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Title:
USE OF STARCH NANOPARTICLES LOADED WITH ACTIVE MOLECULES FOR AQUACULTURE
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2021/078743
Kind Code:
A1
Abstract:
The present invention relates to the use of a starch nanoparticle loaded with at least one active molecule of interest to feed zooplankton, in particular a living prey chosen from rotifers, brine shrimp and copepods. In particular, the invention relates to the use of this loaded starch nanoparticle to increase the size and/or density and/or egg-laying rate of this zooplankton, and/or the hatching rate of the eggs thereof.

Inventors:
BOUKHERROUB, Rabab (Villeneuve d'Ascq, FR)
SOUISSI, Sami (Saint-Martin-Boulogne, FR)
LE FUR, Stefka (Villiers-sur-Marne, FR)
Application Number:
EP2020/079504
Publication Date:
April 29, 2021
Filing Date:
October 20, 2020
Export Citation:
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Assignee:
UNIVERSITE DE LILLE (LILLE, FR)
CENTRALE LILLE INSTITUT (Villeneuve d’Ascq, FR)
UNIVERSITÉ POLYTECHNIQUE HAUTS-DE-FRANCE (Valenciennes, FR)
CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE (PARIS, FR)
YNCREA HAUTS DE FRANCE (Lille, FR)
UNIVERSITÉ DU LITTORAL CÔTE D'OPALE (Dunkerque, FR)
International Classes:
A23K20/142; A23K20/158; A23K20/174; A23K20/184; A23K20/195; A23K20/20; A23K50/80
Attorney, Agent or Firm:
CABINET BECKER ET ASSOCIES (PARIS, PARIS, FR)
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Claims:
REVENDICATIONS

1. Utilisation d’une nanoparticule d’amidon chargée d’au moins une molécule active d’intérêt pour nourrir du zooplancton.

2. Utilisation selon la revendication 1, pour augmenter la taille et/ou la densité et/ou le taux de ponte du zooplancton, et/ou le taux d’éclosion des œufs du zooplancton.

3. Utilisation selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle le zooplancton est une proie vivante choisie parmi les rotifères, les artémias, et les copépodes.

4. Utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, dans laquelle la nanoparticule d’amidon chargée d’au moins une molécule active d’intérêt a une taille moyenne comprise entre 10 et 500 nm, entre 20 et 450 nm, entre 40 et 400 nm, de préférence d’environ 40, 80, 100, 200, ou 400 nm, et d’une manière encore plus préférée d’environ 80 nm.

5. Utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, dans laquelle la proportion en poids de ladite au moins une molécule active d’intérêt est comprise entre 0,01 % et 10 %, entre 0,01 % et 5 %, de préférence entre 0,1 % et 4 %, et d’une manière encore plus préférée entre 1 et 3 % par rapport au poids total de la nanoparticule d’amidon.

6. Utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, dans laquelle ladite au moins une molécule active d’intérêt est choisie parmi les vitamines, les caroténoïdes, les antibiotiques, les hormones, les minéraux, les acides aminés, les peptides, les protéines, les acides gras, et leurs dérivés.

7. Utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 6, dans laquelle ladite au moins une molécule active d’intérêt est choisie parmi la vitamine B 12, la vitamine C, la bétaïne, le sélénium, la tétracycline, le triméthoprime, l’acide oxolinique, la taurine, la méthionine, le glutathion, l’iode, l’œstrogène et l’estradiol.

8. Utilisation d’une composition comprenant au moins une nanoparticule d’amidon chargée d’au moins une molécule active d’intérêt telle que définie selon l’une quelconque des revendications 1 à 7 et, optionnellement, un agent nutritif, en particulier une micro-algue, pour nourrir du zooplancton, de préférence une proie vivante choisie parmi les rotifères, les artémias, et les copépodes.

9. Utilisation selon la revendication 8, dans laquelle la composition est sous forme de poudre ou de solution.

10. Utilisation selon la revendication 8 ou 9, dans laquelle la composition comprend une quantité de nanoparticules d’amidon chargées d’au moins une molécule active d’intérêt comprise entre 0,1 et 300 mg/L, entre 1 et 200 mg/L, entre 10 et 150 mg/L, entre 10 et 100 mg/L, de préférence entre 10 et 80 mg/L, et de manière encore plus préférée entre 20 et 60 mg/L.

11. Utilisation selon l’une quelconque des revendications 8 à 10, dans laquelle la composition est appliquée quotidiennement.

12. Composition comprenant au moins une nanoparticule d’amidon chargée en bétaïne, au moins une nanoparticule d’amidon chargée en vitamine C, et au moins une nanoparticule d’amidon chargée en vitamine B 12.

13. Utilisation d’une composition telle que définie selon la revendication 12, pour nourrir du zooplancton, de préférence une proie vivante choisie parmi les rotifères, les artémias, et les copépodes.

14. Procédé pour enrichir la valeur nutritive du zooplancton, de préférence une proie vivante choisie parmi les rotifères, les artémias, et les copépodes, comprenant l’application d’au moins une nanoparticule d’amidon chargée d’au moins une molécule active d’intérêt telle que définie selon l’une quelconque des revendications 4 à 7 ou d’une composition telle que définie selon l’une quelconque des revendications 8 à 12.

Description:
UTILISATION DE NANOPARTICULES D’AMIDON CHARGEES EN MOLECULES

ACTIVES POUR L’AQUACULTURE

OBJET DE L’INVENTION

La présente invention concerne l’utilisation de nanoparticules d’amidon chargées en molécules actives pour nourrir du zooplancton destiné à être utilisé en aquaculture.

ARRIERE-PLAN DE L’INVENTION

L’aquaculture correspond à la culture d'organismes aquatiques, tels que les poissons, les crustacés, les mollusques, et les plantes aquatiques. Elle peut être pratiquée dans l’eau douce ou l'eau salée dans des conditions contrôlées. L'aquaculture représente une solution alternative à la surpêche et à la disparition de certains organismes aquatiques recherchés en raison des besoins croissants en produits de la mer. En 2008, elle fournissait 76.4 % des poissons d'eau douce consommés dans le monde, 64.1 % des mollusques, 46.4 % des crustacés et seulement 2.6 % des poissons d'eau de mer. L’aquaculture représente aussi une solution pour repeupler les rivières ou les étangs dont les espèces ont disparu, notamment à cause de la surexploitation. En 2016, la production mondiale issue de l’aquaculture (selon FAO) a atteint 110 millions de tonnes et dépasse ainsi la production mondiale de la pêche.

Toutefois, il existe de nombreux inconvénients liés à l’aquaculture. Au niveau local, par exemple, l'aquaculture traditionnelle (ou les poissons sont cultivés en cages ou en bassins sur le littoral) peut, dans certains cas, causer plus de dégâts sur l'environnement que la pêche sauvage. Les problèmes locaux sont souvent relatifs au traitement des déchets et aux effets secondaires des antibiotiques utilisés. L’aquaculture peut aussi contribuer à la prolifération d’espèces envahissantes susceptibles d’endommager la faune, comme c’est le cas pour la perche du Nil ou bien les espèces qui s’échappent des élevages. Les déchets issus de l’aquaculture et produits par les poissons sont organiques et composés d'éléments nutritifs nécessaires à toutes les composantes de la chaîne alimentaire aquatique mais leurs apports en excès au fond de l'océan peuvent endommager, voire éliminer la vie benthique. Ils peuvent aussi diminuer les niveaux d’oxygène dissous dans l’eau et affecter la faune sauvage. L’aquaculture nécessite en outre des quantités importantes d’éléments nutritifs pour l’élevage des espèces aquatiques. Par exemple, l'élevage du saumon demande une grande quantité de poisson sauvage utilisé pour le fourrage (c’est-à-dire la nourriture pour poissons d’élevage). En principe, les poissons ne peuvent ni produire les omega-3 ni les acides gras dont leur corps a besoin. Ils les accumulent soit en consommant des micro-algues (c’est le cas des harengs et des sardines), soit en consommant des poissons-proies (c’est le cas des saumons). Les poissons carnivores comme le saumon ont besoin d’importants apports nutritionnels en protéines provenant du poisson de fourrage. Le problème, c’est que pour produire 1 kg de saumon d’élevage, plusieurs kilogrammes de poisson de fourrage sont nécessaires. Alors que la demande en saumon continue d’augmenter, le besoin en poisson de fourrage grandit davantage. Ainsi, 75% de la pêche dans le monde a dépassé ou est en passe de dépasser son rendement maximal durable.

