Campo de la invención

La presente invención se encuadra en el campo general de la ingeniería genética y en particular, se refiere a proteínas víricas que han sido modificadas mediante la adición de una cola policatiónica de aminoácidos en su extremo N-terminal o C-terminal, de tal forma que presentan actividad antibacteriana específica frente a Escheríchia coli ( E . coli) sin necesidad de tratamientos previos de permeabilización de la envoltura.

Estado de la técnica

Las endolisinas son enzimas producidas por bacteriófagos (virus que infectan bacterias). La función biológica de estas endolisinas es hidrolizar enlaces en la pared celular bacteriana al finalizar el ciclo reproductivo del virus, provocando así la lisis celular y la consiguiente liberación de los nuevos bacteriófagos producidos durante su etapa intracelular. Para poder acceder a su diana en la pared celular, estas enzimas necesitan de la participación de otras proteínas, denominadas holinas (Gutiérrez D, Fernández L, Rodríguez A, and García P (2018). Are Phage Lytic Proteins the Secret Weapon To Kill Staphylococcus aureus ? MBio. 9(1)), que forman poros en la membrana citoplasmática.

Las endolisinas (junto con las holinas) son una de las familias de proteínas más diversas conocidas. Estructuralmente, pueden estar formadas por un único dominio globular, o compuestas por uno o dos dominios de unión a la pared celular y un dominio catalítico (García P, Rodríguez L, Rodríguez A, and Martínez B (2010). Food biopreservation: promising strategies using bacteriocins, bacteriophages and endolysins. Trends Food Sci Technol. 21(8): 373-382; Oliveira H, Meló LDR, Santos SB, Nóbrega FL, Ferreira EC, Cerca N, Azeredo J, and Kluskens LD (2013). Molecular aspects and comparative genomics of bacteriophage endolysins. J Virol. 87(8): 4558-70).

Debido a su capacidad de lisar bacterias, las endolisinas se han propuesto como agentes antibacterianos alternativos al empleo de antibióticos, ya que el uso de estos últimos ha dado lugar a la aparición de resistencias disminuyendo de manera considerable su eficacia (Love MJ, Bhandari D, Dobson RCJ, and Billington C (2018). Potential for Bacteriophage Endolysins to Supplement or Replace Antibiotics in Food Production and Clinical Care. Antibiot (Basel, Switzerland). 7(1)). Adicionalmente, el amplio espectro de actuación de muchos antibióticos puede dar lugar a efectos secundarios durante el tratamiento de infecciones, tales como la alteración de la microbiota natural del paciente al afectar a diferentes especies además del agente causal (Love MJ, Bhandari D, Dobson RCJ, and Billington C (2018). Potential for Bacteriophage Endolysins to Supplement or Replace Antibiotics in Food Production and Clinical Care. Antibiot (Basel, Switzerland). 7(1); O’Flaherty S, Ross RP, and Coffey A (2009). Bacteriophage and their lysins for elimination of infectious bacteria: Review article. FEMS Microbiol Rev. 33(4): 801-819).

Sin embargo, la utilización de endolisinas como agente antibacteriano en el grupo concreto de las bacterias Gram-negativas (G-) tiene varias limitaciones. En primer lugar, debido a problemas de accesibilidad a su diana en la pared celular por la presencia de una membrana lipídica externa (ME). Para paliar este problema se podría emplear un tratamiento permeabilizante de la ME o añadir a la endolisina colas policatiónicas (de aminoácidos con carga neta positiva) que ayuden a vencer las repulsiones electrostáticas debidas a la red de cargas negativas de la superficie celular (Walmagh M, Briers Y, Santos SB dos, Azeredo J, and Lavigne R (2012). Characterization of Modular Bacteriophage Endolysins from Myoviridae Phages OBP, 201φp2-1 and PVP-SE1. PLoS One. 7(5): e36991). En segundo lugar, hay muy poca variabilidad en la composición de la pared celular de las distintas especies de G-, comprometiendo la especificidad (Love MJ, Bhandari D, Dobson RCJ, and Billington C (2018). Potential for Bacteriophage Endolysins to Supplement or Replace Antibiotics in Food Production and Clinical Care. Antibiot (Basel, Switzerland). 7(1); Zampara A, Sørensen MCH, Grimon D, Antenucci F, Briers Y, and Brøndsted L (2018). Innolysins: A novel approach to engineer endolysins to kill Gram-negative bacteria. bioRxiv. 408948).

