本发明属于生物医药领域； 更具体地， 本发明涉及棉酚衍生物在制备抗肿瘤药物中 的应用。 背景技术

恶性肿瘤严重威胁着人类的健康， 传统的化疗和放疗缺乏特异性， 取得疗效的同时 也往往给患者带来较大的毒副作用。

结肠癌 (Colorectal cancer)在美国是第三大常见的癌症类型，也是� �三大导致病人死亡 的癌症类型。 2009年， 美国新增结肠癌病人约有 146970例， 其中 49920例病人死亡。 非转移性结肠癌患者的 5年生存率约 90%， 但发生区域转移 (如淋巴结转移)后下降为 68%, 发生远处转移后则只有 10%。 目前临床治疗结肠癌的策略包括手术切除病灶 、 放 疗和化疗等等。 然而， 即使手术成功切除病灶并辅以术后化疗后， 5年复发率仍然很高。 因此， 进一步研究与开发新的治疗结肠癌的药物及治 疗策略显得尤为重要与紧迫。 据报 道， Bcl-2在早期结肠癌中的异常活化将抑制肿瘤细� ��凋亡， 促进肿瘤发生。 棉酚是从 棉籽中提取的一种化合物， 最初被作为男性避孕药来使用。 之前已有报道证实， 棉酚通 过与肿瘤细胞中 Bcl-2和 Bcl-xL的 BH3结构域结合实现其促凋亡的功能。 因此， 棉酚 可以考虑作为临床治疗结肠癌的候选化疗药物 。

之前有研究指出， 口服棉酚已经进入临床试验， 用于治疗激素非依赖型转移性乳腺 癌和肾上腺癌。 然而， 由于棉酚结构中存在两个活性醛基， 可能因此在体内引起肝损伤 和消化道损伤等毒副反应， 导致它不适合临床应用。 目前已经有一系列的棉酚衍生物被 报道， 如 AT-101 , Apogossypol, TW-37, ABT-737和 WL-276等等， 它们也具有抑制 癌细胞生长的活性。 此外有实验证实， Apogossypol对肝脏和胃肠道的毒性比天然棉酚 要小， 而且药效接近天然棉酚。 由于水溶性良好的化合物通常具有比低水溶性 的同类化 合物更强的药代动力学性能， 在低剂量即可产生更大的功效， 因而化合物的水溶性是评 价药物效价的一项重要的指标。 然而， Apogossypol水溶性较差， 表明它不是一个非常 合适的药物， 需要进一步改进。 因此， 有必要开发水溶性良好并且毒副作用小的棉酚 衍 生物， 作为治疗结肠癌的潜在候选药物。 发明内容

本发明的目的在于提供棉酚衍生物在制备抗肿 瘤药物中的应用。

在本发明的第一方面， 提供一种如式 I所示结构的化合物、 其异构体或其药学上可 接受的盐：

ONa

丫 、o

*■ o

个优选例中， 所述化合物具有如下所示的结构 (6-AP A-钠-棉酮):

在本发明的另一方面， 提供前面所述的化合物在制备防治肿瘤的药物 组合物中的用 途。

在一个优选例中， 所述的肿瘤包括 (但不限于)： 结肠癌， 乳腺癌， 黑色素瘤， 肺癌或 前列腺癌。

在另一优选例中， 所述的肿瘤是结肠癌。

在本发明的另一方面， 提供前面所述的化合物在制备降低抗凋亡蛋白 Bcl-2和 /或 Bcl-xL的表达的药物组合物中的用途。

在本发明的另一方面， 提供一种药物组合物， 含有： 有效量的所述的化合物或其组 合； 以及药学上可接受的载体。

在另一优选例中， 所述的药物组合物用于防治肿瘤。

在另一优选例中， 所述的药物组合物还含有： 有效量的 5-氟尿嘧啶。

在本发明的另一方面， 提供一种制备药物组合物的方法， 所述方法包括： 将有效量 的所述的化合物或其组合与药学上可接受的载 体混合。

在另一优选例中， 所述方法还包括： 将有效量的 5-氟尿嘧啶与所述的化合物或其 组合以及药学上可接受的载体混合。 在本发明的另一方面， 提供一种药盒， 含有所述的化合物； 或含有所述的药物组合 物。

在另一优选例中， 所述的药物组合物用于防治肿瘤。

本发明的其它方面由于本文的公开内容， 对本领域的技术人员而言是显而易见的。 附图说明

图 1 : 棉酚衍生物的制备及结构。

流程 1是化合物 3、 4、 5、 6、 8、 9的结构和制备的简要流程图。

流程 2是化合物 7的结构和制备流程。

其中， 数字 1-7分别代表化合物 1-7 ; R表示相应化合物的取代基。

图 2: 化合物 7抑制细胞生长并诱导细胞凋亡具有时间和剂� �依赖效应。

(A) CT26细胞用不同浓度的化合物 7处理不同时间后， 检测细胞增殖能力。 (B) CT26细胞用不同浓度的化合物 7处理不同时间后， 通过 TUNEL试剂盒检测细 胞凋亡率， 以 DMSO处理作为阴性对照 (NC)。