L'aquaculture pratiquée d’une façon non durable représente une menace grandissante pour les écosystèmes côtiers. En effet, près de 20% des forêts de mangroves ont été détruites depuis 1980, en partie à cause de l'élevage intensif de crevettes. Plus de 269.000 hectares de mangroves philippines ont été converties en fermes à crevettes. La plupart de ces fermes ont été abandonnées en une décennie en raison de l’accumulation de toxines et la perte de nutriments. De plus, l’analyse des coûts a démontré que ces fermes n’étaient pas viables économiquement.

Les fermes de saumon polluent les écosystèmes des littoraux où elles sont installées. En effet, une ferme de 200000 tonnes de saumon produit autant de déchets fécaux qu'une ville de 60.000 habitants. Ces déchets sont rejetés directement dans la mer et ne sont pas traités. Il existe aussi une accumulation de métaux lourds (en particulier du cuivre et du zinc) sur le benthos (le fond marin) à proximité des élevages de saumon. La pêche sauvage est en déclin au niveau mondial, car l’habitat des poissons en particulier dans les estuaires est dans un état critique. L’élevage de poissons, comme le saumon, ne résout pas le problème, car ils ont besoin de consommer des produits provenant d'autres poissons, comme la farine et l'huile de poisson.

Plusieurs analyses prospectives sur le développement du secteur de l’aquaculture ont souligné l’importance d’innover dans toutes les étapes du cycle de production aquacole. Ainsi la tendance actuelle favorise la création de fermes aquacoles sur terre basées sur les technologies de traitement de l’eau. Nous parlons souvent des systèmes RAS (Recirculating Aquaculture Systems) qui proposent des solutions innovantes dans le contrôle de la qualité de l’eau utilisée et son recyclage. Le deuxième verrou majeur de l’aquaculture concerne l’alimentation des poissons de toutes tailles. En effet, la tendance actuelle des programmes de recherche et R&D vise à tester de nouveaux aliments à base végétale en essayant de limiter au maximum dans la matrice alimentaire les farines et huiles de poissons. Toutefois, les poissons domestiqués par le passé (saumon, bar, daurade et mérou tropical) sont carnivores. Par conséquent, une réflexion sur le choix des espèces est nécessaire. Dans tous les cas, les premières phases du cycle d’élevage d’une espèce (classique ou nouvelle) après l’éclosion des œufs représentent un verrou majeur et un réel enjeu pour le développement technologique et l’innovation.

En effet, bien que l'aquaculture soit la culture alimentaire dont la croissance est Tune des plus fortes dans le monde (8,3% par an, SOFIA rapport de la FAO 2010), son développement reste limité compte tenu des difficultés à maîtriser le début du cycle de vie de nombreuses espèces de poissons. L'absence de nourriture appropriée est un frein majeur dans la production de larves de nombreuses espèces de poissons et très peu d’espèces de poissons peuvent être élevées sur un régime alimentaire artificiel sans nourriture vivante. Aujourd'hui, alors que la production de larves de poissons de haute qualité est essentielle pour l'aquaculture, le commerce des aquariums et à des fins de stockage, l'alimentation des larves gagne en importance dans le domaine de l'aquaculture. De plus, et en raison d'une diminution globale de l'offre en Artémia (proie vivante classique récoltée sous forme de cystes dans le milieu naturel) et de la diversification des espèces élevées, comme les poissons ornementaux avec de très petites larves, ou d'autres espèces avec de très petites ouvertures de la bouche, une alternative ou un complément à l’alimentation vivante pour les larves est essentiel.

Si la phase juvénile et adulte est très bien maîtrisée en aquaculture en utilisant une alimentation artificielle (granulés), l’élevage larvaire reste une problématique même pour une écloserie performante ne travaillant que sur une seule espèce. En effet, une forte mortalité au cours du cycle de vie du poisson est observée au cours du développement larvaire. Traditionnellement, les artémias et rotifères servent de nourriture vivante (proies vivantes) pour les poissons d’élevage en phase larvaire. Toutefois, ces espèces ne couvrent pas tous les besoins nutritionnels des poissons ; elles sont donc souvent enrichies de produits industriels artificiels parfois onéreux. De plus, les stocks naturels d’ artémia ne peuvent suffire à la demande actuelle de plus en plus croissante de T aquaculture. C’est pourquoi, les recherches aujourd’hui en aquaculture se concentrent vers une solution durable et respectueuse de l’environnement pour la production de proies vivantes couramment utilisées telles que les artémias et les rotifères. Toutefois, ces proies vivantes classiques, artémias et rotifères, sont pauvres d’un point de vue nutritionnel et nécessitent souvent un enrichissement à base d’éléments nutritifs encapsulés avant de les donner à manger aux larves de poissons. Ces produits d’enrichissement sont notamment des émulsions et/ou des poudres qui sont peu solubles dans l’eau. Il est ainsi souvent observé des pertes significatives des produits d’enrichissement de proies vivantes qui en outre altèrent rapidement la qualité de l’eau. Ainsi, l’élargissement à d’autres espèces de proies vivantes représente un axe de recherche supplémentaire à développer. C’est le cas, par exemple, des copépodes qui représentent une solution idéale à une nourriture alternative pour les larves de poissons. Les copépodes répondent à leurs besoins nutritionnels et constituent une grande part de leur alimentation dans leur environnement naturel.

Devant cette problématique, certains scientifiques se sont notamment intéressés aux nanoparticules pour vectoriser ou administrer des molécules actives d’intérêt chez les proies vivantes. Par exemple, Jimenez-Fernandes et al. (Aquaculture 432 (2014) 426-433) décrivent des nanoparticules de chitosan chargées en vitamine C administrées directement à des larves de sole du Sénégal ( Solea senegalensis ), mais aussi à des rotifères ( Brachionus plicatilis).

Toutefois, il subsiste un réel besoin de développer de nouveaux moyens pour produire en quantité suffisante à grande échelle et en qualité du zooplancton destiné à être utilisé en aquaculture tout en réduisant au maximum l’impact environnemental.

RESUME DE L’INVENTION

Dans ce contexte, les inventeurs ont démontré, de manière surprenante, que des nanoparticules d’amidon chargées ou fonctionnalisées par au moins une molécule active d’intérêt permettaient d’augmenter plus rapidement la taille, la densité du zooplancton, et plus particulièrement, chez des proies vivantes telles que les rotifères, les artémias, et les copépodes, par rapport à des nanoparticules d’amidon non chargées et des nanoparticules de chitosan ou d’alginate chargées ou non chargées. Les inventeurs ont également démontré un effet de ces nanoparticules d’amidon chargées sur le taux de ponte et le taux d’éclosion des œufs de ces proies vivantes, en particulier chez les copépodes. La présente invention concerne donc utilisation d’une nanoparticule d’amidon chargée d’au moins une molécule active d’intérêt pour nourrir du zooplancton. Plus particulièrement, l’invention porte sur l’utilisation d’une nanoparticule d’amidon chargée d’au moins une molécule active d’intérêt pour augmenter la taille et/ou la densité et/ou le taux de ponte du zooplancton, et/ou le taux d’éclosion des œufs du zooplancton. De préférence, le zooplancton est une proie vivante choisie parmi les rotifères, les artémias, et les copépodes.

Selon un mode particulier, la nanoparticule d’amidon chargée d’au moins une molécule active d’intérêt a une taille moyenne comprise entre 10 et 500 nm, entre 20 et 450 nm, entre 40 et 400 nm, de préférence d’environ 40, 80, 100, 200, ou 400 nm, et d’une manière encore plus préférée d’environ 80 nm.

Selon un autre mode particulier, la proportion en poids de ladite au moins une molécule active d’intérêt est comprise entre 0,01 % et 10 %, entre 0,01 % et 5 %, de préférence entre 0,1 % et 4 %, et d’une manière encore plus préférée entre 1 et 3 % par rapport au poids total de la nanoparticule d’amidon.

Selon un autre mode particulier, laquelle ladite au moins une molécule active d’intérêt est choisie parmi les vitamines, les caroténoïdes, les antibiotiques, les hormones, les minéraux, les acides aminés, les peptides, les protéines, les acides gras, et leurs dérivés. De préférence, la molécule active d’intérêt est choisie parmi la vitamine B 12, la vitamine C, la bétaïne, le sélénium, la tétracycline, le triméthoprime, l’acide oxolinique, la taurine, la méthionine, le glutathion, l’iode, l’œstrogène et l’estradiol.

