【발명의 명칭】

골수유래억제세포 관련 질환의 예방 및 치료 용도 【기술분야】

본 발명은 골수유래억제세포 (myeloi d-der ived suppressor ce l l , MDSC)에서 발현되는 CD66c에 대한 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 면역 활성 증강제， 및 상기 면역 활성 증강제를 이용한 MDSC 관련 질환의 예방， 치료 또는 개선에 관한 용도에 관한 것이다. 구체적으로， 본 발명은 CD66c에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 이용하여 MDSC의 생성， 사멸 또는 활성을 조절하여 MDSC의 면역 억제능을 감소시키는 효과를 유도함으로써， MDSC 관련 질환의 예방， 치료 또는 개선 용도 또는 진단 용도를 제공한다. 【배경기술】

최근 암의 치료에 있어 항체나 면역 세포 백신을 이용한 면역 요법 치료에 대한 연구가 활발히 진행되고 있지만, 암세포의 면역 회피 및 억제 작용은 이러한 치료 효과를 저해시킨다. 암세포는 자신에 대한 면역 반응을 막기 위해 각종 면역 세포들의 활동을 저하시키고, 비활성 수지상세포， regul atory T 세포 (Treg) , Tumor-associ ated macrophage (TAM)와 같은 면역 억제 기능을 가진 세포들을 유도하는데， 이러한 면역억제 세포의 하나로 최근 골수유래 면역억제 세포 (mye loi d-der ived suppressor ce l l , MDSC)의 역할이 알려지면서 큰 주목을 받고 있다.

MDSC는 면역억제 기능을 가지는 골수 유래 미성숙 골수 세포의 집합으로 정의되며, 건강한 개체에서는 수가 제한적이나, 만성/급성 감염, 암 등의 병적인 상태에서 말초혈액， 림프기관， 비장， 암 조직 등에 축적되는 것으로 보고되고 있다.

MDSC는 T세포 및 ■ 세포의 면역반응을 억제하고， 면역억제 세포 ( immunosuppress ive cel l )인 Treg 세포의 생성을 유도함으로써, 암세포의 성장을 촉진시키며， 또한 암세포의 원격 전이를 유도할 수도 있는 것으로도 확인되었다.

지금까지 알려진 MDSC의 면역억제 기전은 크게 네 가지 형태로 나눌 수 있는데， 첫 번째는 림프구가 필요로 하는 영양소를 결핍시키는 방법이다. 두 번째 형태는 산화스트레스를 형성하는 것으로, 활성산소나 활성질소를 만들어 T 세포의 증식에서 기능까지 다양한 과정을 저해한다. 세 번째는 림프구의 이동 (traf f icking)과 생존에 영향을 주는 방식이다. T 세포가 림프절로 reci rculat ion 하는 과정을 저해하거나， 종양의 중심으로 T 세포가 이동하는 것을 방해하기도 하고, T 세포 사멸을 유도하는 등의 기전이 알려져 있다. 네 번째는 항원 특이 natural Treg 세포를 증식시키고， 나이브 (naive) CD4+ T세포를 Treg 으로 전환하는 과정을 촉진하는 것으로 알려져 있다.

MDSC의 가장 큰 특징 중의 하나는 형태， 표현형, 및 기능에 있어 다양성을 가진다는 것이다. MDSC의 표지 마커로는 Lineage(-) , HLA- DRL0W/(-) , CDllb(+) , CD33C+) 가 알려져 있다. 이러한 표지 마커들은 수지상 세포， 대식 세포， 과립성백혈구의 전구체 세포들과 같은 여러가지 다른 종류의 골수성 세포에서 공통적으로 발현되고 있어서, MDSC는 면역 억제 기능을 가진 골수성 유래 세포의 집합군으로 정의되어 왔다. 이러한

MDSC 의 다양성은 MDSC의 기원 및 특성을 연구하는데 있어 서로 다른 분석으로 이어져 큰 혼란을 주어 왔다. 이에 MDSC의 세부군을 밝히려는 연구가 진행되어 현재 MDSC는 80% 의 다핵구성 (granulocyt ic) MDSC와 20% 의 단핵구성 (monocyt i c) MDSC로 이루어져 있음이 밝혀겼다. 이 두 세포는 모양과 표현형에서만 차이를 보이는 것이 아니라, 면역을 억제하는 기전도 다른 것으로 밝혀졌는데 다핵구성 MDSC는 활성산소를 매개로 T세포 사이의 접촉을 통해 항원특이적인 면역억제를 유도하는 반면， 단핵구성 MDSC는 주로 arginase의 고발현 및 다양한 면역억제 사이토카인을 매개로 하여 면역 억제 기능을 나타낸다.

최근 연구를 통해 암환자에서 조성되는 면역억제 환경에 MDSC의 축적이 관여한다는 것이 보고되고 있으며, 이는 거의 모든 암종에서 공통적으로 나타났다. MDSC가 증가하는 정도는， 암의 병기가 진행될수록 커진다는 것이 많은 연구를 통해 뒷받침되고 있다. 이에 MDSC의 증가 정도를， 암환자의 낮은 생존율과 치료 반응률에 대한 예후 지표로 활용하고자 하는 연구가 활발하게 진행 중이다. 암의 병태생리에서 MDSC가 중요한 역할을 하고 있음은 분명해 보인다

【발명의 상세한 설명】 2019/221574 1»（：1^1{2019/006007

【기술적 과제】

본 발명의 일 예는 ¾©就에서 발현되는 0예6（：에 결합하는 항체 및 이의 항원결합단편을 포함하는 면역 증강제, 면역 활성화제, 또는 ¾10就에 의한면역 억제능을 감소또는 제거하기 위한조성물에 관한 것이다.

본 발명의 일 예는， ^）엤에서 발현되는 0066（：에 결합하는 항체 및 이의 항원결합단편을 포함하는 ¾©洗 관련 질환의 예방, 치료， 또는 개선용 약학적 조성물또는 이의 용도에 관한 것이다.

본 발명의 일 예는， 光（：에서 발현되는 0예6（；에 결합하는 항체 및 이의 항원결합단편을 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 대상의 면역 반응을증가시키거나활성화시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 추가 일예는， 犯）%에서 발현되는 0066（：에 결합하는 항체 및 이의 항원결합단 접촉하는 단계를 포함하는, 활성을 억제하는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명의 일 예는 상기 면역 증강제 또는 면역 활성화제를, ¾©洗 관련 질환을 갖는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는， 볘就 관련 질환의 예방， 치료， 또는 개선방법에 관한 것이다.

본 발명의 일 예는， 볘엤에서 발현되는 0066（：에 결합하는 항체 및 이의 항원결합단편을 포함하는 면역 증강제 또는 면역 활성화제를, ¾0）況 관련 질환을 갖는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는， 1©엤 관련 질환의 예방， 치료， 또는 개선방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 ¾0此（：에서 발현되는 0^6（：에 결합하는 항체 및 이의 항원결합단편은， 볘엤의 면역 억제능을 제거 또는 감소시키거나， 1«湖（：의 세포수를 감소시키며， 구체적으로 ¾©엤의 활성, 생성 또는 사멸을 조절하거나， 사멸을유도하여 달성할수 있다.

【기술적 해결방법】

본 발명은 발현되는 0^6（：에 결합하는 항체 및 이의 항원결합단편를 포함하는 면역 증강용, 면역 활성화용， 또는 볘洗에 의한 면역 억제능을 감소또는 제거하기 위한용도에 관한 것이다.

또한, 본 발명의 추가 일 예는， ¾0就에서 발현되는 0066（：에 결합하는 항체 및 이의 항원결합단편를 포함하는 엤 관련 질환， 예를 들면, 암， 감염성 질환의 예방， 치료또는 경감용도에 관한 것이다.

구체적으로， 쌔就에서 발현하는 0^6（：에 특이적으로 결합하는 항체를 2019/221574 1»（：1^1{2019/006007

이용하여 光(：에 의한 면역억제반응을 감소시키는 효과를 유도함으로써 , 질환 예방 또는 치료 및 진단 용도에 관한 것이다. 상기 항체는 다클론 항체 또는 단클론 항체일 수 있으며 , 마우스 항체 , 키메릭 항체 또는 인간화 항체일 수 있다.

항원결합단편을 암호화하는 핵산 분자를 제공한다.

다른 예는 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 상기 재조합 벡터는 상기 핵산 분자를 숙주세포에서 발현시키기 위한 발현 벡터로 사용될 수 있다.

다른 예는 상기 핵산 분자 또는 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포를 제공한다. 상기 재조합 세포는 상기 핵산 분자 또는 상기 재조합 벡터를 숙주세포에 형질전환시켜서 얻어진 것일 수 있다.

다른 예는 상기 항체 또는 이의 항원결합단편의 제조 방법을 제공한다. 상기 제조 방법은 상기 핵산 분자를 숙주세포에서 발현시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 발현시키는 단계는 상기 재조합 세포를 배양하는 단계를 포함할 수 있으며, 임의로， 상기 얻어진 세포 배양물로부터 항체를 분리 및/또는 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

(3) 상기 핵산 분자 또는 상기 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 세포를 준비하는 단계;

0)) 상기 핵산 분자의 충분한 발현을 위한 조건 및/또는 기간에서 상기 재조합 세포를 배양하는 단계; 및

(0) 상기 (ø) 단계에서 얻어진 배양물로부터 항체 또는 이의 항원결합단편을 분리 및/또는 정제하는 단계. 이하， 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.

일 구체예에서, 상기 제조 방법은， ¾0 에서 발현되는 0066(：에 결합하는 항체 및 이의 항원결합단편을 포함하는 면역 증강제， 면역 활성화제， 또는 關就에 의한 면역 억제능을 감소 또는 제거하기 위한 조성물에 관한 것이다.

면역억제 기능을 가지는 골수 유래 미성숙 골수 세포의 집합으로 정의되며， 건강한 개체에서는 수가 제한적이나, 만성/급성 감염， 암 등의 병적인 상태에서 말초혈액, 림프기관， 비장, 암 조직 등에 축적되는 것으로 보고되고 있다. MDSC는 T세포 및 ■ 세포의 면역반응을 억제하고, 면역억제 세포 (immunosuppressive cell)인 Treg 세포의 생성을 유도함으로써, 암세포의 성장을 촉진시키며, 또한 암세포의 원격 전이를 유도할 수도 있는 것으로도 확인되었다. 지금까지 알려진 MDSC의 면역억제 기전은, 림프구가 필요로 하는 영양소를 결핍시키는 방법, 림프구의 이동 (trafficking)과 생존에 영향을 주는 방법, 활성산소나 활성질소를 만들어 T 세포의 증식에서 기능까지 다양한 과정을 저해하는 산화스트레스를 형성하는 방법， T세포가 림프절로 recirculation하는 과정을 저해하거나 종양의 중심으로 T 세포가 이동하는 것을 방해하기도 하고, T 세포 사멸을 유도하는 등의 기전이 알려져 있다. 또한， 항원 특이적 natural Treg 세포를 증식시키고, na_ve 抑 4+ T세포를 Treg 으로 전환하는 과정을 촉진하는 것으로 알려져 있다.

MDSC는 면역억제 기능을 가지는 골수 유래 미성숙 골수 세포의 집합으로 정의되며， 건강한 개체에서는 수가 제한적이나, 만성/급성 감염， 암 등의 병적인 상태에서 말초혈액, 림프기관, 비장, 암 조직 등에 축적되는 것으로 보고되고 있다. 암종에 있어서 MDSC 축적과 면역억제 기능은 대장암， 섬유육종, 흉선종， 폐암， 중피종， 림프종, 전립선암， 두경부암, 흑색종등에서 보고 되었다 (Gabri lovich DI, et al . , Coordinated regulation of myeloid cells by tumors , Nat Rev Immunol . 12(4):253-68 (2012)) . MDSC는 암뿐만 아니라 Trypanosoma cruzi , Listeria monocytogenes, Leishmania major, helminths, Candida albicans,

Porphyromonas gingival is 등의 감염 또는 톡소플라즈마증， 다균성 패혈증의 질환에서도 축적되어 면역억제를 유발하는 것으로 알려져 있다 (Garbri lovich DI , et al . , Myeloid-derived suppressor cells as regulators of the immune systems. Nat Rev Immunol . 9(3):162-74 (2009)) . 본 명세서에서 MDSC는 비림프구성 HLA-DRLow/(-) , CDllb+, 및 CD33+ 표현형을 보이는 것이고， 상기 표현형을 나타내면서 CD66c발현하는 MDSC가 본원 발명에 따른 항- CD66c 항체 또는 이의 항원결합단편의 표적이 될 수 있다. 구체적으로, 본 발명에 따른 조성물은 비림프구성 HLA-DRLow/(-), CDllb+, CD33+ 표현형을 보이는 MDSC 중에서 CD66c 양성 MDSC가 축적된 상기 질환을 타깃하여 MDSC에 의한 면역결핍， 면역저하 또는 면역 손상을 개선 또는 치료하기 위한 방안을 제시한다. 예를 들면， 본 발명은 점도표 (dot plot)에서 세포의 크기에 따라 림프구를 제외하고 단핵구와 2019/221574 1»（：1^1{2019/006007

과립구 영역만을 지정한 뒤， - 의 발현이 없거나 낮은 군을 선택하고， 그군에서 0）1113와抑 33에 양성인 그룹을關就로 지정할수 있다.