(C) 对 (B)的 TUNEL结果的统计图。

图 3: 化合物 7 通过与 Bcl-2和 Bcl-xL的 BH3结构域结合下调其蛋白表达水平。 (A-B) 分子对接模拟研究。利用软件 AutoDock Vina (http://vina.scripps.edu/)将抗凋亡 蛋白 Bcl-2(Protein Data Bank code 1YSW) (A)与 Bcl-xL(PDB code 1BXL) (B)与化合物 7 对接。

(C) CT26细胞用 5 μΜ和 10 μΜ化合物 7在处理不同时间， 以 DMSO处理作为阴性 对照 CNC); 之后收集细胞， 裂解， 检测 Bcl-2和 Bcl-xL蛋白表达水平的变化， β-actin作 为内参对照。

图 4: 化合物 7与传统的抗癌药物 5-氟尿嘧啶联用后， 增强了其在体外及体内抑制 结肠癌生长的活性。

(A) 化合物 7可以在体内抑制结肠癌生长。 5 x l0 ⁵ /0.1 ml 的 CT26细胞注入小鼠右 侧背部皮下。 待肿瘤体积达到约 60 mm ³ ， 将小鼠随机分成不同的组， 每组 4只。 CT26 荷瘤小鼠按 10 μιηοΐ/公斤体重的剂量每天经灌胃给予化合� �� 7连续 12天， 以灌胃给予 10%酒精作为阴性对照。 每 2天测定一次肿瘤长度和宽度。 肿瘤体积按公式长 X宽 X宽 Χ 0.52来计算。 （Ρ < 0.01用 *表示）。

(Β) 化合物 7与 5-氟尿嘧啶联用后，在体外显著抑制结肠癌生� ��。 CT26细胞用 10 μΜ 化合物 7与 25 μΜ 5-氟尿嘧啶联合处理或分别单独处理后，检测� ��胞的存活率，以 DMSO 处理作为阴性对照 (NCXP < 0.01用 *表示； P < 0.001用 **表示；)。

(C) CT26荷瘤小鼠按 (A)分组。 荷瘤小鼠按 10 μιηοΐ/公斤体重的剂量每天经灌胃给予 化合物 7， 以 10%乙醇作为对照； 同时， 按 10毫克 /公斤体重的剂量每两天经腹腔注射 5-氟尿嘧啶一次， 以 PBS作为对照。 每 2天测量小鼠肿瘤并计算体积 (Ρ < 0.01用 *表示； Ρ < 0.001用 **表示）。

图 5:化合物 7与天然棉酚 (化合物 1)在正常小鼠体内的毒性比较。6-8周雄性 BALB/c 小鼠分成 3组， 每组 6只， 分别按 120 μιηοΐ/公斤体重的剂量连续 12天经灌胃给予化合 物 7或 1， 对照组灌给 10%乙醇 (NC；)。

(Α) 不同处理组的小鼠生存情况统计。

(Β) 12天以后称量所有小鼠体重， 并做统计分析 (Ρ < 0.01用 *表示）。

(C) 取 3组小鼠的小肠， 用石蜡包埋， 5 μιη切片后做苏木素 -伊红染色， 并于镜下观 察。 具体实施方式

棉酚由于其低水溶性以及体内副作用的原因， 一直没有在临床上被普遍用于抗肿瘤 治疗。 为了克服以上缺点， 本发明人进行了广泛而深入的研究， 设计并合成了一些新的 棉酚衍生物， 并且分析了它们的抗癌活性， 从中找到了一类抗肿瘤效果明显、水溶性好、 毒副作用低的棉酚衍生物。 在此基础上完成了本发明。 化合物

一种具有如结构式 （I) 所示结构的化合物:

R1-R4独立地选自 OH， H或 0。

相对于天然棉酚， 由于在醛基位置上的改变 (由醛基变为 R基团)， 引入水溶性片段 制备得到席夫碱衍生物， 使得本发明的化合物 （特别是化合物 7、 化合物 3以及化合物 6-9) 的可溶性显著优于天然的棉酚。

作为本发明的优选方式， 所述的化合物具有如下所示的结构：

如 " li " 的表示方法是本领域人员熟知的， 其表示该位置的键可以是单键， 也可以 是双键。

本发明还包括上述化合物的药学上可接受的盐 、 水合物或前体， 只要它们也具有防 治肿瘤的作用。 所述的 "药学上可接受的盐"是指一类化合物与无机酸� �� 有机酸、 碱金 属或碱土金属等反应生成的盐。 这些盐包括 （但不限于 (1) 与如下无机酸形成的盐： 如盐酸、 硫酸、 硝酸、 磷酸； （2) 与如下有机酸形成的盐， 如乙酸、 草酸、 丁二酸、 酒 石酸、 甲磺酸、 马来酸、 或精氨酸。 其它的盐包括与碱金属或碱土金属 (如钠、 钾、 钙或 镁)形成的盐， 以酯、 氨基甲酸酯， 或其它常规的 "前体药物" 的形式。

所述的 "化合物的前体"指当用适当的方法服用后， 该化合物的前体在病人体内进 行代谢或化学反应而转变成具有结构式 (I)所示结构的一种化合物， 或结构式 (I)所示结构 的一个化合物所组成的盐或溶液。

