Campo de la invención

La presente invención se encuadra en el campo general de la agrobiotecnología y, en particular se refiere a la acción repelente de algunos compuestos orgánicos volátiles (COVs) producidos por tres cepas de dos hongos entomopatógenos y por una cepa de un hongo nematófago, como repelentes del picudo negro de la platanera (PNP), Cosmopolites sordidus (Germar, 1824) (Coleóptera Curculionidae).

Estado de la técnica anterior

El plátano ( Musa sp .) es el fruto más consumido y cultivado en el mundo (Ferri D.V. et al. 2012. Genetic variability of Beauveria bassiana and a DNA marker for environmental monitoring of a highly virulent isolate against Cosmopolites sordidus. Iridian Journal of microbiology , 52(4), 569-574). La producción mundial ronda los 114 millones de toneladas al año (FAO, 2018).

Entre los principales organismos que afectan a los cultivos de plataneras, Cosmopolites sordidus es el que causa el mayor daño y las mayores pérdidas económicas en todas las áreas de producción, es decir, es la plaga clave de las plantaciones de plataneras. Las pérdidas pueden oscilar entre el 30% y el 90% (Carballo, V. 1998. Mortalidad de Cosmopolites sordidus con diferentes formulaciones de Beauveria bassiana. Manejo Integrado de Plagas (CATIE) (no. 48) p. 45-48 ; Musabyimana T. et al. 2001. Effects of neem seed derivatives on behavioral and physiological responses of the Cosmopolites sordidus (Coleóptera: Curculionidae). Journal of economic entomology , 94(2), 449-454; Muñoz-Ruiz, C. 2007. Fluctuación poblacional del picudo negro ( Cosmopolites sordidus Germar) del plátano (Musa AAB) en San Carlos, Costa Rica. Revista Tecnología en Marcha, 20(1), 24-41).

C. sordidus es un insecto del orden Coleóptera, perteneciente a la familia Curculionidae y a la subfamilia Dryophthorinae. El PNP es una especie nativa de la región indo-malaya (Simmonds N.W. 1966. Bananas. 2nd ed. Longmans, Green and Co. Ltd ., London, pp. 512) que actualmente se extiende como plaga a todas las regiones donde se cultiva la platanera, y en España, está presente, sobre todo, en las Islas Canarias (Carnero H.A. etal. 2002. Métodos alternativos para el control del picudo de la platanera Cosmopolites sordidus Germar, 1824 (Coleóptera: Curculionidae). Actividades del ICIA en Platanera , p. 75).

La invasión y difusión del PNP se debe a su comportamiento de búsqueda para adquirir alimentos, pareja, oviposición y sitios de reproducción. Por otra parte, el PNP posee una baja capacidad de vuelo y es capaz de infectar tanto al cormo de las plataneras, como pseudotallo e hijuelos. En dicho proceso el PNP consigue recursos que son absolutamente esenciales para su crecimiento y desarrollo y, para asegurar la eficacia biológica de futuras generaciones. Estos eficientes mecanismos de búsqueda del PNP se basan en sus antenas que fúncionan como órganos quimio- y mecanorreceptores primarios especializados. Estos precisos mecanismos de evaluación ambiental son cruciales para asegurar la supervivencia y reproducción del PNP en el medio.

Los quimiorreceptores de las antenas suelen detectar productos químicos volátiles. Estos compuestos generan alertas en el insecto sobre la presencia de posibles parejas, alimento, lugares adecuados para depositar sus huevos o peligros que deben evitar. Por lo tanto, cualquier producto químico que pudiese interrumpir y/o modificar el comportamiento del PNP y, en general, su capacidad de búsqueda del huésped ( Musa sp .) proporcionaría una herramienta para su manejo sostenible.

Los COVs son compuestos sólidos o líquidos con una base carbonada que entran en fase gaseosa mediante vaporización a temperatura ambiente (20°C y 0,01 kPa; Pagans E. etal. 2006. Emission of voladle organic compounds from composting of different solid wastes: abatement by biofiltration. Journal ofhazardous materials , 757(1-3), 179-186).