Un autre objet de l’invention porte sur une utilisation d’une composition comprenant au moins une nanoparticule d’amidon chargée d’au moins une molécule active d’intérêt telle que décrite dans la présente demande et, optionnellement, un agent nutritif, en particulier une micro-algue, pour nourrir du zooplancton, de préférence une proie vivante choisie parmi les rotifères, les artémias, et les copépodes. Selon un mode particulier, la composition est sous forme de poudre ou de solution. Selon un autre mode particulier, la composition comprend une quantité de nanoparticules d’amidon chargées d’au moins une molécule active d’intérêt comprise entre 0,1 et 300 mg/L, entre 1 et 200 mg/L, entre 10 et 150 mg/L, entre 10 et 100 mg/L, de préférence entre 10 et 80 mg/L, et de manière encore plus préférée entre 20 et 60 mg/L. Selon un autre mode particulier, la composition est appliquée quotidiennement. Un objet supplémentaire de l’invention concerne une composition comprenant au moins une nanoparticule d’amidon chargée en bétaïne, au moins une nanoparticule d’amidon chargée en vitamine C, et au moins une nanoparticule d’amidon chargée en vitamine B 12. Un autre objet concerne aussi l’utilisation d’une telle composition pour nourrir du zooplancton, de préférence une proie vivante choisie parmi les rotifères, les artémias, et les copépodes.

Un autre objet supplémentaire de l’invention concerne un procédé pour enrichir la valeur nutritive du zooplancton, de préférence une proie vivante choisie parmi les rotifères, les artémias, et les copépodes, comprenant l’application d’au moins une nanoparticule d’amidon chargée d’au moins une molécule active d’intérêt ou d’une composition telles que définies dans la présente demande.

BREVE DESCRIPTION DES FIGURES

Figure 1 :

Figure IA : Evolution de la taille des artémias en fonction du type de nourriture.

Figure IB : Evolution de la taille des artémias en fonction du type de nourriture.

Figure IC : Evolution de la taille des artémias en fonction du type de nourriture.

Figure 2 :

Figure 2A : Suivi journalier des densités de rotifères en fonction du type de nourriture.

Figure 2B : Suivi journalier des densités de rotifères en fonction du type de nourriture.

Figure 2C : Suivi journalier des densités de rotifères en fonction du type de nourriture.

Figure 3 : Suivi journalier du nombre d’œufs pondus par des femelles de copépodes en fonction du type de nourriture.

Figure 4 : Taux d’éclosion à un mois d’œufs pondus par des femelles de copépodes en fonction du type de nourriture.

Figure 5 : Suivi journalier de la croissance en longueur et largeur des copépodes en fonction du type de nourriture.

Figure 6 : Survie des œufs pondus par des femelles de copépodes à J13.

DESCRIPTION DETAILLEE

Tel qu’illustré dans les exemples ci-après, les inventeurs ont démontré que des nanoparticules d’amidon chargées ou fonctionnalisées par au moins une molécule active d’intérêt permettaient d’augmenter plus rapidement la taille, la densité, le taux de ponte, et le taux d’éclosion du zooplancton, et plus particulièrement chez des proies vivantes telles que les rotifères, les artémias, et les copépodes. Ces nanoparticules d’amidon, chargées d’au moins une molécule active d’intérêt, peuvent ainsi agir comme vecteurs de produits nutritifs pour améliorer le profil nutritif et les performances du zooplancton en aquaculture. En outre, ces nanoparticules d’amidon chargées sont stables dans l’eau salée (eau de mer). Elles sont utilisées dans des quantités relativement faibles, limitant ainsi l’impact sur l’environnement et le développement de résistance bactérienne. Elles sont également non toxiques pour le zooplancton. Elles sont applicables à diverses espèces de zooplancton telles que les artémias, les rotifères, et les copépodes, quel que soit la taille de leur bouche car le diamètre de ces nanoparticules peut être facilement contrôlé. Elles offrent une multitude de possibilités de traitement du fait qu’elles puissent être chargées ou fonctionnalisées par une ou plusieurs molécules actives d’intérêt. Enfin, leur coût de fabrication est relativement faible car elles sont obtenues à partir d’amidon qui est un biopolymère très disponible sur le marché, et leur procédé de fabrication par simple broyage est adapté à une échelle industrielle.

La présente invention porte donc sur une utilisation d’une nanoparticule d’amidon chargée d’au moins une molécule active d’intérêt pour nourrir du zooplancton, de préférence une proie vivante choisie parmi les rotifères, les artémias, et les copépodes. L’invention porte aussi sur un procédé ou une méthode pour nourrir du zooplancton, de préférence une proie vivante choisie parmi les rotifères, les artémias, et les copépodes, comprenant l’application d’au moins une nanoparticule d’amidon chargée d’au moins une molécule active d’intérêt sur ladite proie vivante.

L’invention concerne aussi une utilisation d’une nanoparticule d’amidon chargée d’au moins une molécule active d’intérêt pour enrichir la valeur nutritive du zooplancton, de préférence une proie vivante choisie parmi les rotifères, les artémias, et les copépodes. L’invention concerne également un procédé ou une méthode pour enrichir la valeur nutritive du zooplancton, de préférence une proie vivante choisie parmi les rotifères, les artémias, et les copépodes, comprenant l’application d’au moins une nanoparticule d’amidon chargée d’au moins une molécule active d’intérêt ou d’une composition comprenant au moins une nanoparticule d’amidon chargée telle que décrite dans la présente demande. Selon un mode particulier, l’invention concerne une utilisation d’une nanoparticule d’amidon chargée d’au moins une molécule active d’intérêt pour augmenter la taille et/ou la densité et/ou le taux de ponte du zooplancton, de préférence une proie vivante choisie parmi les rotifères, les artémias, et les copépodes, et/ou le taux d’éclosion des œufs du zooplancton. L’invention concerne aussi un procédé ou une méthode pour augmenter la taille et/ou la densité et/ou le taux de ponte du zooplancton, de préférence une proie vivante choisie parmi les rotifères, les artémias, et les copépodes, comprenant l’application d’au moins une nanoparticule d’amidon chargée d’au moins une molécule active d’intérêt ou d’une composition comprenant au moins une particule d’amidon chargée telle que décrite dans la présente demande.

L’amidon est un polyoside, composé de chaînes de molécules de D-glucose, représentant la source principale d’énergie de tous les êtres vivants. L’amidon se trouve dans les graines de céréales (maïs, blé), légumineuses (pois), les racines, les tubercules et rhizomes (pomme de terre, patate douce, manioc), et les fruits (banane). Sa formule chimique brute est [C x (H 2 0) y )] n .

L’amidon est un mélange de deux homopolymères qui diffèrent par leur taux de branchement et leur degré de polymérisation : l’amylose, légèrement ramifiée avec de courtes branches, constituée de 600 à 1 000 unités de D-glucose, conduisant à une masse molaire de 10 4 à 10 6 daltons, et l’amylopectine, avec de longues ramifications, comportant de 10000 à 100000 molécules de D-glucose, conduisant à une masse molaire de 10 6 à 10 8 daltons.

Les nanoparticules (NPs) d’amidon, chargées d’au moins une molécule active d’intérêt, utilisées dans l’invention, peuvent être préparées par toute technique connue de l’homme du métier, et en particulier, par la technique de « broyage planétaire ». Cette technique présente l’avantage de préparer des NPs d’amidon chargées en molécule active d’intérêt en grosse quantité et est donc bien adaptée à une échelle industrielle. En outre, cette technique permet également de préparer des NPs de différentes tailles en fonction des cycles de broyage utilisés. La taille des NPs d’amidon chargées peut ainsi être adaptée à l’espèce de proie vivante visée. Des exemples de cycles de broyage sont illustrés dans le tableau 1 de l’exemple 1 ci-après.

Selon un mode particulier, les NPs d’amidon, chargées d’au moins une molécule active d’intérêt, ont une taille moyenne comprise entre 10 et 500 nm, entre 20 et 450 nm, entre 40 et 400 nm, de préférence d’environ 40, 80, 100, 200, ou 400 nm, et d’une manière encore plus préférée d’environ 80 nm.

Selon l’invention, les NPs d’amidon sont chargées d’au moins une molécule active d’intérêt. Par « chargées », on entend que les NPs d’amidon comprennent au moins une molécule active d’intérêt. On entend aussi que les NPs d’amidon sont fonctionnalisées par au moins une molécule active d’intérêt. Par « au moins une molécule active d’intérêt », on entend que les NPs d’amidon sont nécessairement chargées. Elles peuvent donc comprendre une multitude de combinaisons de molécules actives d’intérêt différentes dont le nombre est d’au moins, de préférence compris entre 1 et 10, entre 1 et 5, et d’une manière encore plus préférée entre 1 et 3. Selon un mode préféré, les NPs d’amidon sont chargées, d’une, deux, ou trois molécules actives d’intérêt différentes.