本发明还包括上述化合物的异构体、 外消旋体， 只要它们也具有防治肿瘤的作用。 化合物具有一个或多个不对称中心。 所以， 这些化合物可以作为外消旋的混合物、 单独 的对映异构体、 单独的非对映异构体、 非对映异构体混合物、 顺式或反式异构体存在。

作为本发明的一种特别优选的方式， 所述的化合物是 6-APA-钠-棉酮。 经验证， 该 化合物水溶性明显大于天然棉酚， 毒副作用明显低于天然棉酚， 且具有非常好的抗肿瘤 作用。

本领域人员应理解， 在得知了本发明化合物的结构以后， 可通过多种本领域熟知的 方法、 利用公知的原料， 来获得本发明的化合物， 比如化学合成或从生物 （如动物或植 物） 中提取的方法， 这些方法均包含在本发明中。

合成化学改造、 保护官能团方法学 (保护或去保护)对合成应用化合物是很有帮助� ��， 并且是现有技术中公知的技术， 如 R. Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers (1989)； T.W. Greene and P.G.M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3 ^rd Ed., John Wiley and Sons (1999)； L. Fieser and M. Fieser, Fieser and

Fieser ' ^y s Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1994)； 禾口 L. Paquette, ed.， Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1995)中都有公开。 用途

基于本发明人的新发现，本发明提供了具有式 （I) 所示的结构的化合物或其异构体、 外消旋体、 药学上可接受的盐、 水合物或前体的用途， 用于制备防治肿瘤的药物 (或组合 物）。 在本发明的实施例中， 具体验证了各化合物对于多种肿瘤细胞株的抑 制作用， 结果 证明了各化合物可以不同程度地发挥抗肿瘤作 用。特别是 6-APA-钠 -棉酮 (化合物 7)的水 溶性比天然棉酚有很大改善， 且具有很好的抗肿瘤活性。 6-APA-钠 -棉酮通过诱导肿瘤 细胞中 Bcl-2和 Bcl-xL蛋白表达水平的下降，并且抑制 Bcl-2和 Bcl-xL与其促凋亡蛋白 形成二聚体来诱导肿瘤细胞发生凋亡。 体内实验证实 6-APA-钠-棉酮能够抑制小鼠结肠 癌细胞形成肿瘤的生长。 此外， 6-APA-钠-棉酮在体内的毒副作用也比天然棉酚� �小， 并且该化合物与 5-氟尿嘧啶联合使用时， 对结肠癌的生长有了更好的抑制作用。 因此， 6-APA-钠-棉酮用于肿瘤 (特别是结肠癌)治疗的前景要优于天然棉酚，� ��有可观的临床研 究和应用价值。 组合物

如本文所用， 术语 "本发明的组合物" 通常是药物组合物， 其含有式 （I) 所示结构 的化合物或其异构体、 外消旋体、 药学上可接受的盐、 水合物或前体作为防治肿瘤的活 性成分； 以及药学上可接受的载体或赋形剂。

本发明中， 术语 "含有" 表示各种成分可一起应用于本发明的混合物或 组合物中。 因此， 术语 "主要由...组成" 和 "由 .. 且成"包含在术语 "含有" 中。

本发明中， "药学上可接受的"成分是适用于人和 /或动物而无过度不良副反应 (如毒 性、 剌激和变态反应)即有合理的效益 /风险比的物质。

本发明中， "药学上可接受的载体" 是用于将本发明的具有式 （I) 所示结构的化合 物或其异构体、 外消旋体、 药学上可接受的盐、 水合物或前体传送给动物或人的药学上 或食品上可接受的溶剂、 悬浮剂或赋形剂。 载体可以是液体或固体。 适用于本发明的药 学上可接受的载体包括（但并不限于）： 盐水、 缓冲液、 葡萄糖、 水、 甘油、 乙醇、 及其 组合。

本发明还提供了制备防治肿瘤的组合物的方法 ， 包括使用具有式 (I)所示的结构的化 合物。 可将有效量的式 （I) 化合物与药学上可接受的载体混合获得本发明 的组合物， 活 性成分在组合物中的重量比例例如可以是 0.0001-50 wt %;较佳地可以是 0.001-20 wt %。

本发明的药物组合物也可以是一种中药或天然 产物提取物， 其中含有本发明的具有 式 (I)所示结构的化合物作为活性成分， 提取可以采用一些已知的方法。

本发明所述的药物组合物的剂型可以是多种多 样的， 只要是能够使活性成分有效地 到达哺乳动物患处的剂型都是可以的。 从易于制备和给药的立场看， 优选的药物组合物 是一种注射或口服的制剂。 比如可选自： 溶液、 或悬浮液、 粉末剂、 颗粒剂、 片剂、 胶 囊剂。 其中具有式 （I) 所示结构的化合物或其异构体、 外消旋体、 药学上可接受的盐、 水合物或前体可以存在于适宜的固体或液体的 载体或稀释液中。 本发明的药物组合物中 可以加入制备不同剂型时所需要的各种常规载 体或辅料， 如填充剂、矫味剂、抗氧化剂、 香料、 色素、 润滑剂、 助流剂、 润湿剂、 乳化剂、 pH缓冲物质等。 这些添加剂都是本领 域人员所熟知的。