La emisión de COVs desempeña fúnciones ecológicas y fisiológicas esenciales para muchos organismos, como los hongos, que liberan un amplio espectro de COVs (Splivallo R. et al. 2011. Truffle volátiles: from Chemical ecology to aroma biosynthesis. New Phytologist , 189(3), 688-699; Kramer R. and Abraham W.R. 2012. Volatile sesquiterpenes from fúngi: what are they good for?. Phytochemistry Reviews, 77(1), 15-37). Las emisiones de COVs füngicos pertenecen a diferentes grupos químicos, como monoterpenoides, sesquiterpenos, alcoholes, aldehidos, compuestos aromáticos, ésteres, furanos, hidrocarburos, cetonas o lactonas (Campos

V.P. et al. 2010. Volátiles produced by interacting microorganisms potentially useful for the control of plant pathogens. Ciencia e Agrotecnologia, 34(3), 525-535; Kramer R. and Abraham

W.R. 2012. Volatile sesquiterpenes from fimgi: what are they good for? Phytochemistry Reviews , 11(1), 15-37).

Los hongos producen diversos compuestos orgánicos volátiles (Crespo R. et al. 2008. Volatile organic compounds released by the entomopathogenic fimgus Beauveria bassiana. Microbiological research, 163(2), 148-151; Müller A. et al. 2013. Volatile profiles of fúngi- chemotyping of species and ecological fimctions. Fungal Genetics and Biology, 54, 25-33) a través de vías metabólicas, implicados en procesos biológicos de control o comunicación entre microorganismos y su entorno. Los COVs fungí eos derivan del metabolismo primario y secundario (Korpi A. et al. 2009. Microbial volatile organic compounds. Critical reviews in Toxicology , 39(2), 139-193), y como pueden propagarse a través de la atmósfera y el suelo, son semioquímicos ideales (Morath S.U. et al. 2012. Fungal volatile organic compounds: a review with emphasis on their biotechnological potential. Fungal Biology Reviews, 26(2-3), 73-83) capaces de actuar como mediadores en las interacciones entre organismos. La producción de COVs füngicos es biológicamente dinámica. El perfil de una especie o cepa particular varía según el sustrato o nutriente, el tiempo de incubación, la temperatura y otros parámetros ambientales (Nilsson A. et al. 2004. Microorganisms and volatile organic compounds in airborne dust from damp residences. Indoor Air, 14(2), 74-82; Fiedler N. et al. 2005. Health effeets of a mixture of indoor air volatile organics, their ozone oxidation producís, and stress. Environmental health perspectives, 113(11), 1542-1548).

Actualmente, no existe ningún plan integrado de control del PNP, únicamente el manejo de la plaga mediante trampas de feromonas para conteo y captura, controlando posibles focos y eliminando las plantas demasiado infectadas, método poco eficiente y caro. En este sentido, la patente ES2600526 describe compuestos orgánicos volátiles de Beauveria bassiana, para su uso como repelente específico de Rhynchophorus ferrugineus. Los COV descritos en dicha patente, concretamente: metilbenceno, hexametil-ciclotetrasiloxanos, 1,4-dimetil benceno, etenilbenceno, dodecametil-pentasiloxano, benzaldehído, 5-metilundecano, aldehido cáprico, 1,4-bis (1,1 -dimetil benceno), benzotiazol y 1-Decanol son específicos para Rhyi ichophorus ferrugineus , y no producen ningún efecto en Cosmopolites sordidus.

Es evidente la gran incidencia que tiene el PNP en los cultivos de platanera y el aumento en las restricciones nacionales y europeas en el uso de insecticidas de síntesis química para estas plagas. Existe pues la necesidad de desarrollar nuevos compuestos derivados de agentes de control biológico naturales para mitigar los daños producidos por Cosmopolites sordidus , y para eliminar los daños provocados en el ambiente cuando se utilizan insecticidas frente a dicho insecto.

Explicación de la invención

La presente invención resuelve los problemas descritos anteriormente, ya que proporciona nuevos COVs con actividad repelente derivados del metabolismo de hongos entomopatógenos ( Beauveria bassiana , Metarhizium anisopliae) y nematófagos ( Pochonia clamydosporia).

Así pues, en un primer aspecto, la presente invención se refiere al uso de al menos un compuesto orgánico volátil de un hongo entomopatógeno y/o nematófago (de aquí en adelante compuesto orgánico volátil de la presente invención), seleccionado de entre estireno, benzotiazol, alcanfor, bomeol, 1,3-dimetoxibenceno, l-octen-3-ol, 3-ciclohepten-l-ona como repelente de Cosmopolites sordidus.