Por los motivos anteriormente expuestos, derivados de la problemática que en general afecta al empleo de endolisinas en G-, existe pues la necesidad de proporcionar proteínas con adecuada actividad lítica que no requieran tratamientos permeabilizantes, y que sean específicas de un grupo concreto de bacterias.

Breve descripción de la invención La presente invención soluciona los problemas descritos en el estado de la técnica ya que proporciona proteínas con actividad antibacteriana específica frente a E. coli sin necesidad de tratamientos previos de permeabilización de su envoltura.

Así pues, en un primer aspecto, la presente invención se refiere a un polipéptido con actividad endolisina (de aquí en adelante, péptido de la presente invención) que comprende la secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO: 3 o un derivado del mismo, o la secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO: 4, o un derivado del mismo. El polipéptido de la presente invención comprende una cola policatiónica de aminoácidos bien en el extremo N-terminal (SEQ ID NO: 3) o C-terminal (SEQ ID NO: 4). En particular, comprende una cola policatiónica de histidinas.

En la presente invención el término “polipéptido” es sinónimo del término “proteína”. En la presente invención el término “polipéptido” se refiere a una secuencia de aminoácidos, donde dichos aminoácidos están unidos entre sí, por enlaces peptídicos.

En una realización particular de la presente invención, el derivado del péptido de la presente invención comprende una deleción, adición, inserción y/o sustitución en la secuencia aminoácídica SEQ ID NO: 3, o SEQ ID NO:4.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un ácido nucleico aislado, que codifica el polipéptido de la presente invención (de aquí en adelante, ácido nucleico de la presente invención). Más en particular, el ácido nucleico de la presente invención, una vez clonado, codifica el polipéptido de secuencia aminoacídica según la SEQ ID NO:3 o SEQ ID NO:4. Más en particular, el ácido nucleico de la presente invención, comprende la secuencia nucleotídica según la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un vector que comprende el ácido nucleico de la presente invención (de aquí en adelante vector de la presente invención).

En otro aspecto, la presente invención se refiere a una célula hospedadora, que contiene el ácido nucleico de la presente invención, y/o el vector de la presente invención, y/o la proteína de la presente invención.

En otro aspecto de la presente invención, se refiere a un método para la transformación genética de una célula huésped mediante la introducción del ácido nucleico de la presente invención para que exprese el polipéptido de la presente invención. El polipéptido de la presente invención una vez expresado es purificado. La transformación genética, la expresión del polipéptido de la presente invención, y la purificación, pueden llevarse a cabo por métodos de ingeniería genética conocidos por el experto en la materia.

En otro aspecto, la presente invención se refiere al polipéptido de la presente invención para su uso como antimicrobiano frente a E. coli. En una realización particular, la presente invención se refiere al polipéptido de la presente invención como antimicrobiano en alimentos, cosméticos, aguas contaminados con E. coli.

En otro aspecto, la presente invención se refiere al polipéptido de la presente invención para su uso en el tratamiento de enfermedades producidas por E. coli. Más en particular, para el tratamiento de infecciones causadas por E. coli.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a una composición que comprende el polipéptido de la presente invención (de aquí en adelante composición de la presente invención). Más en particular, la composición de la presente invención comprende un excipiente química y/o farmacéuticamente aceptable.

En la presente invención por “excipiente” se refiere a cualquier componente que no tiene actividad terapéutica y que es no tóxico, principalmente se refiere a vehículos y tampones tales como soluciones salinas, soluciones acuosas, emulsiones, colorantes, saborizantes, aromatizantes, etc.

En una realización más en particular, la presente invención se refiere a la composición de la presente invención para su uso como antimicrobiano frente a E. coli. En una realización particular, como antimicrobiano en alimentos, cosméticos, aguas contaminados con E. coli.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a la composición de la presente invención para su uso en el tratamiento de enfermedades producidas por E. coli. Más en particular, para el tratamiento de infecciones causadas por E. coli.

