组仅施予超声治疗头假照。

(三）超声造影检查

各组创伤前、 治疗后超声造影， 分析各时间点为 0、 10min、 48h (共 3个时间点）超声造影灌注峰值灰阶变化及视� �评分方法分析微泡增强的超 声空化阻断兔肝实质血流的持续时间， 了解肝实质血流灌注的恢复情况（图 3 )。

(四）创伤后初始出血速度的计算

初始出血速度 ( ml /min )是纱布吸取切口造成后的出血量除以 10s时 间所得到的比值。 取无菌纱布称原始重量， 重量精确到 0. Olg , 切口造成后 立即按秒表计时， 同时纱布吸血， 10s 后纱布称重减去纱布原始重量得到 10s出血量。

(五）兔创伤后肝脏超声空化治疗

超声造影釆用编码激励谐波成像， 机械指数 0. 13 , 造影团注 "脂氟 显" 微泡 0. 01 ml /kg , 图像深度、 增益在实验中保持不变。 按设定时间和 超声定位方向辐照切割伤区肝脏， 超声 ^：泡组釆用超声照射联合经静脉 ： 泡注射； 单纯超声组仅有超声照射； 假照组仅施予超声治疗头假照。 超声 微泡组在治疗时经静脉通道緩慢推注微泡緩慢 推注微泡（ 0. 1 ml /kg , 以生 理盐水稀释至 3ml )同时用超声治疗头垂直轻压辐照切割伤区肝� � 2min (图 1C ); 单纯超声组用 3 ml 生理盐水代替^:泡， 同时用超声治疗探头垂直轻 压辐照肝脏 2min; 假照组治疗头假照 2min, 用相同剂量的生理盐水替代 ： 泡。

(六）视觉评分

止血治疗后立即进行止血效果的视觉评分， 分为以下等级：

0级指一个完全止血；

1级指緩慢渗血；

2级指轻^:的活动性出血；

3级指肉眼可见的出血；

4级指显著的大出血。

(七）病理学检查

每组随机选取三只实验兔， 分两组： 一组为开腹治疗后立即获取辐照 靶区肝组织及未损伤肝组织， 一组为治疗后关腹 48h后获取辐照靶区肝组 织及未损伤肝组织。 光镜观察， 置于 10%甲醛液中固定， 石蜡包埋切片， HE 染色； 电镜观察， 获取辐照后靶区及未损伤肝组织样本， 于 2. 5 %戊二醛液 固定 24h后送往学校电镜室。

结果：

(―) 初始出血速度及出血重量 所有的肝切割伤对肝脏造成显著灌注出血（图 2 B )。 初始出血速度 在任何两组之间都没有显著差异。 治疗后， 超声微泡组视觉评分在 0-1级， 与对照组存在显著差异。 治疗 2分钟和釆血 8分钟共 10分钟的总出血量， 也表明超声 ^：泡组与对照组存在显著差异。

(二） 超声造影检查

超声造影发现， 超声微泡组治疗区域肝实质血流出现灌注缺损 两个 对照组的治疗肝脏灌注基本没有改变。 （图 3 )。

(三） 病理检查

对照组 HE切片显示肝组织为正常结构， 可见清晰肝窦 （图 4A - 4C )。 病理检查显示急性止血机制， 我们在组织学观察发现两个重要病变。 第一 个是超声^:泡组标本切片肝细胞的混浊肿胀， 肝细胞表现出典型的气球样 变， 挤压肝窦间隙 （图 4D - 41 )。 切口周围肝细胞肿胀压迫肝窦几乎消失 (图 4F )。 第二个病变是显著的门静脉区出血，在门静脉 周边形成一个不规 则的环形、 袖套状血肿（图 4D - 4E ), 但门静脉壁完整未受到损伤。 治疗 后 48个小时， 11只动物的肝组织呈白黄色区域坏死。

