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Patent Searching and Data


Title:
VINEYARD CULTURE METHOD ENABLING THE YEASTS THEREOF TO BE OBTAINED FOR HIGH SUGAR AND ALCOHOL CONTENT FERMENTATION
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2011/048238
Kind Code:
A2
Abstract:
Method for culturing resistant vineyards that selects indigenous vines, with natural stock, the fertilizer for which comprises local grasses/weeds, without other nutrients, harvesting being in the autumn. Fermentation method that is based on pressed grapes, in 20-25% of the vats, the wild yeasts thereof being produced and, in initial states, 3.5-6% vol. alcohol being achieved, with subsequent topping-up every 7-15 days; the total added sugar undergoes stepwise fermentation. Three different yeasts are obtained: white yeast (1), slow-growth yeast (2) and yellow yeast (3). Said yeasts make it possible directly to obtain high-quality beverages, such as cider, beers, cognacs, rums, vodkas, etc., with products having an alcohol content of up to 60% vol./vol. Fermentation also takes place with highly concentrated solutions of sucrose, molasses, sugars resulting from starch hydrolysis, and various plant materials. The production of bread, pastries and quality derived products is facilitated.

Inventors:
MARQUEZ SAHUQUILLO MIGUEL JESUS (ES)
NAVARRO AVINO JUAN PEDRO (ES)
Application Number:
ES2010/000421
Publication Date:
April 28, 2011
Filing Date:
October 15, 2010
Export Citation:
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Assignee:
BODEGAS DAGON S L N E (ES)
MARQUEZ SAHUQUILLO MIGUEL JESUS (ES)
NAVARRO AVINO JUAN PEDRO (ES)
International Classes:
A01G17/02; C12G1/022; C12G3/02; C12N1/16
Domestic Patent References:
WO2009046485A12009-04-16
Foreign References:
FR2844275A12004-03-12
FR2751322A11998-01-23
EP1482029A12004-12-01
FR2630455A11989-10-27
FR2687544A11993-08-27
Other References:
ESCUELA OF AGRICULTURA.: 'Sur of Mendoza, Tierra of Buenos Vinos: Enologia.', [Online] 18 February 2003, XP008156055 Retrieved from the Internet: [retrieved on 2011-03-28]
GARCIA MUNOZ-SECA MJ: 'CARACTERIZACIONES MOLECULARES EN CEPAS LEVADURIFORMES' ARTICULO CIENTIFICO PUBLICADO ORIGINALMENTE IN THE REVISTA ''ENOLOGOS'', [Online] no. 39, January 2006 - February 2006, XP008156062 Retrieved from the Internet: [retrieved on 2011-03-29]
PRODUCTOS DEL MONCAYO. VINO ECOLOGICO., [Online] 17 October 2005, XP008156052 Retrieved from the Internet: [retrieved on 2011-03-28]
DATABASE WPI Derwent Publications Ltd., London, GB; AN 1992-038431, XP008159984 & JP 3 285 670 A (BODYSONIC KK) 16 December 1991
DATABASE WPI Derwent Publications Ltd., London, GB; AN 2003-037549, XP008159985 & RU 2 186 846 C2 (GUP G ET AL.) 10 August 2002
DI MARO E ET AL.: 'Yeasts Dynamics During Spontaneous Wine Fermentation of the Catalanesca Grape' INT. J. FOOD MICROBIOL. vol. 117, 2007, pages 201 - 210, XP008156060
Attorney, Agent or Firm:
MOLINERO ZOFIO, Felix (ES)
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Claims:
REIVINDICACIONES

1. - Un método de cultivo de un viñedo resistente a las inclemencias meteorológicas y/o climáticas con el desarrollo de raíces profundas y fuertes caracterizado porque

- se seleccionan unas variedades de viñas naturales autóctonas, teniendo un pie natural, sin injerto alguno,

- se abonan dichas viñas con el compost obtenido de las propias hierbas del terreno,

no se adicionan otros nutrientes que los del propio terreno,

- se recolectan las uvas después de las lluvias del otoño,

2. - Un método de fermentación profunda con levaduras salvajes de uvas que recuerden al terreno y posean sus propiedades organolépticas caracterizado porque se fermentan la totalidad de los azúcares contenidos en las uvas mediante:

- la formación de un pie de cuba con uva estrujada,

- realizar la fermentación en depósitos de capacidad inferior a 5.000 litros sobre el 20-25% de dicho volumen,

- reproducción de las levaduras salvajes autóctonas obtenidas, alcanzando del 3,5 a 6% vol. de alcohol,

- rellenos posteriores cada 7 a 15 días,

- fermentación con las mismas levaduras en escalera hasta la fermentación de todo el azúcar y obtención de un vino de grado alcohólico final entre 14 a 20% vol. 3.- Un método de obtención de levaduras salvajes de uvas según la reivindicación N°2 caracterizado porque se obtienen tres levaduras distintas: Levadura Blanca (1), Levadura de Crecimiento Lento (2) y Levadura amarilla (3), en donde el extracto de la mezcla obtenida de dichas tres levaduras se obtiene en medio YPD, y porque la separación de dichas levaduras se efectúa mediante cultivo en medio YPD con diferentes concentraciones de alcohol y azúcar:

- Levadura Blanca (1) por crecimiento en medios YPD conteniendo concentraciones de etanol hasta 60%

- Levadura de Crecimiento Lento (2) por crecimiento en medios YPD conteniendo concentraciones de etanol hasta 25%.

- Levadura amarilla (3) por crecimiento en medios YPD conteniendo azúcar, de tal forma que, en dicho medio, produce colonias de mayor tamaño que el resto de las levaduras detectadas.

4.- Un método de uso de levaduras salvajes individuales según la reivindicación N°3 caracterizado porque el extracto individual de dichas tres levaduras encuentra aplicación en:

- Levadura Blanca (1) en supervivencia en altas concentraciones de etanol. - Levadura de Crecimiento Lento (2) en formar una capa de micelio beneficiosa para el proceso de fermentación.

- Levadura amarilla (3) en facilitar el crecimiento de levadura en concentraciones de glucosa.

5.- Un método de uso en la producción industrial de alcoholes de levaduras salvajes según la reivindicación N°3 caracterizado porque la mezcla obtenida de dichas tres levaduras^ Levadura Blanca (1), Levadura de Crecimiento Lento (2) y Levadura amarilla (3), realiza la fermentación de bajas hasta altas concentraciones de azúcares provenientes de las soluciones de sacarosa, del azúcar comercial, de la melaza proveniente de caña de azúcar, de la melaza proveniente de remolacha, la fermentación de azucares provenientes de la hidrólisis del almidón, la fermentación de azucares provenientes de materias vegetales y otras. 6.- Un método de uso, en la industria de producción de bebidas alcohólicas de baja graduación, de levaduras salvajes según la reivindicación N°3 caracterizado porque la mezcla obtenida de dichas tres levaduras, Levadura Blanca (1), Levadura de Crecimiento Lento (2) y Levadura amarilla (3), permite por fermentación de azúcares provenientes de distintas fuentes obtener bebidas de baja graduación alcohólica tipo vino, cerveza, sidra, etc.

7. - Un método de uso, en la industria de producción de bebidas alcohólicas de alta graduación, de levaduras salvajes según la reivindicación N°3 caracterizado porque la mezcla obtenida de dichas tres levaduras, Levadura Blanca (1), Levadura de Crecimiento Lento (2) y Levadura amarilla (3), permite por fermentación de azúcares provenientes de distintas fuentes obtener bebidas de alta graduación alcohólica tipo coñacs, roñes, vodkas, etc.

8. - Un método de uso de levaduras salvajes, en la industria de producción de pan, bollería y derivados de calidad, según la reivindicación N°3 caracterizado porque el proceso de fermentación del almidón utiliza dicha mezcla obtenida de dichas tres levaduras, Levadura Blanca (1), Levadura de Crecimiento Lento (2) y Levadura amarilla (3).

Description:
MÉTODO DE CULTIVO DE VIÑEDOS Y OBTENCIÓN DE SUS LEVADURAS PARA FERMENTACIÓN EN ALTOS CONTENIDOS DE AZÚCAR Y ALCOHOL.

