INTRODUCTION

Les infections par des bactéries de la famille des Chlamydiaceae, qui peuvent toucher les hommes ou les animaux, sont responsables d'un ensemble de pathologies particulièrement graves.

La chlamydiose est la plus fréquente des maladies sexuellement transmissibles d'origine bactérienne avec près de 106 millions de nouveaux cas par an. Des traitements efficaces par antibiotiques existent mais cette maladie est souvent asymptomatique (75% des femmes et 50% des hommes). La plupart des patients n'est donc pas traitée car non diagnostiquée et les conséquences d'une infection non traitée peuvent être graves (stérilité, grossesses extra-utérines, accouchements prématurés, infections néonatales).

Ainsi, le développement d'un vaccin est un enjeu sanitaire majeur afin d'éradiquer la maladie.

Il n'existe à ce jour aucun vaccin efficace pour prévenir les infections à Chlamydiae chez l'Homme. Différentes stratégies vaccinales ont été menées ces vingt dernières années mais des problèmes de faible immunogénicité (vaccins antigéniques, formes inactivées) ou réglementaires (formes vivantes atténuées pouvant être réactivées) n'ont pas permis à ces vaccins d'être testés en phase clinique.

La famille des Chlamydiaceae comprend deux genres, Chlamydia et Chlamydophila, eux-mêmes comprenant chacun plusieurs espèces ; chaque espèce se compose de différents biovars et sérovars. Chacune de ces espèces conduit à un ensemble de pathologies invalidantes chez l'homme ou les animaux, voire mortelles dans le cas des infections par C. psittaci.

Les bactéries de la famille des Chlamydiaceae sont des bactéries gram négatives. Elles sont dites « intracellulaires strictes » car ne pouvant croître et se multiplier que dans une vacuole parasitophore au sein d'une cellule eucaryote infectée. Au cours de leur développement, les bactéries de la famille des Chlamydiaceae se présentent sous deux formes : • Le corps élémentaire (CE), qui est la forme infectieuse et ne se divise pas, et

• Le corps réticulé (CR), non infectieux, strictement intracellulaire et qui se divise par fission binaire.

Le CE pénètre la cellule hôte au sein d'une vésicule. Si plusieurs CE infectent la même cellule, les vésicules généralement se regroupent au niveau du centrosome et fusionnent entre elles pour former l'inclusion. Après 5 à 12 heures d'infection, les CE se différencient en CR qui se multiplient activement. Après 30 à 40 heures, les CR se transforment en CE ; l'inclusion et la cellule hôte sont ensuite lysées, libérant la progéniture bactérienne qui va infecter les cellules voisines. Tous ces paramètres peuvent varier d'un sérovar et d'une espèce bactérienne à l'autre, et en fonction des conditions expérimentales (Fields, K. A. & T. Hackstadt, Annu Rev Cell Dev Biol 18: 221 -45, 2002).

Au cours de son cycle de développement, la bactérie met en place de nombreuses stratégies afin de survivre dans la cellule hôte. La bactérie Chlamydia inhibe notamment l'apoptose de la cellule hôte induite par les signaux externes, inhibe la fusion des lysosomes avec l'inclusion bactérienne, déroute le trafic vésiculaire vers la vacuole pour permettre la croissance de celle-ci, et injecte dans le cytoplasme de multiples facteurs de virulence, dont une protéase clef (Chlamydia protease/proteasome-like activity factor, CPAF) qui induit la dégradation de nombreuses protéines eucaryotes, des facteurs de transcription des molécules du complexe majeur d'histocompatibilité, responsables de la présentation des antigènes aux cellules du système immunitaire.

A ces mécanismes développés au cours d'un cycle bactérien continu s'ajoute le phénomène de persistance. En réponse à certains stress dans l'environnement cellulaire, tels que la présence de certains antibiotiques ou de l'Interféron gamma (IFN-γ) ou l'absence de fer, la bactérie arrête son cycle bactérien et son mécanisme prolifératif, devenant ainsi un corps persistant, viable mais non cultivable in vitro. La persistance rend compte d'un haut niveau d'interaction entre le pathogène et l'hôte et permettrait à la bactérie de pouvoir rester vivante, ou dormante (« persistante »), dans l'organisme pendant des mois, voire des années. En effet, bien qu'il soit très difficile de mettre en évidence la persistance in vivo, de multiples études permettent de penser qu'une bactérie Chlamydia peut exister pendant plusieurs années au sein d'un tissu tel que le tractus génital, la muqueuse conjonctive ou le tissu vasculaire, engendrant ainsi infections récurrentes et inflammation chronique (Beatty et al. , Microbiol Rev 58(4): 686-99, 1994; Kern et al. , FEMS Immunol Med Microbiol. 55(2): 131 -9, 2009). Le taux élevé d'infections asymptomatiques et la sévérité des pathologies justifient la recherche active d'un vaccin sûr et efficace pour le contrôle des infections à Chlamydia. A ce jour, une quarantaine d'essais vaccinaux ont été réalisés principalement chez la souris, en utilisant soit des bactéries inactivées ou des antigènes purifiés ou protéines antigéniques recombinantes, voire des vaccins à ADN (voir par exemple Hafner et al. , Vaccine, 32(14) : 1563-1571 , 2014, Farris et al. , Infection and Immunity, 79 : 986-996, 201 1 , Schautteet et al. , Infect. Dis. Obstet. Gynecol. , 201 1 :963513, 201 1 ; Campos et al., In vision and ophtalmology, 36(8) 1477-1491 , WO 92/00096 ; Lu Hang et al. , The Journal of Immunology, 169(1 1 ), 6324-6331 ). Aucun n'a donné de résultat convaincant. Il est convenu qu'une forme atténuée de la bactérie pourrait être la base d'un excellent vaccin. Malheureusement les Chlamydiaceae ne peuvent pas être transformées et très peu de souches atténuées expérimentalement ont pu être isolées.

Actuellement aucun vaccin n'existe sur le marché pour prévenir les infections à Chlamydiaceae chez l'homme. Le caractère asymptomatique d'un grand nombre d'infections par les bactéries de la famille des Chlamydiaceae et la sévérité des pathologies développées justifient la recherche d'un vaccin préventif sûr et efficace, c'est-à-dire qui présente une grande immunogénicité tout en garantissant un faible risque d'infection par le sujet.

Les inventeurs ont trouvé que, de façon très surprenante et contrairement aux préjugés établis, les formes de Chlamydiaceae inactivées par un inhibiteur du peptidoglycane, notamment des β-lactamines ou la D-cyclosérine peuvent être utilisées de façon très efficace pour fabriquer des médicaments pour le traitement prophylactique des infections par des bactéries de la famille des Chlamydiaceae.

DESCRIPTION DE L'INVENTION Les inventeurs ont précédemment montré que le traitement de cultures cellulaires infectées par des bactéries de la famille des Chlamydiaceae, par des inhibiteurs du peptidoglycane, notamment par les β-lactamines, conduit à la formation de formes bactériennes anormales, les formes BL, qui ont perdu toute infectiosité (WO 201 1 /086134 ; Dumoux et al. , PLoS One. 8(12):e8351 1 , 2013). Ces résultats ont été ultérieurement confirmés par d'autres laboratoires. (Ouellette et al. , Mol Microbiol. 85(1 ): 164-178, 2012 ; Pilhofer et al. , Nat Commun. 4:2856, 2013 ; Liechti et al. , Nature. 506(7489) : 507-510, 2014). Les inventeurs ont maintenant trouvé que, de façon tout à fait surprenante, les formes BL présentent toujours des antigènes natifs, alors même que ces formes sont anormalement dilatées et ne sont absolument plus infectieuses. L'injection de formes BL à des souris permet ainsi de protéger ces animaux contre des infections ultérieures par des bactéries infectieuses. Cette forme BL représente donc une forme inactivée utilisable pour immuniser des individus naïfs, susceptibles d'être infectés par les Chlamydiaceae.

Les inventeurs ont montré que la forme BL obtenue par traitement des bactéries de la famille des Chlamydiaceae par un inhibiteur du peptidoglycane, notamment par une β-lactamine, est immunogène. Le terme « immunogène » tel qu'on l'entend ici se rapporte à la capacité d'une molécule de déclencher une réponse immunitaire, que celle-ci soit humorale ou à médiation cellulaire ou encore les deux. Une réponse immunitaire à une forme bactérienne immunogène, telle qu'entendue ici, signifie le développement chez un sujet d'une réponse immunitaire humorale et/ou à médiation cellulaire à une ou des molécules présentes dans ladite forme bactérienne (par exemple, un antigène, comme une protéine, un glycolipide (LPS) ou un polysaccharide). On entend par « réponse immunitaire humorale » une réaction immunitaire dont les effecteurs sont des molécules solubles, comme par exemple les anticorps. Ceux-ci sont notamment produits par les plasmocytes et les lymphocytes B. Une « réponse immunitaire à médiation cellulaire » au sens de l'invention est une réaction immunitaire dont les effecteurs sont des cellules telles que les lymphocytes T cytotoxiques, les cellules T tueuses ou les cellules T helper. Une « réponse immunitaire à médiation cellulaire » au sens de l'invention comprend aussi la production de cytokines, chimiokines et autres molécules similaires produites par les cellules T activées et/ou d'autres cellules hématopoïétiques, y compris celles dérivées de lymphocytes T CD4 ⁺ ou CD8 ⁺ , et/ou des cellules épithéliales. La capacité d'un antigène ou d'une forme bactérienne particulière de stimuler une réponse immunitaire à médiation cellulaire peut être aisément déterminée par l'homme du métier. Il existe dans l'art un grand nombre de tests à cet effet (voir par exemple, Erickson et al. , J. Immunol. 1 51 : 4189-4199, 1993; Doe et al. , fur. J. Immunol. 24 : 2369-2376, 1994).