En la presente invención por “compuesto orgánico volátil” se refiere a una sustancia química carbonada sólida y/o líquida que aparece como producto intermedio o final de las vías metabólicas de los hongos mencionados anteriormente.

En una realización particular, los compuestos orgánicos volátiles de la presente invención pertenecen a diferentes familias químicas y se producen en diferentes tiempos de incubación por los diferentes hongos utilizados.

En una realización particular, los compuestos orgánicos volátiles de la presente invención son seleccionados de entre:

Estireno (C ₈ H ₈ ) (también denominado en la presente invención como compuesto Cl), pertenece al grupo de compuestos químicos clasificados como compuestos orgánicos de vinilo. Cl aparece en el arroz y en Bb1TS11, Pc123 y Ma4TS04.

Benzotiazol (C ₇ H ₅ NS) (también denominado en la presente invención como compuesto C2), es un compuesto aromático heterocíclico identificado por el perfil metabólico de Bb1TS11.

Alcanfor (C ₁₀ H ₁₆ O) (también denominado en la presente invención como compuesto C3), es una cetona cíclica también seleccionada por Bb1TS11. Este compuesto, a diferencia de los otros, se detectó durante las pruebas preliminares realizadas para el desarrollo del protocolo apropiado, con muestras de Bb1TS11. Dada la conocida acción repelente que esta sustancia tiene sobre otros insectos, como mosquitos (Díptera Culicidae) (Nerio L.S. el al. 2010. Repellent activity of essential oils: a review. Bioresource technology, 101(1), 372-378), fue seleccionada como candidato repelente, a pesar de no ser un compuesto mayoritario.

Borneol (C ₁₀ H ₁₈ O) (también denominado en la presente invención como compuesto C4), es un terpeno identificado por el perfil metabólico de Bb1TS11.

1,3-dimetoxibenceno (C ₆ H ₄ (OCH ₃ ) ₂ ) (también denominado en la presente invención como compuesto C5), es un compuesto aromático identificado por Pc123 y Ma4TS04

1-octen-3-ol (CH ₃ (CH ₂ ) ₄ CHCH=C ₂ ) (también denominado en la presente invención como compuesto C6), es un alcohol secundario seleccionado de los perfiles metabólicos de Ma4TS04 y Pc123.

3-ciclohepten-1-ona (C ₇ H1 ₀ O) (también denominado en la presente invención como compuesto C7), es una cetona cíclica identificada por los perfiles metabólicos de Bb1TS11, Ma4TS04 y Pc123 (Figura 1).

En una realización más en particular, el compuesto orgánico volátil de la presente invención, es de un hongo entomopatógeno seleccionado de entre Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae.

En otra realización más en particular, el compuesto orgánico volátil de la presente invención, es del hongo nematófago Pochonia clamydosporia.

En otra realización particular de la presente invención, el compuesto orgánico volátil de la presente invención, es del hongo entomopatógeno Beauveria bassiana y el compuesto el compuesto orgánico volátil de la presente invención es seleccionado de entre estireno (C ₈ H ₈ ), benzotiazol (C ₇ H ₅ NS), alcanfor (C ₁₀ H ₁₆ O) y borneol.

En otra realización particular de la presente invención, el compuesto orgánico volátil de la presente invención, es del hongo entomopatógeno Metarhizium anisopliae y el compuesto orgánico volátil de la presente invención, es seleccionado de entre 1,3-dimetoxibenceno (C ₆ H ₄ (OCH ₃ ) ₂ ), 1-octen-3-ol (CH ₃ (CH ₂ ) ₄ CHCH=CH ₂ ), ₃ -ciclohepten-1-ona (C ₇ H ₁₀ O).

En otra realización particular, el compuesto orgánico volátil de la presente invención, es del hongo Pochonia clamydosporia y el compuesto orgánico volátil de la presente invención, es seleccionado de entre 1,3-dimetoxibenceno (C ₆ H ₄ (OCH ₃ ) ₂ ), 1-octen-3-ol (CH ₃ (CH ₂ ) ₄ CHCH=CH ₂ ), ₃ -ciclohepten-l-ona (C ₇ H ₁₀ O), para su uso como repelente de Cosmopolites sordidus.

En otra realización particular, el compuesto orgánico volátil de la presente invención, es obtenido por síntesis química.

En otra realización particular, el compuesto orgánico volátil de la presente invención, está en forma sólida.

En otra realización particular, el compuesto orgánico volátil de la presente invención, está en forma líquida. En una realización más en particular, la formulación líquida está impregnada en una matriz.