Il est bien entendu que la quantité en poids de molécule(s) actives(s) d’intérêt par particule peut être ajustée en fonction de la quantité de molécule(s) actives(s) d’intérêt souhaitant être véhiculée, donnée ou administrée dans la proie vivante. Ainsi, si l’on souhaite véhiculer une quantité relativement importante dans la proie vivante, la NP d’amidon sera d’autant plus chargée en molécule(s) active(s) d’intérêt.

Selon un mode particulier, la NP d’amidon, est chargée d’au moins une molécule active d’intérêt, dans laquelle la proportion en poids de la molécule active d’intérêt est comprise entre 0,01 % et 10 %, entre 0,01 % et 5 %, de préférence entre 0,1 % et 4 %, et d’une manière encore plus préférée entre 1 et 3 % par rapport au poids total de la nanoparticule d’amidon. Selon un mode encore plus préféré, la NP d’amidon est chargée d’au moins une molécule active d’intérêt à 1 % en poids, par rapport au poids total de la NP d’amidon. Selon un autre mode encore plus préféré, la NP d’amidon est chargée d’au moins une molécule active d’intérêt à 3 % en poids, par rapport au poids total de la NP d’amidon.

Par « molécule active d’intérêt », on entend toute molécule active biologiquement et pouvant être utilisée en aquaculture, et plus particulièrement toute molécule ayant un effet sur le zooplancton, en particulier chez les proies vivantes telles que les artémias, les rotifères, et les copépodes. Comme « molécule active d’intérêt », on peut citer, par exemple et sans limitation, les vitamines, les caroténoïdes, les antibiotiques, les hormones, les minéraux, les acides aminés, les peptides, les protéines, les acides gras, et leurs dérivés. Les vitamines sont des substances organiques nécessaires au métabolisme d’un organisme vivant. Elles peuvent aussi être synthétisées en quantité suffisante par l’organisme vivant lui- même. Un apport insuffisant ou une absence de vitamine peut être la cause de nombreuses maladies. Au contraire, un apport excessif de vitamines peut être toxique pour l’organisme vivant. Les vitamines sont généralement séparées en deux groupes : les vitamines hydrosolubles et les vitamines liposolubles. Parmi les vitamines hydrosolubles, on peut citer la vitamine B1 (thiamine), la vitamine B 2 (riboflavine), la vitamine B 3 (nicotinamide, niacine), la vitamine B 5 (acide pantothénique), la vitamine B6 (pyridoxine), la vitamine B8 (biotine), la vitamine B9 (acide folique), la vitamine B 12 (ou cobalamine), et la vitamine C (acide ascorbique). Parmi les vitamines liposolubles, on peut citer la vitamine A (rétinol), la vitamine D (calciférol), la vitamine E (tocophérol), la vitamine Kl (phylloquinone), et la vitamine K2 (ménaquinone).

Les antibiotiques sont des substances naturelles ou synthétiques qui détruisent ou bloquent la croissance des bactéries. Il existe plusieurs classes d’antibiotiques incluant notamment, les aminosides, les béta-lactamines, les cyclines, les glycopeptides, les macrolides, les nitrofuranes et nitroimidazoles, les quinolones, les phénicolés, les polypeptides, et les sulfamides. Sans limitation, on peut citer comme exemples d’antibiotiques, la pénicilline, les céphalosporines, la tétracycline, l’oxytétracycline, la gentamicine, le triméthoprime, l’acide oxolinique, la fluméquine, la rifampicine, le chloramphénicol et le florfénicol.

Les hormones sont des substances chimiques biologiquement actives synthétisées par des cellules glandulaires. Les hormones transmettent un message sous forme chimique et jouent ainsi un rôle de messager dans l’organisme. Sans limitation, on peut citer comme exemples d’hormones et dérivés l’œstrogène et l’estradiol et aussi les hormones de la thyroïde telle que la thyroxine.

Des exemples de minéraux sont, sans limitation, l’iode, le sélénium, le phosphore, le calcium, le magnésium, le fer, le cuivre, le zinc, le manganèse, le sodium, et le potassium. Dans le cadre de la présente invention le terme « minéraux » inclut également les composés inorganiques, tels que l’iodure de potassium (Kl), l’iodate de potassium (KIO3), l’iodure de sodium, et le sélénite de sodium.

Des exemples d’acides aminés ou dérivés d’acides aminés sont, sans limitation, la méthionine, la taurine, la bétaïne, l’acide aspartique, la thréonine, la sérine, l’acide glutamique, la proline, la cystéine, la glycine, l’alanine, la valine, la lysine, l’histidine, la leucine, la tyrosine, la phénylalanine, et l’isoleucine.

Des exemples de peptides ou dérivés peptidiques sont, sans limitation, le glutathion, l’épinicidine, la cristine, et la bacitracine.

Les acides gras sont des acides carboxyliques à chaînes aliphatiques. Ils constituent des sources importantes d’énergie métabolique. Des exemples d’acides gras sont, par exemple, l’acide butyrique, l’acide valérique, l’acide caprylique, l’acide caprique, l’acide laurique, l’acide myristique, l’acide palmitique, l’acide stéarique, l’acide arachidique, l’acide béhénique, l’acide lignocérique, l’acide myristoléique, l’acide palmitoléique, l’acide oléique, l’acide vaccénique, l’acide linoléique, l’acide alpha-linoléique, l’acide arachidonique, l’acide eicosapentaénoïque, l’acide érucique, et l’acide docosahexaénoïque.

Selon un mode particulier de l’invention, ladite au moins une molécule active d’intérêt est choisie parmi les vitamines, les caroténoïdes, les antibiotiques, les hormones, les minéraux, les acides aminés, les peptides, les protéines, les acides gras, et leurs dérivés. Selon un mode préféré de l’invention, ladite au moins une molécule active d’intérêt est choisie parmi la vitamine B 12, la vitamine C, la bétaïne, le sélénium, la tétracycline, le triméthoprime, l’acide oxolinique, la taurine, la méthionine, le glutathion, l’iode, l’oestrogène et l’estradiol.

Composition

Un objet de l’invention porte sur l’utilisation d’une composition comprenant au moins une nanoparticule d’amidon chargée d’au moins une molécule active d’intérêt telle que définie dans la présente demande et, optionnellement, un agent nutritif, en particulier une micro-algue, pour nourrir du zooplancton, de préférence une proie vivante choisie parmi les rotifères, les artémias, et les copépodes.

La composition peut ainsi comprendre une ou plusieurs NPs d’amidon chargées d’au moins une molécule active d’intérêt. Lorsque la composition comprend un nombre d’au moins deux NPs d’amidon chargées d’au moins une molécule active d’intérêt, on peut dire que la composition comprend un ensemble de NPs d’amidon chargées. Selon un mode particulier de l’invention, la composition comprend un ensemble de nanoparticules d’amidon chargées d’une molécule active d’intérêt. Selon ce mode, l’ensemble de NPs d’amidon est chargé de la même molécule active d’intérêt. Des exemples de compositions selon ce mode particulier sont, par exemple, une composition comprenant un ensemble de NPs d’amidon chargées en vitamine B 12, une composition comprenant un ensemble de NPs d’amidon chargées en bétaïne, une composition comprenant un ensemble de NPs d’amidon chargées en vitamine C.

Selon un autre mode particulier de l’invention, la composition comprend un ensemble de nanoparticules d’amidon, chacune étant chargée d’au moins deux molécules actives d’intérêt. Selon ce mode, l’ensemble de NPs d’amidon est chargé d’au moins deux molécules actives différentes. Des exemples de compositions selon ce mode particulier sont, par exemple, une composition comprenant un ensemble de NPs d’amidon chargées à la fois en vitamine B 12 et en bétaïne, une composition comprenant un ensemble de NPs d’amidon chargées à la fois en vitamine C et en bétaïne, et une composition comprenant un ensemble de NPs d’amidon chargées à la fois en vitamine B 12, en vitamine C, et en bétaïne.