En particulier, la forme BL de la présente invention est susceptible de déclencher une réponse immunitaire de lymphocytes B producteurs d 'anticorps et de lymphocytes-T (LT) spécifiques des Chlamydiae dans la rate. En réponse à une infection intra-vaginale par Chlamydia, ces LT effecteurs activés (effecteurs ou régulateurs) sont susceptibles de quitter la rate pour les ganglions drainant le tractus génital siège de l'infection.

Selon un premier aspect, l'invention a pour objet une composition vaccinale comprenant des bactéries de la famille des Chlamydiaceae préalablement traitées par au moins un inhibiteur du peptidoglycane, notamment par une β-lactamine, ou des extraits de celles-ci pour son utilisation dans le traitement prophylactique et/ou thérapeutique d 'infections par des bactéries de la famille des Chlamydiaceae.

Par « famille des Chlamydiaceae », on entend au sens de l'invention l'ensemble taxonomique composé de deux genres, Chlamydia et Chlamydophila, tel que défini dans Bush & Everett, Int J Syst Evol Microbiol. 51 (Pt 1 ):203-20, 2001 . De même, par « genre Chlamydia », on entend au sens de l'invention l'ensemble taxonomique comprenant les espèces Chlamydia trachomatis, Chlamydia suis et Chlamydia muridarum, et par « genre Chamydophila », l'ensemble taxonomique composé des espèces Chlamydophila abortus, Chlamydophila psittaci, Chlamydophila caviae, Chlamydophila pecorum, Chlamydophila felis et Chlamydophila pneumoniae (Bush & Everett, Int J Syst Evol Microbiol. 51 (Pt 1 ):203-20, 2001 ). I l est bien connu de l'homme du métier que ces espèces ont des spectres d 'hôtes distincts : par exemple, Chlamydia trachomatis et Chlamydophila pneumoniae sont responsables d 'infections chez l'homme, Chlamydia suis chez le porc et Chlamydophila abortus chez les ruminants. L'invention n'est pas limitée à une espèce bactérienne spécifique, mais peut être appliquée à n'importe laquelle des espèces de la famille des Chlamydiaceae et, en particulier, à celles mentionnées ci-dessus.

Divers adjuvants sont couramment utilisés dans la fabrication de compositions vaccinales afin d'en augmenter l'immunogénicité, par exemple en stimulant le système immunitaire. Au sens de l'invention, le terme « adjuvant » décrit toute substance ajoutée pour accélérer, prolonger, renforcer ou modifier la qualité de la réponse immune spécifique induite par la composition selon l'invention quand l'adjuvant et la composition selon l'invention sont utilisés conjointement. Les adjuvants sont ainsi des produits qui augmentent les réactions du système immunitaire inné et adaptatif, lorsqu'ils sont administrés en présence d'antigènes d'origine virale, bactérienne ou synthétique. Ils provoquent l'attraction massive de macrophages au site d'injection, puis dans les ganglions lymphatiques, activent les cellules dendritiques, accroissent la production d'immunoglobulines spécifiques, les anticorps, et stimulent de nombreuses cellules impliquées dans les mécanismes de la défense immunitaire. Ainsi, selon un mode de réalisation particulier, la composition selon l'invention comprend en outre un adjuvant pharmaceutiquement acceptable. Les adjuvants pharmaceutiquement acceptables sont bien connus de l'homme du métier et pourront être choisis en fonction de propriétés propres et intéressantes de ces adjuvants, telles que celles décrites par Petrovsky et al. , Immunology and Cell Biology, 82: 488-496, 2004 ou encore Vermout et al. , Ann. Méd. Vét. 147: 393-401 , 2003. Il est bien connu par ailleurs que les adjuvants de l'immunité peuvent être adaptés en particulier en fonction de la voie d'administration choisie.

L'adjuvant selon l'invention sera par exemple choisi parmi des constituants bactériens, des toxines bactériennes, des adjuvants huileux, des adjuvants minéraux, des oligodésoxynucléotides CpG, des saponines, des adjuvants vésiculaires ou nanoparticulaires, des copolymères synthétiques, des aminés lipophiles, des cytokines, des imidazoquinolones, ou des polysaccharides.

Parmi les constituants bactériens utilisables comme adjuvants selon l'invention, on citera par exemple : - le bacille de Calmette-Guérin ou BCG, qui comprend une souche de Mycobacterium bovis atténuée

- Le muramyl dipeptide (N-acétylmuramyl-l-alanyl-D-isoglutamine) ou MPD, ainsi que ses dérivés synthétiques

- Le tréhalose dimycolate ou TMD

- L'endotoxine des bactéries gram négatives, aussi dite lipolysaccharide ou LPS et son dérivé le monophosphoryl lipide A ou MPL. Parmi les toxines bactériennes utilisables comme adjuvants selon l'invention, on citera à titre d'illustration :

- La toxine cholérique de Vibrio cholerae (CT), en particulier sa sous-unité B purifiée (CTB).

- La toxine pertussique de Bordetella pertussis (PT) sous forme inactivée

- La lymphotoxine thermolabile de Escherichia coli (LT)

Parmi les adjuvants huileux utilisables comme adjuvants selon l'invention, on citera à titre d'illustration :

- Les adjuvants huileux à base de squalène comme par exemple TiterMax (commercialisés sous ce nom par Vaxcel Norcross Georgia USA) ou RIBI adjuvant System (produit commercialisé sous ce nom par Ribi Immunochem Research, Hamilton, Montana USA).

Parmi les adjuvants minéraux utilisables comme adjuvants selon l'invention, on citera à titre d'exemple l'alun, nom communément utilisé pour désigner les composés hydroxyde d'aluminium et phosphate d'aluminium, le phosphate de potassium ou le phosphate de calcium.

Parmi les saponines utilisables comme adjuvants selon l'invention, on citera à titre d'exemple celles extraites de l'écorce de Quillaja saponaria molina (Quil A), préférentiellement les formes purifiées QS-21 et QS-7 (voir pour référence Kensil et al. Dev Biol Stand. ;92:41 -7. 1998).

Parmi les copolymères synthétiques utilisables comme adjuvants selon l'invention, on citera à titre d'exemple les copolymères synthétiques amphipathiques composés de chaînes hydrophiles de polyoxyéthylène (POE) et de chaînes hydrophobes de polyoxypropylène (POP) ou le dimethyldioctadecylammonium bromide ou chloride, (DDA).

Parmi les aminés lipophiles utilisables comme adjuvants selon l'invention, on citera à titre d'exemple l'avridine.

Parmi les cytokines utilisables comme adjuvants selon l'invention, on citera à titre d'exemple l'histamine, l'interféron, en particulier l'INFa, les interleukines, en particulier l'IL-1 et l'IL-2. Parmi les imidazolquinolones utilisables comme adjuvants selon l'invention, on citera à titre d'exemple l'imiquimod ou le resiquimod.

Parmi les polysaccharides utilisables comme adjuvants selon l'invention, on citera à titre d'exemple les dextrans, les mannanes, les glucanes, les chitosanes. Selon l'invention, l'adjuvant est aussi par exemple l'hévéa, TAS03 (composé de squalène, de DL-a-tocophérol, et de polysorbate), le MF59C.1 (composé de polysorbate 80, squalène, trioléate de sorbitan, citrate de sodium, acide citrique et eau).

Les inventeurs ont découvert que, de façon surprenante, les bactéries de la famille des Chlamydiaceae traitées par les inhibiteurs du peptidoglycane, notamment par les β-lactamines, de même que les fragments de ces bactéries, sont très immunogènes. De fait, les compositions vaccinales comprenant ces bactéries inactivées induisent une très bonne protection des souris contre les infections vaginales par Chlamydia muridarum. Les inventeurs ont notamment montré que l'administration répétée des compositions vaccinales de l'invention entraîne une réponse immunitaire des lymphocytes-T spécifique de Chlamydia muridarum dans la rate. En réponse à une infection intra- vaginale par Chlamydia muridarum, ces LT CD4+ et CD8+ activés et les lymphocytes T régulateurs (CD4+ FoxP3+) quittent la rate pour les ganglions drainant le tractus génital.

On entend ici par « cellules T » ou « lymphocytes T » un type de lymphocytes jouant un rôle central dans l'immunité à médiation cellulaire. Les lymphocytes T peuvent être distingués des autres lymphocytes, tels que les cellules B et les cellules tueuses naturelles (cellules NK), par la présence d'un récepteur de lymphocytes T (TCR) sur la surface cellulaire. Un «récepteur des cellules T » ou "TCR" tel qu'utilisé ici est un récepteur présent sur la surface des cellules T qui est responsable de la reconnaissance spécifique des antigènes présentés par les molécules du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH). On distingue des lymphocytes T CD4+ qui expriment la glycoprotéine CD4 sur leur surface, des lymphocytes T CD8+ caractérisés par l'expression de la glycoprotéine CD8. Un « lymphocyte T effecteur » au sens de l'invention est un lymphocyte T assurant une fonction spécialisée dans la réponse immunitaire, telle que la sécrétion de cytokines ou encore l'aide aux lymphocytes B dans la fonction humorale (lymphocytes T CD4+ encore appelés lymphocytes T auxiliaires) ainsi qu'une activité cytotoxique (lymphocytes T CD8+). Des marqueurs de surface surexprimés (ICOS, CD44) ou sous-exprimés (CD62L) marquent l'état d'activation de lymphocytes T effecteurs. Les « lymphocytes régulateurs » au sens de l'invention sont des cellules T qui expriment fortement les marqueurs de la surface CD4 et CD25. Ces cellules expriment également le marqueur FOXP3 qui est un facteur de transcription (Battaglia et Rancarolo 2009). Ces lymphocytes régulateurs sont donc CD4+ CD25highFOXP3high. Ces cellules sont caractérisées par une capacité à supprimer ou réguler négativement les réactions immunitaires médiées par les cellules T effectrices, telles que effectrices CD4+ ou CD8+.