OBJETO DE LA INVENCIÓN

Un primer objeto es desarrollar un método de cultivo de un viñedo resistente a las inclemencias meteorológicas y/o climáticas con el desarrollo de raíces profundas y fuertes Un segundo objeto es desarrollar un método de fermentación profunda con levaduras salvajes de uvas que recuerden al terreno y posean sus propiedades organolépticas, y métodos de obtención de vinos con alta graduación alcohólica.

Un tercer objeto es desarrollar un método de obtención y de uso de levaduras salvajes de uvas, capaces de realizar la fermentación de azúcares en bajas hasta altas concentraciones, provenientes de las soluciones de la sacarosa, del azúcar comercial, de la melaza procedente de caña de azúcar, de la melaza procedente de remolacha, la fermentación de azucares procedentes de la hidrólisis del almidón, y la fermentación de azucares procedentes de materias vegetales

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

En la elaboración del vino es deseable que las levaduras completen la fermentación de todo el azúcar presente en el zumo de uva, así un alto grado de alcohol, normalmente hasta unos 14% vol. o no muy superior, da al vino su estructura final y aromática.

La fermentación de los mostos de uvas en la práctica se puede realizar con levaduras salvajes, levaduras inoculadas o empleando ambos procedimientos Las levaduras salvajes responsables de la vinificación se encuentran de forma natural en los hollejos de las uvas (generalmente en una capa en forma de polvo blanco fino que recubre la piel de las uvas, (vitis vinifera /.), y que se denomina "pruína"). Las cepas de levaduras cultivadas específicas, pueden proporcionar aromas afrutados específicos, alto grado de alcohol, textura agradable en nariz y otras características como fermentar a bajas temperaturas o con relativamente bajo pH etc.

En gran mayoría de las bodegas se utilizan habitualmente levaduras seleccionadas específicas para convertir el azúcar en alcohol. La especie de levadura que se considera mejor para la total fermentación del alcohol es la saccharomyces cerevisiae. La fermentación con levaduras salvajes o indígenas, aunque es muy minoritaria, la practican algunos elaboradores europeos, que han fermentado desde siempre con levaduras salvajes y con muy buenos resultados. Asimismo, elaboradores de vino californianos están empezando a poner en marcha esta fermentación espontánea, con resultados también muy favorables. En la cosecha, las uvas portan millares de organismos, incluidas las levaduras, con el consiguiente riesgo de infección. Una de las características más comunes de las levaduras salvajes es su baja resistencia al alcohol y su poca resistencia a las infecciones.

Sin embargo, muchos tipos de levaduras salvajes son incapaces de actuar una vez se alcance niveles de alcohol del 9% vol., resultando un atasco en la fermentación, un vino sin consistencia, con un sistema de baja inmunidad y gran cantidad de azúcar residual no deseada, entre otros problemas. Una dificultad adicional al utilizar levaduras salvajes en la fermentación, es el tiempo necesario para que la levadura salvaje establezca colonias, quedando el mosto abierto a una infección por otros organismos que tienen un desarrollo más rápido o a la oxidación, además, una vez comienza la fermentación, ésta es larga, lenta y sin garantías de que finalice correctamente. Otro problema añadido es la impredecibilidad de los aromas y ésteres que las levaduras salvajes pueden introducir en el vino. Sin embargo, con las levaduras seleccionadas o de laboratorio comerciales es posible conseguir los sabores y aromas deseados al gusto de cada elaborador.

Una ventaja del empleo de las levaduras salvajes es el hecho de que se tarde más tiempo en iniciar la fermentación, permite más tiempo de contacto de la piel con las uvas, lo que se traduce en más cuerpo, profundidad de carácter, color y sabores más afrutados (es decir, muchas más variables que con los vinos industriales). Se ha constatado que muchos de los impredecibles aromas y ésteres comunicados por las levaduras salvajes dan una interesante naturaleza sofisticada al vino, resultando un vino con sabores complejos, buen bouquet y muy buen alcohol.

Un modo de influir en la cosecha es el riego. Sin embargo, el efecto del riego respecto al grado alcohólico de los vinos es la disminución de la concentración de los azúcares, debido al efecto de la dilución. La producción aumenta al comparar vides irrigadas y no irrigadas, se observa que los compuestos fenólicos y la intensidad de los colorantes disminuyen en los vinos procedentes de vides irrigadas. En el mosto se constata un aumento del ácido málico en uvas de vides irrigadas. El efecto de aportaciones de agua al final de la maduración repercute negativamente en la composición del vino final y la calidad por la disminución de la concentración de elementos debido a la dilución producida en la baya por el agua.

En el estado de la técnica son escasos los trabajos que profundicen en los factores que influyen sobre las calidades de los vinos, pues los factores, que influyen sobre la glicólisis fermentativa de los azúcares por las levaduras salvajes, son complejos debido a la interrelación existente entre éstos, y a la naturaleza de los parámetros que intervienen durante el proceso de fermentación

El documento FR 2844275 tiene por objeto un procedimiento de vinificación natural con levaduras salvajes que se caracteriza por comprender los siguientes pasos: -transferir mediante gravedad las uvas a barricas de madera, - vibrado para asegurar el llenado completo de las barricas, - control de la fermentación de la uva en estos barriles con una oscilación periódica, etc. así como la posterior fermentación malo-láctica del vino y la conservación de este vino en el mismo barril de fermentación. No emplea bombas para el trasiego ni tanques, sólo cubas.

El documento WO2004029 93 propone un método de producción de un producto de fermentación, comprendiendo el método una etapa de fermentación que incluye el contacto con un microorganismo en fermentación o medios de fermentación utilizados con al menos una enzima de esterasa, como p.ej. lipasa, fitasas, fosfolipasa y cutinasa.

En el estado de la técnica, sin embargo, no aparecen referencias del cultivo de las viñas con objeto de conseguir cepas de levaduras salvajes para realizar la fermentación total del azúcar. Representaría un indudable interés práctico un método de obtener levaduras salvajes que realicen la fermentación total del azúcar y con garantías de superar infecciones vínicas.

DESCRIPCION DE LA INVENCION

La presente invención se refiere a un método de cultivo de un viñedo resistente a las inclemencias meteorológicas y/o climáticas con el desarrollo de raíces profundas y fuertes, método de cultivo gracias al cual se desarrollan las levaduras salvajes que realizarán el proceso de fermentación del vino; y a un método de fermentación profunda por el que se realiza la total transformación del azúcar en alcohol, se desarrollan y multiplican estas levaduras salvajes en caldos que alcanzan tan alto grado de alcohol, totalmente superiores a los obtenidos por la fermentación convencional practicada hasta la fecha. E! método natural de cultivo consiste en la obtención de un vino totalmente natural, empezando por la selección de la vid, de forma que sea la propia vid la que se desarrolle y produzca sus frutos y por sus propias levaduras. La intervención del hombre se centrará en la preparación del suelo, cultivando las hierbas para posteriormente enterrarlas para su aportación orgánica al suelo "in situ" sin adición alguna de abono, haciéndose la planta fuerte de una manera natural y adaptándose al terreno por sí sola. Siguiendo este procedimiento, se ha comprobado a través de los años, que la cosecha se podía retrasar con lo que se conseguían unas uvas con más proporción de azúcar; se ha llegado a recoger incluso en los meses de enero y febrero, aunque en los últimos años ha sido posible adelantarla algo permaneciendo el resultado, en cuanto a calidad el mismo, y su producción ha aumentado. El método empieza desde en el mismo momento de la selección de viñas y llega hasta la consecución de la levadura de estas cepas, que posteriormente serán tratadas, en su caso, genéticamente para conseguir una multiplicación más rápida y para que sean las predominantes en el proceso de fermentación, es decir, que se desarrollen en cantidad y fuerza para que prevalezcan frente a otras levaduras que puedan aparecer y que además consigan la total fermentación de los azúcares, para obtener un vino con carácter y muy buen alcohol que le dará longevidad, aromas y sabores, que no sólo nos recuerden el fruto sino también la tierra y el ambiente donde se han cultivado las viñas, resolviendo un problema existente actualmente y que es que con levaduras salvajes o indígenas no se había conseguido, hasta ahora, la fermentación con un alto grado de alcohol.