Descripción de las figuras

Figura 1. Muestra el vector de expresión pCDF-1b, utilizado para clonar las endolisinas de la presente invención. El vector presenta un sitio de clonación múltiple que incluye las secuencias de corte para las enzimas de restricción Ncol y BamHI, un casete de resistencia a estreptomicina (Sm) para la selección de transformantes, así como un promotor T7 y un operador lac para inducir la expresión del gen clonado. Figura 2. Muestra el resultado de un experimento de spot test realizado con UK-C a una concentración de 16 pg/mL sobre una cepa de E. coli. El halo de claridad alrededor del punto donde se ha depositado la solución de la proteína indica el efecto inhibidor del crecimiento producido por la endolisina. Figura 3. Muestra el resultado de un experimento de spot test realizado con Poll-N a una concentración de 16 pg/mL sobre una cepa de E. coli. El halo de claridad alrededor del punto donde se ha depositado la solución de la proteína indica el efecto inhibidor del crecimiento producido por la endolisina. Descripción detallada de la invención

Ejemplo 1: Clonación y expresión de la proteína vírica modificada UK-C.

El gen sintético de la endolisina, de secuencia nucleotídica identificada en la presente invención como SEQ ID NO: 1 , aislado del profago (genoma de un fago insertado en una bacteria) identificado en el genoma de la cepa enterotoxigénica UMNK-88 de E. coli, se amplificó por PCR con los cebadores descritos en la tabla 1 , bajo las siguientes condiciones: 1 ciclo de 5 min a 95°C; seguido por 25 ciclos de 10 s a 95°C, 30 s a 52°C, y 2 min a 72°C, y finalmente 1 ciclo de 10 min a 72 °C. El producto de la amplificación fue purificado y posteriormente digerido con la enzima de restricción BamHI durante 3 h a 37 °C para finalizar con una digestión mediante Ncol a 37 °C durante 24 h. Tras cada digestión, las enzimas se inactivaron a 80 °C durante 20 min, y los productos de digestión se purificaron así mismo tras cada inactivación. El mismo procedimiento de restricción fue llevado a cabo con el plásmido pCDF-1b, el vector usado para la clonación (Figura 1), el cual fue finalmente tratado con fosfatasa alcalina, y posteriormente purificado de forma equivalente. Los productos digeridos de vector e inserto se mezclaron en una proporción 1:3 y se ligaron a 16 °C durante 16 h con la enzima DNA ligasa del bacteriófago T4. Las cantidades de cada una de las moléculas de DNA se estimaron fluorimétricamente con un dispositivo Qubit (Invitrogen®).

Tabla 1: cebadores empleados en la clonación y expresión de la proteína vírica modificada UK-C

El producto de ligación se transformó en células de BL21(AI) quimiocompetentes, preparadas de acuerdo al método descrito por Green y Rogers ([Green R, and Rogers EJ (2013). Transformation of chemically competent E. coli. Methods Enzymol. 529: 329-36). Los transformantes se seleccionaron mediante crecimiento en medio sólido LB conteniendo 100 μg/mL de estreptomicina. Posteriormente se amplificaron mediante PCR utilizando los cebadores correspondientes de confirmación (Tabla 1), bajo las siguientes condiciones: 1 ciclo inicial de 5 min a 95 °C; seguido por 25 ciclos de 30 s a 94 °C, 30 s a 53 °C, 80 s a 72 °C; y 1 ciclo final de 7 min a 72 °C.

Los productos de PCR de clones portadores de inserto se secuenciaron para confirmar su identidad y en tal caso se procedió a su expresión y la purificación de la proteína siguiendo el siguiente procedimiento. Una de las colonias transformantes confirmadas de esta manera, se transfirió a un matraz con 100 mL de caldo LB, incubando el cultivo a 37 °C y 200 rpm. Cuando la DO600 alcanzó un valor de 0,3 se indujo la expresión de la proteína mediante la adición de IPTG y arabinosa, a las concentraciones finales de 1 mM y 0,3%, respectivamente. Tras 4 h de incubación del cultivo en las mismas condiciones, se centrifugó a 4000 g durante 30 min a 4 °C. Tras descartar el sobrenadante, las células se resuspendieron en tampón de lisis (50 mM Tris-HCI, pH 7,6; 1 mM Pefabloc; 0,1 mg/mL lisozima; 10 pg/mL DNAsa I) y se sonicaron en hielo, administrando 30 pulsos de 30 s a intervalos de 30 s. El lisado resultante se centrifugó a 4000 g durante 30 min a 4 °C, y el sobrenadante se filtró a través de un filtro estéril de 0,45 pm seguido por una segunda filtración con un filtro de 0,22 pm. La proteína se purificó a partir del último filtrado con una columna HispurTM Ni-NTA Chromatography (Thermo Fisher Scientific™) a 4 °C. La cantidad total de proteína purificada se determina por el método de Bradford (Kruger NJ (2009). The Bradford Method For Protein Quantitation. Humana Press, Totowa, NJ; pp 17-24). El producto obtenido se congeló en nitrógeno líquido, tras lo cual se almacenó a -80 °C en alícuotas.