Selon un deuxième aspect, la présente invention a pour objet un procédé de préparation d'une composition vaccinale pour le traitement prophylactique et/ou thérapeutique d'infections par des bactéries de la famille des Chlamydiaceae, ledit procédé comprenant une étape de mise en contact, in vitro, de bactéries, de préférence des bactéries intra-cellulaires de la famille des Chlamydiaceae avec au moins un inhibiteur du peptidoglycane, notamment au moins une B-lactamine. On entend au sens de l'invention par inhibiteur du peptidoglycane tout composé capable d'inhiber la synthèse du peptidoglycane ou d'affecter la structure de celui- ci. Les inhibiteurs du peptidoglycane au sens de l'invention comprennent entre autres la D-cyclosérine (d-4-amino-3-isoxazolidinone), la vancomycine, la teicoplanine, la bacitracine, la daptomycine, les B-lactamines. Un « inhibiteur du peptidoglycane » au sens de l'invention est préférablement la D-cyclosérine ou une B-lactamine.

On entend ici par B-lactamine tout antibiotique qui contient un noyau B-lactamine dans sa structure moléculaire. Sont ainsi compris dans les B-lactamines au sens de l'invention aussi bien les dérivés de la pénicilline que les céphalosporines, les monobactames, les carbapénèmes ou les inhibiteurs de la B-lactamase. En particulier, la B-lactamine selon l'invention peut être la benzylpénicilline (pénicilline G), la phénoxyméthylpénicilline (pénicilline V) , l'ampicilline (pénicilline A), la benzatine benzylpénicilline, la méticilline, la dicloxacilline, la flucloxacilline, la co- amoxiclav (amoxycilline + acide clavulanique), la pipéracilline, la ticarcilline, l'azlocilline, la carbénicilline, la céphalexine, la céphalotine, la céphazoline, le céfaclor, le céfuroxime, le céfamandole, le cefotetan, la cloxacilline, le céphadroxil, la céfixime, le cefoxitin, la ceftriaxone, le céfotaxime, la ceftazidime, le céfépime, le cefpirome, l'imipénème, l'imipénème en association avec la cilastatine, la céfixime en association avec l'imipénème, le méropénème, le mécillinam, l'ertapénème, l'aztréonam, l'acide clavulanique, le tazobactam ou le sulbactam. Dans un aspect préféré de l'invention, ladite B-lactamine n'est pas l'amoxicilline. Selon un mode de réalisation plus préféré de l'invention, ladite B-lactamine est choisie dans le groupe constitué de la benzylpénicilline (pénicilline G), la phénoxyméthylpénicilline (pénicilline V), la cloxacilline, le céphadroxil, la céfixime, l'imipénème, la céfixime en association avec l'imipénème, le mécillinam, l'acide clavulanique, le tazobactam et le sulbactam. Dans un mode de réalisation encore plus préféré, ladite B-lactamine est la pénicilline G. L'homme du métier pourra facilement déterminer les conditions du traitement des bactéries par les inhibiteurs du peptidoglycane, particulièrement par les B-lactamines, qui permettent d'obtenir les formes BL qui sont utilisées dans la composition vaccinale. L'effet des β- lactamines sur le phénotype des Chlamydiaceae notamment est connu depuis les années 1970. De façon générale, l'homme du métier pourra s'appuyer sur l'enseignement des publications des inventeurs, ainsi que celles des autres laboratoires ayant montré un effet des B-lactamines sur les Chlamydiaceae (WO 201 1 /086134 ; Dumoux et al. , PLoS One. 8(12):e8351 1 , 2013 ; Ouellette et al. , Mol Microbiol. 85(1 ): 164-178, 2012 ; Pilhofer et al. , Nat Commun. 4:2856, 2013 ; Liechti et al. , Nature. 506(7489) : 507-510, 2014). En particulier, la concentration d'inhibiteur du peptidoglycane, notamment de 6 lactamine, à utiliser pour obtenir les formes BL pourra être aisément évaluée en se basant sur les publications de l'art antérieur, notamment les publications des inventeurs.

Par exemple, une concentration d'au moins 100 μΜ, préférentiellement au moins 200 μΜ, de D-cyclosérine permet de générer des formes BL.

Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, la β-lactamine est utilisée à une concentration supérieure ou égale à 0,1 μΜ, préférentiellement supérieure ou égale à 0,3 μΜ. Selon une première variante de l'invention, le céphadroxil ou le sulbactam est utilisé à une concentration supérieure ou égale à 3 μΜ, préférentiellement supérieure ou égale à 10 μΜ. Selon une autre variante de l'invention la céfixime et l'imipénème sont utilisés en association, chacun à une concentration supérieure ou égale à 30 μΜ. Selon au aspect particulier de l'invention, la céfixime ou l'imipénème est utilisé à une concentration supérieure ou égale à 100 μΜ, préférentiellement supérieure ou égale à 300 μΜ. Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, le mécillinam est utilisé à une concentration supérieure ou égale à 1 μΜ, préférentiellement supérieure ou égale à 3 μΜ. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, le tazobactam est utilisé à une concentration supérieure ou égale à 10 μΜ, préférentiellement supérieure ou égale à 30 μΜ. Selon un aspect particulier de l'invention, l'acide clavulanique est utilisé à une concentration supérieure ou égale à 0.3 μΜ, préférentiellement supérieure ou égale à 1 μΜ. Selon une variante particulièrement avantageuse de l'invention, l'amoxicilline, benzylpénicilline (pénicilline G), la phénoxyméthylpénicilline (pénicilline V), la cloxacilline ou le mécillinam, est utilisé à une concentration supérieure ou égale à 0,1 μΜ, préférentiellement supérieure ou égale à 0,3 μΜ.

De la même façon, l'homme du métier sera à même d'apprécier la durée d'incubation des bactéries avec les inhibiteurs du peptidoglycane, notamment les 6- lactamines, nécessaire à l'apparition des formes BL. Il pourra par exemple suivre l'apparition de telles formes au microscope. Comme expliqué plus haut, il pourra aussi consulter les publications de l'art antérieur.

Il est ainsi particulièrement avantageux d'incuber les bactéries avec lesdits inhibiteurs du peptidoglycane, dont notamment les β-lactamines, durant le temps de développement complet de l'inclusion bactérienne, c'est-à-dire jusqu'à ce qu'elle remplisse 80 à 90 % du volume cellulaire. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, les bactéries de la famille des Chlamydiaceae sont mises en contact avec ledit inhibiteur pendant au moins 1 heure, préférentiellement au moins 2 heures, plus préférentiellement au moins 3 heures, encore plus préférentiellement au moins 4 heures, toujours plus préférentiellement au moins 5 heures, de façon encore plus préférée au moins 10 heures, de façon toujours plus préférée au moins 24 heures. Les bactéries de la famille des Chlamydiaceae existent sous différentes formes, selon la phase de leur cycle de vie. La forme virulente de ces bactéries est le corps élémentaire. Celui-ci est adapté à la survie dans le milieu extérieur, sans possibilité de multiplication mais avec l'aptitude de pénétrer, probablement par phagocytose, à l'intérieur de la cellule-hôte. Dans la vacuole, le corps élémentaire se transforme en corps réticulé, élément plus grand dont l'ADN est décondensé et qui peut se multiplier pour donner des corps élémentaires qui seront ensuite libérés dans le milieu. Les inventeurs ont montré que les bactéries sont particulièrement sensibles aux inhibiteurs du peptidoglycane, notamment aux β-lactamines, après avoir infecté des cellules eucaryotes. Lesdites bactéries sont alors sous forme de corps réticulés qui expriment les enzymes cibles de ces inhibiteurs, indispensables à la biosynthèse d'une molécule régulant la division bactérienne. Avantageusement, lesdites bactéries de l'invention sont traitées par ledit inhibiteur, par exemple par une 6-lactamine, après que ces bactéries ont infecté des cellules eucaryotes. Dans ce cas, il est avantageux dans la composition vaccinale d'utiliser un lysat cellulaire de la cellule eucaryote infectée, ledit lysat comprenant lesdites bactéries traitées par la 6- lactamine.

Dans ce mode préféré de réalisation, la présente invention a pour objet un procédé de préparation d'une composition pour le traitement prophylactique et/ou thérapeutique d'infections par des bactéries de la famille des Chlamydiaceae, ledit procédé comprenant les étapes de : a) mise en contact in vitro de cellules eucaryotes avec des bactéries de la famille des Chlamydiaceae, et obtention de cellules eucaryotes infectées ; b) incubation des cellules eucaryotes infectées obtenues à l'étape a) avec au moins un inhibiteur du peptidoglycane, notamment au moins une 6- lactamine ;

c) préparation d'un lysat des cellules de l'étape b).

Selon l'invention, les étapes a) et b) du procédé de préparation de la composition vaccinale sont réalisées dans des conditions de culture cellulaire classiques et bien connues de l'homme du métier, qui saura les choisir et les adapter en fonction du type de cellule eucaryote utilisé. Préférentiellement, les étapes a) et b) sont réalisées à une température de 37° C, une humidité de l'air de 35% et un taux de C02 de l'air 5%. Selon l'invention les cellules sont cultivées dans un milieu de culture approprié. Selon un aspect de l'invention, l'incubation de l'étape b) est maintenue pendant au moins une heure, préférentiellement au moins 2 heures, plus préférentiellement au moins 3 heures, encore plus préférentiellement au moins 4 heures, toujours plus préférentiellement au moins 5 heures, de façon encore plus préférée au moins 10 heures, de façon toujours plus préférée au moins 24 heures.