Las etapas características esenciales del método natural de cultivo son:

- se seleccionan unas variedades de viñas naturales autóctonas, teniendo un pie natural, sin injerto alguno,

- se abonan dichas viñas con el compost obtenido de las propias materias orgánicas del terreno,

- se recolectan las uvas de forma tardía,

no se adicionan otros nutrientes que los del propio terreno

El método de fermentación profunda con levaduras salvajes de uvas, que recuerdan al terreno y poseen sus propiedades organolépticas; y muy importante fermentan la totalidad de los azúcares contenidos en las uvas. El método de fermentación profunda no emplea ningún tipo de levadura adicional, la realiza sólo con las levaduras salvajes propias de las uvas, es decir, se realiza la fermentación con las levaduras obtenidas de las uvas crecidas por el método natural de cultivo. Estas levaduras salvajes propias de las uvas cuyas propiedades en gran medida recuerdan al terreno son capaces de realizar la fermentación incluso con altos porcentajes de alcohol. En bodega durante largos años se ha ido viendo una evolución de las levaduras salvajes aportadas por las uvas, los sabores, aromas y el bouquet han ido mejorando y estandarizándose y el alcohol era cada vez mejor, hasta que en el año 2.004 sus propiedades se han estabilizado, dando a partir de entonces unos vinos más regulares por sus propiedades.

Más aún, el método de fermentación profunda con levaduras salvajes de uvas permite la obtención de caldos con contenidos aún superiores de alcohol, lo que permite la obtención directa de bebidas alcohólicas como coñacs, etc. Finalmente, el presente método crea las condiciones para la producción industrial de bioetanol con índices energéticos más eficaces en comparación con los obtenidos actualmente en producción industrial de bioetanol por la fermentación de materias primas como el jugo de la caña de azúcar, o la remolacha. Las etapas características esenciales del método de fermentación profunda son:

- formación de un pie de cuba con uva estrujada,

- realización de la fermentación en depósitos de capacidad inferior a 5.000 litros sobre el 20-25% de dicho volumen,

- reproducción de las levaduras salvajes autóctonas obtenidas, alcanzando del 3,5 a 6% vol. de alcohol,

- rellenos posteriores cada 7 a 15 días,

- fermentación con las mismas levaduras en escalera, realizando en etapas sucesivas la fermentación obteniendo en cada etapa un aumento del tanto por ciento de alcohol, hasta la fermentación de todo el azúcar y obtención de un vino de grado alcohólico final entre 14 a 21 % vol.

DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La Figura 1 corresponde al poso de una barrica que contenía un 17.7% de etanol, y del poso de una segunda barrica cuyo contenido en alcohol era 18.2%, sembradas ambas en placas del medio YPD. La Figura 2 muestra en una siembra en el medio YPD las Levadura Blanca 1 , Levadura de Crecimiento Lento 2 y la Levadura amarilla 3.

La Figura 3 presenta una muestra de la parte inferior del tanque y otra del poso del tanque de fermentación de uvas de la cosecha de 2008, en el medio YPD, se aprecian unos hongos filamentosos que podrían tratarse de la levadura de crecimiento lento.

La Figura 4 que corresponde igualmente a la cosecha de 2008, presenta una muestra de la parte inferior del tanque y otra del poso del tanque de fermentación, en el medio YPD, se aprecian unos hongos filamentosos, abundante presencia de levadura blanca y una pequeña de levadura amarilla.

La Figura 5.1 y la Figura 5.2 representan: la columna de la derecha es un medio YPD sin glucosa al que se le ha ido aumentando el nivel de etanol. La columna de la izquierda muestra placas de medio YPD que contiene un 1 % de glucosa. A la izquierda de las fotos, el texto indica el porcentaje de etanol en cada placa. Todas las placas están divididas en tres zonas y en cada zona respectiva está sembrada cada una de las cepas Levadura Blanca 1 , Levadura de Crecimiento Lento 2 y la Levadura amarilla 3. , La Figura 6 presenta el comportamiento de las tres cepas de levadura Levadura Blanca 1 , Levadura de Crecimiento Lento 2 y la Levadura amarilla 3. en medio YPD con un 1% de glucosa a niveles elevados de etanol. Igualmente, todas las placas están divididas en tres zonas y en cada zona está sembrada cada una de las cepas.

La Figura 7 presenta la morfología al microscopio de la siembra por separado de la levadura blanca. La Figura 8 presenta la morfología vista al microscopio de la siembra por separado de la levadura blanca luego de un crecimiento más avanzado.

La Figura 9 corresponde a la levadura de crecimiento lento al microscopio por separado. La Figura 10 corresponde a la misma placa de la Figura 4 a partir de la cual se van a analizar unas hifas obtenidas en un mosto en fermentación.

La Figura 1 1 presenta una de las hifas entera, incluyendo su cabeza. La Figura 12 presenta una ampliación de la cabeza de la hifa de la Figura 11 , y en la que se puede ver que está compuesta por sus pequeñas células.

La Figura 13 es una ampliación donde se observan las pequeñas células de la Figura 12. La Figura 14 es una fotografía de un matraz con espuma debida al desprendimiento de C0 2 de la muestra en la fermentación de un medio con un 60% de azúcar comercial (sacarosa).

La Figura 15 es una fotografía de un matraz con espuma debida al desprendimiento de C0 2 de la muestra en la fermentación de un medio con un 70% de azúcar comercial (sacarosa).

La Figura 16 es una fotografía de un matraz con espuma debida al desprendimiento de C0 2 de la muestra en la fermentación de la melaza de remolacha con un contenido del 12,2% en sacarosa.

La Figura 17 es una fotografía de un matraz con espuma debida al desprendimiento de C0 2 de la muestra en la fermentación de la melaza caña de azúcar pura con un contenido en sacarosa del 40%.

La Figura 18 es una fotografía de un matraz con espuma debida al desprendimiento de C0 2 de la muestra en la fermentación de la melaza de remolacha con un contenido en sacarosa del 12,2%.

La Figura 19 es una fotografía de un matraz con espuma debida al desprendimiento de C0 2 de la muestra en la fermentación de la melaza de remolacha con un contenido en sacarosa del 18,4%.

La Figura 20 es una fotografía de un matraz con espuma debida al desprendimiento de C0 2 de la muestra en la fermentación de la melaza de remolacha con un contenido en sacarosa del 42,7%.

La Figura 21 es una fotografía de un matraz con espuma debida al desprendimiento de C0 2 de la muestra en la fermentación de azúcares procedentes de almidón con una concentración de almidón del 20%. La Figura 22 es una fotografía de un matraz con espuma debida al desprendimiento de C0 2 de la muestra en la fermentación de azúcares procedentes de almidón con una concentración de almidón del 40%.

La Figura 23 es una fotografía de un tubo con espuma debida al desprendimiento de C0 2 de la muestra en la fermentación de azúcares procedentes de materia vegetal.

La Figura 24 es una fotografía de un tubo con espuma debida al desprendimiento de C0 2 de la muestra en la fermentación de azúcares procedentes de materia vegetal.

REALIZACIONES PREFERENTES

Realización N°1. MÉTODO DE CULTIVO DE UN VIÑEDO RESISTENTE a). Condiciones de cultivo:

Los trabajos se iniciaron en 1.989. Se seleccionaron las viñas autóctonas, Bobal, CRUJIDERA, Royal y Tardana. Desde el primer momento se realiza una agricultura enteramente natural. En el cultivo no se emplea ningún abono químico ni orgánico, a excepción del compost elaborado con las hierbas del terreno donde están plantadas las vides. Esto corresponde al Primer Objeto de la Invención, Método de cultivo de un viñedo resistente, que consiste en conseguir unas viñas resistentes por sí mismas y que sean capaces de bastarse con los nutrientes propios del terreno, por lo que desarrollarán unas raíces profundas y fuertes. Así, se consigue que la uva adquiera los sabores y aromas que recuerden al terreno donde se cultivan. No se realiza ningún riego, a pesar de que la pluviosidad en la zona es inferior a 500 l/m 2 , ya que se trata de un clima continental y seco, (entre 300 a 500 mm de pluviosidad). Esto corresponde asimismo al Primer Objeto de la Invención para el tipo de cultivo, que logrará que también las levaduras presentes en la piel de las uvas se adapten a esta climatología. b) Cronología de recolección y características de las uvas:

- Año 1.990: se recoge la uva más tarde, pues las uvas aguantaban perfectamente debido principalmente a la forma de cultivo. Estas viñas se han ido extendiendo por el terreno, terreno que tiene orientación sur y que se encuentra en un microclima, ya que a ambos lados del mismo existen dos pequeños bosques.