Selon un autre mode particulier, la composition comprend plusieurs ensembles de nanoparticules tels que décrits ci-dessus. De préférence, la composition comprend entre 2 et 10, 2 et 9, 2 et 8, 2 et 7, 2 et 6, 2 et 5, 2 et 4, et d’une manière encore plus préférée 2, 3, ou 4 ensembles de nanoparticules d’amidon chargées. Des exemples de compositions selon ce mode particulier sont, par exemple, une composition comprenant un ensemble de NPs d’amidon chargées en vitamine B 12 et un ensemble de NPs d’amidon chargées en bétaïne ; une composition comprenant un ensemble de NPs d’amidon chargées en vitamine C et un ensemble de NPs d’amidon chargées en bétaïne ; une composition comprenant un ensemble de NPs d’amidon chargées en vitamine B 12, un ensemble de NPs d’amidon chargées en vitamine C, et un ensemble de NPs d’amidon chargées en bétaïne ; une composition comprenant un ensemble de NPs d’amidon chargées à la fois en vitamine B 12 et en vitamine C et un ensemble de NPs d’amidon chargées en bétaïne ; une composition comprenant un ensemble de NPs d’amidon chargées à la fois en bétaïne et en vitamine C et un ensemble de NPs d’amidon chargées en vitamine B 12 ; et une composition comprenant un ensemble de NPs d’amidon chargées à la fois en vitamine B 12 et en bétaïne et un ensemble de NPs d’amidon chargées en en vitamine C. Bien entendu, les molécules actives d’intérêt utilisées dans les exemples de composition ci- dessus sont interchangeables et peuvent être remplacées par n’importe quelle molécule active d’intérêt telle que définie dans la présente demande.

Un autre objet de l’invention porte sur une composition comprenant un ensemble de nanoparticules d’amidon chargées d’au moins deux molécules actives d’intérêt tel que décrit dans la présente demande, incluant les modes de réalisation particuliers et préférés.

Un autre objet de l’invention porte sur une composition comprenant au moins deux ensembles de nanoparticules d’amidon chargées d’au moins une molécule active d’intérêt tel que décrit dans la présente demande, incluant les modes de réalisation particuliers et préférés.

Une composition préférée selon l’invention comprend au moins une nanoparticule d’amidon chargée en bétaïne, au moins une nanoparticule d’amidon chargée en vitamine C, et au moins une nanoparticule d’amidon chargée en vitamine B 12. Cette composition préférée comprend donc un ensemble de nanoparticules d’amidon chargées en bétaïne, un ensemble de nanoparticules d’amidon chargées en vitamine C, et un ensemble de nanoparticules d’amidon chargées en vitamine B 12.

Selon un mode particulier, la composition telle que définie dans la présente demande comprend en outre un agent nutritif, en particulier une micro-algue. Des exemples de micro-algues sont T-isochrisis (T-iso) et Rhodomonas (Rhodo).

Selon un autre mode particulier, la composition est sous forme de poudre ou de solution. De préférence, la composition est sous forme de solution.

Selon un autre mode particulier, la composition comprend une quantité de nanoparticules d’amidon chargées d’au moins une molécule active d’intérêt comprise entre 0,1 et 300 mg/L, entre 1 et 200 mg/L, entre 10 et 150 mg/L, entre 10 et 100 mg/L, de préférence entre 10 et 80 mg/L, et de manière encore plus préférée entre 20 et 60 mg/L. Dans le contexte de l’invention, la quantité de nanoparticules d’amidon chargées d’au moins une molécule active d’intérêt est exprimée en poids/volume. Plus spécifiquement, elle est exprimée en mg/L d’eau. De préférence, l’eau est de l’eau salée, telle que de l’eau de mer. Une composition encore plus préférée selon l’invention comprend environ 30 mg/L de NPs d’amidon chargées en bétaïne à 3%, environ 5 mg/L de NPs d’amidon chargées en vitamine B 12 à 3 %, et environ 5 mg/L de NPs d’amidon chargées en vitamine C à 3 %.

Une autre composition encore plus préférée selon l’invention comprend environ 200 mg/L de NPs d’amidon chargées en bétaïne à 3%, environ 200 mg/L de NPs d’amidon chargées en vitamine B 12 à 3 %, environ 200 mg/L de NPs d’amidon chargées en vitamine C à 3 %, et environ 200 mg/L de NPs d’amidon chargées en sélénium à 3%.

Une autre composition encore plus préférée selon l’invention comprend environ 30 mg/L de NPs d’amidon chargées en bétaïne à 1% ou 3%, environ 5 mg/L de NPs d’amidon chargées en vitamine B 12 à 1 % ou 3%, et environ 5 mg/L de NPs d’amidon chargées en vitamine C à 1 % ou 3%.

Un objet préféré concerne donc une telle composition préférée pour nourrir du zooplancton, de préférence une proie vivante choisie parmi les rotifères, les artémias, et les copépodes.

Proies vivantes

Selon l’invention, les NPs d’amidon chargées d’au moins une molécule active d’intérêt et les compositions telles que décrites dans la présente demande sont utilisées pour nourrir du zooplancton, et en particulier des proies vivantes utilisées en aquaculture, telles que les rotifères, les artémias, et les copépodes.

Les proies vivantes utilisées en aquaculture sont également appelées « zooplancton ». Le zooplancton regroupe la partie animale du plancton et représente les organismes vivants dans la colonne d’eau dans tous les milieux aquatiques (eau douce, eau saumâtre et eau marine) avec des capacités de locomotion limitées. Le zooplancton est classifié en fonction de la taille des organismes. On peut notamment citer la classe du microzooplancton (<200pm) comprenant les rotifères, les premiers stades larvaires (nauplii) de copépodes les protistes, les ciliés et les foraminifères planctoniques. On peut également citer la classe du mesozooplancton comprenant les stades juvéniles et adultes de copépodes, les crustacés libres, les copépodes qui vivent dans tous les milieux aquatiques et les cladocères (ex. Daphnies) se trouvant essentiellement en milieu dulçaquicole. Le zooplancton comprend aussi d’autres classes d’organismes de grandes tailles (macro- et megazooplancton) tels que certains crustacés (le krill et les mysidacés) et le zooplancton gélatineux comprenant les mollusques, les cnidaires (ex. méduses), et les cténophores. Enfin, la plupart des stades larvaires d’animaux aquatiques se développent en forme planctonique et font partie du méroplancton par opposition à l’holoplancton qui regroupe tous les organismes dont la totalité du cycle de vie se déroule dans la colonne d’eau.

Les artémias (Artémia salina) sont des crustacés vivant dans des lacs salés ou des marais salants (souvent en Amérique latine et en Californie). Une caractéristique spécifique des artémias est qu’ils nagent sur le dos. Ils peuvent vivre dans l’eau à des salinités très élevées (jusqu’à environ 300g/L). Leur taille adulte est en moyenne de 8 à 10 mm mais elle peut atteindre 15 mm en fonction de leur environnement. Leur corps de forme allongée se divise en 20 segments et comporte 20 paires « pattes », ou appendices en forme de feuilles qui oscillent à un rythme régulier. Quand l’environnement des artémias n’est pas favorable à leur développement, les femelles peuvent produire des œufs de dormance (forme de diapause) appelés cystes. Ces cystes peuvent être conservés longtemps sans accès à l’eau. Ils peuvent ensuite être réhydratés pour donner naissance aux nauplii d’ artémias. Les nauplii atteignent l’âge adulte après 2 semaines à une température de 25°C. Les artémias représentent la proie vivante la plus utilisée en aquariophilie et en aquaculture.

Un aspect particulier de l’invention porte sur une utilisation d’une nanoparticule d’amidon chargée d’au moins une molécule active d’intérêt ou une composition comprenant au moins une telle nanoparticule d’amidon pour nourrir les artémias. Un aspect préféré de l’invention porte sur une utilisation d’une nanoparticule d’amidon chargée d’au moins une molécule active d’intérêt ou une composition comprenant au moins une telle nanoparticule d’amidon pour augmenter la taille et/ou la densité et/ou le taux de ponte des artémias, et/ou le taux d’éclosion des œufs desdits artémias. Un aspect encore plus préféré de l’invention porte sur une utilisation d’une nanoparticule d’amidon chargée d’au moins une molécule active d’intérêt ou une composition comprenant au moins une telle nanoparticule d’amidon pour augmenter la taille des artémias.