Les cellules eucaryotes selon l'invention sont des cellules animales, préférentiellement des cellules de mammifères ou des cellules aviaires. Ces dernières sont par exemple des cellules de l'ordre des Galliformes, comme celles de poulet (Gallus gallus) ou de celui des Anseriformes, comme celles de canard colvert (Anas platyrhynchos) ou de canard musqué (Cairina moschata). Les cellules de mammifères selon l'invention sont par exemple des cellules eucaryotes issues de rongeurs (Rodentiens), des cellules eucaryotes porcines (Suidae), ou des cellules eucaryotes de primates. Les cellules eucaryotes de rongeurs sont par exemple de la famille des muridés (Muridae), dans laquelle on trouve entre autres les sous-familles des hamsters (Cricetinae) ou des souris et rats (Murinae), dont font partie par exemple la souris (mus musculus) ou le rat (rattus norvegicus). Les cellules eucaryotes porcines comprennent, entre autres, les cellules eucaryotes du porc domestique (Sus scrofa domesticus). Les cellules eucaryotes de l'ordre des primates comprennent, entre autres, les cellules eucaryotes de la famille des Cercopithecidae, dans laquelle on mentionnera par exemple le singe vert (Chlorocebus sabaeus), ou de celle des Hominidae, laquelle comprend en particulier l'homme (Homo sapiens). Toutefois, les cellules eucaryotes au sens de la présente invention ne comprennent pas les cellules dont l'obtention nécessite ou a nécessité la destruction d 'embryons humains. Selon un mode de réalisation de l'invention, les cellules eucaryotes sont des cellules primaires ou des lignées cellulaires immortalisées ou tumorales, telles que, par exemple, des cellules eucaryotes provenant de lignées cellulaires. Les « cellules primaires » sont définies comme étant un groupe de cellules originales dérivées d'un tissu normal jusqu'au 10e passage inclus, utilisées pour la production de produits biologiques. Par « cellules immortalisées », on entend au sens de l'invention, des cellules se divisant au-delà de la limite de Hayflick, les cellules pouvant être immortalisées spontanément ou du fait de la mise en œuvre d'une technique d 'immortalisation. Les techniques d 'immortalisation des cellules sont bien connues de l'homme du métier qui saura choisir parmi elles les mieux adaptées à son objectif. A titre d'exemple, et sans toutefois limiter l'invention à ces exemples, on peut citer comme technique d'immortalisation la transformation par un oncogène, comme par exemple ceux codant l'antigène T de SV40, la protéine Ras, la protéine Myc ou la protéine Abl, ou la surexpression d'une reverse transcriptase de la télomérase, par exemple hTERT, ou encore la culture des cellules eucaryotes à confluence pendant plusieurs passages. Les cellules eucaryotes utilisées sont choisies par exemple parmi des cellules épithéliales ou des fibroblates. Ainsi, selon un mode de réalisation de l'invention, les cellules eucaryotes utilisées sont à titre d'exemple des fibroblastes primaires d'origine embryonnaire, comme par exemple des CEF (Chick Embryo Fibroblast), des REF (Rat Embryo Fibroblast) ou des MEF (Mouse Embryo Fibroblast). Il est aussi possible d'utiliser des lignées de cellules souches aviaires, comme décrit dans WO 2008/ 129058). Préférentiellement, les cellules eucaryotes selon l'invention proviennent de lignées cellulaires. Selon un mode de réalisation avantageux les cellules eucaryotes selon l'invention proviennent d'une des lignées choisie parmi les lignées cellulaires immortalisées NIH3T3, Vero, COS-7, les lignées tumorales Caco-2, CHO, PC12, HeLa, Jurkat, HL-60, les lignées AtT20, GH3, HEK-293, HT29, HT-29, LNCap, MCF-7, MDA-MB-231 , MDCK, Saos-2, Sf9, Sf21 , S2, T-47D, U20S et EB66® (Valneva, France). Ces cellules sont couramment utilisées par les laboratoires travaillant dans le domaine. Elles sont disponibles auprès de collections de cultures cellulaires comme l'ATCC (American Type Culture Collection) ou la DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen), ou commercialement. L'homme du métier saura choisir si nécessaire les cellules eucaryotes selon l'invention en fonction de la bactérie utilisée ou bien encore en fonction du sujet auquel on destine la composition selon l'invention. Les bactéries entières peuvent être utilisées en tant qu'immunogène dans la composition vaccinale de l'invention, une fois qu'elles ont été traitées avec ledit inhibiteur du peptidoglycane, notamment une β-lactamine. Toutefois, l'homme du métier comprendra aisément que des extraits des bactéries ainsi traitées peuvent aussi être utilisés dans ladite composition vaccinale, pour autant que lesdits extraits présentent des antigènes natifs intacts. Selon un premier mode de réalisation, ledit extrait est un extrait membranaire. Selon un autre mode de réalisation, l'extrait est un extrait cytoplasmique. Des protocoles pour isoler des extraits membranaires ont été décrits dans l'art (voir par exemple Frohlich et al. , J Microbiol Methods. 91 (2) : 222-230, 2012) et peuvent être utilisés pour obtenir de tels extraits. Ils comprennent notamment deux étapes, une première de cavitation à l'azote et une seconde d'immunoprécipitation avec des anticorps contre le LPS des bactéries de la famille des Chlamydiaceae.

La cavitation à l'azote permet de lyser les cellules eucaryotes de façon douce, sans augmentation brusque de la température dans l'échantillon (Gottlieb & Adachi, Methods Enzymol. 322 : 213-221 , 2000). Avantageusement, certains débris de cellules eucaryotes sont éliminés par centrifugation à petite vitesse (entre 3 000 g et 6000 g), tandis que les bactéries restent dans le surnageant. Dans un mode de réalisation préféré, la méthode de l'invention comprendra donc une étape supplémentaire de centrifugation à petite vitesse entre l'étape de cavitation à l'azote et l'étape d'immunoprécipitation avec des anticorps contre le LPS des bactéries de la famille des Chlamydiaceae. Une sonication douce dans la glace peut être utilisée également.

Des anticorps contre le LPS (ou des anticorps anti-MOMP, anti-InC, anti-PMP ou anti- CPAF...) de la famille des Chlamydiaceae ont été décrits dans l'art antérieur (Herrera et al. , Mol. Med. 9 : 135-142, 2003). Ils permettent d'isoler sélectivement la fraction membranaire bactérienne dans l'étape d'immunoprécipitation après avoir lysé les cellules eucaryotes tandis que la fraction cytoplasmique bactérienne reste dans le surnageant.

Il peut être avantageux d'enrichir la fraction bactérienne en soumettant les lysats débarrassés des débris cellulaires à une centrifugation pour séparer la fraction membranaire bactérienne qui reste dans le surnageant de la fraction particulaire qui précipite. De préférence, les lysats sont centrifugés à une vitesse comprise entre 10 000 et 20 000 g, plus préférablement, entre 12 000 g et 18 000 g, encore plus préférablement, entre 14 000 g et 17 000 g, et de façon la plus préférée entre 15 000 g et 16 000 g. Les extraits cytoplasmiques peuvent être obtenus en soumettant le culot à une ultracentrifugation isopycnique, selon les conditions décrites par Frohlich et al. (J Microbiol Methods. 91 (2) : 222-230, 2012). Comme le montrent les résultats des inventeurs, les compositions vaccinales de l'invention sont en particulier utiles pour prévenir ou traiter les infections par les bactéries de la famille des Chlamydiaceae, ainsi que les pathologies causées par lesdites infections. Les compositions vaccinales de l'invention sont notamment capables de déclencher une réaction immunitaire spécifique contre les bactéries de la famille des Chlamydiaceae. Cette réaction est caractérisée notamment par une réponse immunitaire de lymphocytes-T spécifique de Chlamydia muridarum dans la rate. En réponse à une infection intra-vaginale par Chlamydia muridarum, ces LT CD4+ et CD8+ activés et les lymphocytes T régulateurs quittent la rate pour les ganglions drainant le tractus génital. Comme le montrent les résultats rapportés dans les exemples (voir notamment les exemples 3 et A), cette réponse immunitaire est capable de protéger l'individu contre les bactéries de la famille des Chlamydiaceae. Selon un troisième aspect, l'invention a donc aussi pour objet des bactéries de la famille des Chlamydiaceae et/ou des extraits de celles-ci caractérisées en ce que lesdites bactéries ont été préalablement traitées par au moins un inhibiteur du peptidoglycane, notamment au moins une β-lactamine, pour leur utilisation dans le traitement prophylactique ou thérapeutique d'infections par des bactéries de la famille des Chlamydiaceae.

L'invention a aussi pour objet l'utilisation d'une composition comprenant bactéries de la famille des Chlamydiaceae et/ou des extraits de celles-ci caractérisées en ce que lesdites bactéries ont été préalablement traitées par un inhibiteur du peptidoglycane, notamment au moins une β-lactamine, pour fabriquer un médicament pour le traitement prophylactique ou thérapeutique d'infections par des bactéries de la famille des Chlamydiaceae. De la même façon, l'invention porte aussi sur une méthode de traitement, préférentiellement prophylactique, d'infections par des bactéries de la famille des Chlamydiaceae par une composition comprenant bactéries de la famille des Chlamydiaceae et/ou des extraits de celles-ci, lesdites bactéries ayant été préalablement traitées par un inhibiteur du peptidoglycane, notamment au moins au moins une β-lactamine. Selon un mode de réalisation particulier, ladite méthode de traitement comprend une étape d'administration de ladite composition à un sujet risquant d'être infecté par des bactéries. Préférentiellement, cette administration entraîne une augmentation de la population de lymphocytes T CD4+ et CD8+ effecteurs spécifiques activés dans la rate puis leur migration vers les ganglions drainant le tractus génital infecté. Alternativement, selon un autre mode de réalisation préféré, cette administration entraîne une diminution de la population des lymphocytes T régulateurs dans la rate et une augmentation dans les ganglions drainant le tractus génital infecté. De façon plus préférée, cette administration entraîne une augmentation de la population des lymphocytes T CD4+ et CD8 + effecteurs spécifiques activés puis leur migration vers les ganglions drainant le tractus génital et une diminution de la population des lymphocytes T régulateurs dans la rate et une augmentation dans les ganglions drainant le tractus génital infecté.