Años 1.996 a 1.998: Las viñas empezaron a producir uvas de diferentes sabores y aromas a partir de los 6, 7 años y van mejorando cada año la calidad de su producción. Se hace vino con las uvas recolectadas tardíamente, en correspondencia con el Segundo Objeto de la Invención. Para este tipo de cultivo tardío se logra un alto grado alcohólico entre 14° a 16° alcohol, de una forma totalmente natural con las levaduras salvajes que aparecen en el mosto, es decir, superando en mucho la opinión generalizada que las levaduras salvajes difícilmente sobreviven y se desarrollan en medios con tales altos grados de alcohol. Aunque no se aclimatan a más graduación de alcohol ya en el año 1.998 cambian los aromas. Se sabe que las levaduras son seres vivos muy sensibles y parece que se están aclimatando gradualmente a estas altas graduaciones de alcohol.

- Año 2.002: Según el Primer Objeto de la Invención, se recoge la primera cosecha comercial realizando la vendimia tardía, en época de nieblas y especialmente después de las lluvias del otoño. Se ha establecido según la Invención que aunque normalmente cuando llueve en septiembre las uvas engordan, no obstante, con las lluvias del otoño engrosa la piel de las uvas, las uvas no engordan, y es cuando aparecen las levaduras del Segundo Objeto de la Invención, método de fermentación profunda con levaduras salvajes, las que intervendrán posteriormente en el proceso innovador de fermentación del azúcar.

Realización N°2. MÉTODO DE FERMENTACIÓN PROFUNDA CON LEVADURAS SALVAJES Según el Segundo Objeto de la Invención, la obtención del vino se realiza:

elaborando un pie de cuba con uva estrujada, en depósitos de capacidad inferior a 5.000 litros, sobre el 20-25% de dicho volumen, o una relación proporcional equivalente, para que se reproduzca la levadura, siendo ésta la levadura salvaje o natural de la viña.

- Duración de la fermentación: entre 15 a 20 días alcanzando del 3,5 a 6% vol. de alcohol. - A partir de este pie de cuba, se va añadiendo del 15 al 20% del volumen del contenedor cada 7 a 15 días, realizando una fermentación en escalera y aportando de esta manera oxígeno y nutriente a las levaduras que aumentarán la graduación alcohólica, hasta conseguir fermentar todo el azúcar y

- Grado alcohólico final entre el 16 al 19% vol. de alcohol.

2.1- Producción a partir de 2002: En el año 2.002 se produjeron caldos con 15,5° de alcohol, en el 2.003 igual grado alcohólico, y en el año 2.004 se obtiene ya una cantidad de alcohol entre 15,5 a 18,98% vol..

De esta forma se consigue obtener un vino con cuerpo, muy buen alcohol, con lo que se asegura su calidad a lo largo del tiempo, y con muy buenos sabores que nos recuerdan al ambiente y al terreno, aromas que recuerdan el fruto donde proceden, consiguiéndose un bouquet y personalidad característicos y debido a la longevidad de las viñas, (viñedos viejos con más de 70 años), una mayor calidad en los caldos fermentados.

2.2.- CARACTERIZACIÓN DE LAS LEVADURAS SALVAJES AUTÓCTONAS.

Según el Tercer Objeto de la Invención, Método de obtención de levaduras salvajes autóctonas, se ha estudiado en laboratorio las levaduras causantes de la fermentación correspondiente al Segundo Objeto de la Invención, para lo que se extrajeron muestras representativas del vino producido.

Muestras: Las muestras recogidas pertenecían a la cosecha de 2004 y fueron:

- Muestra del poso de una barrica que contenía un porcentaje de etanol de 17.7% vol. de alcohol, en adelante 17.7%.

- Muestra del poso de otra barrica cuyo contenido en alcohol era 18.2% vol. de alcohol, en adelante 18.2%. Estudio de las muestras en placas:

1- Las muestras se sembraron en placas conteniendo el medio YPD (Yeast extract- Peptone-Dextrose). En la Figura 1 se puede ver un ejemplo de los resultados obtenidos, en el que se observan tres tipos distintos de colonias.

2- Se tomó una muestra de los tres tipos de levadura y se sembró en una nueva placa del medio YPD para que crecieran en mayor cantidad y poder diferenciarlas mejor, véase la Figura 2. Se ha señalado con una flecha cada una de las levaduras en esta Figura 2, así se distinguen la Levadura Blanca 1 , la Levadura de Crecimiento Lento 2 y la Levadura amarilla 3. 3- Con las levaduras perfectamente definidas y diferenciadas, se determinó su capacidad de crecimiento. Se tomó la misma cantidad de cada tipo de levadura y se sembró en una nueva placa YPD y se comprobó que la levadura denominada de crecimiento lento, efectivamente crecía más lentamente que las otras dos.

4- Se tomaron nuevas muestras, pero no de barricas, sino ahora del tanque de fermentación y de la cosecha de 2008.

- Se tomó una muestra del líquido de la parte inferior del tanque.

- Se tomó otra muestra del poso del tanque de fermentación.

Las dos muestras fueron sembradas en dos placas del medio YPD y se observó la aparición de unos hongos filamentosos, indicados en la Figura 3 y véase mejor en la Figura 4, con una flecha, que suponíamos podría tratarse de la levadura de crecimiento lento 2 que en el proceso de fermentación se encuentra en forma de hongos filamentosos, para posteriormente evolucionar a la forma de levadura que hemos obtenido en barricas. En las placas también se observan abundante levadura blanca 1 y en menor medida la levadura amarilla 3.

- ENSAYOS DE LAS LEVADURAS AISLADAS A DISTINTAS CONCENTRACIONES DE ETANOL a- Siembra de los glicerinados de las tres levaduras - Crecimiento de las levaduras a distintas concentraciones de etanol y glucosa

Se realizaron los glicerinados de cada una de las tres levaduras y se sembraron en medios con distintos niveles de etanol para ver su capacidad para desarrollarse. Se prepararon dos tipos de medios, uno con glucosa (1%) y otro sin glucosa. Después de algunos intentos fallidos de preparación en el medio de YPD con etanol, debido a que las concentraciones elevadas de etanol fluidifican en exceso el medio YPD, se elaboró un procedimiento adecuado. Se consigue que el medio solidifique al aumentar la cantidad de agar en dependencia de la cantidad de etanol que se fuera a añadir a continuación. En estas placas se sembraron las levaduras, cuidando de sembrar la misma cantidad de las levaduras en todas las placas, obteniendo los siguientes resultados, véanse las Figuras 5.1 y 5.2:

1.- La levadura blanca crece adecuadamente en todas las concentraciones de etanol y en grandes cantidades tanto en el medio con glucosa (1%), como en el medio sin glucosa, pues puede utilizar como fuente de alimentación tanto el carbono del etanol, como también la peptona y el extracto de levadura, que son componentes del medio YPD. 2. -La levadura amarilla presenta una morfología distinta dependiendo de si el medio contiene glucosa, o no. En medios con glucosa crece en forma de grandes colonias, mientras que en los medios sin glucosa crece en forma de colonias más pequeñas, pero en mucho mayor número. En ambos casos se produce una reducción de la cantidad producida de levadura al aumentar el porcentaje de etanol.

3. - La levadura de crecimiento lento al igual que la levadura amarilla crece de forma distinta dependiendo de si el medio lleva glucosa, o no. En este caso, el comportamiento es el opuesto a la levadura amarilla, así las colonias en el medio sin glucosa presentan un mayor tamaño, que las colonias en el medio con glucosa aunque estén en menor número. En cuanto al crecimiento en los distintos niveles de etanol vemos como a niveles altos de etanol crecen con más dificultad. b.- Crecimiento de las levaduras a concentraciones superiores de etanol

En ensayos posteriores se aumentó la concentración de etanol para determinar la concentración límite de etanol que resiste cada tipo de levadura. Este ensayo entrañaba un problema y era que la cantidad de etanol a añadir era bastante alta y el medio podía tener problemas para solidificar, por lo que se decidió aumentar la concentración de agar en el medio del 2% al 3%. La cantidad de glucosa que se empleó en el medio fue del 1%

Se obtuvieron los siguientes resultados:

La . levadura blanca creció significativamente en todas las concentraciones de etanol. La diferencia entre unas concentraciones y otras era la velocidad de crecimiento de la levadura. Para las concentraciones mayores, la velocidad de crecimiento es menor, la levadura empleó más días en crecer, pero como se puede ver la cantidad de levadura crecida es muy similar en todas las placas.