본 발명 따른 ¾©就에서 발현되는 0^6（：에 결합하는 항체 및 이의 항원결합단편 또는 상기 항체 또는 항원결합단편을 포함하는 면역 증강제를 이용하여 ¾： 관련 질환의 예방， 치료 또는 개선용 약학적 조성물 또는 용도를 제공할수 있다.

본 발명에 따른 항체에 의한 의 용해 효과를 전혈（ ^ 13100（1）과 쌔（：에서 모두 0묘 能6 양성인 세포를 뺘洗 세포수 감소 또는 세포 사멸을 유도할 수 있으며， 바람직하게는 새 방식으로 溫）엤의 세포 수 감소 또는 세포 사멸을 유도할 수 있다. 전혈에는 期此 6 타깃 항원이 양성인 호중구와 犯）엤 가 혼합되어 있어, 만을 선택적으로 용해하였다고 보기 어려우나, 호중구를 제거하고 얻어진 말초혈액 단핵세포作요版：）에 대해서 항체에 의한 ¾0）엤 의 선택적인 용해가가능하다.

상기 관련 질환은 의한 면역 억제 활성을 나타내는 질환으로서， 00660 양성인 ¾©엤가 증가된 질환의 기준인 정상 세포 대비 증가한 질환이며, 예를 들면, 특정 질환을 갖는 대상에서 00660 양성인 光（：의 수 또는 활성이 , 대응하는 정상 대상의 시료의 단위 부피당 ¾10 의 수 또는 활성을 100% 기준으로 할 때, 약 200%이상, 약 300%이상， 약 500%이상, 약 700%이상, 약 1,000%이상, 약 1,500%이상 일 수 있으며， 예를 들면 약 200 내지 5,000%, 또는 200% 내지 3,000%, 200 내지 1,500% 등일 수 있다. 예를 들면, ¾0洗 관련 질환을 갖는 것으로 의심되는 대상 및 정상인의 시료, 혈액을 취하여, 유세포 분석기로 !）（:의 시료 내 세포 수를 분석하여， 쌔엤 관련 질환을 갖는 것으로 의심되는 대상의 쌔엤의 세포 수가 정상인 세포수와 비교하여 증가여부를 결정한다. 구체적으로, 시료 （예， 혈액）의 단위 부피당 汉： 세포의 수가 정상인에 비해서 증가한 경우 일 수 있으며 정상 대상의 시료의 단위 수 또는 활성을 100% 기준으로 할 때， 약 200%이상， 약 300%이상, 약 500%이상, 약 700%이상， 약 1,000%이상， 약 1,500%이상 일 수 있으며, 예를 들면 약 200 내지 5,000%, 또는 200%내지 3,000%, 200내지 1,500%등일 수 있다.

구체적인 볘엤는, 예를 들면 비림프구성 此 1 _^ （ /（-）， 0）1比+, 抑 33+표현형을 보이는볘就 중에서 00660 양성 «（：가 증가된 또는 축적된 질환또는 상기 ¾© 세포수가 정상 세포 수에 비해 증가된 질환일 수 있다. 상기 MDSC 관련 질환의 예는 만성/급성 감염 및 암 등을 포함하며， 구체적으로 MDSC에 의한 면역 억제능을 나타내는 만성/급성 감염 및 암일 수 있으며， 예를 들면 비림프구성 HLA-DRLow/(-) , CDllb+ , CD33 + 표현형을 보이는 MDSC 중에서 CD66c 양성 MDSC가 축적된 질환， 또는 MDSC 중에서 CD66c 양성 MDSC가축적된 감염질환 및 암등을포함한다.

상기 MDSC 관련 감염질환은 Trypanosoma cruzi , Li ster ia monocytogenes , Lei shmania major , helminths , Candida albicans , Porphyromonas gingival i s 등의 감염 또는 톡소플라즈마증， 다균성 패혈증의 질환일 수 있다.

예를 들면, 상기 MDSC 관련 암은 CD66c 양성인 MDSC가 증가된 암일 수 있으며 , 고형암 및 혈액암을 포함하며 , 상기 고형암의 예는 대장암, 섬유육종, 흉선종, 폐암, 중피종, 림프종, 전립선암, 두경부암， 흑색종， 위암， 간암, 또는 유방암일 수 있으며, 바람직하게는 대장암, 위암 또는 간암일 수 있다. 상기 암 및 암전이의 예방, 억제， 또는 치료 용도는 예를 들면， 암 세포 성장을 억제 할 수 있다. 상기 혈액암 (hematopoiet ic mal ignancy)의 예는 급성골수구성백혈병 (acute myeloid leukemi a) , 급성림프구성 백혈병 (acute lymphoblast i c leukemia) , 급성단구성백혈병 (acute monocyt i c leukemi a) , 또는 호지킨림프종 (Hodgkin ¹ s lymphoma) , 비호지킨 림프종 (non-Hodgkin ¹ s lymphoma)일 수 있다.

본 발명은 MDSC에서 발현되는 CD66c에 결합하는 항체 및 이의 항원결합단편에 관한 것으로서, CD66c(Cluster of Di f ferent i at ion 66c)는 CEACAM 6 (carcinoembryonic ant igen-related cel l adhesion molecule 6) 또는 NCA(non-speci f ic cross-react ing glycoprotein ant i gen) -90으로도 알려진 단백질로, 세포 접착 (cel l adhesion)과 연관된 중요한 단백질로 알려져 있으며 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열 (Genbank Protein No . AAH05008)로 표시될 수 있다.

본 명세서에서 "항체’’라 함은， 면역계 내에서 항원의 자극에 의하여 만들어지는 물질을 의미하는 것으로서 그 종류는 특별히 제한되지 않는다. 상가 항체는 비자연적으로 생성된 것, 예컨대， 재조합적 또는 합성적으로 생성된 것일 수 있다. 상기 항체는 동물 항체 (예컨대， 마우스 항체 등) , 키메릭 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체일 수 있다. 상기 항체는 단클론 항체 또는 다클론 항체일 수 있다. 상기 항- CD66c항체 또는 항원결합단편은 앞서 설명한 CD66c 의 특정 항원결정부위에 특이적으로 결합하는 것으로, 동물 항체 (예컨대, 마우스 항체) , 키메릭 항체， 인간화 항체， 및 이들의 항원결합단편들로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다. 상기 동물 항체는 인간 이외의 동물 종으로부터 유래된 것일 수 있으며， 예컨대, 쥐, 생쥐, 염소， 기니피그， 당나귀， 토끼， 말， 라마, 낙타， 조류 (예컨대， 닭， 오리 등) 등으로부터 유래된 것일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 이와 같은 동물 항체로부터 키메릭 항체 및/또는 인간화 항체를 제작하는 기술은 관련 기술 분야에 잘 알려져 있다. 상기 인간화 항체는 IgG ( IgGl , IgG2, IgG3 , IgG4) , IgM, IgA, IgD, IgE 또는 임의의 subc l ass 같은 임의의 적합한 아이소타입일 수 있으며， 바람작하게는 IgGl 또는 IgG2 아이소타입일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 탈푸코오스화된 IgGl 또는 IgG2 아이소타입일 수 있다.

또한 본 명세서에서 항체는， 특별한 언급이 없는 한， 항원 결합능을 보유한 항체의 항원 결합 단편도 포함하는 것으로 이해될 수 있다. 본 명세서에서 ¹¹ 상보성 결정부위 (Complementar i ty-determining regions , CDR) ¹ '라 함은, 항체의 가변 부위 중에서 항원과의 결합 특이성을 부여하는 부위를 의미한다. 앞서 설명한 항체의 항원 결합 단편은 상기 상보성 결정부위를 하나 이상 포함하는 항체 단편일 수 있다. 용어， ”CDR( complementar i ty determining region)"은 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 고가변 영역 (hypervar i able region)의 아미노산 서열을 의미한다. 중쇄 및 경쇄는 각각 3개의 CDR을 포함할 수 있다 (CDRH1 , 抑 RH2, CDRH3 및 抑 RL1 , CDRL2, CDRL3) . 상기 CDR은 항체가 항원 또는 에피토프에 결합하는 데 있어서 주요한 접촉 잔기를 제공할 수 있다. 한편， 본 명세서에 있어서， 용어， "특이적으로 결합 ¹ ' 또는 "특이적으로 인식”은 당업자에게 통상적으로 공지되어 있는 의미와 동일한 것으로서, 항원 및 항체가 특이적으로 상호작용하여 면역학적 반응을 하는 것을 의미한다.

용어, "항원 결합 단편"은 면역글로불린 전체 구조에 대한 그의 단편으로， 항원이 결합할 수 있는 부분을 포함하는 폴리펩타이드의 일부를 의미한다. 예를 들어 , scFv, (scFv)2, scFv-Fc , Fab, Fab' 또는 F(ab’)2일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명에 따른 항- CD66c는 CD66c를 특이적으로 인식 및/또는 결합하고 항체는 마우스 항체, 키메릭 항체 또는 인간화 항체를 포함한다. 본 발명에서 키메릭 항체는 가변 영역 서열들이 하나의 종으로부터 유래되고 불변 영역 서열들이 다른 종으로부터 유래된 항체들， 예를 들어， 가변 영역 서열들이 마우스 항체로부터 유래되고 불변 영역 서열들이 인간 항체로부터 유래된 항체를 의미한다. 본 발명에서 인간화 항체란 인간에서 면역성이 적으면서 비인간 항체의 활성을 보유하는 항체를 의미한다. 이는， 예를 들어， 비인간 CDR 영역을 유지시키고, 항체의 나머지 부분을 인간 대응부 (counter parts)로 치환함으로써 제조될 수 있다. 예를 들어， 하기 문헌들이 참조된다: Morr i son et al， Proc . Nat l . Acad. ScL USA, 81 : 6851- 6855(1984)； Morr i son and Oi , Adv. Immunol . , 44 : 65-92 (1988)； Verhoeyen et al , Science , 239 : 1534-1536 ( 1988)； Pad lan, Molec . Immun. , 28 :489-

498 ( 1991)； Pad lan, Molec . Immun. , 31(3) : 169-217 ( 1994) .

본 발명에서 항체 절편은 항체 경쇄 가변 영역 (VL) 및 항체 중쇄 가변 영역 (VH)를 포함하여 CD66c 에피토프를 선택적으로 인식할 수는 것이면 이에 제한이 없으나， Fab , Fab ' , F(ab ' )2 , scFv, dsFv 및 CDR로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다. 특히， 상기 scFv는 상기 중쇄 가변부위 (VH) 및 경쇄 가변부위 (VL)를 링커 폴리펩타이드로 연결하여 단쇄 (single chain)로 만든항체 절편이다.

용어 "힌지 영역 (hinge region)”은 항체의 중쇄에 포함되어 있는 영역으로서， CH1 및 CH2 영역 사이에 존재하며， 항체 내 항원 결합 부위의 유연성 (f lexibi l i ty)를 제공하는 기능을 하는 영역을 의미한다. 예컨대, 상기 힌지는 인간 항체로부터 유래한 것일 수 있으며， 구체적으로， IgA, IgE, 또는 IgG, 예컨대, IgGl， IgG2, IgG3, 또는 IgG4로부터 유래한 것일 수 있다.

항-抑 66c 항체는 다클론 항체 또는 단클론 항체일 수 있으며， 예컨대, 단클론 항체일 수 있다. 단클론 항체는 당 업계에 널리 알려진 방법대로 제조될 수 있다. 예컨대, phage di splay기법을 이용해서 제조될 수 있다. 상기 인간화 항체는 마우스항체나 키메릭 항체와 달리 인체 투여 시， 면역원성의 원인을 대폭 줄이는 차별성 외에도 안정성 측면에서 키메릭 8F5 항체보다 10배 이상의 높은 안정성을 보였다. 구체적으로는， 높은 온도， 예를 들면 온도 62 ^° C에서 ANS 결합에 의한 형광값 변이율이 200% 미만으로 안정성이 높다.