En otra realización particular, el compuesto orgánico volátil de la presente invención, está en forma gel.

En otro aspecto, la presente invención se refiere al uso de una composición que comprende al menos un compuesto orgánico volátil de la presente invención, como repelente de Cosmopolites sordidus.

Los compuestos orgánicos volátiles de la presente invención se han identificado como metabolitos de una cepa de B. bassiana (Bb1TS11), una cepa de M anisopliae ( Ma4TS04) y una cepa de P. clamydosporia ( Pc123). Bb1TS11 (CECT 21121, NCBI MK 156717) y .U/4TS04 (CECT 21126; NCBI MK 156715) se aislaron de muestras de suelo de la rizosfera de las plantaciones de platanera ubicadas en Canarias; por lo tanto, se supone que esas cepas han interactuado con la población canaria de PNP. Mientras que Pc123 se aisló de huevos de Heterodera avenae, en Sevilla (ATCC No. MYA-4875; CECT No. 20929).

Breve descripción de las figuras

Figura 1. Diagrama de Venn que representa los COVs identificados por GC/MS-SPME en las muestras.

Figura 2. Análisis de Cromatografía de Gases/Espectrometría de Masas (GCMS) mediante SPME para B bassiana 1TS11 de 20 días de incubación.

Figura 3. Análisis de Cromatografía de Gases/Espectrometría de Masas (GCMS) mediante SPME para B bassiana 1TS11 de 30 días de incubación.

Figura 4. Análisis de Cromatografía de Gases/Espectrometría de Masas (GCMS) mediante SPME para M. anisopliae 4TS04 de 10 días de incubación.

Figura 5. Análisis de Cromatografía de Gases/Espectrometría de Masas (GCMS) mediante SPME para P clamydosporia 123 de 10 días de incubación

Figura 6. Esquema de los estímulos colocados en un olfactómetro. El representa a los individuos que han elegido los atrayentes; E2 representa a todos los individuos que han acudido al repelente de los candidatos evaluados o, alternativamente, a la ausencia de estímulos; EC indica individuos que han elegido no moverse.

Figura 7. Resultados de la prueba de Tukey en las PCFAs. SL-Ha (Adultos de PNP en condiciones sin luz y con hambre), SL-SHa (Adultos de PNP en condiciones sin luz y sin hambre), L-Ha (Adultos de PNP en condiciones con luz y con hambre), L-SHa (Adultos de PNP en condiciones con luz y sin hambre)

Figura 8. Resultados de la prueba de Tukey en las PRs, en condiciones óptimas para su movimiento (SL-Ha). COVs: C1 (estireno); C2 (benzotiazol); C3 (alcanfor); C4 (bomeol); C5 (1,3-dimetoxibenceno); C6 (1-octen-3-ol); C7 (3-ciclohepten-1-ona). Exposición detallada de modos de realización

Insectos y cormo/pseudotallo de platanera utilizados en los bioensayos

Los adultos de PNP se recogieron en la Isla de Tenerife (Canarias, España) mediante trampas de feromonas cebadas con ECOSordidina6O (ecobertura ^® , ref: 019-FACS60), basado en sordidina. Los insectos se mantuvieron en cajas a 28±0,5°C en la oscuridad. Las cajas de plástico (40x30x21 cm) contenían un papel de filtro y un pequeño recipiente perforado con agua destilada, para mantener los niveles de humedad en torno al 80±5%. Se seleccionaron al azar 20 individuos (sin distinguir entre machos y hembras) sanos de PNP de la población stock para los experimentos con bioensayos en olfactómetro de dos vías.

Se recogieron trozos de cormo y pseudotallo de platanera ( Musa sp .) de los invernaderos de la Universidad de Alicante, de plantas procedentes de las Islas Canarias (CULTESA). Se utilizaron 15,6 g de cormo/pseudotallo para los experimentos de bioensayo en olfactómetro de dos vías.

Hongos

Se han utilizado dos especies de hongos entom opatógenos ( Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae) y una especie de hongo nematófago ( Pochonia clamydosporia).