本发明还提供了一种防治肿瘤的方法， 包括步骤： 给需要的对象施用有效量的式 （I) 化合物。 活性成分的给药量是治疗有效量。 当外用时， 本发明所述的化合物的安全有效 量通常约 0.1ng-100mg/kg体重； 较佳的约 lng-10mg/kg体重。 当然， 具体剂量还应考虑 给药途径、 用药者健康状况等因素， 这些都是熟练医师技能范围之内的。

此外，本发明所述的化合物还可与其他活性成 分或治疗剂 （如其它抗肿瘤药物等） 一 起使用。 作为本发明的优选方式， 所述的其它活性成分或治疗剂是 5-氟尿嘧啶。

作为本发明的优选方式， 本发明所述的化合物与 5-氟尿嘧啶当用于制备药物组合物 时， 两者的使用量按照摩尔比为 1： (1-20); 较佳地为 1： (5-10); 更佳地为 1： 8。

本发明还提供了一种药盒， 其特征在于， 含有本发明所述的一种或多种化合物； 或 含有本发明所述的药物组合物。所述的药盒中 还可含有使用说明书， 以指导药物的使用。 本发明的主要优点在于：

(1) 首次揭示了一类新的棉酚衍生物， 其比天然棉酚具有更好的水溶性， 且具有较好 的抗肿瘤效果。

(2) 本发明的化合物毒副作用低， 用药安全。

(3) 本发明的化合物完全可以通过人工合成的方式 生产， 成本低廉。 下面结合具体实施例， 进一步阐述本发明。 应理解， 这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。 下列实施例中未注明具体条件的实验方法， 通常按照常规 条件如 Sambrook等人，分子克隆：实验室指南 (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件， 或按照制造厂商所建议的条件。 除非另外说明， 否则百分 比和份数按重量计算。

I. 材料和方法

除非另外说明， 所用的试剂购自 GL Biochem (上海） 公司。

1. 化合物的制备

化合物制备的概要流程见图 1， 方法描述如下：

制备 6-APA- Na-棉酮 （化合物 7)

取 39毫克 6-APA(6-氨基青霉素烷酸)， 氢氧化钠 10毫克， 0摄氏度下溶于 6毫升甲 醇和异丙醇 [1 : 1 ( v/v) ]中， 检测 PH接近 6时， 加入棉酮 48毫克， 室温保持 5小时， 抽滤， 异丙醇淋洗， 干燥得到 64毫克化合物 7。

a 化合物 7

1H NMR (300 MHz, CD ₃ OD) δ 9.54 (s, 2H), 9.53 (s, 2H), 5.65 (d, J = 6 Hz, 2H)„ 5.66 (d, J = 5.7 Hz, 2H), 5.44-5.46 (m, 4H), 4.28(br s, OH), 4.25 (br s, OH), 3.99 (m, 4H), 1.96(s, 6H), 1.98 (s, 6H), 1.66(s, 6H), 1.66 (s, 6H), 1.59 (s, 12H), 1.44 (d, J = 6.9 Hz, 12H), 1.43 (d, J = 7.2 Hz, 12H); ¹³ C NMR (75 MHz, CDC1 ₃ ) δ 187.3, 187.3, 185.4, 185.3, 172.8, 171.2, 171.1, 167.4, 167.2, 161.8, 161.5, 151.7, 151.6, 145.9, 145.8, 138.3, 138.3, 135.4, 135.4, 126.6, 126.5, 125.8, 125.7, 110.2, 73.3, 70.7, 70.5, 66.8, 66.7, 64.5, 63.4, 31.2, 28.3, 26.3, 23.9, 19.3, 19.1, 19.0, 13.4, 13.2. Anal. Calcd for C ₄₆ H ₄₄ N ₄ Na ₂ 0 ₁₄ S2.3CH ₃ 0顧 ₂ 0: C, 51.75; H, 5.50; N, 4.93. Found: C, 51.23; H, 5.06; N, 4.87. 制备 L-苯丙氨酸钠-消旋棉酚 （化合物 3)

取氢氧化钠 8毫克， 溶于 6毫升甲醇和异丙醇 [1 : 5(v/v)]全溶后， 加入 L-苯丙氨酸 33毫克， 反应液加热至 60摄氏度 0.5小时， 当 PH为 8后， 加入消旋棉酚 52毫克， 反 应液保持在 65-70摄氏度 3小时， 得到黄色沉淀， 过滤沉淀， 异丙醇淋洗， 干燥后得到 55毫克化合物 3。