Par « infection par une bactérie de la famille des Chlamydiaceae » ou « infection par une Chlamydiaceae », on entend la présence dans au moins une cellule du corps du patient ou de l'animal de ladite bactérie de la famille des Chlamydiaceae. L'infection peut être génitale, oculaire, respiratoire ou pulmonaire; elle peut aussi toucher d'autres sites, comme l'endothélium vasculaire ou les articulations.

Bien qu'un grand nombre des infections causées par les bactéries de la famille des Chlamydiaceae soit asymptomatique, lesdites infections peuvent néanmoins causer des pathologies sérieuses chez les patients ou les animaux. Par « pathologie causée par une infection par des bactéries de la famille des Chlamydiaceae », on entend au sens de l'invention toute pathologie dont le déclenchement est directement ou indirectement causé par une infection par au moins une bactérie de la famille des Chlamydiaceae.

Sont ainsi comprises dans les pathologies causées par une infection par des bactéries de la famille des Chlamydiaceae au sens de l'invention les pathologies causées par Chlamydia suis, Chlamydia muridarum, abortus, Chlamydophila psittaci, Chlamydophila caviae, Chlamydophila pecorum et Chlamydophila felis. Sont ainsi plus particulièrement incluses dans lesdites pathologies causées par une infection par Chlamydiaceae au sens de l'invention les avortements et les mortalités néo-natales causés par Chlamydophila abortus, ainsi que les conjonctivites, les kératoconjonctivites, les rhinites purulentes, les entérites, les bronchopneumonies et les pneumonies, causées en particulier chez le porc par Chlamydia suis. Chez l'homme, ces pathologies peuvent en particulier être des pathologies génitales ou des pathologies oculaires ou trachome induisant des cécités (Chlamydia trachomatis), mais elles peuvent aussi être des pathologies respiratoires (pneumopathies néo-natales). Ainsi il est connu que les infections par Chlamydophila pneumoniae provoquent une forme de pneumonie et que Chlamydophila psittaci est responsable de la psittacose. Il est également connu que les infections par des bactéries de la famille des Chlamydiaceae disséminent dans l'organisme provoquant de nombreuses infections et pathologies atypiques comme des dysfonctionnements cardio-vasculaires et circulatoires (athérome). Parmi les dysfonctionnements cardio- vasculaires et circulatoires causés par les bactéries de la famille des Chlamydiaceae, on peut citer respectivement les sténoses valvulaires et l'athérome. D'autre part, lesdites bactéries de la famille des Chlamydiaceae peuvent aussi entraîner des maladies inflammatoires et des pathologies articulaires. Il est connu en particulier que ces bactéries peuvent causer des arthrites sévères.

Toutefois, dans un mode de réalisation préféré de l'invention, les pathologies causées par une infection par des bactéries de la famille des Chlamydiaceae sont des pathologies oculaires ou des pathologies génitales. Selon un aspect plus particulièrement préféré de l'invention, les pathologies oculaires causées par une infection par des bactéries de la famille des Chlamydiaceae comprennent le trachome. Selon un autre aspect plus particulièrement préféré, les pathologies génitales causées par une infection par des bactéries de la famille des Chlamydiaceae comprennent le lymphogranulome vénérien ou maladie de Durand- Nicolas-Favre. Selon encore un autre aspect plus particulièrement préféré de l'invention, les pathologies génitales chez l'homme causées par une infection par des bactéries de la famille des Chlamydiaceae comprennent des pathologies telles que des urétrites et des orchi-épididymites. Celles-ci peuvent conduire à une diminution de la fertilité masculine. Selon encore un autre aspect plus particulièrement préféré de l'invention, une infection par des bactéries de la famille des Chlamydiaceae causent chez la femme des pathologies génitales telles que des cervico-vaginites, des cervicites, des endocervites, des urétrites, des endométrites ou des péri-hépatites, qui peuvent donner des complications comme des infections génitales hautes et, en particulier, des salpingites pouvant évoluer entre autres vers la formation de pyosalpinx et hydrosalpinx responsables de l'obstruction totale des trompes de Fallope. Les salpingites représentent ainsi le principal facteur de risque de stérilité d'origine tubaire et de grossesse extra-utérine chez la femme.

Il est bien connu de l'homme du métier que l'incidence des infections est de façon générale inversement corrélée à l'état de santé du patient, et que le risque d'infection est donc plus grand chez des individus par ailleurs déjà infectés par d'autres micro-organismes. Les compositions comprenant par ailleurs d'autres principes actifs, ou mélange de principes actifs permettent ainsi une meilleure protection de la santé générale des sujets, et par conséquent une meilleure protection contre les infections par les bactéries de la famille des Chlamydiaceae.

Ainsi, selon une variante particulièrement avantageuse de l'invention, la composition comprend en outre un autre principe actif. A titre d'exemple, cet autre principe actif est, au sens de l'invention, une autre composition vaccinale.

Parmi les autres compositions vaccinales selon l'invention, on peut citer notamment les compositions vaccinales susceptibles de diminuer le risque des infections à pneumocoques, du tétanos, de la poliomyélite, de la grippe, de la diphtérie, de la coqueluche, de l'hépatite B, de l'hépatite A, d'HPV (Human papilloma virus), de la tuberculose (par exemple par le Bacille de Calmette Guérin). Plus préférablement, ladite autre composition vaccinale est capable d'augmenter, chez les individus vaccinés, l'amplitude et la rapidité de la réponse immune protectrice.

L'homme du métier saura par ailleurs choisir au mieux les voies et modes d'administration de la composition selon l'invention, ainsi que les posologies et formes galéniques optimales, selon les critères généralement pris en compte dans la fabrication d'un médicament ou l'établissement d'un traitement pharmaceutique ou vétérinaire. De préférence, ces composés seront administrés par voie systémique, en particulier par voie intraveineuse, par voie intramusculaire, intradermique, intra- péritonéale ou sous-cutanée, par voie orale, ou par voie topique (au moyen de gel, aérosols, gouttes, etc.). il sera particulièrement avantageux selon l'invention d'administrer la composition par voie entérale, orale, parentérale (par exemple sous- cutanée, intradermique, ou intramusculaire) ou mucosale (par exemple intranasale, sublinguale, intravaginale, transcutanée). De manière plus préférée, la composition pharmaceutique de l'invention sera administrée à plusieurs reprises, de manière étalée dans le temps. Son mode d'administration, sa posologie et sa forme galénique optimale peuvent être déterminés selon les critères généralement pris en compte dans l'établissement d'un traitement adapté à un patient comme par exemple l'âge ou le poids corporel du patient, la gravité de son état général, la tolérance au traitement et les effets secondaires constatés. La composition selon l'invention est préparée sous toute forme galénique connue de l'homme du métier, par exemple sous forme liquide ou gel, telle que des solutions, suspensions, sirops, ou sous forme de spray, ou sous forme solide, telle que sous forme de comprimés, de microsphères, ou de gélules. Avantageusement, la composition selon l'invention est préparée sous forme de solution ou de suspension injectable. Selon une variante de l'invention, la composition est lyophilisée afin d'être fournie ou préparée sous forme solide.

La solution selon l'invention est administrée à une dose thérapeutiquement efficace, en particulier à une dose immunogène c'est-à-dire capable d'induire une réponse immunitaire spécifique d'antigène. La réponse immunitaire spécifique d'antigène pourra être mesurée selon toute technique connue de l'homme du métier. A titre d'exemple, la réponse immunitaire spécifique d'antigène est évaluée par la mesure de la concentration d'anticorps (Immunoglobulines ou Ig) spécifiques de la bactérie de la famille des Chlamydiaceae utilisée, chez le sujet, en particulier les IgM, IgG et IgA, à un temps donné après la dernière administration de la composition, par test Elisa ou Elispot. La réponse immunitaire spécifique d'antigène est évaluée à partir d'échantillons biologiques du sujet, comme par exemple le sang, le sérum, les larmes ou les sécrétions vaginales.

L'homme du métier pourra adapter la dose d'administration de la composition selon l'invention en fonction par exemple de la voie d'administration choisie, du schéma de vaccination, ainsi que des caractéristiques du sujet, telles que l'espèce, l'âge, le poids, l'état de santé général. Selon un mode de réalisation, la composition selon l'invention est administrée selon un schéma de vaccination comprenant plusieurs administrations. Par exemple, selon un mode de réalisation, la composition est administrée de manière répétée entre 2 et 4 fois sur une période de 15 à 90 jours, puis une ou plusieurs administrations de rappel sont effectuées entre 1 et 10 ans à compter de la première administration.

En fonction de la forme galénique et du type d'administration souhaitée, la composition selon l'invention comprend en outre au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable. A titre d'exemple, la composition selon l'invention pourra en outre comprendre des diluants, tel que le sodium, le carbonate de calcium, ou le lactose par exemple, des agents lubrifiants, tels que par exemple le stéarate de magnésium, des colorants, des agents de sapidité, des agents de texture, des antibiotiques, tels par exemple du thimérosal ou des antibiotiques de la famille des β-lactamines, des protéines, notamment de l'albumine ou de l'ovalbumine, des stabilisants, tels que le glutamate monosodique (MSG) et le 2-phénoxyéthanol. Selon un quatrième aspect de l'invention, celle-ci a aussi pour objet une méthode de diagnostic in vitro d'une infection par une bactérie de la famille des Chlamydiaceae chez un sujet, comprenant les étapes consistant : a) à mettre en contact un échantillon dudit sujet avec une bactérie de la famille des Chlamydiaceae préalablement traitée par au moins un inhibiteur du peptidoglycane, notamment une β-lactamine, et

b) à déterminer la présence d'anticorps dans ledit échantillon qui sont capables de se lier à ladite bactérie.