Les rotifères sont des planctons métazoaires qui représentent une bonne part du micro zooplancton (zooplancton de petite taille). Ils peuplent différents biotopes allant des milieux dulçaquicoles (eaux douces) aux milieux hyper salés (lacs salés, etc...). Toutefois, selon les milieux, ils ne sont pas également représentés : très communs en eaux douces et saumâtres, ils sont moins abondants en mer. L’espèce Brachionus plicatilis est un rotifère euryhalin qui appartient à l’ordre des monogonontes dont la reproduction est essentiellement parthénogénétique. Des phases de reproductions sexuées peuvent être déclenchées par des stimuli exogènes (température, salinité, etc..) et/ou endogènes (vieillissement, etc...). Le mâle du Brachionus, et des monogonontes en général, est nain et possède un gros testicule qui occupe la majeure partie du volume corporel. Dans le milieu naturel, ces rotifères traversent les périodes défavorables sous la forme d’œufs de durée (forme de diapause) issue de la reproduction sexuée : c’est un état de vie ralenti. Au moment où les conditions deviennent compatibles avec la vie de ces animaux, les œufs vont éclore et les rotifères femelles vont se reproduire de façon parthénogénétique pour coloniser le milieu. En élevage, les paramètres physico-chimiques sont contrôlés et régulés afin de favoriser la parthénogenèse. C’est un mode de reproduction utilisé par certains organismes métazoaires. Les femelles vont produire des œufs à 2n chromosomes qui vont se développer sans la fécondation par un gamète mâle. La parthénogenèse est équivalente à un clonage. Les individus issus d’une même femelle sont tous des femelles identiques entre elles et avec leur mère. En aquaculture (surtout en écloserie) et en aquariologie (les sections dédiées aux proies vivantes dans les aquariums), les rotifères sont couramment utilisés pour nourrir les larves de poissons pendant les premiers stades de développement.

Un aspect particulier de l’invention porte sur une utilisation d’une nanoparticule d’amidon chargée d’au moins une molécule active d’intérêt ou une composition comprenant au moins une telle nanoparticule d’amidon pour nourrir les rotifères. Un aspect préféré de l’invention porte sur une utilisation d’une nanoparticule d’amidon chargée d’au moins une molécule active d’intérêt ou une composition comprenant au moins une telle nanoparticule d’amidon pour augmenter la taille et/ou la densité et/ou le taux de ponte des rotifères, et/ou le taux d’éclosion des œufs desdits rotifères. Un aspect encore plus préféré de l’invention porte sur une utilisation d’une nanoparticule d’amidon chargée d’au moins une molécule active d’intérêt ou une composition comprenant au moins une telle nanoparticule d’amidon pour augmenter la densité des rotifères.

Le terme copépode provient de deux racines Grecques : kope qui signifie rame et pados qui signifie pied. Il existe plus de 20000 espèces de copépodes qui, pour la majorité d'entre elles, sont marines. Ces petits crustacés représentent l'une des principales composantes du zooplancton (60%) et jouent un rôle clef dans les réseaux trophiques des milieux aquatiques. Ils sont des consommateurs primaires et secondaires et servent aussi de nourriture à de nombreux invertébrés et larves de poissons. Leur mode de vie est très variable selon l'espèce, ils peuvent être planctoniques, épi-benthiques et benthiques ou bien vivre accrochés à un hôte tel un parasite. Le régime alimentaire dépend aussi de l'espèce : herbivore, omnivore et carnivore. La reproduction se fait par accouplement car les gamètes ne sont pas expulsés dans le milieu. La reproduction est journalière mais elle est influencée par des facteurs externes comme la température, la quantité de nourriture, la salinité ou encore la photopériode. Lors d'un accouplement, le mâle place un spermatophore sur l'urosome de la femelle. Celui-ci est conservé par la femelle pour féconder les œufs et incuber dans un sac ovigère ou relâcher directement dans le milieu. La fécondité est importante et correspond environ à entre 20 et 40 œufs par jour comme par exemple chez l’espèce Acartia tonsa. Lorsque les conditions du milieu deviennent défavorables, des œufs de diapause peuvent être remarqués. Ceux-ci attendront une période plus propice pour éclore. Le cycle de vie est complexe car il est constitué de nombreuses mues et métamorphoses avant d'atteindre le stade adulte reproducteur. Cependant, malgré leur complexité ces organismes sont dotés d'une grande capacité d'adaptation.

Un aspect particulier de l’invention porte sur une utilisation d’une nanoparticule d’amidon chargée d’au moins une molécule active d’intérêt ou une composition comprenant au moins une telle nanoparticule d’amidon pour nourrir les copépodes. Un aspect préféré de l’invention porte sur une utilisation d’une nanoparticule d’amidon chargée d’au moins une molécule active d’intérêt ou une composition comprenant au moins une telle nanoparticule d’amidon pour augmenter la taille et/ou le taux de ponte des copépodes, et/ou le taux d’éclosion des œufs desdits copépodes.

De préférence, les NPs d’amidon chargées d’au moins une molécule active d’intérêt ou les compositions comprenant de telles NPs telles que décrites dans la présente demande sont appliquées quotidiennement (une fois par jour) sur le zooplancton, de préférence une proie vivante choisie parmi les rotifères, les artémias, et les copépodes.

Un objet de l’invention est donc aussi une utilisation quotidienne d’au moins une nanoparticule d’amidon chargée d’au moins une molécule active d’intérêt ou d’une composition les comprenant, pour nourrir du zooplancton, de préférence une proie vivante choisie parmi les rotifères, les artémias, et les copépodes. Un autre objet de l’invention porte également sur une utilisation d’une composition comprenant une dose de nanoparticules d’amidon telles que décrites dans la présente demande comprise entre 0,1 et 300 mg/L/jour, entre 1 et 200 mg/L/jour, entre 10 et 150 mg/L/jour, entre 10 et 100 mg/L/jour, de préférence entre 10 et 80 mg/L/jour, et de manière encore plus préférée entre 20 et 60 mg/L/jour.

Un autre objet de l’invention porte aussi sur un procédé ou une méthode pour nourrir du zooplancton, de préférence une proie vivante choisie parmi les rotifères, les artémias, et les copépodes, comprenant l’application quotidienne d’au moins une nanoparticule d’amidon chargée d’au moins une molécule active d’intérêt ou d’une composition les comprenant sur ladite proie vivante.

Un autre objet de l’invention porte également sur un procédé ou une méthode pour nourrir du zooplancton, de préférence une proie vivante choisie parmi les rotifères, les artémias, et les copépodes, comprenant l’application d’une composition comprenant une dose de nanoparticules d’amidon telles que décrites dans la présente demande comprise entre 0,1 et 300 mg/L/jour, entre 1 et 200 mg/L/jour, entre 10 et 150 mg/L/jour, entre 10 et 100 mg/L/jour, de préférence entre 10 et 80 mg/L/jour, et de manière encore plus préférée entre 20 et 60 mg/L/jour.

L’invention sera mieux comprise à la lumière des exemples suivants, qui sont donnés à titre purement illustratif et non limitatif.

EXEMPLES

Exemple 1 : Procédés de préparation et caractérisation

1. Nanoparticules d’amidon (NPs d’amidon )

2 g d’amidon ont été pesés dans un bol de broyage de 50 mL. En fonction de la taille de nanoparticules (NPs) souhaitée, des billes en oxyde de zirconium de diamètre 10 mm ou 20 mm ont été ajoutées dans le bol. Ce bol a ensuite été placé dans le broyeur PM 100 avec un cycle défini selon la taille des NPs (voir Tableau 1). 20 minutes avant la fin du dernier cycle, la molécule d’intérêt a été introduite dans le bol de broyage (sauf pour les NPs de 400 nm la molécule d’intérêt est introduite directement avec l’amidon), préalablement pesée dans un Eppendorf à l’aide d’une balance, à une concentration de 1% (20 mg ici, pour 2 g de NPs).

Une fois le cycle terminé, le bol a été placé sous une hotte et les NPs contenues dans le bol ont été transférées dans un tube fermé. Les tubes ont été ensuite stockés dans un réfrigérateur à 4°C et dans le noir pour éviter que les molécules d’intérêt ne se dégradent.

Tableau 1 :

Au cours des cycles de broyage, une pause de 3 minutes toutes les 10 minutes a été appliquée et le sens de rotation de broyage a été inversé. La vitesse de broyage était de 400 rpm.

2. Compositions

Une solution de NPs a été préparée en pesant une quantité exacte de NPs dans un tube, à l’aide d’une balance sous une hotte (la quantité à peser varie en fonction des espèces ou des concentrations à administrer). De l’eau de mer a ensuite été ajoutée dans le tube. Cette solution non homogène a été passée au vortex et quelques minutes aux ultrasons jusqu’à ce qu’elle soit devenue homogène. Enfin, la solution a été versée dans un bêcher de culture comprenant les proies vivantes, ou stockée à 4°C pendant quelques jours, le temps de l’expérimentation. Exemple 2 : Résultats expérimentaux sur les artémias

Le but de l’expérimentation était de confirmer les effets positifs des nanoparticules d’amidon fonctionnalisées en aquaculture et l’aquariologie, en suivant l’augmentation de la taille des nauplii d’ artémias, une espèce très utilisée dans le secteur.