化合物 3

1H NMR (300 MHz, CD ₃ OD) δ 9.45 (s, 2H), 9.26 (s, 2H), 7.50 (s, 2H), 7.49 (s, 2H), 7.23-7.00 (m, 20H), 4.19 (dd, J = 9.3, 3.6 Hz, 2H), 4.13 (dd, J = 9.3, 3.6 Hz, 2H), 3.74 (m, 4H), 3.39 (dd, J = 13.5, 3.6 Hz, 4H), 3.07 (dd, J = 13.5, 9.3 Hz, 2H), 2.97 (dd, J = 13.5, 9.3 Hz, 2H), 1.95 (s, 12H), 1.51 (d, J = 6.3 Hz, 12H), 1.49 (d, J = 6.9 Hz, 12H); ¹³ C NMR (75 MHz, CDCI3) δ 175.2, 175.2, 172.0, 171.9, 161.5, 149.5, 149.4, 146.9, 137.2, 131.5, 131.4, 129.4, 129.3, 129.1, 128.5, 128.2, 128.2, 128.0, 128.0, 127.2, 127.2, 126.3, 126.3, 117.5, 117.4, 116.8, 116.7, 115.4, 103.5, 103.4, 67.2, 67.1, 63.4, 40.9, 40.5, 27.2, 23.9, 19.4, 19.1, 19.0. 制备 2-氨基 2吲哚 -乙酸甲酯- (-)棉酚 （化合物 4)

取 2-氨基 2吲哚-乙酸甲酯 41毫克， 室温下溶于甲醇后， 加入 (-)棉酚 52毫克， 之 后反应液加热至 50-54摄氏度， 2-3小时后， 抽滤得到 62毫克化合物 4。

Ή NMR (300 MHz, CDC1 ₃ ) δ 9.64 (d, J = 7.8 Hz, IH), 9.60 (d, J = 7.5 Hz, IH), 8.30 (br s, OH), 7.95 (br s, NH), 7.64 (m, 2H), 7.52 (s, 2H), 7.08-7.36 (m, 6H), 5.53(m, IH), 5.55 (m, IH), 5.37 (br s, OH), 5.32 (br s, OH), 3.76(s, 3H), 3.78 (s, 3H), 3.66 (m, 2H), 1.99 (s, 3H), 2.02 (s, 3H), 1.50 (d, J = 6.6 Hz, 12H); ¹³ C NMR (75 MHz, CDC1 ₃ ) δ 173.5, 170.2, 161.2, 149.1, 147.1, 136.4, 132.2, 129.1, 128.0, 128.0, 125.0, 124.1, 123.0, 120.7, 118.8, 118.2, 116.0, 114.6, 111.7, 104.0, 58.8, 58.7, 53.1, 27.5, 20.3, 20.3, 20.0. 制备 （Rg， S， S)2-氨基 -3甲氧基 -3-(4-对硝基)丙醇- (-)棉酚 （化合物 5)

取 (S， S)2-氨基 -3甲氧基 -3-(4-对硝基)丙醇 39毫克， 氢氧化钠 6毫克， 室温下溶于 5毫升无水甲醇中， 检测 PH为 8后， 加入 (-)棉酚 39毫克， 反应液保持在 50-54摄氏度 5小时， 抽干溶剂用石油醚 /丙酮 (4: 1)重结晶得到 36毫克化合物 5。

化合物 5 ESI-MS [M-H]": 933.3; 1H NMR (300 MHz, CDC1 ₃ ) δ 13.45 (m, NH), 9.31 (d, J = 9 Hz, 2H), 8.17 (d, J = 7.8 Hz, 4H), 7.93 (br s, OH), 7.54 (s, 2H), 7.49 (d, J = 7.8 Hz, 4H), 5.36 (br s, OH), 4.62 (br s, OH), 3.86 (m, 2H), 3.73 (m, 4H), 3.44 (m, 2H), 3.31 (s, 6H), 2.00 (s, 6H), 1.49 (d, J = 7.8 Hz, 12H); ¹³ C NMR (75 MHz, CDC1 ₃ ) δ 172.9, 163.4, 149.5, 147.8, 146.6, 146.0, 131.9, 128.2, 128.0, 127.9, 127.9, 123.3, 123.3, 117.8, 117.1, 115.1, 103.6, 81.0, 68.1, 61.5, 56.8, 27.2, 19.4, 19.4, 18.8. 制备 6-APA-K-(+)棉酚 (化合物 6)

取 43毫克 6-APA，氢氧化钾 11毫克， 0摄氏度下溶于 6毫升甲醇和异丙醇 [l : l(v/v)] 中， 检测 PH接近 6时， 加入 C+)棉酚 52毫克， 室温保持 5小时， 有黄色沉淀， 抽滤， 异丙醇淋洗， 干燥得到黄色粉末 42毫克化合物 6。

K 化合物 6

1H NMR (300 MHz, CD ₃ OD) δ 9.86 (s, 2H), 7.55 (s, 2H), 5.66 (br s, 2H), 5.41 (br s, 2H) 4.30 (br s, OH), 3.82(m, 2H), 2.03 (s, 6H), 1.73 (s, 6H), 1.58 (s, 6H), 1.44 (br d, 12H). 制备 L-异亮氨酸钠-消旋棉酚 （化合物 8)

取氢氧化钠 9毫克， 溶于 6毫升甲醇和异丙醇 [1 : 5(v/v)]全溶后， 加入 L-异亮氨酸 29毫克， 反应液加热至 60摄氏度 0.5小时， 当 PH为 9后， 加入消旋棉酚 58毫克， 反 应液保持在 65-70摄氏度 3小时， 得到黄色沉淀， 过滤沉淀， 异丙醇淋洗， 干燥后得到 52毫克化合物 8。