구체적인 가혹조건에서 항체 물성의 변이로 인해 키메릭 8F5 항체는 1 ,406 % 의 ANS 반응성 변화를 보인 반면， 인간화 항체는 114%， 133% 정도의 상대적으로 미미한 변화를 보여 상당히 단백질 측면에서 안정화되었음을 알수 있다.

상기 키메릭 8F5 및 인간화 항체는 T 세포의 활성화를 증가시키며， 이는 T 세포 활성인자에 의한 활성화 증대 및 서로 다른 사람의 동종 수지상 세포와 T 세포 혼합으로 인한 T 세포 활성 조건에서도 활성 증대를 보이는 경우를 들 수 있다. 이러한 T 세포 활성화 유도는 암세포와의 공동 배양 시 암세포의 사멸을 유도하였으며， 다양한 암세포와 공동 배양 조건에서 T세포 활성화유도하는 경우를들 수 있다.

본 발명에 따른 항체 또는 이의 단편은， 종양 퇴화 (tumor regression) 활성 및 종양 세포주에 대해 직접적인 억제 효과를 갖는다. 본 명세서에서 종양의 퇴화는 종양 크기의 감소 및/또는 종양 세포의 성장 저해， 중단 또는 감소 등을 유도 또는 촉진하는 것을 포함한다. 종양의 크기 감소는 예를 들면， 본 발명의 항체 또는 이의 단편을 포함하는 조성물을 처리하기 전을 100%를 기준으로, 상기 항체 또는 이의 단편을 포함하는 조성물을 투여한 경우에 얻어진 종양의 크기가 97%이하， 95%이하， 90%이하， 85%이하, 80%이하， 75% 이하의 크기를 갖는 경우 등을 들 수 있다. 본 발명에 따른 항체는 항체-의존성 세포매개성 세포독성 (ADCC, Ant i body-dependent cel 1 -mediated cytotoxici ty)과 보체계 의존 세포독성 (CDC, complement -dependent cytotoxi ci ty)을 가지며, 바람직하게는 ADCC특성을 갖는다.

본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원결합단편은 자연살상 (natural ki l ler) 세포 또는■세포 유래 세포 치료제를 병용하여 MDSC 관련 질환을 개선 또는 치료할수 있다.

구체적으로， 본 발명에 따른 항- CD66c 항체는 암세포 살해능이 자연 살해 세포와의 병용에 의해 증가하며， 이를 통해, CEACAM6 양성인 암세포뿐만 아니라， 역시 CEACAM6 양성인 MDSC 의 효과적인 제거를 위해 ■ 세포또는■세포치료제와의 병용 처리의 효과가우수하다.

구체적인 실험으로서, EZ-cytox enhanced cel l vi abi l i ty ki t (Daei l Lab) 를 이용하여 세포 생존율을 즉정한 결과， 두 종의 암세포주 모두에서 자연 살해 세포의 병용에 의한 세포 사멸 효과가 단독처리 시 대비 증가하는 것으로 확인되었다 (도 12a 및 도 12b) . 본 발명에 따른 항- CD66c 항체에 의한 MDSC 의 선택적 용해 결과와 ■ 세포 또는 ■ 세포치료제의 병용효과를 통해， CEACAM6 양성인 암세포 및 CEACAM6 양성인 MDSC 를 모두 표적으로 하여 제거할 수 있다. 본 발명에 따른 항-CD66 _C 항체는 각각 MDSC 와 암세포로 다른 표적 세포에 대해 ADCC 를 보이지만， 실제 두 종류의 세포가 함께 증가되어 있는 암환자의 경우 본 발명에 따른 항-CD66c항체로 두 종류의 표적을 동시에 제거할 수 있으며, 또한 ■ 세포치료제와의 병용으로 암세포 및 MDSC표적을동시 제거하는 효능이 더욱 향상된다. 본 발명에 따른 항체는 항체에 결합된 당잔기인 FUC0湖를 일부 또는 전부 제거한 것일 수 있다. 본 발명에 따른 푸코오스 제거 항체는 MDSC의 세포 사멸효과를 가지며, 일예에서 본 발명에 따른 항체는 저 푸코오스 형태 또는 탈푸코오스 (defucose)형태의 항체가 fucose형태의 항체에 비해 MDSC 살상에 대한 효능이 우수하여 면역 활성 증강 효능이 크다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이， "정상 푸코스’’ 또는 ’’정상 푸코스 함량’’은 푸코스 함량이 전형적으로 90% 이상인 항체를 지칭한다. 본 발명에 따른 저 푸코오스 또는 탈 푸코오스 형태의 항체는， 푸코스 함량이 약 10이하%인 항체， 약 7%이하， 또는 약 5%이하일 수 있으며， 예를 들면 0 내지 약 10%, 0내지 약 7%, 또는 0내지 약 5%범위일 수 있다.

구체적으로， 본 발명에 적용되는 항체는 다음의 상보성 결정부위 (complementarity determining region； CDRs)를 포함하는, 항-CD66c 항체 또는 이의 항원 결합단편일 수 있다:

서열번호 1또는서열번호 9의 아미노산서열을포함하는 CDR-H1 , 서열번호 2또는서열번호 10의 아미노산서열을포함하는 CDR-H2, 서열번호 3의 아미노산서열을포함하는 CDR-H3,

서열번호 4, 서열번호 11 또는 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1 ,

서열번호 5의 아미노산서열을포함하는 CDR-L2, 및

서열번호 6또는서열번호 13의 아미노산서열을포함하는抑R-L3임 . 상기 항체의 중쇄 가변영역은 서열번호 22 , 23, 24, 25, 26 또는 27의 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크 (V-FR1) , 서열번호 32, 33， 34, 35, 36 또는 37의 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크 (V-FR2) , 서열번호 42, 43, 44, 45, 46 또는 47의 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크 (V- FR3) , 및 서열번호 52, 53, 54, 55, 56 또는 57의 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크 (V-FR4)로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 프레임 워크를 포함하는 것인 항-CD66c 항체 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있다. 2019/221574 1»（：1^1{2019/006007

상기 항체의 경쇄 가변영역은， 서열번호 28， 29, 30 또는 31의 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크（丄 犯）, 서열번호 38, 39， 40 또는 41의 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크 서열번호 48, 49, 50, 또는 51의 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크（丄-요3）, 및 서열번호 58, 59, 60 또는 61의 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크（丄-요4）로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 하나의 프레임 워크를 포함하는 것인 항- 00660항체 또는 이의 항원 결합단편일 수 있다.

상기 항체는서열번호 7， 14, 15， 16， 17또는 18의 아미노산서열을 포함하는 중쇄 가변영역; 및 서열번호 8， 19， 20, 또는 21의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 또는 이의 항원 결합단편일 수 있다.

본 발명에 따른 마우스 항체 또는 키메릭 항체의 일예는 서열번호 1 내지 3의 아미노산 서열을 포함하는 ■ 영역의 001?를 결정하는 아미노산 서열 및 서열번호 4 내지 6의 아미노산 서열을 포함하는 1영역의 결정하는 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있다. 상기 마우스 항체 또는 키메릭 항체의 일예에 서열과 가변영역 서열을 하기 표 1에 정리한다.

구체적으로， 본 발명의 항체의 일예는 m 영역의 결정하는 아미노산 서열로서 서열번호 1（00^）, 서열번호 2犯에2） 및 서열번호 301«3） 및/또는 I 영역의 결정하는 아미노산 서열인 서열번호 4犯 1）， 서열번호 501«2） 및 서열번호 6此에3）의 아미노산 서열을 포함한다.

상기 마우스 항체 또는 키메릭 항체는서열번호 7의 아미노산서열을 포함하는 영역 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 1영역을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명에 따른 마우스 항체 또는 키메릭 항체를 유효성분으로 포함하는 질병 또는 이의 증상의 개선， 예방 또는 치료용 약학 조성물, 키트또는 치료방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 마우스 항체 또는 키메릭 를 들면 기탁번호

［（比卵내 - 요예의 하이브리도마로부터 생산된 항체의 。 - , ◦예내2, 抑묘내3， ◦예_1그， ◦예- ， 및 포함하는 항-◦예此 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 ^）엤 관련 질병 또는 이의 증상의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 상기 하이브리도마 세포는 한국세포주은행 (Korean Cel l Line Research Foundat ion, KCLRF)에 ’8F5’로 2010년 2월 22일자로 기탁번호 KCLRF-BP-00230로 기탁된 것이며， KR 10- 1214177등록공보에 자세히 기재되어 있다.

본 발명은 상기 마우스 항체 또는 키메릭 항체를 이용하여 항- CD66c 항체 8F5의 아미노산 서열과 사람 항체 서열을 프레임 워크 서열에 기초하여 제조한다. 인간화 재조합 항체 후보 중에서 발현 정도와 aggregat ion 유무, 세포결합 정도를 기준으로 인간화 후보항체 중에서 발현이 정상적으로 이뤄지며， 단백질 자체의 불안정성으로 형성되는 aggregat ion 이 적으며, 또한 타겟 항원 양성의 세포에 결합하는 능력이 키메릭 항체와 유사한 인간화 항체 후보를 선별한다. 구체적으로 세포결합 양상은 키메릭 항체와 비슷한 수준으로서 항체 양성률 (% gated)과 형광 평균값 (mean)을 곱하고 이를 키메릭 항체와 상대 비교하여 土 20% 범위 내 포함되는 후보 항체를 선별한다. 따라서, 본 발명에서 선정된 항체군은 통상 인간화 항체 생성 시， 인간화 항체의 framework region 에 마우스 항체 CDR 부위 서열을 삽입하였을 때 원래 단백질 구조의 변경으로 항체 결합력이 급격히 저하된다는 결과를 고려하였을 때， 매우 우수한 인간화 항체를 선별하였다할수 있다.

바람직하게는, 키메릭 항체 대비하여 세포결합력을 기준으로 높은 결합력을 나타내는 다섯 종류의 인간화 재조합 항체를 선택하고， 이들을 ELISA 방법으로 CD66c 항원 및 유사 CD66 항원들에 대한 결합력 분석을 실시한다.

또한， 본원 발명에 따른 인간화 항체는 키메릭 항체에 비해 우수한 안정성을 나타내며, 예를 들면 ANS 반응성 변이%가 200% 미만으로 안정한 항체이며， 200% 미만은· 변화가 매우 미미한 것으로 간주되고,. 그 이상은 의미 있는 단백질 구조 ^' 변경이 이뤄져 ANS 반응성이 관찰된 것으로 해석될 수 있다. 따라서， 본 발명에 따른 인간화항체는 키메릭 항체 대비 유사한 항원 결합혁 및 세포 결합력을 가지며， 항체 단백질 자체의 물리적 안정성이 증가하였으며， 이러한 사실은 치료용 항체의 druggabi l i ty 측면에서 매우우수한특정이라할수 있다.

ANS 시약에 대한 항체의 형광값 변이율은 저온 조건 (예， 4 ^° C )에서 측정한 형광값과， 고온 조건 (예， 62 ^° C )에서 측정한 형광값의 차 (di f ference)를， 저온조건에서 측정한 형광값으로 나눈 값을 의미한다. 2019/221574 1»（：1^1{2019/006007

［수학식］

형광값 변이율 = （고온 조건에서 측정한 형광값- 저온 조건에서 측정한 형광값）/（저온조건에서 측정한 형광값）

구체적인 항체 형광값 변이율을 얻는 방법으로서， 냉장조건（4 ^° 0 및 온도에서 각각 4시간 방치한 후에 요 시약 반응성을 형광 리더기로 분석하여 형광값으로 표시하고， 상기 수학식을 이용하여 형광값 변이율을 측정할수 있다. 본 발명에 따른 인간화 항체의 일예는 서열번호 9 내지 13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 또는 경쇄 가변영역의 결정하는 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산 서열을 포함할 수 있으며， 추가로 마우스 항체 또는 키메릭 항체의 일예는 서열번호 1 내지 3의 아미노산 서열을 포함하는 영역의 결정하는 아미노산서열 및 서열번호 4내지 6의 아미노산 서열을 포함하는 영역의 결정하는 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산서열을포함하는 항체일 수 있다.

구체적으로, 인간화 항체의 일예는 서열번호 1 또는 9의 아미노산 서열을 포함하는 쌔 영역의 0 1을 결정하는 아미노산 서열， 서열번호 2 또는 10의 아미노산 서열을 포함하는 영역의 0 2를 결정하는 아미노산 서열， 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 영역의 0 3을 결정하는 아미노산서열을포함하는 중쇄 가변영역일 수 있다.