Cette étude a été réalisée dans les conditions suivantes : température : 25 °C, salinité : 25 g/L, pH : 7, 9- 8, 3, eau filtrée et stérilisée par autoclave, aération par pipettes pasteur, éclairage : 8 h à 21 h, teneur en ammoniaque < lmg/L, oxygène dissout > 4 mg/L. 1. Protocole :

Pour une manipulation de 12 béchers d’ IL, le protocole était le suivant :

Jour 0 : L’éclosion : 0,5 g de cystes d’ artémias ont été placés dans IL d’eau de mer, avec un bullage fort à une température de 25 °C pendant 48 h.

Jour 2 : La séparation : Les nauplii d’artémias ont été récupérés à l’aide d’un faisceau lumineux, et séparés dans plusieurs béchers d’ IL en fonction du type de nourriture avec un bullage moyen. 4 traitements par manipulation ont été réalisés avec 3 réplicas par type de nourriture, ce qui fait un total 12 béchers d’ IL comprenant environ 300 artémias par bêcher. Jour 4 : Le nourrissage : A partir du 4 eme jour, 50 mg de NPs sous forme d’une solution homogène et 10 mL d’algues T-iso ont été ajoutés dans les béchers d’ IL d’eau de mer tous les jours.

Jour 5, 7, 9, 11 : Mesure de la taille : Dans chaque bêcher, 25 artémias ont été prélevés et figés dans l’alcool. La fixation a été effectuée de la manière suivante : avec une lumière ou un faisceau lumineux, les artémias ont été attirés à la surface du bêcher ce qui a facilité leur capture avec une pipette pasteur. Puis, ils ont été mis dans une boîte de pétri et l’éthanol a été ajouté (à hauteur de 5 à 10% du volume total). Enfin, une fois que les artémias étaient complètement figés, leur taille a été mesurée avec une caméra oculaire et un logiciel Top View, tous les 2 jours pendant 11 jours.

Pour les manipulations de 1 à 11 décrites ci-dessous, il a été utilisé 50 mg par litre d’eau de NPs pour nourrir les artémias chaque jour. Les NPs d’amidon avaient une taille moyenne de 80 nm, celles d’alginate environ 250 nm et celles de chitosan environ 250 nm.

2. Résultats :

Manipulation 1 :

Les résultats du tableau de la figure 1, Exemple 1, montrent que les artémias nourris avec des NPs d’amidon chargées en vitamine B 12 à 0,1 % voient leur taille augmenter plus rapidement par rapport aux artémias nourris avec les algues T-iso ou avec les NPs d’amidon non chargées en molécule d’intérêt active. Manipulation 2 :

Les résultats du tableau de la figure 1, Exemple 2, montrent que les artémias nourris avec des NPs d’amidon chargées en bétaïne à 1 % et avec des NPs d’amidon non chargées voient leur taille augmenter de manière plus importante par rapport aux artémias nourris avec les algues T- iso ou avec un mélange de NPs d’amidon chargées en vitamine B 12 à 1 % et de NPs d’amidon chargées en bétaïne à 1 %.

Manipulation 3 :

Les résultats du tableau de la figure 1, Exemple 3, montrent que les artémias nourris avec des NPs d’amidon chargées en vitamine C à 1 %, avec des NPs d’amidon chargées à la fois en vitamine B 12 à 1 % et en bétaïne à 1 %, et avec des NPs d’amidon non chargées voient leur taille augmenter de manière plus importante par rapport aux artémias nourris avec les algues T- iso.

Manipulation 4 :

Les résultats du tableau de la figure 1, Exemple 4, montrent que les artémias nourris avec des NPs d’amidon chargées à la fois en vitamine C à 1 % et en bétaïne à 1 %, voient leur taille augmenter de manière plus importante par rapport aux artémias nourris avec les algues T-iso, avec les NPs d’amidon seul, ou avec des NPs d’amidon chargées à la fois en vitamine C à 1 % et vitamine B 12 1 %.

Manipulation 5 :

Les résultats du tableau de la figure 1, Exemple 5, montrent que les artémias nourris avec des NPs d’amidon chargées en sélénium à 1 % et avec des NPs d’amidon seules voient leur taille augmenter de manière plus importante par rapport aux artémias nourris avec les algues T-iso ou avec les NPs en glutathion à 1 %.

Manipulation 6 :

Les résultats du tableau de la figure 1, Exemple 6 montrent que les artémias nourris avec des NPs d’amidon chargées à la fois en vitamine C à 1% et en sélénium à 1 % voient leur taille augmenter de manière plus importante par rapport aux artémias nourris avec les algues T-iso ou avec les NPs d’amidon seul. En outre, les artémias nourris avec des NPs d’amidon seul voient leur taille augmenter de manière plus importante par rapport aux artémias nourris des NPs d’alginate. Manipulation 7 :

Les résultats du tableau de la figure 1, Exemple 7 montrent que les artémias nourris avec des NPs d’amidon chargées à la fois en vitamine C à 1% et en sélénium à 1 % et avec des NPs d’amidon chargées en iodure de potassium à 1 % voient leur taille augmenter de manière plus importante par rapport aux artémias nourris avec les algues T-iso ou avec les NPs d’amidon seul (frais ou stocké). En outre, il n’est observé aucune différence entre les NPs d’amidon fraîches et NPs d’amidon stockées pendant un mois à 4°C. Les NPs d’amidon peuvent donc être stockées sans avoir d’impact sur la croissance des artémias.

Manipulation 8 :

Les résultats du tableau de la figure 1, Exemple 8 montrent de meilleurs résultats sur la taille des artémias nourris avec des NPs d’amidon chargées à la fois en sélénium à 1% et en bétaïne à 1 %.

Manipulation 9 :

Les résultats du tableau de la figure 1, Exemple 9 montrent de meilleurs résultats sur la taille des artémias nourris avec des NPs d’amidon chargées en DL-méthionine ou avec des NPs d’amidon seul.

Manipulation 10 :

Les résultats du tableau de la figure 1, Exemple 10 ne montrent pas de meilleurs effets sur la taille des artémias nourris avec des NPs d’amidon chargées en hormone ou en antibiotique.

Manipulation 11 :

Les résultats du tableau de la figure 1, Exemple 11 montrent de meilleurs résultats sur la taille des artémias nourris avec des NPs d’amidon seul ou chargées avec une molécule active d’intérêt par rapport aux artémias nourris avec des NPs de chitosan seul ou chargées avec de la vitamine C 1%. En outre, il a été observé que les NPs de chitosan augmentent le taux de mortalité des artémias et troublent l’eau de mer des béchers contenant ces NPs de chitosan.

Exemple 3 : Résultats expérimentaux sur les rotifères

Le but de l’expérimentation est de comparer l’évolution des populations des rotifères, appartenant à l'espèce Brachionus plicatilis, selon l’ajout de différentes nanoparticules. Cette étude a été réalisée dans les conditions suivantes : température : 23-25 °C, salinité : 25 g/L, pH : 7, 9-8, 3, eau filtrée et stérilisée par hypochlorite de sodium, aération par pipettes pasteur, éclairage : 16 h/8 h, teneur en ammoniaque < lmg/L, oxygène dissous > 4 mg/L.

1. Préparation de la culture mère de rotifères

Les rotifères ont été cultivés dans des cuves cylindriques de 30 litres. Les cuves ont été inoculées avec de faibles densités (10-30 individus par mL) et nourris tous les jours à satiété avec T-isochrisis et Rhodomonas sp. L’eau des cuves a été renouvelée intégralement une fois par semaine.

2. Tests des NPs contenant une seule molécule d’intérêt Protocole :

24 béchers de IL de culture de rotifères ont été mis en place. Ces 24 béchers ont été répartis en 6 groupes (algue T-iso (témoin), amidon seul, vitamine B 12, bétaïne, vitamine C et sélénium) constitués de 4 réplicas. Chaque jour, il a été introduit 100 mg de nanoparticules fonctionnalisées avec 1% d’une molécule d’intérêt.

Résultats :

Les résultats du tableau de la figure 2, Exemple 12 montrent que la meilleure densité est obtenue avec les rotifères nourris avec des NPs d’amidon chargées en bétaïne à 1 %. Suivent ensuite les NPs d’amidon chargées en vitamine B 12 à 1 %, les NPs d’amidon chargées en vitamine C à 1 %, et les NPs d’amidon chargées en sélénium à 1 %.