De telles méthodes sont bien connues de l'homme du métier et peuvent être mises en œuvre à l'aide d'un grand nombre de procédures standard, telle que la détection de radioactivité, de fluorescence, de luminescence, de chimioluminescence, d'absorbance, ou par microscopie, imagerie, etc. Ainsi, selon un mode de réalisation préféré de l'invention, ladite méthode comprend les étapes consistant : a) à mettre en contact ledit échantillon avec des anticorps spécifiques de ladite bactérie engendrés contre ladite bactérie préalablement traitée par un inhibiteur du peptidoglycane, notamment une β-lactamine, lesdits anticorps comprenant un marqueur produisant un signal détectable, ou étant fixés à un réactif marqué de manière détectable;

b) à laisser la bactérie présente dans ledit échantillon s'y lier de manière à

former des complexes antigènes/anticorps ; et

c) à déterminer la présence de ladite bactérie dans ledit échantillon au moyen dudit marqueur détectable.

Selon un cinquième aspect, l'invention porte sur une trousse de diagnostic pour la détection d'une infection par une bactérie de la famille des Chlamydiaceae, comprenant ladite bactérie préalablement traitée par un inhibiteur du peptidoglycane, notamment une β-lactamine, conjointement avec des substances pour effectuer une analyse de détermination d'immunité humorale contre ladite bactérie, dans un récipient d'emballage unitaire. Les trousses de diagnostic selon l'invention incluent sans limitation les trousses pour les méthodes immunologiques telles que immunohistochimie, ELISA (Enzyme- Linked Immunosorbent Assay), le « western blotting », l'immunoenzymométrie, rimmunofluorométrie, l'immunoluminométrie, l'immunoradiométrie (IRMA), ΕΜΙΤ (Enzyme Multiplied Immunoassay Technique), l'immunodosage à flux latéral, les tests en dipstick, l'immuno histo/cyto-chimie et tous les autres tests qui sont connus de l'homme du métier. Ces méthodes immunologiques permettent de déterminer la présence ou l'absence d'un anticorps dans un échantillon. Elles permettent aussi de mesurer la quantité dudit anticorps dans l'échantillon. L'invention a donc aussi pour objet, selon un sixième aspect, l'utilisation d'une bactérie de la famille des Chlamydiaceae préalablement traitée par un inhibiteur du peptidoglycane, notamment une β-lactamine, comme réactif de diagnostic in vitro dans une analyse de liaison, éventuellement dans un kit de diagnostic, pour la détection d'anticorps neutralisant conférant une immunité contre ladite bactérie. Elle a aussi pour objet l'utilisation d'anticorps spécifiques d'une bactérie de la famille des Chlamydiaceae engendrés contre ladite bactérie préalablement traitée par un inhibiteur du peptidoglycane, notamment une β-lactamine, comme réactif de diagnostic in vitro dans une analyse de liaison, éventuellement dans un kit de diagnostic, pour la détection de ladite bactérie. Outre les dispositions qui précèdent, la présente invention comprend également d'autres caractéristiques et avantages qui ressortiront des exemples qui suivent, et qui doivent être considérés comme illustrant l'invention sans en limiter la portée.

LEGENDES DES FIGURES

Figure 1 : Efficacité vaccinale des formes BL. Les formes BL entraînent une diminution significative du nombre de souris infectées.

Figure 2 : Proportion d'animaux issus des différents groupes d'immunisation (Mefs, b-Lac, b-Lac/3, De) présentant une perte vaginale de Chlamydia muridarum à différents temps après infection. ° :p<0.08; * p<0.05; ** p<0.01 ; *** p< 0.005 par rapport au groupe Mefs (Test de Mann Whitney). Figure 3 : A-Caractérisation de la perte cellulaire au niveau de la lamina propria des cornes utérines des souris, corne utérine normale grade 0, (A), grade 1 (B), grade 2 (C), grade 3 (D), clichés pris au grossissement 10X. B-Evaluation de la sévérité des atteintes microscopiques des cornes utérines des animaux des différents groupes. Corne utérine normale (grade 0, A), grade 1 (B), grade 2 (C), grade 3 (D). *p=0.054 (Test de Mann Whitney). Figure 4 : Nombre total de lymphocytes spléniques des souris après immunisation complète par les formes vaccinales ou contrôles. Les cellules isolées ont été comptées sur lame de Malassez et leur nombre a été rapporté au nombre de cellules viables analysées par cytométrie en flux grâce à un marqueur de viabilité (Fixable Viability Dye, BD Biosciences). Graphique représentatif d'une expérience sur des groupes d'animaux testés individuellement (PBS, n=3 ; MEF, n=4 ; b-Lac, n=5 ; De, n=5). Means +/- SEM. Le symbole « ns » ou l'absence d'étoiles indique l'absence de différences statistiquement significatives entre le groupe d'animaux contrôles immunisés avec du sonicat de cellules MEF non infectées et le groupe d'animaux contrôles injectés avec du PBS seul, ou entre les groupes MEF et b-Lac, ou MEF et De. Figure 5 : Nombre des lymphocytes T CD4 ⁺ totaux, et activés après immunisation complète par les formes vaccinales. Le nombre total des lymphocytes T CD4 ⁺ (A) ainsi que le nombre de lymphocytes T CD4+ présentant des marqueurs d'activation sont représentés en s'intéressant à l'expression membranaire de CD25 (B), de CD44 ^hl CD62L ^l0W (C), ICOS ⁺ (D) et à l'expression intracellulaire de FoxP3 pour mettre en évidence la population de lymphocytes T régulateurs (E). Graphiques représentatifs d'une expérience sur des groupes d'animaux testés individuellement (PBS, n=3 ; MEF, n=4 ; b-Lac, n=5 ; De, n=5). Means +/- SEM. Test t non-apparié : les symboles *, **, représentent les mesures des valeurs p issues des tests effectués vis-à-vis du contrôle MEF (* p<0,05, ** p<0,01 ,). Le symbole « ns » ou l'absence d'étoiles indique l'absence de différences statistiquement significatives entre le groupe d'animaux contrôles immunisés avec du sonicat de cellules MEF non infectées et le groupe d'animaux contrôles injectés avec du PBS seul, ou entre les groupes MEF et b-Lac, ou MEF et De.

Figure 6 : Nombre des lymphocytes T CD8 ⁺ totaux, et activés après immunisation complète par les formes vaccinales. Le nombre total des lymphocytes T CD8 ⁺ (A), ainsi que le nombre de lymphocytes T CD8+ présentant des marqueurs d'activation sont représentés en s'intéressant à l'expression membranaire de ICOS (B), et de CD44 ^hl CD62L ^l0W (C). Graphiques représentatifs d'une expérience sur des groupes d'animaux testés individuellement (PBS, n=3 ; MEF, n=4 ; b-Lac, n=5 ; De, n=5). Means +/- SEM. Test t non-apparié : les symboles *, représentent les mesures des valeurs p issues des tests effectués vis-à-vis du contrôle MEF (* p<0,05,). Le symbole « ns » ou l'absence d'étoiles indique l'absence de différences statistiquement significatives entre le groupe d'animaux contrôles immunisés avec du sonicat de cellules MEF non infectées et le groupe d'animaux contrôles injectés avec du PBS seul, ou entre les groupes MEF et b-Lac, ou MEF et De.

Figure 7 : Nombre total de cellules dans les ganglions et la rate des souris après immunisation complète par les formes vaccinales, et une semaine post-infection intra-vaginale par Chlamydia muridarum. Les cellules isolées ont été comptées sur lame de Malassez et leur nombre a été rapporté au nombre de cellules viables analysées par cytométrie en flux grâce à un marqueur de viabilité (Fixable Viability Dye, BD Biosciences). Graphiques représentatifs d'une expérience sur des groupes d'animaux testés individuellement (PBS, n=3 ; MEF, n=4 ; b-Lac, n=5 ; De, n=5). Means +/- SEM. Test t non-apparié : les symboles *, **, représentent les mesures des valeurs de p issues des tests effectués vis-à-vis du contrôle MEF (* p<0,05, ** p<0,01 ,). Le symbole « ns » ou l'absence d'étoiles indique l'absence de différences statistiquement significatives entre le groupe d'animaux contrôles immunisés avec du sonicat de cellules MEF non infectées et le groupe d'animaux contrôles injectés avec du PBS seul, ou entre les groupes MEF et b-Lac, ou MEF et De. Figure 8 : Nombre des lymphocytes T spléniques CD4 ⁺ et T CD8 ⁺ totaux, et activés après immunisation complète par les formes vaccinales et une semaine post-infection intra-vaginale par Chlamydia muridarum. Le nombre total des lymphocytes T CD4 ⁺ (A) et CD8 ⁺ (D) ainsi que leur profil d'activation sont ici représentés en s'intéressant au nombre de lymphocytes T CD25 ⁺ parmi les T CD4 ⁺ (B) et T CD8 ⁺ (E), et au nombre de lymphocytes T CD4 ⁺ et T CD8 ⁺ CD44 ^hi CD62L ^l0W (C et F, respectivement). Graphiques représentatifs d'une expérience sur des groupes d'animaux testés individuellement (PBS, n=3 ; MEF, n=4 ; b-Lac, n=5 ; De, n=5). Means +/- SEM. Test t non-apparié: les symboles *, **, représentent les mesures des valeurs p issues des tests effectués vis-à-vis du contrôle MEF (* p<0,05, ** p<0,01 ,). Le symbole « ns » ou l'absence d'étoiles indique l'absence de différences statistiquement significatives entre le groupe d'animaux contrôles immunisés avec du sonicat de cellules MEF non infectées et le groupe d'animaux contrôles injectés avec du PBS seul , ou entre les groupes MEF et b-Lac, ou MEF et De. Figure 9 : Nombre des lymphocytes T ganglionnaires CD4 ⁺ et T CD8 ⁺ totaux, et activés après immunisation complète par les formes vaccinales et une semaine postinfection intra-vaginale par Chlamydia muridarum. Le nombre total des lymphocytes T CD4 ⁺ (A) et CD8 ⁺ (E), ainsi que leur profil d'activation sont ici représentés en s'intéressant à la population lymphocytaire CD4+ CD25 ⁺ (C) et ICOS ⁺ (D), et au nombre de lymphocytes T CD4 ⁺ et T CD8 ⁺ CD44 ^hi CD62L ^l0W (B et F respectivement). Graphiques représentatifs d'une expérience sur des groupes d'animaux testés individuellement (PBS, n=3 ; MEF, n=4 ; b-Lac, n=5 ; De, n=5). Means +/- SEM. Test t non-apparié : les symboles *, **, représentent les mesures des valeurs p issues des tests effectués vis-à-vis du contrôle MEF (* p<0,05, ** p<0,01 ,). Le symbole « ns » ou l'absence d'étoiles indique l'absence de différences statistiquement significatives entre le groupe d'animaux contrôles immunisés avec du sonicat de cellules MEF non infectées et le groupe d'animaux contrôles injectés avec du PBS seul, ou entre les groupes MEF et b-Lac, ou MEF et De. Figure 10 : Le nombre des lymphocytes T CD4 ⁺ et T CD8 ⁺ en prolifération dans les ganglions drainant le tractus génital et la rate après immunisation complète par les formes vaccinales et une semaine post-infection intra-vaginale par Chlamydia muridarum. Le nombre total des lymphocytes T CD4 ⁺ (A) et CD8 ⁺ (B) en prolifération dans les ganglions drainant le tractus génital (I) et la rate (II) est ici présenté. Graphiques représentatifs d'une expérience sur des groupes d'animaux testés individuellement (PBS, n=3 ; MEF, n=4 ; b-Lac, n=5 ; De, n=5). Means +/- SEM. Test t non-apparié : Le symbole « ns » ou l'absence d'étoiles indique l'absence de différences statistiquement significatives entre le groupe d'animaux contrôles immunisés avec du sonicat de cellules MEF non infectées et le groupe d'animaux contrôles injectés avec du PBS seul, ou entre les groupes MEF et b-Lac, ou MEF et De.