La levadura amarilla creció en todas las placas, pero su crecimiento fue pequeño, en algunas placas incluso cuesta observar si ha crecido o no. Así, en las placas que se observa un mayor crecimiento son las de 25 y 40% vol. de etanol.

La levadura de crecimiento lento creció en un gran número de colonias para una concentración del 25% vol. y para mayores concentraciones de etanol no experimentó crecimiento alguno.

Así, preliminarmente se concluye que la levadura de crecimiento lento no resiste condiciones en las que la concentración de etanol sea superior al 25% vol., mientras que la levadura blanca resiste concentraciones de etanol muy elevadas, y a la levadura amarilla le cuesta mucho crecer en todas las concentraciones de etanol, y crece en cantidades muy pequeñas. c- Ensayos de levaduras a niveles aún mayores de etanol.

Los niveles de etanol ensayados en estas placas fueron: 40%, 45%, 50%, 60% vol. Los resultados obtenidos, véase la Figura 6, fueron:

- La levadura blanca crece significativamente en todas las placas aunque a 60% vol. de etanol se aprecia una marcada disminución de la cantidad de levadura, posiblemente, porque a este nivel se ve afectada por la toxicidad del etanol. - La levadura de crecimiento lento no crece en ninguna de estas placas.

- La levadura amarilla sí presenta indicios de crecimiento en algunas de estas placas pero parece ser que es un crecimiento residual por la gran cantidad de levadura sembrada con el asa y que permanece en la estría de siembra. d.- Morfología de los distintos tipos de levaduras

Se observaron los distintos tipos de levaduras al microscopio.

En las Figuras 7 y 8 se pueden observar las imágenes correspondientes a la levadura blanca 1. En la Figura 8 se aprecia un gran número de células en reproducción.

En la Figura 9 se pueden observar las imágenes correspondientes a la levadura de crecimiento lento 2.

En la Figura 10 se pueden observar las imágenes correspondientes al mosto en fermentación recogido del tanque de fermentación de la cosecha de 2008, en el que se aprecian unas hifas, elementos filamentosos cilindricos característicos de la mayoría de los hongos.

En la Figura 1 1 se pueden observar las imágenes correspondientes a una hifa entera de la Figura 10, observándose perfectamente la cabeza de dicha hifa.

En la Figura 2 se pueden observar las imágenes correspondientes a una ampliación de la cabeza" de hifa de la Figura 11 , en la que se observa que está formada por pequeñas células.

En la Figura 13 se pueden observar las imágenes correspondientes a las pequeñas células que forman la cabeza de hifa de la Figura 12. Estas células tienen un aspecto muy parecido a las observadas en la levadura de crecimiento lento 2, véase la Figura 9. Aunque, el tamaño de las células de la cabeza de hifa resulta mayor y su membrana celular más gruesa que las de las células observadas en la levadura de crecimiento lento 2.

Realización N°3. CAPACIDAD DE LAS CEPAS MEZCLADAS EN LA FERMENTACIÓN DE LA

SACAROSA (AZÚCAR COMERCIAL).

Se prepara un medio de cultivo en matraces con diferentes concentraciones peso/volumen de azúcar comercial. Los componentes del medio son:

Fosfato monopotásico 0,5%

- Sulfato de amonio 0,2%

- Sulfato magnésico heptahidratado 0,004%

- Extracto de levadura 0,1%

- Agua.

Las concentraciones de azúcar son: 1 , 2, 10, 15, 20, 25, 30, 40 y 50 % todas ellas en porcentaje peso/volumen.

Preparación de las cepas de la levadura blanca 1 , amarilla 3, levadura de crecimiento lento 2 para inocularlas en los distintos medios:

Se siembran en el medio líquido YPD (5 mi), las colonias de las distintas cepas crecidas en placas de medio YPD, cada cepa por separado, y se ponen en agitación 24 horas a 240 r.p.m y 28°C. Una vez transcurrido este tiempo y habiendo crecido todas las cepas se pone 20 μΙ de cada una de ellas en un tubo de ensayo con 5 mi del correspondiente medio en cada tubo y se ponen en agitación a 240 r.p.m 24 horas.

Una vez trascurrido este tiempo cada medio presenta el siguiente crecimiento

En los ensayos se mide la absorbancia para evaluar el crecimiento celular en el medio de cultivo. La medida de la absorbancia está directamente relacionada con la cantidad de células de levadura que hay en un determinado volumen de medio de cultivo. La diferencia medida por el espectrofotómetro entre la intensidad de la luz emitida por la lámpara y la que llega al detector una vez atravesada la muestra, es decir, la cantidad de luz absorbida por las células será mayor a mayor número de células en la muestra.

Estos valores de crecimiento ya nos dan una idea de que estas levaduras tienen una gran resistencia a altas concentraciones de azúcar.

Se traspasó el contenido del tubo de ensayo a un matraz con el medio de cultivo a su correspondiente concentración, quedando un volumen total de 40ml. Se puso en agitación a 240 r.p.m. durante 4 horas para que las células inoculadas se multiplicaran. Una vez transcurrido este tiempo se paró la agitación dejando los cultivos a 31 °C en condiciones anaerobias. Se puso una pequeña agitación (22 r.p.m) para intentar que las células estuvieran bien repartidas por todo el cultivo. En estos momentos se dio por comenzada la fermentación. A la semana siguiente se determinó la concentración de carbohidratos por el Método Colorimétrico Fenol-Sulfúrico de Dubois obteniendo los siguientes porcentajes:

Porcentaje azúcar inicial (%) Porcentaje azúcar final (%)

0,052

0,049

10 0,947 15 4,988 20 9,506 25 13,024 30 21 ,988 40 31 ,137 50 40,333

Así se puede observar como se ha reducido el contenido en azúcares en todos los matraces, lo que indica que se ha producido la fermentación a todas las concentraciones ensayadas.

A continuación se describe teóricamente, la cantidad de etanol que se puede encontrar en estos casos; por ejemplo para la concentración inicial 20% azúcar se ha obtenido una concentración final de 9,5% de azúcar esto quiere decir que en 100 mi de caldo inicial se han consumido 10,5gr de azúcar:

La reacción que describe la fermentación alcohólica es la siguiente:

C 6 H 12°6 + 2 P¡ + 2 AJDP→ 2 CH 3 -CH 2 OH + 2 C0 2 + 2 ATP

De la relación estequiométrica obtenemos que por cada mol de glucosa obtenemos dos moles de etanol.

10Ornl de caldo → 10,5 gramos glucosa

10,5 gramos glucosa→ 0,058 moles glucosa (PM glucosa= 180,16gr/mol)

0,058 moles glucosa → 0,116 moles etanol (estequiometria 1 :2) 0,116moles etanol → 5,370 gramos etanol (PM etanol= 46,07 gr/mol)

5,370 gramos etanol → 6,806 mi etanol (densidad etanol= 0,789 gr/ml)

Resumen: 100 mi caldo→ 6,806 mi etanol. Si consideramos que el rendimiento real es el 80% del teórico: 6,806x0,8 = 5,445 mi de etanol. Es decir que en el ejemplo de una concentración inicial 20% de azúcar se ha obtenido una concentración final de alcohol aproximada de 5,4% vol.

Como parece que estas cepas de levadura resisten sin problemas concentraciones de hasta el 50% de azúcar el siguiente paso fue aumentar la concentración de azúcar. Se hicieron pruebas con concentraciones del 60 y 70% (peso/volumen) de azúcar, véanse la Figura 14 y 15. Se observa la formación de espuma producida por las burbujas de C0 2 producto de la fermentación. Estos medios estuvieron en agitación 72 horas a 28°C y 240 r.p.m. Para comprobar que las cepas crecen sin problemas en estos medios tan concentrados en azúcar se midió la densidad óptica de estos dos cultivos y los resultados que se obtuvieron fueron:

Se constata que las cepas crecen incluso en el medio con una concentración de azúcar del 70%; al final de la fermentación de este caldo el grado alcohólico teórico que se obtendría sería 45,37°. A continuación se expone el algoritmo de cálculo de este dato.