또한 인간화 항체의 일예는 서열번호 4 , 11 또는 12의 아미노산 서열을 포함하는 영역의 0예1을 결정하는 아미노산 서열, 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 I 영역의 결정하는 아미노산 서열， 서열번호 6 또는 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 VI 영역의 0 3을 결정하는 아미노산서열을포함하는중쇄 가변영역일 수 있다.

인간화 항체의 일예는 서열번호 7 및 서열번호 14 내지 18의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역로 이루어지는 군에 선택된 중쇄 가변영역과， 서열번호 8 및 서열번호 19 내지 21의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역로 이루어지는 군에서 선택된 경쇄 가변영역을 포함할 수 있으며, 단 서열번호 7 및 서열번호 8을 포함하는 항체는 제외된다.

상기 인간화 항체의 일예에 서열과 가변영역 서열을 하기 2019/221574 1»(：1/10公019/006007

표 1에 정리한다.

【표 1]

2019/221574 1»(：1^1{2019/006007 본 발명에 따른 인간화 항체의 일예의 프레임 워크 서열을 하기 표 2 및 3에 나타내며， 상기 항체는 중쇄 가변영역의 프레임 워크 1 내지 4 , 및 경쇄 가변영역의 프레임 워크 1 내지 4로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 프레임 워크를 포함하는 항체일 수 있다.

구체적으로， 중쇄 가변영역에서 프레임 워크 1의 아미노산 서열은 서열번호 23 내지 27을 포함할 수 있으며， 프레임 워크 2의 아미노산 서열은 서열번호 32 내지 37을 포함할 수 있으며, 프레임 워크 3의 아미노산 서열은 서열번호 43 내지 47을 포함할 수 있으며, 및 프레임 워크 4의 아미노산 서열은 서열번호 53 내지 57을 포함할 수 있다.

경쇄 가변영역에서 프레임 워크 1의 아미노산 서열은 서열번호 29 내지 31을 포함할 수 있으며， 프레임 워크 2의 아미노산 서열은 서열번호 39 내지 41을 포함할 수 있으며， 프레임 워크 3의 아미노산 서열은 서열번호 49 내지 51을 포함할 수 있으며， 및 프레임 워크 4의 아미노산 서열은 서열번호 59 내지 61을 포함할 수 있다. 상기 인간화 항체의 일예에 따른 프레임워크 서열을 하기 표에 나타낸다.

【표 2】

【표 3】

상기 인간화 항체는 서열번호 14 내지 18의 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 ■영역 및 서열번호 19 내지 21의 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택된 1영역을 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로， 상기 인간화 항체의 예는, 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 ■영역 및 서열번호 21의 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택된 영역을 포함하는 항체 0¾8+\¾6) , 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 ■영역 및 서열번호 21의 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택된 1영역을 포함하는 항체 (\¾8+\¾11) , 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 VH영역 및 서열번호 19의 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택된 영역을 포함하는 항체 (Vk5+VH7)， 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 VH영역 및 서열번호 20의 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택된 VL영역을 포함하는 항체 (Vk7+VH6) , 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH영역 및 서열번호 20의 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택된 VL영역을 포함하는 항체 (Vk7+VH10)， 서열번호 16의 아미노산서열을 포함하는 VH영역 및 서열번호 20의 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택된 VL영역을 포함하는 항체 (Vk7+VH7)， 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 VH영역 및 서열번호 20의 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택된 VL영역을 포함하는 항체 (Vk7+VH5)， 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 VH영역 및 서열번호 21의 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택된 VL영역을 포함하는 항체 (Vk8+VH7)일 수 있다. 상기 항체의 구체적인 조합 및 아미노산 서열은 하기 표 6에 나타낸다. 상기 항체의 바람직한 일예는， 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH영역 및 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 VL영역을 포함하는 항체 (Vk8+VH6) , 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 개영역 및 서열번호 21의 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택된 VL영역을 포함하는 항체 (Vk8+VH11) , 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 VH영역 및 서열번호 19의 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택된 VL영역을 포함하는 항체 (Vk5+VH7) , 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 영역 및 서열번호 20의 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택된 VL영역을 포함하는 항체 (Vk7+VH6) , 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 VH영역 및 서열번호 20의 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택된 VL영역을 포함하는항체 (Vk7+VH10)일 수 있다.

CD66C항체 또는 항체 절편은 다양한 표지기 (labeling agent) , 독성 물질 또는 항종양제와 결합할 수 있다. 당해 기술 분야에 있어서 주지 방법에 의해 본 발명의 항체는 상기 표지기， 독소， 또는 항종양제와 결합될 수 있는 것은 당업자에게 분명하다. 이러한 결합은 항체 또는 항원의 발현 후， 부착부위에 화학적으로 수행하는 것도 가능하고， 혹은 DNA 레벨로 본 발명의 항체 또는 항원 내에 결합산물을 조작해 넣어도 괜찮다. 이어서 본 명세서에 있어서 이하로 기재하는 적절한 숙주계에 있어서 DNA를 발현시키고 그리고 발현시킨 단백질을 회수해, 필요에 따라 재생시킨다. 결합은 당해 기술 수준에 있어서 알려진 링커를 통해 달성해도 괜찮다. 특히 이 기술과 함께 산성 조건 혹은 환원 조건 하에서 또는 특정 프로테아제에 대한 노출시에 독소 또는 항종양제를 방출하는, 다양한 링커를 이용할 수 있다. 특정 양태에 있어서는 표지기， 독소, 또는 항종양제를 다양한 길이의 스페이서 암에 의해 결합시키고 잠재적인 입체 장애를 감소시키는 것이 바람직한경우도 있다.

CD66c의 항원결정부위에 대한 항체 또는 항체 절편은 CD66c 단백질， CD66c의 항원결정부위, CD66c의 항원결정부위를 포함하는 CD66c 단백질 일부， 또는 CD66c의 항원결정부위를 발현하는 세포를 항원으로 이용하여 통상의 방법으로 제조가능 하다. 일례로, CD66c 항체 제조방법은， (a) CD66c 단백질, CD66c의 항원결정부위， CD66c의 항원결정부위를 포함하는

CD66c 단백질 일부, 또는 CD66c의 항원결정부위를 발현하는 세포를 동물에 주입하여 면역화 시키는 단계, (b) CD66c에 특이적인 항체를 생산하는 비장세포를 수득하는 단계 및 (c) 상기 비장세포를 골수종세포와 융합시켜, CD66c에 대한 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 선별하는 단계를 포함하는 CD66c 항체를 생산하는 생산주 제조방법으로 통하여 실시가능 하다. 상기 생산주는 생체외 ( in vi tro)에서 배양하거나, 생체내 주입하여 항체를 분리할 수 있다. 일례로， 마우스의 복강내에 삽입하고 복수로부터 분리， 정제한다. 단클론 항체의 분리 및 정제는 배양 상층액 또는 복수를 이온교환 크로마토그래피 (DEAE 또는 DE52 등)， 항 면역글로불린 칼럼 또는 프로테인 A 컬럼 등의 친화성 크로마토그래피를 이용하여 실시할 수가 있다. 본 발명에 따른 항체가 결합하는 항원결정부위는 MDSC 특이적인 발현을 나타낸다. 따라서 , 항- CD66c 항체는 MDSC의 검출에 유용하게 사용할 수 있을 뿐만 아니라 독성물질을 포함시켜 MDSC만을 특이적으로 세포살상 (cytotoxici ty) 시킬 수 있다.

다른 예는 본 발명에 따른 항체의 CD66c을 포함하는 MDSC의 검출을 위한 마커로서의 용도를 제공하며， 이에 CD66c에 대한 항체 또는 이의 항원결합단편을 이용하여 MDSC 검출 및 MDSC 관련 질환의 진단용도 또는 진단의 정보를 제공하는용도사용될 수 있다.

예를 들면， CD66c에 대한 항체 또는 이의 항원결합단편을 이용하여 상기 항체의 항원결정부위와 상호작용하는 물질을 포함하는 MDSC의 검출용 조성물을 제공한다. 상기 상호작용하는 물질은 CD66c에 위치하는 항원결정부위와 상호작용 가능한 모든 물질, 예컨대， 화학물질 (smal l molecular chemi cal ) , 항체， 항체의 항원결합단편， 앱타머 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

본 발명 진단 조성물은 다양한 세포， 조직 또는 다른 적절한 시료에 있어서의, CD66c의 바람직하지 않은 발현 또는 과잉 발현의 검출로서， 시료를 본 발명의 항체와 접촉시키는 것 및 시료에 있어서 CD66c의 존재를 검출하는 것을 포함한 검출에 유용하다. 따라서， 본 발명 진단 조성물을 이하로 정의하는 발병 또는 질환상태를 평가하기 위해 이용해도 무방하다. 특히 CD66c를 발현하는， MDSC를 본 발명의 항체, 항체 단편 또는 유도체로 타겟팅해도 괜찮다. 본 발명의 항체가 결합한 세포는 그러므로 보체계 등의 면역계 기능에 의해 또는 세포 매개성 세포 독성에 의해 공격되고 따라서 , CD66C의 바람직하지 않은 발현 또는 과잉 발현을 나타내는 세포의 수가 감소하거나또는 이러한세포가사멸된다.

구체적인 예로서， 본 발명에 따른 CD66c에 대한 항체 또는 이의 항원결합단편을 이용한 MDSC 관련 질환의 진단 방법 또는 진단용 조성물을 제공한다.

MDSC 관련 질환, 예를 들면 암을 진단하기 위하여， 본 발명에 따른

CD66c에 대한 항체 또는 이의 항원결합단편을 이용하는 경우, 암 조직 또는 암세포의 자체에서의 CEACAM6 항원 발현과 상관없이 암조직 주변의 침윤된 MDSC를 표적으로 진단 및 치료에 활용할 있다. 본 발명에 따른 CD66c에 대한 항체는 고형암 세포에서 발현되는 CD66c에 결합할 뿐만 아니라, 고형암에서 CD66c를 발현하지 않는 암에서도， 암에 의한 MDSC 증가 상태를 MDSC에서 발현되는 CD66c를 표적으로 하여 탐지하여 암을 탐지할 수 있다. 구체적으로, 암세포에서 CEACAM6 가 양성인 폐 선암 ( lung adenocarcinoma)과 암세포 자체에서는 CEACAM6가 음성인 편평상피암 ( lung squamous cel l carcinoma) , 비뇨기계 암 (Ur inary bladder cancer) 및 피부 암 (Melanoma mal ignancy) 조직에 CEACAM6 면역 염색한 결과 암 조직의 비 종양부위에 CEACAM6 양성인 MDSC가 있는 것을 확인하였다 (도 13) .

따라서， 암세포 세포표면의 CEACAM6 양성도와 상관없이， 암환자에서는 MDSC 가 증가되는 경향을 보이며， 이는 실시예 8의 결과와 같이 미세종양환경에 침윤되어 있는 MDSC 를 검출하고 확인할 수 있다. 이는 MDSC를 선택적으로 용해할 수 있음을 보인 실시예 5.2의 결과와 함께 고려하였을 때， 암세포 상의 CEACAM6 양성도와 상관없이 MDSC 를 표적으로 진단 및 치료목적에 사용할 수 있음을 나타낸다. 암 종에 따라 암세포 세포표면의 CEACAM6 발현 유무는 다를 수 있으나， 이와 상관없이 대부분의 암 종에서 MDSC는 증가되기 때문에， 본원 발명에 따른 CD66c 항체를 이용하여 MDSC를 표적 치료를 통해 대부분의 암 종을 대상으로 한 범용의 진단 및 치료적 목적으로 이용할수 있다.

본 발명의 일 양태에 있어서는 본 발명의 항체， 항체 단편 또는 유도체를 표지기에 결합시킨다. 이러한 항체는 진단 애플리케이션에 특히 적합하다.

본 발명에 따른 조성물은 단독 활성 약제로서 투여할 수 있고, 또는 다른 약제와조합하여 투여될 수 있다.