Utilizamos una cepa de B. bassiana Bb1TS11. Bb1TS11 (CECT 21121; NCBI MK156717) aislada de muestras de suelo de la rizosfera de cultivos de plataneras ubicadas en las Islas Canarias, en concreto de Tenerife; por lo tanto, se supone que esta cepa ha interactuado directamente con la población canaria de PNP. En lo que respecta a M. anisopliae , la cepa Ma4TS04 (CECT 21126; NCBI MK156715), como la comentada anteriormente, ha sido aislada de suelo canario. El hongo P. clamydosporia cepa 123, Pc123 se aisló de huevos de Heterodera avenae, en Sevilla (ATCC No. MYA-4875; CECT No. 20929). Los hongos se mantuvieron en oscuridad a 4°C en agar harina de maíz (CMA; BBL Sparks, MD).

Para el uso de los hongos en los análisis de GC/MS-SPME se prepararon formulaciones sólidas de los mismos a partir de sustrato de arroz ( Oryza sativa ) según Güerri-Agulló B. el al. (2011). Se utilizaron matraces de 250 mL a los que se agregaron como sustrato 75 g de arroz.

Análisis de los compuestos orgánicos volátiles (COVs) producidos por los hongos parásitos de invertebrados La técnica GC/MS (Cromatografía de gases-Espectrometría de masas) utilizada fue la MicroExtracción en Fase Sólida (SPME). En ella, se utiliza una fibra de sílice fundida (aproximadamente 1 cm de largo y 0,110 mm) cubierta con una pequeña cantidad de fase de extracción, colocada en una jeringa modificada llamada habitualmente “holder” .

Se prepararon cuatro muestras para analizar los COVs, una para cada cepa de hongos, más una muestra de arroz no inoculada por ningún hongo (esterilizada), utilizada como control. Para cada muestra se tomaron 5 g de arroz de los matraces de cultivo y se colocaron en un vial (HS, crimb, FB, 20 mi, clr, cert, 100 PK, Agilent Technologies) tapado herméticamente con un tapón de presión con una membrana de plástico. Las muestras se incubaron individualmente en un baño termostático, con una temperatura fija de 60°C. Para C3 se realizaron ensayos hasta 100°C.

La absorción de los COVs liberados se produjo al colocar la fibra del “holder” expuesta en el interior del vial sin tocar la muestra de arroz, durante 15 minutos. Después de esta operación, el “holder” se insertó en el inyector de GC donde se expuso a la desorción durante cuatro minutos a 150°C con el modo “splitless”. El equipo utilizado es un espectrómetro de masas Agilent 5973 Network junto con un cromatógrafo de gases, modelo 6890N de Agilent.

El programa de temperatura utilizado para la cromatografía fue: temperatura inicial de 35°C durante 5 min y a 3°C/min a 150°C durante 1 min. Posteriormente a 5°C/min a 250°C hasta el final del análisis. El análisis cromatográfico duró 38 minutos. La columna utilizada es un DB624 de J&W Scientific de 30 m, 0,25 mm ID y 1,4 mm. La fuente de ionización para impacto electrónico a 70eV y 230°C. Se utilizó un simple cuadrupolo como detector, y su temperatura fue de 150°C. Wiley275 es la biblioteca utilizada para identificar detalles de los COVs.

Los perfiles metabólicos de los hongos involucrados en el estudio se revisaron sin los COVs identificados en el perfil control, la fibra sin muestra y los perfiles metabólicos del sustrato control, arroz autoclavado sin inoculo de hongo. Además, de los COVs Totales (T-COVs) característicos de cada hongo, se seleccionaron dos categorías de COVs: los COVs mayoritarios (M-COVs) y los COVs minoritarios (m-COV). Los M-COVs están representados por todas aquellas sustancias que han presentado una coincidencia ³ 50% con compuestos de la biblioteca y una abundancia máxima > 100000 ppm. Los m-COVs están, por otra parte, representados por todos los compuestos detectados que presentaron una concordancia de ³ 50% y una abundancia máxima entre 20000 ppm y 100000 ppm. Bb1TS11 presentó 49 T-COVs diferentes, característicos de su perfil metabólico (Tabla 1; Figura 2 y 3). De éstos, solo tres compuestos, que representan el 6,1% del total, se encontraron pertenecientes a la categoría M-COVs; mientras que, se encontró que 12 compuestos diferentes pertenecían a la categoría de m-COVs y representan el 24,5% del total. De los M-COVs, se encontró 3-ciclohepten-l-ona (C7) en las seis mediciones realizadas durante los 60 días de crecimiento de hongos; mientras que, la N-etil-bencenamina se detectó solo en las mediciones realizadas a los 30 y 40 días después de la inoculación del sustrato. Finalmente, el 1,3-octadieno es el tercer M-COVs y se identificó solo en la medición realizada 50 días después de la inoculación del sustrato. Entre los m-COVs solo se detectó borneol (C4) a los 10, 20, 40 y 50 días a partir del inoculo. Los otros m-COVs de Bb1TS11 se detallan en la Tabla 1. También se detectó benzothiazol (C2).