La reacción que describe la fermentación alcohólica es la siguiente: C 6 H 12 0 6 + 2 P¡ + 2 ADP→ 2 CH 3 -CH 2 OH + 2 C0 2 + 2 ATP

De la relación estequiométrica obtenemos que por cada mol de glucosa obtenemos dos moles de etanol.

100ml de -caldo 70 gramos glucosa

70 gramos glucosa 0,338 moles glucosa (PM glucosa= 180,16gr/mol)

0,338 moles glucosa 0,777 moles etanol (estequiometria 1 :2)

0,777 moles etanol 35,8 gramos etanol (PM etanol= 46,07 gr/mol)

35,8 gramos etanol * 45,37 mi etanol (densidad etanol= 0,789 gr/ml)

Resumen: 100ml caldo→ 45,37 mi etanol. Si consideramos que el rendimiento real es el 80% del teórico: 45,37x0,8=36,30 mi etanol, o una concentración de 36,35 vol.

Realización N°4. CAPACIDAD DE LAS CEPAS MEZCLADAS EN LA FERMENTACIÓN DE LA MELAZA (PROCEDENTE DE CAÑA DE AZÚCAR) CON DIFERENTES DILUCIONES.

Se utilizó la melaza procedente de la caña de azúcar como base para el medio de cultivo. A partir de esta melaza se hicieron distintas diluciones para comprobar el comportamiento de las cepas ante los distintos niveles de azúcar. La melaza de partida tenía 78,9° Brix y un contenido en sacarosa del 49,9%.

Los medios preparados se muestran en la siguiente tabla:

El procedimiento para la inoculación de las cepas es el siguiente:

Se toma una colonia de cada cepa, Levadura Blanca 1 , la Levadura de Crecimiento Lento 2 f \a Levadura amarilla 3 sembrada en el medio YPD, y se resuspenden todas juntas en 1 ml de agua. Se toma una alícuota de 5 mi de cada medio de cultivo preparado y se pone en tubos de ensayo, se inoculan 50 μΙ de la mezcla de cepas a cada tubo. Se pone en agitación a 240 r.p.m y 28°C. A las 66 horas muestran el siguiente crecimiento:

Los valores de OD 6 oo de cada muestra son independientes de las otras, siendo una medida de cómo se hayan adaptado las levaduras a ese medio.

El siguiente paso es transferir una alícuota con una dilución 1/1000 del contenido de estos tubos a su correspondiente matraz. Una vez inoculadas las levaduras al matraz se aplica una agitación a 240 r.p.m y 28°C. A las 16 horas presentaba el siguiente crecimiento:

A partir de las 16 horas, se reduce la agitación para disminuir el aporte de oxígeno y dar comienzo a la fermentación. En las Figuras 16 y 17 se observa la formación de espumas producidas por la presencia de C0 2 liberado, producto de la fermentación. La Figura 16 corresponde a un matraz en el que la concentración de sacarosa es del 23%. La Figura 17 corresponde a un matraz en el que la concentración de sacarosa es del 40%. Es de señalar que la melaza es un fluido muy viscoso por lo que las células encuentran mucha resistencia para difundir a través de esta, es por eso que cuando la melaza no está diluida con algo de agua el crecimiento celular resulta prácticamente imposible, como se aprecia en el caso N° 6, que es melaza pura. Así, vemos que las cepas crecen en un porcentaje del 40% de sacarosa sin dificultad, al final de la fermentación de este caldo el grado alcohólico teórico que se obtendría sería 25,93°, dando el cálculo, equivalente al 20,7% vol.

Se realizó otro experimento con melaza procedente de remolacha, esta melaza tenía una concentración de 76,8° Brix. El contenido en sacarosa de esta melaza era del 47%. Se prepararon las siguientes diluciones de la melaza para la preparación de los medios:

En estos medios se inocularon las cepas estudiadas de Levadura Blanca 1 , la Levadura de Crecimiento Lento 2 y la Levadura amarilla 3 y se pusieron en agitación a 240 r.p.m y 28°C. El crecimiento observado después de una semana de agitación fue:

% sacarosa OD 600

6,1 12,88

12,2 11 ,22

18,4 14,3

24,4 13,32

27,5 12,36

30,5 9,4

36,6 2,54

42,7 2,34

47

De esta tabla se puede comprobar cómo a partir de 30,5% de sacarosa, las levaduras ya van encontrando más resistencia para su reproducción, esto se manifiesta con una disminución de la absorbancia, aunque todavía a 42,7% persiste la formación de espuma y tienen suficiente capacidad para realizar la fermentación alcohólica.

Esto se puede observar en las Figuras 8, 19 y 20. La Figura 18 muestra un matraz con melaza en el que la concentración de sacarosa es del 42,7%, la Figura 19 muestra un matraz con melaza en el que la concentración de sacarosa es del 18,4%, la Figura 20 muestra un matraz con melaza en el que la concentración de sacarosa es del 12,2%. Los resultados obtenidos, véase la Figura 18, demuestran que se puede fermentar un caldo con un contenido hasta 42,7% de azúcar, lo que supone un 27,68°, 28% volumen/volumen de etanol (véase método de cálculo teórico anteriormente expuesto), algo realmente extraordinario. Como hemos señalado un material aparte es la melaza que al ser un fluido muy viscoso las células encuentran mucha resistencia para difundir a través de esta, por eso cuando la melaza no está diluida con algo de agua el crecimiento celular es prácticamente imposible.

Realización N°5. CAPACIDAD DE LAS CEPAS MEZCLADAS EN LA FERMENTACIÓN DE AZUCARES

PROCEDENTES DE LA HIDRÓLISIS DEL ALMIDÓN. Representa indudable interés práctico la presente realización ya que el almidón es el origen de tratamientos para la producción de ambas, pan o de cerveza. Se prepararon diferentes disoluciones de almidón en agua, el almidón no es soluble en agua por lo que queda resuspendido. Para hidrolizarlo se utilizó el método de hidrólisis ácida que consiste en bajar el pH a 0,8 con ácido sulfúrico y ponerlo en agitación a 84°C durante 6 horas.

Las concentraciones de almidón utilizadas son: 10%, 20%, 40% y 50% todas ellas referidas en porcentaje peso/volumen. Una vez hidrolizado el almidón se neutralizó el pH con NaOH y se inocularon las cepas procedentes de un cultivo saturado en el medio YPD, un cultivo saturado es aquél en el que el número de células permanece constante, es decir, mueren las mismas que nacen. Se inocularon 170 μΙ de cultivo de cada cepa, la mezcla de la Levadura Blanca 1 , la Levadura de Crecimiento Lento 2 y la Levadura amarilla 3. A las 48 horas de agitación a 240 r.p.m y 28°C los medios presentan el siguiente crecimiento:

Porcentaje inicial de almidón en el matraz

Í%1 OD 600

10 0,749

20 0,556

40 0,471

50 0,351

Como se aprecia en la tabla anterior, las OD 60 o más bajas corresponden a los matraces preparados con una mayor concentración de almidón que es donde mayor resistencia encuentran las levaduras para sobrevivir, y por lo tanto el número de éstas es menor. A las 48 horas de agitación se detiene la misma para que no haya aporte de oxigeno y se deja terminar la fermentación. La Figura 21 corresponde a un matraz preparado con un 20% de almidón. La Figura 22 corresponde a un matraz preparado con un 40% de almidón. Puesto que la harina contiene almidón, y las levaduras son capaces de fermentar almidón, la utilización de estas tres cepas de levadura en el proceso de fermentación, a la vez, puede conferir mayor calidad, cualquiera que sea el producto de fermentación de la harina que se desee obtener, puesto que la acción coordinada de las tres levaduras mejorará en sí mismo el proceso de fermentación. La levadura que funciona mejor en glucosa {Levadura Amarilla 3) puede dar una cobertura a las otras dos en medios de alto contenido de la misma (de alguna manera deben sobrevivir en un 70% de sacarosa), la Levadura de Crecimiento Lento 2 puede crear un velo que favorezca la ausencia de oxígeno, y proporcionar todas las ventajas para que se produzca una mejor fermentación, y por último la Levadura Blanca 1 puede crecer en medio de concentraciones muy elevadas de etanol, y tal vez proteger a las otras especies de levaduras presentes en el proceso. En consecuencia en cualquier proceso en que esté presente la fermentación desde azúcares fermentables, estas levaduras pueden proporcionar presumiblemente una mayor calidad al producto obtenido.