MDSC 검사방법은 (a) CD66c 항체를 MDSC를 포함하는 시료에 반응시키고, (b) 상기 항체에 대하여 양성반응을 나타내는 시료를 MDSC로 판단하는 것이다. 상기 시료는 림프액， 골수， 혈액 또는 혈구일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 CD66c 항체를 이용하여 MDSC 관련 질환을 검사하는 경우, 상기 CD66c 항체는 항원-항체 반응성을 확인할 수 있는 물질로 표지된 것일 수 있다. 사용 가능한상기 물질로는 방사성동위원소， 형광물질， 발광물질, 크로모젠 (chromogen) , 또는 기타 염색 물질 등이 있다. 또한본 발명의 CD66c 항체는 MDSC 질환을 진단하기 위한진단키트로 제공될 수 있다. 상기 진단키트는 CD66c 항체 이외에, 항원-항체반응 검출수단을 포함할 수 있다. 상기 검출수단은 유세포측정, 면역조직화학염색, 효소결합 면역톱착 분석 (enzyme l inked immunosorbent assay： ELISA) , 방사선 면역측정법 (radioimmunoassay: RIA) , 효소 면역분석 (enzyme immunoassay: EIA) , 형광면역분석 (Floresence immunoassay: FIA) 및 발광면역분석 ( luminescence immunoassay： LIA)으로 이루어진 군으로부터 선택된 방법을실시하기 위한통상의 물질 일 수 있다.

상기 고형암의 치료 효과는 암세포 (특히， 암줄기세포) 또는 이를 포함하는 암조직의 성장 억제 (양적 감소)， 사멸 (apoptosi s) 효과뿐 아니라, 이동 (migrat ion) , 침습 ( invasion) , 전이 (metastasi s) 등을 억제하여 이로 인한 암의 악화를 억제하는 효과를 포함한다. 본 발명에 따른 항체는 STING agoni st 또는 5_Fu 와 병용 처리하여 효과를 극대화 하고자， 본 발명의 항체와 병용 처리 시 보다 높은 효과를 얻을 것으로 기대할수 있다.

본 명세서에서, "대상” 또는 ’’환자’’는 MDSC 관련 질환의 경감, 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 환자를 의미하는 것으로, 모든 포유류， 예컨대 인간， 원숭이 등의 영장류, 마우스, 래트 등의 설치류일 수 있고， MDSC 관련 질환을 앓고 있거나 MDSC 관련 질환의 증상을 갖거나， MDSC 관련 질환 발병의 위험이 있는 환자일 수 있다.

본 발명에 따른 항체 혹은 항체 절편의 투여는 허용된 모든 약물 투여방법에 의해 시행될 수 있다. 구체적으로 예를 들면， CD66c 항체를 유효성분으로 포함하는 치료제를 MDSC 관련 질환을 갖는 대상， 즉 인간 또는 동물에 경구 또는 비경구， 바람직하기로는 비경구로 투여하는 것이다. 상기 치료제는 약리학적으로 허용 가능한 부형제를 포함할 수 있으며， 이의 투여량은 환자의 상태에 따라 적절히 조절하는 것이 바람직하나， 일예로 1일 3 mg 내지 6 , 000 mg 일 수 있다. 치료제의 제형은 액제， 산제， 유제， 현탁제 또는 주사제일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발병은 CD66c 항원결정부위에 대한 항체, 항체 절편 (F( ab’)2 , Fab 및 Fv 등)， 및 리간드 이뤄진 군에서 선택된 항체를 이용하여 MDSC 관련 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 항체 혹은 항체 절편은 바람직하기는 단클론 또는 다클론 항체로 이루어진 군에서 선택되며， 바람직하기로는 사람과 동물에서 기원한 것이다. 상기 CD66c 항체 또는 항체 절편은 상기에서 언급한 독소물질이 더욱 포함된 것일 수 있다. 독소물질은 항체에 융합， 접합, 결합, 또는 링크될 수 있으며， 이는 공지의 기술로 실시가능 하다.

본 발명의 의약 조성물은 단독 활성 약제로서 투여해도 괜찮고 또는 기타 약제와 조합하고， 바람직하게는 당해 기술 분야에 있어서 문제의 질환의 치료에 적합한 것이 알려지는 것과 조합해 투여해도 괜찮다. 또한， 본 발명의 항체를 투여하는 방법은， 다른 항암치료, 예를 들면 화학적 요법, 방사선 요법， 세포치료제와 병행하여 수행할 수 있다. 상기 화학적 요법 또는 세포 치료제에 사용되는 다양한 MDSC 관련 질환을 치료로 알려진 치료제를 사용할 수 있다.

【발명의 효과】

본 발명은 골수유래억제세포 (mye l o i d-der i ved suppressor ce l l , MDSC)에서 발현되는 CD66c에 대한 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 면역 활성 증강제 , 및 상기 면역 활성 증강제를 이용한 MDSC 관련 질환의 예방, 치료 또는 개선에 관한 용도를 제공한다.

【도면의 간단한 설명】 도 1은 마우스 8F5 항체로부터 항체 유전자를 클로닝하여 키메릭 재조합 항체로 발현시켜, CD66c 항원 양성인 A549 세포 표면에 결합함을 보여주는 결과이다.

도 2a 내지 도 2c는 96종의 인간화 재조합 항체 중에서 1차 선정된 8종의 인간화 재조합 항체에 대한 HPLC 분석 결과로서, 각 항체 별로 왼쪽

0D 220 nm, 오른쪽 0D 280 nm 분석한 결과를 나타내고 있다. 항체의 aggregat ion 및 절편 등의 항체 유래 불순물 포함 여부를 나타내는 결과이다.

도 3a 내지 도 3e는 96종의 인간화 재조합 항체 중에서 1차 선정된 8종의 인간화 재조합 항체에 대한 CD66c 항원 양성 세포 표면 결합을 확인한 결과로서, 키메릭 항체와 비교하여 유사한 정도의 세포 표면 결합을 나타낸다.

도 4a 및 도 4b는 96종의 인간화 재조합 항체 중에서 선정된 5종의 인간화 재조합 항체에 대한 CD66c 항원에 대한 결합력을 ELISA통해 확인한 결과로서， 도 4a는 CECACAM6 （抑 66c） 항원에 대한 결과이며, 도 4b는 CEACAM1 （抑 66a） 항원에 대한결과이다.

도 5a 및 도 5b는 96종의 인간화 재조합 항체 중에서 선정된 5종의 인간화 재조합 항체에 대한 가혹 온도 조건에서의 항체 안정성을 확인한 결과이다.

도 6a 내지 도 6d는 CH0에서 발현시킨 인간화 재조합 항체의 CD66c 항원 양성 세포 A549의 세포표면 결합을나타낸 결과이다.

도 7의 상단은 MDSC 분석 방법에 대한 이해를 돕기 위한 모식도로, 점도표（dot plot）에서 세포의 크기에 따라 림프구를 제외하고 단핵구와 과립구 영역만을 지정한후에， HLA-DR의 발현이 없거나 낮은 군을 선택하고， 그 군에서 CDllb와 CD33에 양성인 그룹을 MDSC로 특정한 점도표 모식도이며， 하단은 지정된 MDSC군에서 DNP002의 양성률을 확인한결과이다.

도 8는 DNP002 처리 후 MDSC 사멸효과를 분석한 대표적인 결과로, 탈푸코오스 DNP002에 의하여 MDSC가 현격하게 감소하였음을 보여준다. CD66b는 granulocyt i c MDSC에서 발현하나 monocyt i c MDSC에서 발현하지 않으므로 MDSC 아형구분에 사용한다. 도 8에서 특정한 MDSC 대부분은 CD66b 양성이므로 granulocyt i c MDSC라 구분할 수 있으며， DNP002 처리에 의하여 granulocyt ic MDSC가현격하게 감소하였다.

도 9는 5명의 환자에서 탈푸코오스 DNP002 처리 후 MDSC사멸효과를 분석한 것으로, 5명의 환자 모두에서 DNP002로 인해 MDSC군의 수가 대조군 대비 감소함을 백분율로 비교하여 나타낸 결과로서， 그래프에서 가로축에 기재된 P#1는 pat ient ' s whole blood #1를 의미하며 세로축은 상대적인 MDSC viabi l i ty %변화를 의미한다.

도 10은 위암 환자의 혈액에서 분리된 PBMC에 DNP002 항체를 처리한 후 MDSC사멸효과를유세포분석기를 이용하여 분석한 결과를 나타낸다. 도 11a는 DNP002의 i sotype 에 따른 MDSC 사멸 효과를 비교한 결과로서， 탈푸코오스 (afucosylated) IgGl 타입의 DNP002 가 혈액 내 MDSC 사멸을 가장효과적으로유발하는 현상을 확인한결과이다.

도 lib는 5명의 위암 환자에서 DNP002의 i sotype 에 따른 MDSC사멸 효과를 비교한 결과로서， 환자 모두에사 탈푸코오스 (afucosyl ated) IgGl 타입의 DNP002 가 혈액 내 MDSC 사멸을 가장 높게 나타냈음을 대조군 대비 백분율로 비교하여 나타낸 결과로서, 그래프에서 가로축에 기재된 P#1 는 pat ient ' s whole blood #1를 의미하며 세로축은 상대적인 MDSC vi abi l i ty % 변화를 의미한다.

도 12a 및 도 12b는 DNP002 의 타깃 항원인 CEACAM6 가 양성인 위암 세포주 A549 와 췌장암 세포주 AsPC-1에 DNP002 항체 단독, NK 세포 단독， 및 DNP002 항체와■ 세포의 병용 조건에서 분석한 세포 사멸 효과에 대한 결과이다.

도 13은 암세포에서 CEACAM6 가 양성인 폐 선암 ( lung adenocarcinoma)과 암세포 자체에서는 CEACAM6가 음성인 편평상피암 ( lung squamous cel l carcinoma) , 비뇨기계 (Ur inary bladder cancer) 및 피부 암 (Melanoma mal ignancy) 조직에 CEACAM6 면역 염색한 결과 암 조직의 비 종양부위에 CEACAM6 양성인 MDSC가 있는 것을 확인한사진이다.

【발명의 실시를위한 형태】

하기의 실시예를들어 본 발명을 더욱 자세히 설명할 것이나, 발명의 권리범위가하기 실시예로 한정되는 것은 아니다. <실시예 1>항- CD66c키메릭 항체의 제조

1.1. 항- CD66c항체 유전자서열 클로닝

8F5 항체 유전자는 Mouse Ig-Pr imer Set (Mi l l ipore , Cat . #: 69831)을 이용하여 클로닝하였다. 8F5 하이브리도마로부터 분리한 RNA로부터 Mouse Ig-Primer Set을 이용하여 PCR을 수행하고， 이를 pGem-T 벡터 (Promega, Cat. #： A3600)에 삽입한후， 시퀀싱을 통해 DNA염기서열을 확인하였으며 , IMGT site (www. imgt .org)를 통해 마우스 항체 유전자를 확인하였다. 분석된 8F5 항체의 중쇄 및 경쇄 가변영역 서열은 다음과 같다.

【표 4]

1-2. 키메릭 항체 제조

상기 제작된 마우스 항체 85의 아미노산 서열을 기초로， 항체를 제작하였다. 라스미드 제작

키메릭 항체의 발현을 위하여， 중쇄 발현용 플라스미드와 경쇄 발현용 플라스미드를 각각 제작하였다 . 경쇄 발현용 플라스미드는 pOptiVEC (Invitrogen 사) 벡터를 사용하였고, 중쇄 발현용 플라스미드는 pcDNA3.3 (Invitrogen사) 벡터를사용하였다.

추가적인 아미노산 삽입 없이 항체 각각의 가변영역 코딩 cDNA와 불변영역 코딩 cDNA를 연속적인 아미노산 서열로서 발현되도록 하기 위하여， 상기 클로닝한 가변영역의 코딩 염기서열과 알려진 human IgGl 불변영역 (중쇄) 및 kappa 불변영역 (경쇄) 코딩 염기서열을 연결한 유전자 조각 각각을 합성 (Bioneer 사)하였다. 이와 같이 합성한 중쇄 및 경쇄 발현 유전자는 제한 효소 Xho I 과 Sal I으로 자른 후， 경쇄 유전자조각은 pOptiVec 벡터에， 중쇄 유전자 조각은 pcDNA3.3 벡터에 각각 ligation하여 완전한 항체 발현용 플라스미드를 제작하였다 ( pcDNA3.3-ant i-CD66c 중쇄 발현 플라스미드 및 p0ptiVEC-anti-CD66c경쇄 발현 플라스미드).

1-2-2. 형질전환

상기 제작된 pcDNA3.3-ant i-CD66c중쇄 발현 플라스미드와 pOptiVEC- anti-CD66c 경쇄 발현 플라스미드를 抑0세포 유래인

DG44세포 (Invitrogen)에 transfect ion시켜 형질전환과정을수행하였다.