Tabla 1. COVs detectados en el hongo Bb1TS11 a los 10-60 días

Ma4TS0 m4 ostró 49 T-COVs diferentes característicos de su perfil metabólico (Tabla 2; Figura 4). De estos, solo seis compuestos, que representan el 12.2% del total, se encontraron pertenecientes a la categoría de M-COVs; mientras que, se encontró que 11 compuestos diferentes pertenecían a la categoría de m-COVs y representaban el 22.4% del total. De los M- COVs, se encontró 3-ciclohepten-l-ona (C7) de 10 a 30 días después del inoculo; mientras que l-octen-3-ol (C6) se detectó como M-VOC solo en las mediciones realizadas a los 20 y 30 días desde la inoculación del sustrato. El 4-fluoro-l,4-xileno se detectó en las mediciones realizadas los 20 y 60 días de la inoculación del sustrato. También, el 1,2-dipentil-ciclopropeno se detectó en las mediciones realizadas los 10 y 50 días después de la inoculación. También se detectó 1,3-dimetoxibenceno (C5). Los otros M-COVs de Ma4TS04 se detallan en la tabla. Entre los m-COVs, el (+ -)-gymnomitrene se detectó a los 10, 20 y 40 días desde el inoculo. También, se encontró l-octen-3-ol (C6) como m-COVs solo a los 10 y 40 días desde el inoculo. Los otros m-COVs deMa4TS04 se detallan en la Tabla 2.

Tabla 2. COVs detectados en el hongo Ma4TS04 a los 10-60 días

Pc123 mostró 111 T-COVs diferentes característicos de su perfil metabólico (Tabla 3; Figura 5). De estos, solo 14 compuestos, que representan el 12.6% del total, se encontraron pertenecientes a la categoría de M-COVs; mientras que, se encontró que 43 compuestos diferentes pertenecían a la categoría de m-COVs y representan el 38,7% del total. De los M- COVs, se encontró 1,3-dimetoxibenceno (C5) en las seis mediciones realizadas durante el crecimiento del hongo; mientras que l-octen-3-ol (C6) ha sido detectado como M-COVs solo en mediciones realizadas a los 10, 20, 30 y 60 días desde la inoculación del sustrato. A los 20, 40 y 50 días de la inoculación, se identificó la 3-octanona; mientras que 3-ciclohepten-l-ona (C7) se encontró solo a los 10 y 20 días desde el inoculo. Entre los m-COVs, se detectó 2-(2- etoxietoxi)-etanol a los 30 y 40 días desde el inoculo. Propionoin, 2-butanona y 2-dodecanona se detectaron a los 40 y 50 días desde el inoculo. También, 16-oxosalutaridina y 3-metil-butanal se detectaron, pero a los 50 y 60 días. Los otros m-COVs dePc123 se detallan en la Tabla 3.

Tabla 3. COVs detectados en el hongo Pc123 a los 10-60 días.

Descripción del olfactómetro de dos vías o tubo en “Y”

Se construyeron olfactómetros de dos vías (tubo en “Y”) (Rhodes el al. 2012. The role of olfactory cues in the sequential radiation of a gall-boring beetle, Mordellistena convicta. Ecológica l Entomology. 37(6): 500-507.) para los bioensayos de laboratorio para comprobar la respuesta de los individuos adultos de PNP a estímulos con los mencionados compuestos orgánicos volátiles. El olfactómetro se construyó en su totalidad a partir de secciones de tubo de vidrio resistente al calor conectadas cada una por un cono hermético (5 mm). Los tubos de vidrio poseían un diámetro interno de 30 mm, la rama principal medía 200 mm y los brazos de la unión en “Y” 150 mm de longitud. El ángulo entre cada brazo y el cuerpo principal fue de 75°. El extremo de cada brazo se unió a un contenedor de vidrio (60 mm de longitud, 25 mm de diámetro) en el que se colocan las cámaras de olor (CO) (Bazzocchi G.G. and Maini S. 2000. Ruolo dei semiochimici volatili nella ricerca delTospite da parte del parassitoide Diglyphus isaea (Hymenoptera Eulophidae). Prove olfattometriche. Bollettino dell'Istituto di Entomología “G. Grandi” Universitá di Bologna, 54 , 143-154) en los cuales se insertaron los estímulos olfativos que se analizaron. El aire en el interior de cada brazo del olfactómetro se mantuvo constante para todos los experimentos con el flujo de aire natural. Los tubos se cubrieron para evitar el escape de los insectos. Al cambiar las sustancias de los ensayos, los frascos se lavaron con alcohol etílico (Benito Parraga, S. L.), agua y con n-hexano (PanReac AppliChem) para eliminar todos los restos de los volátiles de muestras anteriores.