Experimento 6: CAPACIDAD DE LAS CEPAS MEZCLADAS EN LA FERMENTACIÓN DE AZUCARES

PROCEDENTES DE MATERIA VEGETAL.

Para la realización de este experimento se tomó, en calidad de ejemplo de materia vegetal procedente de plantas silvestres, la especie Nicotiana glauca. Se tomaron muestras de distintas partes de las plantas, raíz, tallo verde, tallo leñoso y hojas. Para poder obtener los azucares de las plantas, éstas de trituraron y se mezcló el triturado con agua para que los azucares solubles de la planta se disolvieran en el agua. En este punto la cantidad (en porcentaje peso/volumen) de azúcar presente en los medios era:

Muestra Porcentaje inicial de

azúcar (%)

Tallo verde 1 ,98

Tallo leñoso 1 ,53

Hoja 2,19

Raíz 1 ,61

A las muestras se les inocularon las cepas procedentes de un cultivo saturado en medio YPD. Se inocularon 35 μΙ de cultivo de cada cepa, de la mezcla de la Levadura Blanca 1 , la Levadura de Crecimiento Lento 2 y la Levadura amarilla 3. Se pusieron estos medios en agitación a 240 rpm y 28°C durante 48 horas. A continuación se midió el crecimiento celular y la cantidad de azúcar en las muestras para determinar la que se había consumido.

Muestra Porcentaje de azúcar (%) OD 600

Tallo verde 1 ,710 1 ,221

Tallo leñoso 0,93 1 ,411

Hoja 1 ,98 1 ,363

Raíz 0,77 0,865 En los datos se aprecia como las levaduras han consumido el azúcar inicial.

Se detuvo la agitación de los medios para que se dejaran de oxigenar y comenzara la fermentación. A igual que en las Figuras anteriores, en las Figuras 23 y 24 se pueden ver las burbujas producto de la fermentación. Se repitió el experimento en medios en los que las concentraciones de azúcar fueran mayores. Para aumentar el contenido en azucares del medio se hizo una hidrólisis ácida del material vegetal obteniendo así las siguientes concentraciones de azúcar:

muestra Porcentaje inicial de azúcar (%)

Tallo verde 3,850

Tallo leñoso 16,59

Hoja 8,63

Raíz 18,50

En este momento se inocularon las cepas procedentes de un cultivo saturado de medio YPD. Se inocularon 35 μΙ de cultivo de cada cepa. Se mantuvieron estos medios en agitación a 240 rpm y 28°C durante 48 horas. Transcurrido este tiempo se midió el crecimiento celular. muestra OD 600

Tallo verde 1 ,670

Tallo leñoso 1 ,183

Hoja 2,078

Raíz 1 ,881

Se puede comprobar cómo al aumentar el contenido en azúcares las levaduras no se ven afectadas.

DISCUSIÓN

De los resultados observados y expuestos anteriormente se pueden inferir varios hechos. La utilización a la vez de las tres cepas de levadura de la presente solicitud, en el proceso de fermentación, es decir de forma coordinada, puede conferir mayor calidad, cualquiera que sea el producto de fermentación que se desee obtener, puesto que la acción coordinada de las tres levaduras mejorará en sí mismo el proceso de fermentación. Puesto que estas tres levaduras fueron obtenidas de barrica, las tres deben de estar al final del proceso de fermentación donde las concentraciones de etanol rondan los 16-19 grados. La levadura que funciona mejor en glucosa (Levadura Amarilla 3) puede dar una cobertura a las otras dos en medios de alto contenido de la misma (de alguna manera deben sobrevivir en un 70% de sacarosa, pues así lo atestiguan los resultados obtenidos), la Levadura de Crecimiento Lento 2 puede crear un velo que favorezca la ausencia de oxígeno, y proporcionar todas las ventajas necesarias para que se produzca una mejor fermentación, y por último la Levadura Blanca 1 puede crecer en un medio con concentraciones muy elevadas de etanol, y tal vez proteger así a las otras especies de levaduras presentes en el proceso, para de esta forma (protegiendo el conjunto de levaduras) se produzca una posterior mejora de los caldos obtenidos, o de cualquiera que sea el producto obtenido. En consecuencia, en cualquier proceso en que esté presente la fermentación, desde azúcares fermentables, estas levaduras pueden proporcionar presumiblemente una mayor calidad al producto obtenido. Por tanto esto explicaría porqué se debe obtener una mayor calidad del producto que se obtenga con diversas fuentes fermentables (sacarosa, melaza, almidón, mosto, etc).

Por otra parte, esta acción coordinada junto con las características propias de cada cepa (analizadas en la presente Descripción) permiten explicar porqué se pueden fermentar soluciones con una altísima concentración de sacarosa (o sucedáneos) y por tanto obtener productos con una elevadísima concentración de etanol (recuérdese que la mayoría de las cepas de levadura no soportan concentraciones de etanol superiores al 13%).

La actuación coordinada de estas tres levaduras junto con la presencia inicial de mayores cantidades de azúcares, puede hacer que la fermentación sea más rica en productos secundarios. Se han analizado diversas materias (origen de fermentación) que cubren un amplio espectro de productos representativos de la industria de fermentación, como el azúcar, el almidón, la melaza, los restos vegetales, etc. Los microorganismos necesitan unas condiciones adecuadas para poder crecer, reproducirse, y desarrollarse. Esto no siempre se consigue. Puesto que las 3 levaduras estudiadas en la presente solicitud, son capaces de fermentar en un medio simple conteniendo almidón, se puede inferir que pueden ser útiles en aquellos procesos que utilicen el almidón como origen previo a la fuente de carbono para la fermentación. Se sabe que las levaduras son capaces de fermentar almidón hidrolizado, y que las levaduras son necesarias, no obstante para producción de cerveza.

Se puede inferir por tanto de lo analizado hasta aquí, que con la mezcla de estas levaduras se obtendrán:

1.- mayores concentraciones de etanol

2.- productos de mayor calidad

3.- fermentaciones de materias infermentables hasta la fecha por su elevado contenido de azúcar, y por su elevada producción consiguiente de etanol.

Destacando resultados positivos.

•Se pueden obtener bebidas con mayor graduación de alcohol •Se puede obtener alcohol con una mayor eficiencia energética, puesto que mayor concentración de etanol significa menor cantidad de energía invertida para destilar.

•Se pueden obtener vino, pan y cerveza de mayor calidad. Todos estos alimentos necesitan las levaduras para ser obtenidos. Su obtención con las levaduras descritas en la presente solicitud producirán un producto de mayor calidad.

•Se puede producir una elaboración más eficaz de bioetanol partiendo de biomasa, tanto no vegetal, como vegetal. En consecuencia, los costes de producción pueden ser mucho menores que los actuales. Esto significa una mejora sustancial de los procesos convencionales de obtención de bioetanol, partiendo de cualquiera de sus orígenes, en cuanto a fuente de carbono, puesto que sea cual sea dicha fuente, el sustrato de la fermentación es la glucosa que luego sería convertida a etanol por levaduras del género Saccharomyces cerevisiae (fundamentalmente). Las industrias que probablemente moverán mas volumen económico y más beneficiadas serán, entre otras: la de producción de bioetanol como combustible, y la de las alcoholeras industriales, que producen alcohol de fuentes poco elevadas en concentración de sacarosa o glucosa, y por tanto son muy poco eficientes en costes..

•Los resultados obtenidos permiten inferir que las levaduras estudiadas en la presente solicitud son capaces de mejorar energética y económicamente, en general, todo proceso basado en la fermentación de azúcares. Por tanto no debe descartarse la utilización de las levaduras aquí descritas en cualquier proceso de fermentación de azúcares, lo que puede incluir prácticamente la producción de cualquier bebida alcohólica obtenida desde plantas o derivados, como frutas, partiendo de sus azúcares ya extraídos o extrayéndolos.

Trabajo de las levaduras encontradas en la presente solicitud:

•Las levaduras trabajan coordinadamente, no hay otra manera de explicar que cada una de ellas tenga un papel preponderante, es decir, nos encontramos ante un fenómeno de sinergismo.