1H NMR (300 MHz, CD ₃ OD) δ 9.78 (s, 2H), 7.54 (s, 2H), 3.85 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 3.77 (m, 2H), 2.06 (m, 2H), 2.02 (s, 6H), 1.65 (m, 2H), 1.50 (br d, 12H), 1.24 (m, 2H), 1.00 (2 br d, 6H), 0.94 (br t, 6H); ¹³ C NMR (75 MHz, CDC1 ₃ ) δ 175.6, 175.5, 171.7, 161.8, 149.7, 147.1 131.6, 128.2, 127.5, 127.4, 117.9, 117.7, 117.0, 115.8, 103.8, 63.4, 38.9, 38.8, 27.2, 24.1, 24.1, 19.6, 19.2, 15.3, 15.3, 10.8. 制备 L-异亮氨酸钠 -(+)棉酚 （化合物 9)

取氢氧化钠 13毫克， 溶于 6毫升甲醇和异丙醇 [1 : 5(v/v)]全溶后， 加入 L-异亮氨酸 42毫克， 反应液加热至 60摄氏度 0.5小时， 当 PH为 9后， 加入 (+)棉酚 85毫克， 反应 液保持在 65-70摄氏度 3小时， 得到黄色沉淀， 过滤沉淀， 异丙醇淋洗， 干燥后得到 119 毫克化合物 9。

9

1H NMR (300 MHz, CD ₃ OD) δ 9.76 (s, 2H), 7.53 (s, 2H), 3.82(d, J = 2.4 Hz, 2H), 3.75

(m, 2H), 2.03 (m, 2H), 2.03 (s, 6H), 1.50 (t, J = 6.9 Hz, 12H), 1.00 (d, J = 6.6 Hz, 6H), 0.93 (t, J = 7.2 Hz, 6H); ¹³ C NMR (75 MHz, CDC1 ₃ ) δ 175.4, 171.8, 161.8, 149.7, 147.0, 131.7, 128.1, 127.3, 117.8, 116.9, 115.7, 103.7, 63.4, 38.8, 27.2, 24.6, 24.2, 24.0, 19.5, 19.2, 15.3, 10.7.

2. 细胞培养

小鼠结肠癌细胞系 CT26(获自美国 ATCC生物资源中心)， 乳腺癌细胞系 4T1 (获自 美国 ATCC生物资源中心)与黑色素瘤细胞系 B16-F10 (获自美国 ATCC生物资源中心） 用 RMPI-1640培养基 (HyClone, Logan, UT)添加 10%胎牛血清 (HyClone；)， 100单位 /毫升 青霉素和 100ug/mL链霉素 (Invitrogen, Carlsbad, CA)培养。 人结肠癌细胞系 HCT116(获 自美国 ATCC生物资源中心)和 SW620(获自美国 ATCC生物资源中心)， 肺癌细胞系 A549C获自美国 ATCC生物资源中心；)， 乳腺癌细胞系 MDA-MB-435C获自美国 ATCC生 物资源中心)和 MCF-7(获自美国 ATCC生物资源中心)， 前列腺癌细胞系 PC-3(获自美国 ATCC生物资源中心)用 DMEM (HyClone) 添加 10%胎牛血清，青霉素和链霉素在 37°C， 5% C0 ₂ 培养箱中培养。

3. 细胞活力检测

先将合成的化合物用 DMSO溶解。 将不同类型肿瘤细胞系以每孔 5 X 10 ³ /100 μ1种 于 96孔板。 贴壁后， 加入不同浓度的化合物或联合 5-氟尿嘧啶 （Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japan)处理 72小时， 以 DMSO为阴性对照。 处理结束后， 加入 3-(4,5- 甲基偶氮基) -2,5二苯基四唑盐 (MTT， Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), 然后再在 37°C避 光孵育 4小时。 产生的晶体用 DMSO溶解后于酶标仪上读数。

4. 细胞增殖能力检测

CT26细胞以每孔 2 X 10 ³ 细胞 /ΙΟΟ μΙ种于 96孔板。 加入不同浓度的化合物 7处理 不同时间后， 用 Cell Titer 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Kit试剂盒 (Promega Corporation, Madison, WI)检测细胞增殖能力。 实验具体操作步骤见试剂盒说明书。

5. TUNEL细胞凋亡检测

CT26细胞用不同浓度的化合物 7处理不同时间后，用 In Situ Cell Death Detection Kit 试剂盒 (Roche Applied Science, Mannheim, Germany)检测细胞凋亡程度。 细胞用 PBS 洗两次后， 用 4%多聚甲醛在室温下固定 1小时， 用 PBS洗两次后， 用通透细胞溶液在 冰上处理细胞 2分钟， 再用 PBS洗两次后， 与凋亡检测反应混合液在 37°C避光孵育 1 小时， 细胞核用 DAPI染色， 最后用 PBS洗两次。 在荧光显微镜下分析样品， 随机选五 个视野计数阳性的细胞， 统计分析阳性细胞百分比。