Bioensayos de comportamiento (olfactómetro de dos vías) utilizando los COVs propuestos

El olfactómetro de dos vías (ODV) se utilizó para evaluar el comportamiento del PNP sometido a la acción de diferentes estímulos olfativos (atrayentes y repelentes). Refiriéndose a los estudios realizados por J. Jalinas (2016) en PRP (Picudo Rojo de las Palmeras, Rhynchophorus ferrugineus), todos se realizaron colocando un individuo de PNP en el centro del brazo recto. Los insectos en prueba tienen 10 minutos para moverse y elegir o no un estímulo. En total se realizaron 10 bioensayos diferentes, con un total de 120 individuos de PNP para cada uno. Cada prueba consta de seis réplicas, cada una con 20 individuos. Los ensayos se agruparon en dos grupos diferentes: Pruebas de Condiciones Fisio- Ambientales (PCFAs) y Pruebas de Repelentes (PRs).

En el primer grupo, llamado Pruebas de Condiciones Fisio- Ambientales (PCFAs), se realizaron cuatro pruebas en las que se probó la actividad atractiva del cormo/pseudotallo. De los dos CO, el atractivo natural se colocó en uno (a la derecha o a la izquierda se eligió al azar) mientras que, en el otro CO, no se colocaron atrayentes ni repelentes, solo aire ambiental. Con esta estimulación olfativa, se probaron dos condiciones fisio-ambientales diferentes. En estas pruebas, quisimos evaluar la incidencia de una condición ambiental, es decir, se evaluó la incidencia que la presencia de luz (L) o su ausencia (SL) tiene en el movimiento del PNP. Se sabe que el PNP tiene un hábito predominantemente nocturno (Gold C.S., Pena J.E., Karamura E.B. (2001). Biology and integrated pest management for the banana weevil Cosmopolites sordidus (Germar) (Coleóptera: Curculionidae). Integrated Pest Management Reviews , 6(2), 79-155).

Además, se probó el movimiento del PNP con una condición fisiológica como es el hambre. Se probaron dos subpoblaciones de PNP: la primera consistió en individuos con un arreglo de comida ( Musa sp.) ad libitum (SHa), mientras que otro estaba compuesto de individuos con al menos una semana de inanición (Ha). De esta manera, fue posible definir el dominio de las condiciones fisio-ambientales en las que C. sordidus tiene la mayor tasa de movimiento.

En el segundo grupo, llamado Pruebas de Repelentes (PRs), se realizaron siete pruebas con PNP en condiciones SL-Ha.

Las pruebas se realizaron con siete compuestos potencialmente repelentes (C1-C7), se utilizaron muestras comerciales de dichos compuestos (Sigma-Aldrich). En estas pruebas, en los CO, se colocaron en uno cormo/pseudotallo frescos y en el otro un dispensador de 0,5 mi (Cl, C2, C5, C6 y C7) o 0,5 g (C3 y C4) del repelente puro a ensayar. Los dispensadores utilizados se construyeron en el laboratorio utilizando sobres de miracloth (Merck KGaA) (3,5 cm x 2,5 cm) que contenían 2 g de gel de sílice 60A (70-200m, Cario Erba) en su interior. El volumen de compuesto se añadió directamente a la sílice.

Los datos etológicos mostrados por los PNP, en las pruebas de ODV, se recopilaron en una hoja de cálculo de Excel. Como se muestra en la figura 6, los individuos de C. sordidus respondieron a la prueba de tres maneras diferentes: algunos fueron los estímulos El, que siempre incluían los atrayentes (cormo/pseudotallo y feromonas). Otros individuos han recurrido al estímulo E2; en este OC, todos los compuestos ensayados se colocaron individualmente (un compuesto/ensayo) o no se colocó ningún tipo de estímulo. Sin embargo, otros han preferido no elegir, deteniéndose en lo que hemos llamado "casa" (EC).