La eficacia de la endolisina UK-C purificada fue testada mediante experimentos de “spot test” frente a distintas cepas bacterianas. Cultivos de estas cepas crecidos en medio LB líquido a 37 °C hasta una DO600 de 0,3 se mezclaron con 5 mL de LB fundido a 50 °C y se vertieron seguidamente sobre placas con medio LB sólido. Una vez solidificado todo el medio, se depositaron en su superficie alícuotas de 10 μL de suspensiones de la enzima UK-C a distintas concentraciones. Tras incubar a 37 °C durante 12 h, se observó la aparición de zonas de inhibición del crecimiento producidos por la lisis (Figura 3).

Los resultados obtenidos (tabla 2) demuestran que UK-C es capaz de lisar de forma directa a la mayoría (91,2 %) de cepas de E. coli testadas (159 en total), sin necesidad de ningún tratamiento previo de permeabilización de su superficie celular. Además, su acción lítica se limita a esta especie sin afectar a ninguna de las bacterias ensayadas pertenecientes a otras especies, incluso aquellas próximamente emparentadas. En base a estos resultados, la endolisina UK-C se confirma como un agente antimicrobiano con alta especificidad frente a E. coli. Tabla 2. Resultados de los experimentos de “spot test” obtenidos con la endolisina UK-C frente a distintas cepas bacterianas.

1, Aparición (+) o no (-) de claridad en el crecimiento en el ensayo de spot test en la zona donde se añade una concentración de endolisina de 16 μg/mL.

2, Ochman H, and Selander R (1984). Standard reference strains of E. coli from natural populations. J Bacteriol. 157(2): 690-693.

3, Cepas enterotoxigénicas de E. coli, por cortesía del Dr. Anders Nilsson (Universidad de Estocolmo, Suecia).

4, Cepas enterotoxigénicas de E. coli aisladas por la Universidad de Alicante en salidas de campo a granjas porcinas, por cortesía de DHESA (Fortuna, Murcia, España). 5, Cepas aviares de E. coli, por cortesía del Dr. Pablo Catalá (CECAV, Castellón, España).

6, Cepas aviares de Salmonella, por cortesía del Dr. Pablo Catalá (CECAV, Castellón, España).

7, Cepas clínicas de Salmonella, por cortesía del servicio de Microbiología del Hospital General Universitario de Elche (Alicante, España). Ejemplo 2: clonación y expresión de la proteína vírica modificada Poll-N.

El gen sintético de la endolisina, de secuencia nucleotídica identificada en la presente invención como SEQ ID NO:2, aislado del bacteriófago Pollock de E. coli, se amplificó por PCR con los cebadores descritos en la Tabla 3 bajo las siguientes condiciones: 1 ciclo de 5 min a 95°C; seguido por 25 ciclos de 10 s a 95°C, 30 s a 52°C, y 2 min a 72°C, y finalmente 1 ciclo de 10 min a 72 °C. El producto de la amplificación fue purificado y posteriormente digerido con la enzima de restricción BamHI durante 3 h a 37 °C para finalizar con una digestión mediante Ncol a 37 °C durante 24 h. Tras cada digestión, las enzimas se inactivaron a 80 °C durante 20 min, y los productos de digestión se purificaron así mismo tras cada inactivación. El mismo procedimiento de restricción fue llevado a cabo con el plásmido pCDF-1b, el vector usado para la clonación (Figura 2), el cual fue finalmente tratado con fosfatasa alcalina, y posteriormente purificado de forma equivalente. Los productos digeridos de vector e inserto se mezclaron en una proporción 1:3 y se ligaron a 16 °C durante 16 h con la enzima DNA ligasa del bacteriófago T4. Las cantidades de cada una de las moléculas de DNA se estimaron fluorimétricamente con un dispositivo Qubit (Invitrogen®). Tabla 3. Cebadores empleados en la clonación y expresión de la proteína vírica modificada Poll-N El producto de ligación se transformó en células de BL21(AI) quimiocompetentes, preparadas de acuerdo al método descrito por (Green y Rogers Green R, and Rogers EJ (2013). Transformation of chemically competent E. coli. Methods Enzymol. 529: 329-36). Los transformantes se seleccionaron mediante crecimiento en medio sólido LB conteniendo 100 μg/mL de estreptomicina. Posteriormente se amplificaron mediante PCR utilizando los cebadores correspondientes para la confirmación (Tabla 3), bajo las siguientes condiciones: 1 ciclo inicial de 5 min a 95 °C; seguido por 25 ciclos de 30 s a 94 °C, 30 s a 53 °C, 80 s a 72 °C; y 1 ciclo final de 7 min a 72 °C.