우선 transfection 3일전에 부유상태의 DG44 세포를 5%FBS가 포함된 MEMa 배지에 적응시킴으로서 부착상태 세포로 변환시켜 형질전환 효율을 높일 수 있게 적응시켰다. 형질전환은 ViaFect transfection regent (Pr omega, Cat.#: E4981)를 사용하여 6wel 1 plate에서 수행하였다. 형질전환 하루 전날 1 X 105 cells/well의 농도로 계대 배양하여 부착상태로 적응된 DG44세포를 준비하였고, 형질전환에 사용된 DNA의 양은 pcDNA3.3-ant i-CD66c 중쇄 발현 플라스미드와 p0ptiVEC-anti_CD66c 경쇄 발현 플라스미드 각각 2ug, 1.5ug씩 1.5 : 1비율의 조합으로 사용하였다. 형질전환은 48시간 동안 수행하였다. 형질전환된 세포군을 분석하기 위하여 유세포분석기 (flow cytometer) 을 이용하였다. 도 1과 같이 키메릭 항체의 발현은 A549비소세포폐암 세포주로 확인하였다. 도 1은 마우스 8F5 항체로부터 항체 유전자를 클로닝하여 키메릭 재조합 항체로 발현시켜, CD66c항원 양성인 A549세포 표면에 결합함을보여주는 결과이다.

<실시예 2>인간화항- CD66c단클론항체의 제작

2.1 In silico Humanization ⁰ !] 의한재조합항체 서열 선정 마우스 00660 항체, 85 （중쇄 아미노산서열: 7 중쇄 코딩 : 묘요 10 0: 62； 경쇄 아미노산서열: 況요 犯 0: 8； 경쇄 코딩 0 : 況 0 犯炯:

유지하여 항원 결합력이 동등하거나 우수하면, 사람 항체 유전자를 코딩하고 서열을 기반으로 1 31116방0 요 ）：! 에 대한 부위 서열을 재조합한 인간화 항체 서열을 1^0 방법으로 선별하였다. 마우스 00660 항체 8 5 의 중쇄， 경쇄 각각 서열과 가장 유사성이 높아 인간화 재조합 항체 서열의 3신 0116으로 사용한 사람 항체 61 ^" 1111^½ 유전자는 아래 표 5와 같다. 상기 마우스 00660 항체의 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역의 아미노산 서열과 핵산 서열, 그리고 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역의 서열을 하기 표 6에 나타낸다.

【표 5]

위의 사람 항체 Germline유전자 서열을 이용하여 선정한 인간화 8F5 항체 서열로서， 중쇄 가변영역 12종， 경쇄 가변영역 8종을 선별하였으며， 해당 서열은 아래 표 3과 같으며, 상기 선별된 인간화 항체의 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역의 아미노산 서열， CDR 서열 및 프레임워크 서열을 하기 표 6 내지 표 8에 나타내고 chimeric 항체와 인간화 항체의 중쇄 및 경쇄 가변영역의 아미노산 서열을 표 1에 나타냈다. 마우스 항체와 인간화 항체는 중쇄 抑R3와 경쇄 CDR2 서열이 동일한 것이 바람직하다. 하기 표 6에서 진하게 밑줄을 그어 표시한 부분은 CDR 항체서열이다. 표 7에서 진하게 밑줄을 그어 표시한 부분은 변경된 아미노산을 나타낸다.

【표 6】 2019/221574 1»(：1/10公019/006007

【표 7】

2019/221574 1»（：1/10公019/006007

【표 8］

2.2 인간화 재조합 항체의 발현 및 분석

선별된 항체 서열들은 각각 사람 IgGl 중쇄 불변영역과 kappa 경쇄 불변영역과 연결하여 사람 IgGl 형태로 293T 세포에서 발현시켰다. Transfection 한 후, 7일 뒤에 배양액은 KanCap A resin (Kaneca 사)을 이용하여 인간화 재조합 항체를 정제하였다.

정제한 항체는 0D280 nm 측정으로 정량하였으며， SDS-PAGE 를 수행하였다. 또한， Sepax Zenix-C SEC-300 size exclusion column (Sepax technologies 사)으로 HPLC를 수행하여 280nm 와 220nm로 분석함으로써， 항체의 순도 및 aggregation여부를 분석하였다 (도 2a내지 도 2c)

2.3 인간화 재조합 항체의 세포 결합 및 항원 결합분석

2-3-1 세포결합 분석

발현시킨 96종의 인간화 재조합 항체를 각각 동일 양 (lug)을 CD66c 양성 세포인 A549 비소세포폐암 세포주가 담긴 시험관에 넣어 4 ^° C에서 30분간 반응시킨 후 PBS로 수세하고, FITC-conjugated goat ant i-Human IgG

(DiNona Inc, Korea)를 넣어 4 ^° C에서 15분간 반응하였다. 다시 PBS로 수세한 후 유세포분석기 (Stratedigm， SlOOOEXi)로 분석하여 그 결과를 아래에 기재하였다.

96종의 인간화 재조합 항체 후보 중에서 발현 정도와 aggregation 유무, 세포결합 정도를 기준으로 8종을 1차로 선정하였다 (표 9 및 표 10 , 도 3a 내지 도 3e) . 하기 표 9 및 표 10은 1차 선정된 항 CD66c 인간화 항체 및 키메릭 8F5 의 분석 결과로서 표 10은 Flow cytometer 분석 결과를 나타낸다.

【표 9]

【표 10]

상기 선정된 8종의 항체는 발현 정도와 aggregation유무， 세포결합 정도를 표 9에 나타냈으며， 구체적으로 1차 선정된 8종 항체에 대한 발현 정도와 분자량을 정리한 것이다. 또한， 표 10의 유세포 분석 결과를 살펴보면， 8종의 인간화 재조합 항체가 키메릭 항체 대비 土 20%의 세포 결합력을 나타내어 키메릭 항체와 매우 유사한 세포 결합력을 나타냄을 확인하였다. 이로써 96종의 인간화 후보항체 중에서 발현이 정상적으로 이뤄지며， 단백질 자체의 불안정성으로 형성되는 aggregation 이 적으며， 또한 타겟 항원 양성의 세포에 결합하는 능력이 키메릭 항체와 유사한 인간화 항체 8종을 1차 선별하였다.

특히 세포주 결합력은 수치상으로는 차이가 있어 보이나， 도 3과 같이 실제 세포결합 양상은 키메릭 항체와 비슷한 수준으로서 항체 양성률 (% gated)과 형광 평균값 (mean)을 곱하고 이를 키메릭 항체와 상대 비교하여 士 20% 범위 내 포함되는 8종을 선별한 것으로서, 통상 인간화 항체 생성 시， 인간화 항체의 framework region 에 마우스 항체 CDR 부위 서열을 삽입하였을 때 원래 단백질 구조의 변경으로 항체 결합력이 급격히 저하된다는 결과를 고려하였을 때， 매우 우수한 인간화 항체를 선별하였다 할 수 있다.

2-3-2 항원 결합 분석

상기와 같이 선정한 8종 인간화 재조합 항체 중에서, 키메릭 항체 대비하여 세포결합력을 기준으로 높은 결합력을 나타내는 다섯 종류의 인간화 재조합 항체를 선택하고， 이들을 此比쇼 방법으로 00660 항원 및 유사 0066 항원들에 대한 결합력 분석을 실시하였다.

【표 11】

CD66c (CEACAM6； SinoBiological 사) 와 CEACAM1 항원

(SinoBiological 사)을 96 well plate에 웰 당 100 씩 코팅한 후， blocking하였다. 일차항체 양은 lOug/ml 부터 3 배씩 희석하여 37 ^° C 온도에서 1시간 결합시켰으며， 이차항체로서 goat anti-Human Ig -HRP 접합체 (Jackson ImmunoResearch 사)를 1 : 10000으로 희석하여 37 °C 온도에서 30분간 결합시켰다. 각 단계 사이는 3번씩 수세과정을 거치고 TMB 반응하였다. IN H2S04 용액으로 TMB 용액과 동량 ( 100ul) 처리하여 반응 중지한 후, 450nm로 0D값을 측정하였다.

상기 실험결과로서 96종의 인간화 재조합 항체 중에서 선정된 5종의 인간화 재조합 항체에 대한 CD66c항원에 대한 결합력을 도 4a, 표 12 및 도 4b, 표 13 에 나타냈으며， 도 4a와 표 12 는 CECACAM6 (CD66c) 항원에 대한 결과이며， 도 4b와 표 13 은 CEACAM1 (CD66a) 항원에 대한 결과이다.

도 4a, 표 12 및 도 4b, 표 13의 항원에 대한 결합력 결과로부터， CEACAM6에 대해서는 모든 항체들이 키메릭 항체와 유사한 결합 양상을 보였으며, 期ACAM1에 대해서는 약한 결합과 결합하지 않은 그룹으로 양분되었다.

【표 12] 2019/221574 1»（：1^1{2019/006007

【표 13】

2 .4 인간화 재조합 항체의 안정성 분석

상기 항원 및 세포결합 양상을 통해 선정한， 상기 실시예 3.3의

5종의 인간화 재조합 항체를 높은 온도 조건에 방치하여 항체의 안정성 여부를 분석하는 실험을 수행하였다.

안정성 즉정은 8 -크 1 10-1-1¼1）뇨1:113161163111군011 301（1 （이하 ; 크 사）를 이용한 결합 실험을 통해 확인하였다. 는 단백질 변성 시 노출되는 소수성 부위에 결합할 때와 그렇지 않을 때의 형광 파장이 달라 이러한 파장 변화를 측정함으로써 단백질의 변성 유무를 확인할 수 있는 화합물이다. 인간화 재조합 항체를 PBS (phosphate buf fered sal ine)를 이용해 0.2 mg/ml 농도로 모두 맞춘 후， 가혹 조건으로서 50 ^° C 온도에서 4시간 동안 방치하였다. 0.2 mg/ml ANS 용액을， 측정하기 위한 항체 희석액 500 ul 당 20 ul 넣어 섞어준 후, 5 분 후에 형광리더기로 360 nm exci tat ion, 460 nm emi ssion 조건에서 분석하였다. 추가적으로 70 ^° C 온도에서 30분간 더 방치한조건에서도 ANS시약반응을측정하였다.

상기 표 11에 나타낸 5종의 인간화 재조합 항체에 대한 가혹 온도 조건에서의 항체 안정성을 확인한 결과를 도 5a 및 도 5b에 나타냈다. 즉 가혹 조건으로서 50 ^° C 온도에서 4시간 동안 항체를 방치한 후 ANS 시약 반응성을 형광으로 측정하고, 추가로 70 ^° C 온도에서 30분간 더 방치한 조건에서도 ANS 시약 반응을 측정한 결과를 나타낸다. 도 5a 의 실험결과에 나타낸 바와 같이, 50 ^° C 온도에서 4시간 방치 조건에서는 5 종의 항체 대부분이 ANS 반응이 미미했었으나， 70 ^° C 온도에서 추가 30분 방치 조건에서는 대부분 항체의 형광값이 크게 증가하였다. 그 중에서는 protein ID： 3058 재조합 항체가 가장 낮은 형광값 증가세를 보여， 5 종류의 재조합 인간화항체 중에서 가장온도 변화에 대해 안정적인 결과를보였다.

또한， ANS 시약 반응성 변화율을 측정하고자, 냉장조건 (4 + 2 ^° C ) 및 62 ^° C 온도에서 각각 4시간 방치한 후에 ANS 시약 반응성을 상기 동일한 방법으로 형광 리더기로 분석하였다. 또한， ANS 시약에 대한 항체의 형광값 변이율은 저온 조건 (예, 4 ^° C )에서 측정한 형광값과， 고온 조건 (예,

62 ^° C )에서 측정한 형광값의 차 (di f ference)를， 저온 조건에서 측정한 형광값으로 나눈 값을 의미한다.