Figure 1 1 : Nombre des lymphocytes T régulateurs CD4 ⁺ totaux et en prolifération dans les ganglions drainant le tractus génital et la rate après immunisation complète par les formes vaccinales et une semaine post-infection. Le nombre total des lymphocytes T CD4 ⁺ régulateurs (Treg) totaux (A) et en prolifération (B) dans les ganglions drainant le tractus génital (I) et la rate (II) est ici présenté. Graphiques représentatifs d'une expérience sur des groupes d'animaux testés individuellement (PBS, n=3 ; MEF, n=4 ; b-Lac, n=5 ; De, n=5). Means +/- SEM. Test t non-apparié : les symboles représentent les mesures des valeurs p issues des tests effectués vis-à-vis du contrôle MEF (* p<0,05,). Le symbole « ns » ou l'absence d'étoiles indique l'absence de différences statistiquement significatives entre le groupe d'animaux contrôles immunisés avec du sonicat de cellules MEF non infectées et le groupe d'animaux contrôles injectés avec du PBS seul , ou entre les groupes MEF et b-Lac, ou MEF et De. EXEMPLES

Exemple 1 : Immunisation de souris C57BL/6J.

Des souris C57BL/6J ont été vaccinées par des compositions différentes, puis infectées secondairement par des bactéries de la famille des Chlamydiaceae.

Afin d'éviter une réaction immunitaire de l'hôte liée à la reconnaissance d'alloantigènes portés par les cellules eucaryotes, les différentes formes bactériennes (infectieuse, BL) ont été produites dans des fibroblastes embryonnaires issus de souris C57BL/6J.

Dans ce but, des fibroblastes embryonnaires (MEF) issus de souris C57BI/6 avec Chlamydia muridarum (Cm) ont été infectés in vitro. Cette souche est génétiquement très proche de Chlamydia trachomatis. Elle infecte la souris et le cobaye mais pas l'espèce humaine, et entraîne les mêmes séquelles physiopathologiques au niveau du tractus génital que chez l'Homme.

Plusieurs compositions ont été préparées

- C1 -composition comprenant une forme infectieuse de Cm ou encore appelé forme virulente (infection cellulaire in vitro de 72h et prélèvement du lysat cellulaire)

- C2- composition comprenant une forme infectieuse inactivée 30 min à 56 ° C ou encore appelée forme chauffée (idem 1 suivi d'une étape d'inactivation par la chaleur)

- C3- composition comprenant une forme inactivée par antibiotiques:

(infection cellulaire in vitro de 3h, puis incubation continue des cellules infectées avec la pénicilline G (100IU/mL), prélèvement du lysat cellulaire après 90h). Cette forme est une forme BL et en particulier, une forme b-Lac.

li a été vérifié par titration que la forme 1 était infectieuse, et que les formes 2 et 3 ne l'étaient pas. 4 groupes de souris femelles C57BL/6J âgées de 8 semaines ont été utilisés.

Trois groupes ont été injectés par voie intrapéritonéale (IP) une ou plusieurs fois avec l'une des compositions, puis les 4 groupes ont été infectés par voie vaginale par la forme infectieuse de Cm. La quantité de composition utilisée pour chaque injection correspondait à environ 10 cm ² de cellules (MEF) cultivées in vitro, infectées à 100%, dans un volume de 150μΙ par injection IP.

- groupe 1 (4 animaux): infection avec Cm (1 million d'IFU).

- groupe 2 (3 souris): une injection IP (au temps to) de la forme 1 de la bactérie. A t0+39j, infection vaginale avec 1 million d'IFU de Cm.

- groupe 3 (3 souris): trois injections IP (to, to + 10j, to + 21 j) de la forme 2 de la bactérie. A tO + 39j, infection vaginale avec 1 million d'IFU de Cm.

- groupe 4 (4 souris): trois injections IP (to, to + 10j, to+ 21 j) de la forme 3 de la bactérie. A tO + 39j, infection vaginale avec 1 million d'IFU de Cm.

Après infection, les souris ont été maintenues isolées pendant 82 jours, sans aucun traitement antibiotique, afin de permettre aux séquelles physiopathologiques de se développer. Les souris ont ensuite été sacrifiées, et examinées : aspect macroscopique du tractus génital, recherche de lésions tissulaires (hydrosalpinx, déformations, kystes liquidiens,), mesure du poids de la rate, prélèvements de différents organes (dont les ganglions para-aortiques drainant l'utérus) en vue d'analyses ultérieures. Résultats obtenus:

- Groupe 1 : 3/4 des souris présentaient des lésions tissulaires des voies génitales hautes sur au moins une des 2 cornes utérines (rate 106 +/- 3g, ganglions para-aortiques normaux)

- Groupe 2: 1 /3 des souris présentaient des lésions tissulaires des voies génitales hautes sur au moins une des 2 cornes utérines (rate 1 14 +/-

9g, ganglions para-aortiques normaux) - Groupe 3: 2/3 des souris présentaient des lésions tissulaires des voies génitales hautes sur au moins une des cornes utérines (rate 280 +/- 81 g, ganglions para-aortiques normaux). Une souris a été sacrifiée 60j après infection car elle présentait des plaies cutanées et une perte de poids importante, potentiellement sans rapport avec l'expérience.

- Groupe 4: aucune souris ne présentait de lésions tissulaires des voies génitales hautes (rate 111 +/- 17g, ganglions para-aortiques normaux)

Cette étude préliminaire montre que seul le groupe de souris préinjectées avec la forme BL de Cm a été protégé du développement de lésions tissulaires des voies génitales hautes, suite à une infection par Cm.

Exemple 2 : Efficacité vaccinale des formes BL

Afin de confirmer l'efficacité vaccinale des formes BL, une nouvelle expérience a été réalisée dans les mêmes conditions que dans l'exemple 1.

• Souris 1 -10 : immunisation par les MEFs à J0, J10 et J21

o Souris 1 -5 : infection par 2.10 ⁶ IFU à J39

^■ 3/5 souris (60%) présentent des séquelles (lésions tissulaires des voies génitales hautes)

o Souris 6-10 : infection par 2.10 ⁵ IFU à J39

^■ 3/5 souris (60%) présentent des séquelles (lésions tissulaires des voies génitales hautes)

• Souris 11 -20 : immunisation par la forme infectieuse préalablement inactivée 10 min à 90° C à J0, J10 et J21

o Souris 11 -15 : infection par 2.10 ⁶ IFU à J39

^■ 3/5 souris (60%) présentent des séquelles (lésions tissulaires des voies génitales hautes)

o Souris 16-20 : infection par 2.10 ⁵ IFU à J39

^■ 3/5 souris (60%) présentent des séquelles (lésions tissulaires des voies génitales hautes)

• Souris 21 -30 : immunisation par la forme BL à J0, J10 et J21

o Souris 21 -25 : infection par 2.10 ⁶ IFU à J39

^■ 0/5 souris (0%) présente des séquelles (lésions tissulaires des voies génitales hautes)

o Souris 26-30 : infection par 2.10 ⁵ IFU à J39 ^■ 0/5 souris (0%) présente des séquelles (lésions tissulaires des voies génitales hautes)

• Souris 31 -40 : immunisation par la forme infectieuse Cm à J0, J10 et J21

o Souris 31 -35 : infection par 2.10 ⁶ IFU à J39

^■ 2/5 souris sont mortes 1 semaine après l'infection

^■ 2/3 souris survivantes présentent des séquelles (lésions tissulaires des voies génitales hautes

o Souris 36-40 : infection par 2.10 ⁵ IFU à J39

^■ 2/5 souris sont mortes 1 semaine après l'infection

^■ 2/3 souris survivantes présentent des séquelles (lésions tissulaires des voies génitales hautes)

Les résultats montrent une diminution significative du nombre de souris infectées dans le groupe préalablement immunisées par la forme BL (Figure 1 ). Ces résultats confirment que l'administration de la forme BL protège les souris d'une infection par C. muridarum.

Exemple 3 : Effet de l'injection intrapéritonéale de différentes doses immunisantes de formes b-Lac (formes BL, traitées par une B-lactamine) ou des formes Pc (formes BL traitées par la D-cvclosérine) de Chlamydia muridarum sur la protection vis-à-vis de l'infection vaginale par C. muridarum et le développement de la pathologie tubaire.