3. Tests des NPs contenant deux molécules d’intérêt Protocole :

24 béchers de IL de culture de rotifères ont été mis en place. Ces 24 béchers ont été répartis en 8 groupes (algue T-iso (témoin), amidon seul, vitamine C et vitamine B 12, sélénium et vitamine C, vitamine B 12 et bétaïne, sélénium et vitamine B 12, vitamine C et bétaïne, sélénium et bétaïne) constitués de 3 réplicas. Chaque jour, il a été introduit 100 mg de nanoparticules fonctionnalisées avec 1% de deux molécules d’intérêt.

Résultats :

Les résultats présentés du tableau de la figure 2, Exemple 13 montrent que la meilleure densité est obtenue avec les rotifères nourris avec des NPs d’amidon chargées à la fois en bétaïne à 1 % et en vitamine C à 1%. Il est aussi observé que les meilleurs résultats sont obtenus avec des NPs d’amidon chargées au moins en bétaïne à 1 %. 4. Tests des NPs contenant deux molécules d’intérêt

Protocole :

Le protocole qui a été utilisé est identique au protocole décrit ci-dessus.

Résultats :

Les résultats du tableau de la figure 2, Exemple 14 montrent que la meilleure densité est obtenue avec les rotifères nourris quotidiennement avec des NPs d’amidon à une concentration de 300 mg/L chargées en bétaïne et vitamine C à 3 %.

5. Tests des NPs sans molécule d’intérêt Protocole :

Le protocole qui a été utilisé est identique au protocole décrit ci-dessus sans les molécules d’intérêt.

Résultats :

Les résultats du tableau de la figure 2, Exemple 15, montrent que la meilleure densité est obtenue avec les rotifères nourris avec des NPs d’amidon à une concentration de 200 mg/L par jour. Un dosage plus important (300 et 500 mg/L/jour) affecte négativement le développement des rotifères. A noter aussi que le traitement sans micro-algues donne des résultats négatifs. Les NPs d’amidon seules ne subviennent donc pas aux besoins nutritionnels des rotifères.

6. Tests des NPs sur la meilleure combinaison Protocole :

Le protocole qui a été utilisé est identique au protocole décrit ci-dessus.

Résultats :

Les résultats du tableau de la figure 2, Exemple 16 montrent que la meilleure densité est obtenue avec les rotifères nourris avec 200 mg/L/jour de NPs d’amidon chargées en bétaïne à 3 % ; en vitamine B 12 à 3%, en vitamine C à 3%, et en sélénium à 3%.

7. Tests des NPs avec d’autres molécules d’intérêt en lien avec l’aquaculture Protocole :

Le protocole qui a été utilisé est identique au protocole décrit ci-dessus.

Résultats :

Les résultats du tableau de la figure 2, Exemple 17 montrent que la meilleure densité est obtenue avec les rotifères nourris avec les NPs d’amidon chargées en tétracycline. Les résultats du tableau de la figure 2, Exemple 18 montrent que la meilleure densité est obtenue avec les rotifères nourris avec les NPs d’amidon chargées en DL-méthionine 1 %.

8. Tests comparatifs Protocole :

Le protocole qui a été utilisé est identique au protocole décrit ci-dessus.

Résultats :

Les résultats du tableau de la figure 2, Exemple 19 ne montrent aucun effet pour les NPs de chitosan qui en outre altèrent la qualité de l’eau. Les NPs d’amidon sont donc plus performantes et applicables dans la culture des rotifères.

Exemple 4 : Résultats expérimentaux sur les copépodes

Le but de l’expérimentation était de comparer la production d’œufs des copépodes, appartenant à l'espèce Acartia tonsa, selon l’ajout de différentes nanoparticules.

Quotidiennement, les œufs ont été collectés et comptés pour comparer les taux de pontes avec et sans NPs. Pour cela les œufs ont été placés dans un bêcher de 1800 mL et homogénéisés à l’aide d’un fort bullage. Ensuite 5 mL ont été prélevés et comptés et cela à 3 reprises. Les œufs ont ensuite été stockés à 3 °C en milieu anoxique et dans l’obscurité. Ces œufs ont été réutilisés ensuite pour effectuer des taux d’éclosion comparatifs. Pour effectuer ces taux d’éclosion, un nombre d’œufs connu a été mis à incuber en 3 réplicas dans des béchers de 80 mL nourris avec Rhodomonas et T-isochrisis. Après 48 h d’incubation à 18 °C, les œufs non éclos ont été comptés pour obtenir le taux d’éclosion.

Cette étude a été réalisée dans les conditions suivantes : salinité : 33 g/L, pH : 7, 8-8, 3, eau filtrée, éclairage : 16 h/8 h, teneur en ammoniaque < lmg/L, oxygène dissous > 4 mg/L.

1. Effet des NPs sur le taux de ponte des copépodes

Manipulation 1 :

Dans cette expérience une dose de 25 mg/L de NPs a été ajoutée quotidiennement. Cette dose est constituée de 8,3 mg de NPs d’amidon fonctionnalisées avec de la bétaïne à 3%, 8,3 mg de NPs d’amidon fonctionnalisées avec de la vitamine C à 3% et 8,3 mg de NPs d’amidon fonctionnalisées avec de la vitamine B 12 à 3% également.

Les résultats du tableau de la figure 3, Exemple 20 montrent une augmentation du nombre journalier d’œufs pondus par femelle de 20 % en moyenne avec les NPs fonctionnalisées.

Manipulation 2 :

Dans cette expérience, une composition de 40 mg/L de NPs comprenant 30 mg de bétaïne à 3 %, 5 mg de vitamine B 12 à 3 %, et 5 mg de vitamine C à 3 % a été ajoutée quotidiennement. Les résultats du tableau de la figure 3, Exemple 21 montrent une augmentation du nombre journalier d’œufs pondus par femelle de 44 % en moyenne avec les NPs fonctionnalisées.

Manipulation 3 :

Dans cette expérience, une composition de 40 mg/L de NPs comprenant 30 mg de bétaïne à 1 %, 5 mg de vitamine B12 à l %, et 5 mg de vitamine C à 1 % a été ajoutée quotidiennement de J0 à J5. Ensuite, une composition de 40 mg de NPs comprenant 30 mg de bétaïne à 3 %, 5 mg de vitamine B 12 à 3 %, et 5 mg de vitamine C à 3 % a été ajoutée quotidiennement à J6.

Les résultats du tableau de la figure 3, Exemple 22, montrent une augmentation du nombre journalier d’œufs pondus par femelle de 10 % en moyenne avec les NPs fonctionnalisées à 1% et de 54 % avec les NPs fonctionnalisées à 3%.

Manipulation 4 :

Dans cette expérience, une composition de 80 mg/L de NPs comprenant 60 mg/L de bétaïne à 3 %, 10 mg/L de vitamine B12 à 3 %, et 10 mg/L de vitamine C à 3 % a été ajoutée quotidiennement.

Les résultats du tableau de la figure 3, Exemple 23, montrent que la forte dose (80 mg/L/j) de NPs affecte les taux de pontes à partir de J4.

2. Effet des NPs sur le taux d’éclosion des copépodes

Après un mois de stockage, des œufs d ’Acartia de trois différentes collectes ont été mis à incuber en trois réplicas. Une composition de 40 mg/L/j de NPs comprenant 30 mg de bétaïne à 3 %, 5 mg de vitamine B 12 à 3 %, et 5 mg de vitamine C à 3 % avait préalablement été ajoutée lors de la culture des géniteurs. Les résultats du tableau de la figure 4, Exemples 24, 25 et 26 montrent que les NPs fonctionnalisées augmentent d’environ 6 % le taux d’éclosion des œufs de copépodes. En outre, il a été observé une meilleure qualité des œufs. 3. Effet sur la survie et la croissance des copépodes

Un suivi a été réalisé sur deux colonnes de 40L. Dans ces enceintes un même nombre d’œufs a été mis à incuber. Une colonne a été soumise à un ajout de 10 mg/L de NPs fonctionnalisées à 3% de molécules d’intérêt par jour (8 mg de NPs avec bétaïne, 1 mg de NPs avec Vitamine C et 1 mg de NPs avec Vitamine B 12). Ensuite, 4 prélèvements ont été effectués, au 3 eme , 7 eme , IQ eme et j eme j our p Qur me surer la largeur et la longueur des copépodes. 20 individus par traitement ont été mesurés.

Les résultats du tableau de la figure 5, exemples 27 et 28 montrent une légère augmentation en largeur et en longueur des copépodes avec les NPs fonctionnalisées à partir de J 10.

Après un comptage final de la population, présenté dans le tableau de la figure 6, Exemple 29, il a été observé que la survie à J13 est de 22 % (nombre d’adultes à J13 / nombre de Nauplii) pour les copépodes témoins contre 38 % pour les copépodes traités avec les NPs fonctionnalisées.