［수학식］

형광값 변이율 = (고온 조건에서 측정한 형광값- 저온 조건에서 측정한형광값)/ (저온조건에서 측정한 형광값)

도加와 같이 가혹조건의 온도 (50 ^° C )에서 온도를좀 더 올린 62 ^° C 온도에서 4시간 방치 후， ANS 시약 반응성을 확인하였다. 5종이 재조합 인간화 항체와 키메릭 항체 모두 냉장 조건에서는 ANS 반응 값이 미미했으나， 온도를 상승함에 따라 ANS 형광값이 증가하였다. 그러나， 키메릭 8F5는 62 ^° C 온도조건 보관실험에 의하여 ANS 시약 반응성이

1 ,406%까지 증가하였으며， 동시에 침전물이 발생하여 불안정한 결과를 보였다. 그러나， 인간화 항체 5종은 키메릭 항체보다 ANS 시약 반응성 변화가 현저히 낮게 측정되었으며， 침전물이 발생되지 않았다. 특히, Protein ID 3019 인간화 항체와 Protein ID 3058 인간화 항체는 각각

114%, 133%로 ANS 반응성의 변화가 측정되어 가장 안정한 항체로 평가되었다. ANS 시약 반응성이 커진다는 의미는 단백질 구조 상 안쪽에 배치되어 있던 소수성 아미노산의 노출이 증가한다는 의미이고, 이는 단백질 구조의 변성과 이로 인한 단백질 aggregate 즉， 침전물 생성의 원인이 된다. 본 발명에 따른 인간화 항체는 ANS 반응성 변이%가 200% 미만으로 안정한 항체이며, 200% 미만은 변화가 매우 미미한 것으로 간주되고， 그 이상은 의미 있는 단백질 구조 변경이 이뤄져 ANS 반응성이 관찰된 것으로 해석될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 인간화 항체는 키메릭 항체 대비 유사한 항원 결합력 및 세포 결합력을 가지며, 항체 단백질 자체의 물리적 안정성이 증가하였으며， 이러한 사실은 치료용 항체의 druggabi l i ty측면에서 매우우수한특징이라할수 있다.

2.5 인간화 재조합항체의 CH0세포 발현 및 분석

상기 실시예 2.3에서 선정된 5종의 인간화 재조합 항체를 실제 대부분의 치료용 항체를 발현시키기 위해 사용하는 抑 0 세포에 발현시켜 분석하였다. 선정된 5종의 인간화 재조합 항체를 구성하기 위한 경쇄 및 중쇄 가변영역 DNA 서열을 코돈 최적화 과정을 거친 후, 합성하여 사람 IgGl 불변영역 유전자와 over lay PCR 방법으로 연결하고 Xhol 과 EcoRI 유전자 조각으로 pcDNA3.4 벡터 (Li fe Technology 사)에 클로닝하였다. 상기 표 11은 CH0 세포 발현을 위해 선별된 인간화 항체의 경쇄 및 중쇄 조합을 나타낸다.

가변-불변영역 유전자 PCR을 위해 사용한 DNA pr imer 서열은 아래 표 14와 같다.

【표 14】

5 종의 인간화 재조합 항체는 ExpiCHO (trademark) Expression System Ki t (ThermoFi sher 사; Cat . No:A29133)을 이용하여 Transient transfect ion 시켰으며, 발현시킨 항체는 도 6a 내지 도 6c와 같이 CD66c 양성 세포인 A549 비소세포폐암 세포주에 결합시켜 Flow cytometer로 분석하였다. 5종류 인간화 재조합 항체는 모두 키메릭 항체와 유사한 결합력을 보였다. 상기 측정한 Flow cytometer 형광값을 CH0 배양액의 항체 발현 양으로 나누어, 상대적인 항체 발현양에 대한 세포표면 결합력 (relat ive cel l binding)을 표시한 것을 도식화하면 도 6d와 같았다. 따라서， 인간화 재조합 항체는 CH0 세포에서도 적절히 발현되는 것을 확인하였다. 항체의 세포 표면 결합력을 구하고 이를 100% 로 하여 상대적인 변화를도시한 것이 도 6d이다.

<실시예 3> DNP002항체의 CH0세포발현 및 분석

대부분의 치료용 항체를 발현시키기 위해 사용하는 CH0 세포에서 항

CD66c에 대한 인간화 항체인 DNP002를 발현시켜 분석하였다. DNP002 항체의 아형에 따른 기능 차이를 확인하기 위해 IgGl 타입과 IgG2 타입의 항체를 제조하였다.

인간화 재조합 항체를 구성하기 위한 경쇄 및 중쇄 가변영역 DNA 서열을 코드 (codon) 최적화 과정을 거친 후， 합성하여 사람 IgGl 또는 IgG2 불변영역 유전자와 over lay PCR 방법으로 연결하고 Xhol 과 EcoRI 유전자 조각으로 pcDNA3.4벡터 (Li fe Technology사)에 클로닝하였다.

【표 15】 2019/221574 1»(：1/10公019/006007

탈푸코오스 (afucosylated) DNP002 인간화 항체를 제조하기 위하여, DNP002 IgGl 타입의 항체 발현 시， 2F-PF(2F-Peracetyl-Fucose； Merck, Cat#： 344827) 를 배양액에 50 uM로 투여하여 배양하였으며, Mabselect sure Protein A column (GE Healthcare Li fescience, Cat#: 11003494) 사용하여 정제하였다. 정제한 항체는 phosphate buffered saline으로 투석하고 280 nm 흡광값을 흡광계수 1.4로 나누어 "mg/mL" 농도 단위로 변환하고 이후 시험에 사용하였다.

탈푸코오스화는 푸코오스에 결합특성이 있는 Biotinylated Lens culinaris agglutinin (Vector laboratories , Cat#：B-1045) 반응성을 상대적으로 비교하여 평가하였다. 푸코오스가 결합되어 있는 IgGl DNP002는 Biotinylated Lens culinaris agglutinin과 반응하고 SA_HRP( Jackson immunoresearch, Cat#: 016-030-084)에 의하여 TMB 발색을 유도하였으나 탈푸코오스화 DNP002는 상대적인 발색이 미미하였다 (표 16).

【표 16】

＜실시예 항체의 반응성 조사 MDSC에 대한 DNP002 항체의 반응성을 유세포 분석 (flow cytometric analysis)을통해 확인하였다.

구체적으로 위암환자의 혈액을준비한 뒤 , 각 형광이 다르게 결합된 MDSC의 표지 항원들에 대한 항체 (항-HLA-DR-FITC, CDllb-PE, CD33-PE 항체)와 함께, APC가 결합된 DNP002 항체를 전혈 100 uL에 첨가하고 20분간 4 ^° C에서 반응시켰다. 적혈구 용해 버퍼 IX RBC Lysis Buffer (ThermoFisher , Cat#： 00-4333-57) 5 ml을 첨가하여 실온에서 30분간 반응시킨 후 원심분리하여 분해된 RBC를 제거하고， 다시 PBS로 수세한후 유세포 분석을 시행하였다. 염색강도는 형광강도에 대한 log 로 측정하고 10승 단위로 표시하였다.

결과 분석은， 점도표(dot plot)에서 세포의 크기에 따라 림프구를 제외하고 단핵구와 과립구 영역만을 지정한 뒤, HLA-DR의 발현이 없거나 낮은 군을 선택하고， 그 군에서 CDllb와 CD33에 양성인 그룹을 MDSC로 지정하였다. 지정된 MDSC군에서 DNP002의 양성률을 확인하였다 (도 7) . 구체적으로， 도 7에서 상단에 나타낸 그래프 중에서 왼쪽부터 오른쪽 방향으로, 1) FSC 및 SSC dot plot에서 monocytes와 granulocytes만을 구획화(gating)， 즉， lymphocytes를 제외. (FSC: forward scatter , 분석하는 세포의 사이즈를 나타내는 변수， SSC： side scatter, 분석하는 세포의 granularity를 나타내는 변수로서， 세포 내 granule이 있는 정도를 나타내는 변수)이며， 2) HLA-DR Low혹은 (-) 그룹을 구획화한 것이며, 3) 상기 1번， 2번 구획화 중에서 CDllb와 CD33 이 양성인 그룹이 MDSC이다. DNP002양성인 MDSC는 90.9 % (도 7의 오른쪽 dot plot 내에서 upper right 부위)이고， DNP002 음성인 MDSC는 4.4% (도 7의 오른쪽 dot plot 내에서 upper left 부위 ) 이다. MDSC는 단핵구성 MDCS와 다핵구성 (granulocytic) MDSC로 아형으로 구분되며， 다핵구성 MDSC는 CD66b를 발현하나 단핵구성

MDCS는 CD66b를 발현하지 않아 MDSC 아형 구분에 CD66b 발현 여부는 유용하게 사용할수 있다.

도 7은 MDSC를 특정하는 방법 (림프구 제외， HLA-DR low/(-)， CDllb+, 抑 33+)과 특정한 MDSC에서 DNP002(anti-CD66c)가 반응하고 있음을 증명하는 결과이다. MDSC에 DNP002가 결합하므로 MDSC특정하는 방법으로 DNP002을 사용할 수 있으며 (도 7)， DNP002는 ADCC효과를 유발하여 MDSC를 제거할 수 있다 (도 8) . 하기 시험결과에서 DNP002가결합한 MDSC는 90.9%이다.

도 8은 CD66b 양성인 다핵구성 MDSC가 DNP002 처리에 의하여 살상되고 그 비율이 감소한 현상을 보여준다. 도 8에서 상단 (control)의 점도표는 DNP002을 처리하기 전 시료이며， 하단 (DNP002)은 DNP002 처리 이후 MDSC가 감소한 결과이다. CD66b는 monocytic MDSC와 granulocytic

MDSC를 구분할 수 있는 마커이다. 하기 시험결과에서 대부분의 MDSC는 CD66b 양성인 granulocytic MDSC이며, granulocytic MDSC가 DNP002에 의하여 효과적으로살상되었다.

위암 환자 19명의 혈액을 분석한 결과， 전체 PBMC 내 MDSC 상의 DNP002 의 양성률은 평균 34.3 -76.7%로 나타났고， 평균 55.1%의 양성률을 보였다. 하기 표 17은 19명의 위암 환자 샘플을 가지고 DNP002 항체의 MDSC 반응성을분석한 것이다.

【표 17】

<실시예 5> DNP002에 의한 MDSC용해 효과

5.1. 전체 혈액세포 (whole blood) 내 DNP002에 의한 MDSC용해 효과 DNP002에 의한 MDSC살해 효과를 확인하기 위하여 5명의 위암 환자 혈액에 적혈구 용해 버퍼 IX RBC Lysi s Buf fer (ThermoF i sher , Cat#： 00- 4333-57)를 첨가하여 적혈구를 용해 시킨 후, 12 wel l plate 에 wel l 당 1 X 105 씩 분주하여 준비하였다. DNP002 항체를 각 wel l 에 10 ug/mL 이 되도록 첨가하고 37 ^° C 인큐베이터에서 하루 배양하였다. 배양 후 PBS로 세척하고, 각 형광이 다르게 결합된 MDSC 표지 항원에 대한 항체 (항 HLA-DR, CDllb, CD33 항체)와 20분간 4 ^° C에서 반응시켰다. PBS로 수세한 후 유세포 분석을 시행하였다. 염색강도는 형광강도에 대한 log 로 측정하고 10승 단위로 표시하였다.

상기 실험결과로서, 도 8은 DNP002 항체가 혈액 내 MDSC 의 세포사멸을 효과적으로 유도하여 DNP002 항체 처리전에 비하여 MDSC 비율이 현격하게 감소한 대표적인 결과를 나타낸다. 도 9는 도 8과 동일한 시험을 5명의 위암환자 혈액시료에서 각각 시험하고 도표화한 결과이다. Open bar는 DNP002 처리 이전 MDSC 비율을 의미하며 , closed bar는 DNP002 처리 이후 MDSC의 상대적 비율을 의미한다. DNP002 처리 이후에 5명의 환자 시료 모두에서 MDSC비율이 확연히 감소하였음을 확인할수있다.

5.2. PBMC (말초혈액 단핵 세포) 내 DNP002에 의한 MDSC용해 효과

DNP002 항체의 MDSC타겟 살해 능력을 보다분명히 밝히고자, 성숙한 호중구 (neutrophi l ) 를 제외하고 MDSC만을 얻어서， 호중구에 의한 영향 없이 DNP002항체의 MDSC사멸 효과를 확인하였다.

구체적으로， 2명의 위암 환자 혈액을 Ficol l-Paque PLUS (Ge heal thcare , Cat#： 17-1440-02) 용액을 이용해 MDSC가 포함된 PBMC 층만을 분리하였다. 이러한 Ficol l 용액을 통한 혈액세포의 비중분리는 효과적으로 성숙 호중구를 제외시켜 보다 정확한 MDSC 사멸효과를 확인할 수 있도록 한다. 준비된 PBMC 는 12 wel l plate에 wel l당 1 X 10 ⁵ 씩 분주하고 DNP002 항체를 각 wel l 에 10ug/mL 이 되도록 첨가하고 37 ^° C 인큐베이터에서 48시간 배양하였다. 이때, PD-1 에 대한 항체인 Nivolumab (Bri stol-Myers Squibb)을 대조군으로 이용하여 MDSC 살해능을 비교하였다. 배양 후 세포를 PBS로 세척하고， 유세포분석을.통해 MDSC군의 증감을 확인하였다 (도 10) . 유세포 분석 결과 DNP002 를 처리한 군은 그렇지 않은 군 대비 평균 약 49% 의 세포 사멸 효과를 보였다. 반면 대조군으로 이용한 Nivolumab은 약 24% 의 MDSC 사멸 효과를 보이는데 그쳤다. MDSC 사멸 효과는 두 환자에서 분리한 MDSC모두에서 동일하게 나타났다. 따라서 본 실험을 통해 DNP002항체에 의한 MDSC살상효과가상당함을 확인할수 있다.