4 groupes de 10 souris femelles ont été immunisés en injection intrapéritonéale à J0, J0+10, JO+21 soit avec un extrait de fibroblastes embryonnaires de souris C57/BL6 (Mefs), soit avec la forme b-Lac (b-Lac), soit avec la forme Lac diluée au tiers de la dose habituelle (b-Lac/3), soit avec la forme De (De). Ces formes vaccinales ont été produites dans des Mefs.

A J32, les animaux ont été cyclés par injection sous cutanée de 50μΙ de Deprovera (50mg/mL, Pfizer).

A J39 les animaux ont été infectés par voie vaginale avec 10 ⁷ IFU de Chlamydia muridarum. A J3, J6, J8, J10 et J13 post infection, des frottis vaginaux ont été effectués et la présence de Chlamydia muridarum a été évaluée par titration de la capacité infectieuse des Chlamydiae extraites de ces frottis (Figure 2).

A 8 semaines post infection le reste des animaux (n=6) a été sacrifié, les cornes utérines disséquées et les lésions macroscopiques (kystes liquidiens et zones translucides au niveau des cornes utérines ou de l'oviducte) ont été recherchées à la loupe binoculaire. Seules les souris du groupe b-Lac ne présentent aucune lésion macroscopique. Les cornes utérines ont été fixées au paraformaldéhyde, déshydratées et incluses en paraffine. Des sections longitudinales ont été colorées à l'HPS (hemalun Phloxine, Safran) pour mettre en évidence les différentes structures de la corne utérine (myomètre et endomètre comprenant l'épithélium et la lamina propria). Nous avons évalué la sévérité des atteintes microscopiques par la perte cellulaire observée au niveau de la lamina propria utérine (Figure 3).

Un plus grand nombre d'animaux présentant des lésions tubaires mineures (grade 1 ) ou pas de lésions (grade 0) est observé dans les groupes b-Lac et De, comparés aux groupes Mefs et b-Lac/3. Les atteintes les plus sévères visibles dans le groupe Mefs sont absentes des groupes b-Lac, b-Lac/3 et De.

Ces résultats confirment donc l'effet protecteur de 3 injections intra-péritonéales de formes b-Lac (avec un effet dose confirmé) et de formes De, vis à vis de l'infection vaginale par une forme virulente de Chlamydia muridarum. Cette protection se traduit par une diminution de la charge bactérienne dès le début de l'infection locale, une réponse anticorps spécifique détectable dans la rate des souris immunisées infectées, et une protection vis à vis des lésions génitales inflammatoires post infection dans ces mêmes souris. Exemple 4 : Etude de l'activation lymphocvtaire après immunisation complète suivie ou non d'une infection.

1. Profil d'activation des lymphocytes T après immunisation complète par les formes vaccinales b-Lac et De in vivo

Une semaine après immunisation complète (trois immunisations à une semaine d'intervalle chacune), les splénocytes de souris individuelles ont été récupérés comme précédemment décrit et le profil d'activation des lymphocytes T CD4 ⁺ et CD8 ⁺ a été étudié par cytométrie en flux en s'intéressant à l'expression des marqueurs d'activation classiques CD25, CD62L, CD44 et ICOS. La stratégie de sélection (gating) des populations lymphocytaires T CD4 ⁺ ou T CD8 ⁺ employée a été la suivante : FSC/SSC (diffraction de la lumière émise aux petits angles et à 90° ), Singulets (élimination des doublets cellulaires), CD19 négatives (exclusion des lymphocytes B), CD3 ⁺ (sélection des lymphocytes T porteurs d'un TCR) puis CD4 ⁺ (lymphocytes T CD4 ⁺ ) ou CD8 ⁺ (lymphocytes T CD8 ⁺ ). L'étude du nombre de lymphocytes T régulateurs CD4 ⁺ (Treg) a été effectuée après perméabilisation des splénocytes et marquage intracellulaire de la molécule FoxP3. La stratégie de gating des lymphocytes T CD4 ⁺ régulateurs (Treg) employée a été la suivante : FSC/SSC, Singulets, CD19 négatives (exclusion des lymphocytes B), Fixable Viability Dye ⁺ (sélection des cellules viables), CD3 ⁺ (lymphocytes T), CD4 ⁺ (lymphocytes T CD4 ⁺ ) puis FoxP3 ⁺ (sélection des Treg, une forte expression de FoxP3 étant un marqueur spécifique des Tregs). Les analyses statistiques ont été effectuées en utilisant le logiciel GraphPad Prism.

Dans la rate, les nombres totaux de lymphocytes, ou de lymphocytes T CD4+ ou CD8+ ne sont pas significativement différents entre les différents groupes (Figures 4, 5A, 6A). Toutefois, le nombre de lymphocytes T activés CD4 ⁺ CD44 ^hi CD62L ^l0W est significativement augmenté suite à l'immunisation par la forme vaccinale b-Lac seulement (Figure 35). Le profil d'expression d'ICOS sur les lymphocytes T CD4 ⁺ montre lui aussi une augmentation très significative du nombre des lymphocytes T CD4 ⁺ ICOS ⁺ (ICOS étant un marqueur reflétant le potentiel inflammatoire des lymphocytes T CD4 ⁺ ) (Figure 5). En parallèle, le marquage intracellulaire FoxP3 montre une diminution de la population lymphocytaire régulatrice CD4 ⁺ , significative en termes de nombre suite à l'immunisation par la forme vaccinale De. La même tendance est observée dans le groupe b-Lac (Figure 5E). Les formes vaccinales n'induisent pas de différences significatives pour ce qui est des populations T CD8 ⁺ ICOS ⁺ (Figure 6B). On constate une augmentation significative du nombre de lymphocytes T activés CD8 ⁺ CD44 ^hl CD62L ^l0W après immunisation par la forme b-Lac (Figure 6C). 2. Profil d'activation des lymphocytes T après immunisation complète par les formes vaccinales b-Lac et De suivie d'une infection intra-vaginale par 10 ⁷ IFU de Chlamydia muridarum.

Après immunisation complète (trois immunisations à une semaine d'intervalle chacune), les souris ont été cyclées par une injection de progestérone (Deprovera, 50μΙ par souris) et infectées par Chlamydia muridarum par voie intra-vaginale à 10 ⁷ IFU. Après une semaine post-infection, les souris ont été sacrifiées et testées individuellement. Les splénocytes et ganglions drainant le tractus génital (inguinaux/para-aortiques/mésentériques) ont été récupérés et isolés. Le profil d'activation et le nombre des lymphocytes T CD4 ⁺ et CD8 ⁺ ont été étudiés par cytométrie en flux comme indiqué au paragraphe précédent (partie 1 ) en s'intéressant à l'expression de CD25, CD62L, CD44 et ICOS. L'étude de la prolifération des lymphocytes T ainsi que le nombre de Treg est réalisée après perméabilisation et marquage intracellulaire de la molécule Ki67 (prolifération) et FoxP3 (Treg). Les analyses statistiques ont été effectuées en utilisant le logiciel GraphPad Prism.

La figure 7 présente le nombre total de cellules lymphoïdes des ganglions drainant le tractus génital et de la rate des souris des 4 groupes PBS, MEF, b-Lac ou De. Il est très clair que l'immunisation avec la forme b-Lac suivie par l'infection intra-vaginale des souris entraîne une nette augmentation du nombre des lymphocytes des ganglions drainants (p<0,05) et une diminution tout aussi marquée dans la rate (p<0,01 ).

Dans la rate de ces souris, on observe également, pour le groupe b-Lac, une diminution significative des lymphocytes T CD4+ CD25+ (Figure 8B) et une tendance comparable pour les lymphocytes T CD4+ et CD4+ CD44 ^hi CD62L ^l0W (Figure 8A et 8C respectivement) En ce concerne les lymphocytes T CD8+, dans le groupe b-Lac, ils sont significativement diminués (p<0,05, Figure 8D), ainsi que les T CD8+CD25+ (p<0,01 , Figure 8E).

Une image en miroir est observée dans les ganglions drainants, avec une augmentation significative des mêmes populations T CD4+ et CD4+ CD25+ (Fig.9A et C) dans le groupe b-Lac, et une tendance comparable pour les lymphocytes T CD4+ et CD4+ CD44 ^hi CD62L ^l0W et ICOS ^hi CD4 ⁺ (Figure 9 B et D). La même observation s'applique aux lymphocytes T CD8+, et CD8+ CD44 CD62L eux aussi significativement augmentés seulement dans le groupe b-Lac (Figure 9 E et F).

En accord avec les résultats ci-dessus, si l'on examine les nombres des lymphocytes T CD4+ et CD8+ en prolifération (porteurs du marqueur nucléaire Ki67) on constate une nette tendance à la diminution dans la rate et à l'augmentation dans les ganglions, toujours seulement dans le groupe b-Lac (Figure 10).

Les analyses du nombre de lymphocytes T régulateurs (porteurs des marqueurs CD4 et FoxP3) aboutissent aux mêmes conclusions, toujours dans le groupe b-Lac: tendance à la diminution des Treg CD4+ KÏ67+ dans la rate, et augmentations significatives (p<0,05) des T reg CD4+ et CD4+ KÏ67+ dans les ganglions drainants (Figure 1 1 ).

L'ensemble de ces résultats suggère que les injections immunisantes de formes b-Lac induisent une activation et une réponse immunitaire T spécifiques de Chlamydia muridarum dans la rate, avec production d'anticorps spécifiques. En réponse à une infection intra-vaginale, les lymphocytes T activés quittent la rate pour les ganglions drainant le tractus génital. Ainsi une base immunitaire à l'origine de la baisse de charge bactérienne locale (lymphocytes effecteurs) et à la diminution de la réaction inflammatoire locale génératrice de lésions tissulaires (lymphocytes T régulateurs) est apportée.