Esta triple expresión etológica se evaluó primero con índices de movimiento construidos ad hoc , para tener una medida rápida y explicativa de las pruebas únicas realizadas en ODVs. Además, los datos fúeron probados a través de la prueba estadística de chi-cuadrado, con el software estadístico Rstudio.

Los índices de movimiento nacen de la necesidad de tener una herramienta rápida y fácilmente explicativa y, al mismo tiempo, útil para resumir la situación etológica mostrada por los PNP en las pruebas.

Se supuso que una población de PNP, puesta en ODV y la ausencia de algún estímulo se distribuiría de manera uniforme en las tres opciones posibles mientras se mantenía una relación También se consideró que los individuos que permanecen en la EC son aquellos que no respondieron al estímulo atractivo (en el caso en que no se colocó ningún estímulo en E2) o que fueron rechazados por la sustancia probada (en el caso en que E2 era colocado un candidato repelente). Por lo tanto, se construyeron tres índices que tomaron en consideración la relación entre los individuos en EC, E1 y E2 y el número total de individuos evaluados ( N ). Los tres índices son los siguientes: donde: mi = número de individuos que han elegido E1, n _E2 = número de individuos que han elegido E2, n _EC = número de individuos que permanecen en la EC, N = número total de individuos analizados.

Finalmente, para obtener un índice que tome en consideración todas estas relaciones entre grupos de individuos, los índices I _E1 , I _E2 e I _EC se han resumido en un solo índice: IM (índice de Movimiento): donde: 0 < IM> + ¥. Cuanto más cerca está de cero el IM, más significativa es la porción de la población que ha permanecido inmóvil, sin reaccionar o capturar el estímulo atractivo.

El IM se calculó para cada uno de los seis ensayos (N= 20 PNP), generando una serie de datos para cada prueba. Luego, con el software estadístico R, se realizaron pruebas ANOVA en PCFAs, PRs.

Las condiciones fisio-ambientales en realidad interfieren con la movilidad de las PNP (X ² = 17.952; df= 6; p-valor = 0.006352). A partir del análisis de ANOVA realizado en los IMs de las réplicas individuales, hubo una diferencia significativa entre las condiciones (F-valor = 3.305; p-valor = 0.0413). En la prueba de Tukey (Figura 7) podemos ver cómo las condiciones de sin luz (SL) y sin hambre (SHa) SL-SHa (IM = 0.53) son aquellas en las que el estímulo alimentario atrae más a los PNPs. El hábito nocturno de el PNP hace que el insecto, en ausencia de luz (SL), sea más móvil; además, la condición de inanición (Ha) estimula aún más los PNPs en la búsqueda de alimentos y, por lo tanto, le da mayor movilidad. La actitud nocturna del PNP es evidente ya que las pruebas realizadas en condiciones de SL, es decir, SL-Ha y SL-SHa (IM= 0,48), muestran una mayor movilidad de los PNP con respecto a las condiciones con luz (L), o L-Ha (luz-hambre) (IM= 0.36) y L-SHa (IM= 0.22). Por estas razones, la condición SL- Ha se usó como condición experimental para las PRs.

Del análisis de los datos relativos a las PRs más el control (SL-Ha), resultó que hay una significación (X ² = 34.142; df= 7; p-valor = 1.62e ^-5 ) y que, por lo tanto, el fenómeno observado sigue un patrón que no es accidental. A partir del análisis de ANOVA de los IMs , surgió que hay diferencias estadísticamente significativas entre las pruebas bajo examen (F-valor = 2.798; p-valor = 0.0181). De la prueba de Tukey (Figura 8) está claro que todos los COVs probados tienen una acción repelente hacia el PNP, disminuyendo su movilidad con respecto al control. El compuesto C7 resulta ser el que tiene la mayor acción repelente, registrando el valor de IM más bajo. No parece haber una diferencia significativa entre C1 y C6 con respecto a la tasa de repelencia. Por lo tanto, según los valores de los IMs, los diferentes COVs muestran el siguiente gradiente de repelencia: C7 (IM= 0,11), C5 (IM= 0,18), C2 (IM= 0,26), C1 (IM= 0 ,28), C4 (IM= 0,28), C3 (IM= 0.45) y C6 (IM= 0.47).