6. 分子对接模拟

本发明人利用软件 AutoDock Vina (http://vina.scripps.edu/)将抗凋亡蛋白

Bcl-2(Protein Data Bank code 1YSW)与 Bcl-xL(PDB code 1BXL)与化合物 7对接。

7. 免疫印迹

细胞用化合物 7处理后， 细胞裂解液用 10%SDS-PAGE凝胶电泳， 之后转印到硝酸 纤维素膜 (Amersham Bioscience, Buckinghamshire, UK)上。 膜用含 5%(w/v)脱脂牛奶和 1 %。(v/v)吐温 -20的 TBS溶液室温封闭 1小时，然后用抗 Bcl-2 (Cell Signaling, Beverly, MA): Bcl-xL (Cell Signaling)和 β-actin (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, C A)的抗体在 4°C 孵育过夜。 TBST洗 3次后，用辣根过氧化物酶 (HRP)标记的二抗 (Jackson ImmunoRe search Laboratories, West Grove, PA)在室温下孵育 1小时， TBST洗 3次后， 用化学发光底物 SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA) 显色， 实验具体操作步骤见试剂盒说明书。

8. 体内抗肿瘤活性检测

6-8周的雄性 BALB/c小鼠购自上海实验动物中心， 小鼠的饲养依据上海第二医科 大学关于实验动物使用的准则。 5 x l0 ⁵ /0.1 ml 的 CT26细胞注入小鼠右侧背部皮下。 待 肿瘤体积达到约 60 mm ³ ， 将小鼠随机分成不同的组， 每组 4只。 化合物 7用 10%乙醇 溶解。 小鼠按 ΙΟ μιηοΙ/公斤体重的剂量连续 12天经灌胃给予化合物 7， 以灌胃给予 10% 乙醇作为对照。 5-氟尿嘧啶按 10毫克 /公斤体重的剂量每两天经腹腔注射给药一次� � 以 腹腔注射 PBS作为阴性对照。 每 2天测定一次肿瘤长度和宽度。肿瘤体积按公� �长 X宽 X宽 Χ 0.52来计算。

9. 体内毒性检测

化合物 7和天然棉酚 (化合物 1)用 10%(ν/ν)乙醇溶解。 6-8周雄性 BALB/c小鼠分成 3组， 每组 6只， 分别按 120 μιηοΐ/公斤体重的剂量连续 12天经灌胃给予化合物 7或 1， 对照组灌给 10%乙醇。 统计小鼠的生存情况， 12天以后称量所有小鼠体重， 并做统计分 析。 取 3组小鼠的小肠， 用石蜡包埋， 5 μιη切片后做苏木素 -伊红染色， 并于镜下观察。

10. 统计分析

用 Student's t-test检验比较两组数据之间的差异， P值小于 0.05被认为差异有统计 学意义。

11. 实施例

实施例 1. 细胞活力检测

本发明人首先检测了新合成的化合物 (图 1， 化合物 3-9; 其中化合物 8为光学消旋 体， 化合物 9为正旋光化合物)对不同肿瘤细胞系的杀伤作� ��。将一些人和小鼠的肿瘤细 胞系用不同浓度的化合物处理 72小时后， MTT法检测细胞活力。

结果表明， 化合物 3-9对于肿瘤细胞均具有一定的杀伤效果， 特别是化合物 7。 人 和小鼠结肠癌细胞系 SW620, HCT1 16和 CT26对化合物 7比较敏感，半数致死剂量 IC ₅₀ 约为 6 至 18 μΜ (；表 1)。 乳腺癌细胞系 MDA-MB-435 , MCF-7和 4T 1对化合物 7也有一 定敏感性， IC _5Q 值超过 28 μΜ。 化合物 7还对小鼠黑色素瘤细胞系 B 16-F 10 , 人肺癌细 胞系 Α549和前列腺癌细胞系 PC-3具有比较明显的杀伤作用 (表 1)。 这些结果表明， 化 合物 7对结肠癌细胞系有显著的杀伤作用。 因此， 化合物 7可作为肿瘤 （特别是结肠癌) 治疗的候选药物进一步去研究。

表 1、 细胞增殖活力检测

为进一步研究化合物 7对结肠癌细胞系的杀伤作用是否具有时间和� �量依赖效应， 本发明人用不同浓度的化合物 7在不同时间点处理 CT26细胞， 检测细胞的增殖能力。 结果表明， 20 μΜ化合物 7明显抑制 CT26细胞的生长（图 2Κ)。 在 20 μΜ化合物 7处理 24小时后， 大约 80%的 CT26细胞存活。 再处理 24小时后， 只有约 60%的细胞存活； 再处理 3天后， 几乎所有的细胞都已死亡。 10 μΜ和 5 μΜ化合物 7同样可以有效地抑 制 CT26细胞的生长（图 2Α)。 然而， 2 μΜ化合物 7对 CT26细胞只有轻微的抑制作用， 即使在处理 120 h后， 超过 90%的细胞仍然存活（图 2A)。 另外， 在同一时间点， 高剂量 的化合物 7对 CT26细胞的杀伤作用比低剂量的要强。这些数� �表明， 化合物 7对 CT26 细胞的杀伤作用具有时间和剂量依赖效应。 实施例 2. 化合物 7诱导 CT26细胞凋亡