表 1. 各实验组在初始出血速度、视觉出血评分和治 疗后出血量方面 的比较

初始出血速

平均视觉评 治疗后 10分钟 组 别 度

分 出血量（克）

(克 /秒）

超声微泡 0. 38 ±

0. 10 ± 0· 08 2. 21 ± 1. 26* 组 0. 52*

超声组 0. 12 ± 0· 04 3. 67 士 0· 52 14. 63 ± 7. 24 微泡组 0. 12 ± 0· 06 3. 83 ± 0· 41 11. 68 ± 3· 77 注： P <0. 01 *表示超声^:泡组与对照组相比， 存在显著差异。

结论：

^：泡联合低声强的超声为肝脏创伤出血症提� �了一个新的止血用途。 参考文献

1. Beal SL. Liver. In: Ivatury RR, Cayten CG. Eds (1996) The textbook of penetrating trauma, Baltimore. MD: Wi 11 iam & Wi lkins, pp 571-585

2. Beal SL (1990) Fatal Hepatic Hemorrhage: An Unresolved Problem in the Management of Complex Liver Injuries. J Trauma 30 (2)： 163-169.

3. 吴在德， 吴肇汉. 外科学. 第 7 版. 北京 ： 人民卫生出版社 ， 2008: 405.

4. Vaezy S， Mart in R， Schmiedl U， et al (1997) Liver hemostasis using high-intensity focused ultrasound. Ultrasound Med Biol 23: 3413-1420

5. Vaezy S， Mart in R， Mourad P， Crum LA (1999) Hemostasis using high intensity focused ultrasound. Eur J Ultrasound 9: 79 87

6. Zderic V, Brayman AA， Sharar SR， Crum LA, Vaezy S (2006) Microbubble - enhanced hemorrhage control us ing high in tens i ty focused ultrasound. Ultrasonics 45: 113-120

7. Cue JI, Cryer HG, Miller FB (1990) Packing and planned reexplorat ion for hepatic and retroperitoneal hemorrhage: Critical refinements of a useful technique. J Trauma 30: 1007-1013

8. 冯若. 超声空化与超声医学. 中华超声影像学杂志， 2004， 13: 63-65.

9. JB Cain, Lake, AM (2008) Histotripsy: minimal ly invas ive technology for prostatic tissue ablation in an in vivo canine model. Urology 27(3).

10. Miller DL, Quddus J (2000) Diagnostic ultrasound activation of contrast agent gas bodies induces capillary rupture in mice. Proc Natl Acad Sci 97: 10179 10184

11. Miller DL, Gies RA (2000) The influence of ultrasound frequency and gas body composition on the contrast agent-mediated enhancement of vascular bioef f ect s in mouse intestine. Ultrasound Med Biol 26: 307 313

12. Hwang JH, Brayman AA， Reidy MA, et al (2005) Vascular effects induced by combined 1-MHz ultrasound and microbubble contrast agent treatments in vivo. Ultrasound Med Biol 31: 553-564

13. Hwang JH, Tu J, Brayman AA， et al (2006) Correlat ion between inert ial cavitation dose and endothelial cell damage in vivo. Ultrasound Med Biol 32: 1611-1619. 14.吴巍， 陈宏， 李荣清， 钱梦騄， 冯若， 姜藻 低功率超声栓塞肿瘤新生血 管治疗肿瘤的临床研究. 中国介入影像与治疗学， 2005, 6.

15.吴巍， 石林， 姜藻等 低频超声治疗肿瘤的机理研究进展. 实用肿瘤学 杂志， 2006, 1.

16.李秋颖， 刘政， 刘德英等. 微泡联合纤维蛋白原诱导超声栓塞肠系膜微 血管的实验研究. 临床超声医学杂志， 2006 , 8: 449-451.

17.李佩惊， 左松， 刘政， 左松等. 间歇式超声发射对^：泡超声空化损伤小 血管的增强作用. 临床超声医学杂志， 2007; 9: 577-580.

18.李秋颖， 刘政， 李佩惊等. 微泡介导下脉冲式聚焦超声空化导致血管损 伤的实验研究. 中国超声医学杂志， 2008 , 24 ( 4 ): 297-300.