DNP002 에 의한 MDSC 의 용해 효과를 전혈 (실시예 5.1)과 PBMC (말초혈액 단핵세포; 실시예 5.2) 각각에 대해 확인하였다. 전혈 및 PBMC 에는 ADCC 를 유발할 수 있는 환자 본인의 ■ 세포가 있어 , DNP002를 매개로 하여 期 ACAM6 양성인 세포를 ADCC 로 용해할 수 있다. 그런데， 전혈에는 CEACAM6 타깃 항원이 양성인 호중구와 MDSC 가 혼합되어 있어， MDSC 만을 선택적으로 용해하였다고 보기 어렵다. DNP002 에 의한 MDSC 의 선택적인 용해를 명확히 하기 위해， 호중구를 원심분리로 층분리시켜 없앤 PBMC를 대상으로 추가 실험하였다 (실시예 5.2) . 이에 DNP002 에 의한 MDSC 용해가분명함을 확인하였다.

<실시예 6>항체 isotype에 따른 MDSC용해 효과

DNP002 항체의 MDSC 타겟 살해 능력을 확인하기 위해 3가지 유형의 DNP002 항체 제제를 준비하였다. 항체는 i sotype에 따라 NK 세포에 발현한 FcrRI I I (CD16)의 친화도에 차이가 발생하며, 친화도에 비려하여 항체의존성 세포매개 세포독성 (ADCC)이 증가한다. IgG2 i sotype은 FcrRI I I에 대한 친화도가 매우 낮아 ADCC 효능이 없는 반면, IgGl i sotype은 FcrRI I I에 대한 친화도가 높아 ADCC 효능이 뛰어나다. 항체의 ADCC 효능은 i sotype 뿐만 아니라 항체 297번째 아스파라진 아미노산에 연결된 당쇄구조에 따라 달라지는 것으로 보고 되었으며， 특히 당쇄에 푸코오스가 없는 경우 ADCC 효능이 증가한다 (Shi tara K. , et al , J Immunol Mehtods . 2005 Nov 30； 306 (1-2) IgG subclass- independent improvement of ant i body-dependent cel lular cytotoxi ci ty by fucose removal from Asn297-1 inked ol igosacchar ides) .

DNP002 항체의 i sotype 및 탈푸코오스 따른 MDSC 타겟 살상 능력을 확인하기 위해 in vi tro 시험을 수행하였다. 5명의 위암 환자 혈액에 적혈구 용해 버퍼 IX RBC Lysi s Buf f er (ThermoF i sher , Cat#: 00-4333-57) 첨가하여 RBC 용해시킨 후， 12 wel l plate 에 wel l 당 1 X 105씩 분주하여 준비하였다. DNP002 IgGl 타입과 IgG2 타입 및 탈푸코오스 (af lucosylated) IgGl 타입의 3가지 종류의 항체를 각각 웰에 10 ug/mL 이 되도록 첨가하고 37 °C 인큐베이터에서 하룻동안 배양하였다. 배양 후 로 세척하고， 각 형광이 다르게 결합된 MDSC 표지 항원에 대한 항체 (항 HLA-DR, CDllb , 抑 33 항체)와 20분간 4 ^° C에서 반응시켰다. PBS로 수세한 후 유세포 분석을 시행하였다. 염색강도는 형광강도에 대한 log 로 측정하고 10승 단위로 표시하였다.

시험대상인 위암 환자 5명 모두에서 IgG2， IgGl, 탈푸코오스 (afucosylated) IgGl 타입 순으로 MDSC 사멸효과가 증가하는 것으로 관찰되었다 (도 11a, lib) . Isotype과 탈푸코오스 (afucosylated, 푸코스 함량이 10%이하)에 따라 MDSC 사멸효과에 차이가 발생하는 것은 항체와 FcrRI I I 간의 친화도에 따른 차이로 판단되며 , ■세포에 의한 ADCC 효과로 MDSC가살상된 것으로 이해할수 있다.

도 11a에 나타낸 바와 같이, MDSC를 효과적으로 제거할 수 있는 DNP002 제제 유형을 확인한 대표적인 시험결과이다. 상단 (control ) 대비

DNP002 IgG2는 상당부분의 MDSC가 잔존하고 있으나， DNP002 IgGl은 MDSC 비율을 현격하게 감소시켰다. 본 시험에서 DNP002 IgGl에 의한 MDSC 살상효과가 상당하나, IgG2에 의한 살상효과는 미미하다는 것을 확인할 수 있었고， IgG2 i sotype은 ADCC 효능이 IgGl i sotype에 비하여 없거나/매우 낮으므로 DNP002 IgGl에 의한 MDSC 살상효과는 ADCC에 의한 것으로 추론할 수 있다.

도 lib에 나타낸 바와 같이, 도 9와 동일한 시험을 5명의 위암환자 혈액시료에서 시험하고 도표화한 결과이며， 그래프의 가로축은 5명의 위암환자 각각을 나타낸다 (P#l， P#2， P#3, P#4, P#5) . Control , IgG2 , IgGl , IgGl-afucosylated 순으로 MDSC 살상효과가 관찰되었다. IgG2 i sotype은 ADCC 기능이 없어 MDSC살상효과가 없거나 미미하나 ADCC 기능이 있는 IgGl과 탈푸코오스화로 ADCC 기능을 강화한 IgGl-afucosylated에서는 MDSC살상효과가뛰어나다. <실시예 7> DNP002 와 자연 살해 세포의 병용에 의한 암세포 사멸 효과

DNP002항체와자연 살해 세포 (Natural ki l ler cel l )의 병용 효과를 확인하기 위해 in vi tro 시험을 수행하였다. 3명의 정상 혈액으로부터 Fi col 1-Paque PLUS (Ge healthcare , Cat# : 17-1440-02) 용액을 이용하여 PBMC 를 분리한 뒤， CD56 mi cro bead (Mi ltenyi Biotec , Cat# : 130-050- 401)를 이용하여 CD56 양성 자연 살해 세포만을 분리하였다. 도 12a 및 도 12b에서 가로축은 각각 상기 자연 살해 세포의 기원인 혈액의 공여자 (donor) 3명을 의미한다. 96 wel l plate 에 DNP002 의 타깃 항원인 CEACAM6 가 양성인 위암 세포주 A549 와 췌장암 세포주 AsPC-1을 wel l 당 lxlO ⁴ 씩 분주하여 준비한 뒤， 앞서 분리한 자연 살해 세포를 wel l 당 2xl0 ⁵ 씩 분주하고 DNP002 항체를 10ug/mL 이 되도록 처리하여 37 ^° C 에서 6시간배양하였다.

EZ-cytox enhanced cel l vi abi l i ty ki t (Daei l Lab) 를 이용하여 세포 생존율을 측정한 결과, 두 종의 암 세포주 모두에서 DNP002 항체와 자연 살해 세포의 병용에 의한 세포 사멸 효과가 단독처리 시 대비 증가하는 것으로 확인되었다 (도 12a 및 도 12b) .

이는 DNP002 의 암세포 살해능이 자연 살해 세포와의 병용에 의해 상당히 증폭하였음을 나타낸다. 이를 통해, CEACAM6 양성인 암세포뿐만 아니라， 역시 期 ACAM6 양성인 MDSC 의 효과적인 제거를 위해 ■ 세포 또는 NK세포치료제와의 병용 처리가뛰어날수 있음을나타낸다.

실시예 5.2 결과와 같이 DNP002 에 의한 MDSC의 선택적 용해 결과와 실시예 7의 ■ 세포 또는 NK 세포치료제의 병용효과를 통해, CEACAM6 양성인 암세포 및 CEACAM6 양성인 MDSC 를 모두 표적으로 하여 제거할 수 있음을 알 수 있다. 실시예 5.2와 실시예 7이 각각 MDSC 와 암세포로 다른 표적 세포에 대해 ADCC를 보였지만， 실제 두 종류의 세포가 함께 증가되어 있는 암환자의 경우， DNP002 로 두 종류의 표적을 동시에 제거할 수 있으며, 또한 암세포 및 MDSC 표적을 동시 제거하기 효능을 배가하기 위해 · 세포치료제와의 병용이 기능할수 있음을나타낸다.

<실시예 8> CEACAM6가 음성인 암환자의 미세종양 환경에서 MDSC의 검출

CEACAM6 항원은 암세포뿐만 아니라 MDSC 에도 발현되기 때문에 DNP002 항체를 이용하여 암세포뿐만 아니라 MDSC 를 검출할 수 있다. 이를 확인하기 위해 CEACAM6 항원이 양성이거나 음성인 암환자 조직에서 암세포가 아닌 MDSC 가 검출되는 지를 면역조직화학염색 ( Immunohi stochemi stry) 법으로 확인하였다 .

면역조직화학염색법은 다음과 같은 방법으로 수행하였다. xylene 에 10 분씩 3회， 100% alcoho에 10분씩 2회， 80%, 70% 알코올 (al cohol )에 5분，

3분간 deparaf f in 하고 3차 증류수에 세척 한다. 이어서， 0.03% ¾0 ₂ 으로 실온에서 10분간 담궈서 Peroxidase Blocking 후 3차 증류수로 세척한다. 바로 IX 시트레이트 완충액 (Ci trate buf fer , pH 6.0)에 슬라이드를 넣고 20분간 끓여서 수돗물에 중탕해서 서서히 식힌 뒤 3 차 증류수로 세척하고 다시 IX PBS로 일회 세척 후 조직이 있는 부위에 DNP002 의 모클론인 8F5 항체를 슬라이드 1 장당 150 ul (10ug/ml ) 씩 실온에서 90 ± 5 분 동안 반응시킨다. 반응 후 IX PBS로 5 분씩 4 번 세척한다. 이차 항체를 슬라이드 1 장당 100 ul씩 실온에서 20 분간 반응시키고 반응 후 IX PBST로 5 분씩 4 번 세척하고 DAB Chromogen 을 슬라이드 1 장당 100 씩 실온에서 3 분간 발색 시키고 수돗물에 10 분 동안 세척 한다. Mayer’ s Hematoxyl in 을 슬라이드 1 장당 100 ul씩 실온에서 3 분간 대조 염색하고 흐르는 수돗물에 10 분 동안 세척한다. 이어서 dehydrat ion한 뒤에 mount ing을 한다.

암세포에서 CEACAM6 가 양성인 폐 선암 ( lung adenocarcinoma)과 암세포 자체에서는 CEACAM6가 음성인 편평상피암 ( lung squamous cel l carcinoma) , 비뇨기계 암 (Ur inary bladder cancer) 및 피부 암 (Melanoma mal ignancy) 조직에 CEACAM6 면역 염색한 결과 암 조직의 비 종양 부위에 CEACAM6 양성인 MDSC가 있는 것을 확인하였다 (도 13) . 이는 암 조직 또는 암세포의 자체에서의 CEACAM6 항원 발현과 상관없이 암조직 주변의 침윤된 MDSC를 표적으로 진단 및 치료에 활용할 있음을 나타낸다.

암세포 세포표면의 CEACAM6 양성도와 상관없이， 암환자에서는 MDSC 가 증가되는 경향을 보이며, 이는 실시예 8의 결과와 같이 미세종양환경에 침윤되어 있는 MDSC를 검출하고 확인할 수 있다. 이는 MDSC 를 선택적으로 용해할 수 있음을 보인 실시예 5.2의 결과와 함께 고려하였을 때, 암세포 상의 CEACAM6 양성도와 상관없이 MDSC 를 표적으로 진단 및 치료목적에 사용할 수 있음을 나타낸다. 암 종에 따라 암세포 세포표면의 CEACAM6 발현 유무를 다를 수 있으나, 이와 상관없이 대부분의 암 종에서 MDSC는 증가되기 때문에， DNP002를 이용하여 MDSC를 표적 치료를 통해 대부분의 암 종을 대상으로 한 범용의 진단 및 치료적 목적으로 이용할 수 있음을 나타낸다.