本发明人用不同浓度的化合物 7处理 CT26细胞 24、 48或 72小时， 通过 TUNEL 试剂盒检测肿瘤细胞的凋亡率（图 2B)。 TUNEL统计结果见图 2C。

上述结果表明， 化合物 7可诱导肿瘤细胞凋亡， 且诱导肿瘤细胞凋亡具有时间和剂 量依赖效应。 实施例 3. 化合物 7通过与 Bcl-2和 Bcl-xL的 BH3结构域结合下调其蛋白表达水平 之前的研究结果表明， 棉酚可作为 BH3结构域的模拟物来调节 Bcl-2家族蛋白的表 达。 本发明人通过 AutoDock Vina软件将化合物 7与 Bcl-2和 Bcl-xL做了模拟对接。 对 接模型的结果显示， 化合物 7可以结合到 Bcl-2和 Bcl-xL的 BH3结构域中（图 3A)， 说 明化合物 7能结合到 Bcl-2和 Bcl-xL上。

因此， 本发明人用化合物 7处理 CT26细胞后， 检测 Bcl-2和 Bcl-xL蛋白表达水平 的变化。结果表明， 5 μΜ和 10 μΜ化合物 7在处理 CT26细胞 24小时后， Bcl-2和 Bcl-xL 蛋白水平有显著下降 (图 3C)。

上述数据表明， 化合物 7可以降低 CT26细胞中的抗凋亡蛋白 Bcl-2和 Bcl-xL的表 达， 与分子模拟对接的结果一致。 实施例 4. 化合物 7与 5-氟尿嘧啶联用后，增强了其在体外及体内抑� ��结肠癌生长的 活性

根据本发明人之前的研究结果， 化合物 7具有体外抗肿瘤活性。 本发明人给 CT26 荷瘤小鼠按 10 μιηοΐ/公斤体重的剂量每天经灌胃给予化合� �� 7， 12天后， 给药组小鼠的 肿瘤体积显著小于对照组 (Ρ < 0.01) (图 4Α)。 本发明人选择 5-氟尿嘧啶 (5-FU)与化合物 7(图中简写为" 7" )联用，研究它们联用后对结肠癌生长的抑制� �果。结果表明， ΙΟ μιηοΙ/ 升化合物 7与 25 μιηοΐ/升 5-氟尿嘧啶联用后， 对 CT26细胞的生长抑制明显超过化合物 7或 5-氟尿嘧啶单独使用的效果 (Ρ < 0.01) (图 4Β)。

因此， 本发明人给 CT26荷瘤小鼠按 10 μιηοΐ/公斤体重的剂量每天经灌胃给予化合 物 7， 以 10%乙醇作为对照； 同时， 按 10毫克 /公斤体重的剂量每两天经腹腔注射 5-氟 尿嘧啶一次， 以 PBS作为对照。 结果表明， 12天后， 化合物 7与 5-FU联用组的小鼠肿 瘤体积明显小于化合物 7或 5-FU单用组 (Ρ < 0.01)(图 4C；)。

上述结果表明， 化合物 7与 5-FU联用可以作为新的结肠癌化疗策略。 实施例 5. 化合物 7与天然棉酚 (化合物 1)的体内毒性比较

之前有文章报道 apogossypol按 120 μιηοΐ/公斤体重的剂量处理小鼠后， 比等同剂量 的天然棉酚毒性小。 因此， 本发明人按同样的剂量经灌胃给予小鼠化合物 7(图中简写为 " 7"；)或化合物 1(图中简写为 " 1 " ), 对照组灌给 10%乙醇， 观察小鼠的生存情况与体 重变化。

结果显示， 由于化合物 1在小鼠体内的损伤的积累， 在第 8天， 化合物 1处理的小 鼠有一只死亡； 第 12天， 第二只小鼠死亡 (图 5Α；)。 然而， 所有的化合物 7处理的小鼠 在第 12天仍然存活。 另外， 化合物 1处理 12天后的小鼠体重与处理前相比有显著下降 (Ρ < 0.01), 而化合物 7处理后的小鼠体重并没有显着下降 (图 5Β)。

而且， 化合物 1处理的小鼠小肠与对照组相比有明显损伤， 但化合物 7处理组小鼠 与对照组没有明显差别 (图 5C)。

因此，化合物 7比化合物 1在体内的毒性小，表明它是一个较为理想的� �肿瘤药物， 可用于进一步的临床。 实施例 6. 各化合物的水溶性实验

测量天然棉酚 (化合物 1和 2)以及各新化合物 (化合物 3-9)在 37°C时在 100克水中的 溶解度， 以比较它们的水溶性情况。

结果发现， 化合物 7在 37 °C时在 100克水中的溶解度为 9.25克， 而天然棉酚在同样 条件下的溶解度小于 0.001克。 因此， 化合物 7的水溶性要明显优于天然棉酚。

化合物 3、 6以及 8-9(均为盐)的水溶性也较好，溶解度大大提高� ��明显优于天然棉酚。 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作 为参考， 就如同每一篇文献被单独引 用作为参考那样。 此外应理解， 在阅读了本发明的上述讲授内容之后， 本领域技术人员 可以对本发明作各种改动或修改， 这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书 所限定 的范围。