«La Levadura Amarilla 3 podría utilizarse en aquellos procesos en los que sea necesaria una levadura con gran resistencia a estrés osmótico, y que además sea capaz de crecer, desarrollarse, reproducirse y fermentar. El estrés osmótico es un problema de lucha por el agua existente en un medio acuoso. Una concentración muy elevada de glucosa implica un sistema defensivo notablemente eficaz para evitar los daños producidos por una fuerte presión. Cuanta más glucosa en el medio más presión extema en la célula hacia el exterior. Por tanto es un fenómeno que tiene muchas implicaciones físicas, químicas y biológicas. Este fenómeno es de tal importancia que numerosos grupos de investigación vienen estudiándolo en el mundo desde hace decenas de años, para conocer los daños y respuestas en las células. Especialmente se ha utilizado la levadura S. cerevisiae para este propósito. Actualmente existen muchos grupos de investigación empeñados en mejorar alguno/s de los paso/s cruciale/s, tanto del daño como de la resistencia, para al final obtener levaduras como la Levadura Amarilla 3, con el agravante, de que aquellas serían modificadas genéticamente y esta levadura de la presente solicitud es una levadura obtenida por selección natural.

»La Levadura blanca 1 posee una tolerancia al etanol muy elevada. Hablar de una concentración de etanol de un 60% en placa y un 70% v/v en líquido, significa hablar de números no reportados en la técnica hasta la fecha en ninguna revista científica o documento de patente, para cepas de S. cerevisiae. Al igual que en el caso de la resistencia a glucosa, los valores descritos multiplican los observados hasta la fecha en varios órdenes de magnitud. Esto significa que las cepas de la presente solicitud Levadura blanca 1 , Levadura de Crecimiento Lento 2 y Levadura Amarilla 3, poseen un potencial para resolver problemas científicos y técnicos, de órdenes de magnitud superiores a las cepas conocidas hasta la fecha. En el caso de la Levadura blanca 1 es importante notar el papel que potencialmente podría desarrollar. El etanol es un tóxico para la mayoría de los organismos vivos. Su toxicidad depende de las especies y de la concentración. El etanol es utilizado desde muy antiguo para desinfectar, todo tipo de material, en ámbitos relacionados con la medicina. Normalmente la gran mayoría de las especies de bacterias patógenas se ven afectadas por el etanol, causándoles la muerte. La Levadura Blanca 1 puede tener aplicaciones en este ámbito. Se puede utilizar para estudiar como sobreviven los microorganismos (y en especial un organismo modelo como es la levadura S. cerevisiae) a concentraciones elevadas de etanol, y así poder determinar las claves del proceso. También podrían servir para transportar microorganismos no resistentes a elevadas concentraciones de etanol por ese tipo de soluciones. Una elevada concentración de la Levadura blanca 1 puede crear un microentorno que permita sobrevivir durante un corto período de tiempo a ciertos microorganismos. Lo mismo se podría decir de la Levadura Amarilla 3 para elevadas concentraciones de azúcar. Este tipo de estrategia se utiliza cuando se realizan, por ejemplo técnicas de electroporación de DNA en protoplastos, la acción de las exo- y endonucleasa se evita (se protege el DNA) mediante la utilización de elevadas concentraciones de un DNA distinto al objeto de electroporación, como por ejemplo esperma de salmón.

•Las levaduras son oxidativas, fermentativas, o bien su actividad metabólica es a la vez de ambos tipos. En la superficie de un líquido, las levaduras oxidativas pueden crecer en forma de película, de velo, o de espuma, y por ello se denominan levaduras formadoras de película. La Levadura de Crecimiento Lento 2 es especialmente sensible en su plasticidad morfológica, a los cambios producidos por aspectos claves de la fermentación. Por ejemplo, cuando se observa su desarrollo en placa de YPD (véanse las Figuras 3 y 4), se aprecia un ennegrecimiento rápido con el paso del tiempo. Si se observa un cambio rápido en dichas levaduras (pasa rápidamente de un color blanco intenso a un negro fuerte; las levaduras en un estado normal tienen color blanco), debe ser porque está en contacto algún factor con el que habitualmente no lo está. Este factor probablemente es el oxígeno. Apoya esta hipótesis, el hecho dé que el ennegrecimiento se observa primero y de forma más intensa en la parte de la levadura que está en contacto con el oxígeno en mayor concentración (superficie del medio YPD). Refuerza esta hipótesis, la observación de que este fenómeno se produce cuando la Levadura de Crecimiento Lento 2 se encuentra en forma de micelio y no cuando se encuentra en forma esférica. Esta argumentación es coherente con el hecho de que la fermentación es un proceso de combustión parcial de la glucosa que se produce en ausencia de oxígeno. Por tanto ésta será más efectiva cuanto menos oxígeno esté presente. De esta forma se puede suponer que la Levadura de Crecimiento Lento 2 puede estar contribuyendo a que la fermentación se produzca en mejores condiciones garantizando un velo que proteja de la presencia de oxígeno. En consecuencia un uso inmediato comercial, sería su integración en procesos de fermentación, cualesquiera que sea su tipología, para producir un mejor proceso, más eficaz y de mayor calidad. En general, los azúcares son la fuente energética más apropiada para las levaduras, aunque en las oxidativas, por ejemplo, las formadoras de película oxidan los ácidos orgánicos y el alcohol, y también contribuyen en la producción de los sabores o "bouquet" de los vinos. Por tanto un uso comercial de esta levadura sería para dotar de bouquet a las cepas vínicas, o de cualquier otro proceso fermentativo como producción de licores, bebidas alcohólicas de baja graduación, pan, etc. También podría utilizarse en cualquier proceso industrial de los mencionados anteriormente o donde sea especialmente necesaria e importante la ausencia de oxígeno, y que permita la utilización de una levadura formadora de película, como por ejemplo podría ser la producción de un medicamento o sustancia sensible al oxígeno. Dentro de este grupo se enmarcarían todas las sustancias consideradas como antioxidantes, es decir, aquellas que son especialmente sensibles a un desbalance electrónico en el entorno en que se encuentran. Desbalance electrónico caracterizado por un exceso o defecto de carga electrónica respecto a un estado basal.

Esta misma levadura podría utilizarse para proteger determinadas soluciones del fenómeno de la oxidación, como método de evitar la pérdida de propiedades naturales de alimentos, o soluciones industriales, sensibles al oxígeno o, lo que es lo mismo (producido por oxígeno o no) a la presencia de un agente creador de un desbalance electrónico, bien capturando electrones (caso por ejemplo del oxígeno), bien cediendo electrones (caso por ejemplo del Fe2+). Dentro de este tipo de sustancias conocidas como antioxidantes, se agrupan un gran número de sustancias de interés biomédico, y beneficiosas, en general para una gran mayoría de organismos vivos, pues su principal función es actuar como tamponadores de un desequilibrio electrónico. Por ejemplo, aquellas sustancias que son de interés en procesos de envejecimiento y cáncer, como antioxidantes: ácido cítrico, ascórbico (vitamina C), glutatión, resveratrol, etc. En general son sustancias que actúan como actúan los indicadores de pH, es decir, cambian su conformación electrónica con facilidad ganando o perdiendo electrones ante cambios relativamente pequeños en el balance electrónico del entorno en el que se encuentran. La fabricación, o el transporte, o el almacenado de este tipo de sustancias creando un velo de este tipo, se verían, claramente mejorados. Posteriormente se podría recoger este velo, en un simple proceso de centrifugación. Esto podría ser por ejemplo, de gran interés en biomedicina o en todos aquellos sectores alimenticios donde el uso de sustancias antioxidantes añadidas a los alimentos está cobrando un gran auge en los últimos años. También en los sectores industriales donde se fabriquen sustancias muy sensibles a las oxidación. Actualmente este lugar de la técnica puede estar ocupado con otras técnicas como la de fabricación o embasado al vacio, pero en este caso, la utilización de este tipo de levaduras podría significar una gran reducción de costes y en algunos casos un mejora de la calidad del producto, puesto que la implementación del vacío podría suponer algún impacto en el producto-en el momento de producirlo.

Una vez descrita suficientemente la invención, así como varias realizaciones preferentes de la misma, sólo debe añadirse que es posible realizar modificaciones en su constitución y materiales empleados sin apartarse del alcance de la misma, definido en las siguientes reivindicaciones.