Los productos de PCR de clones portadores de inserto se secuenciaron para confirmar su identidad y en tal caso se procedió a su expresión y la purificación de la proteína siguiendo el siguiente procedimiento. Una de las colonias transformantes confirmadas de esta manera, se transfirió a un matraz con 100 mL de caldo LB, incubando el cultivo a 37 °C y 200 rpm. Cuando la DO600 alcanzó un valor de 0,3 se indujo la expresión de la proteína mediante la adición de IPTG y arabinosa, a las concentraciones finales de 1 mM y 0,3%, respectivamente. Tras 4 h de incubación del cultivo en las mismas condiciones, se centrifugó a 4000 g durante 30 min a 4 °C. Tras descartar el sobrenadante, las células se resuspendieron en tampón de lisis (50 mM Tris-HCI, pH 7,6; 1 mM Pefabloc; 0,1 mg/mL lisozima; 10 pg/mL DNAsa I) y se sonicaron en hielo, administrando 30 pulsos de 30 s a intervalos de 30 s. El lisado resultante se centrifugó a 4000 g durante 30 min a 4 °C, y el sobrenadante se filtró a través de un filtro estéril de 0,45 pm seguido por una segunda filtración con un filtro de 0,22 pm. La proteína se purificó a partir del último filtrado con una columna HispurTM Ni-NTA Chromatography (Thermo Fisher Scientific™) a 4 °C. La cantidad total de proteína purificada se determina por el método de Bradford (Kruger NJ (2009). The Bradford Method For Protein Quantitation. Humana Press, Totowa, NJ; pp 17-24). El producto obtenido se congeló en nitrógeno líquido, tras lo cual se almacenó a -80 °C en alícuotas.

La eficacia de la endolisina Poll-N purificada fue testada mediante experimentos de “spot test” frente a distintas cepas bacterianas. Cultivos de estas cepas crecidos en medio LB líquido a 37 °C hasta una DO600 de 0,3 se mezclaron con 5 mL de LB fundido a 50 °C y se vertieron seguidamente sobre placas con medio LB sólido. Una vez solidificado todo el medio, se depositaron en su superficie alícuotas de 10 μL de suspensiones de la enzima Poll-N a distintas concentraciones. Tras incubara 37 °C durante 12 h, se observó la aparición de zonas de inhibición del crecimiento producidos por la lisis (Figura 3). Los resultados obtenidos demuestran que Poll-N es capaz de lisar de forma directa a la mayoría (92,5 %) de cepas de E. coli testadas (159 en total), sin necesidad de ningún tratamiento previo de permeabilización de su superficie celular. Además, su acción lítica se limita a esta especie sin afectar a ninguna de las bacterias ensayadas pertenecientes a otras especies, incluso aquellas próximamente emparentadas (Tabla 4). En base a estos resultados, la endolisina Poll-N se confirma como un agente antimicrobiano con alta especificidad frente a E. coli.

Tabla 4. Resultados de los experimentos de “spot test” con la endolisina Poll-N frente a distintas cepas bacterianas.

1, Aparición (+) o no (-) de claridad en el crecimiento en el ensayo de spot test en la zona donde se añade una concentración de endolisina de 16 μg/mL.

2, Ochman H, and Selander R (1984). Standard reference strains of E. coli from natural populations. J Bacteriol. 157(2): 690-693. 3, Cepas enterotoxigénicas de E. coli, por cortesía del Dr. Anders Nilsson (Universidad de

Estocolmo, Suecia).

4, Cepas enterotoxigénicas de E. coli aisladas por la Universidad de Alicante en salidas de campo a granjas porcinas, por cortesía de DHESA (Fortuna, Murcia, España).

5, Cepas aviares de E. coli, por cortesía del Dr. Pablo Catalá (CECAV, Castellón, España). 6, Cepas aviares de Salmonella, por cortesía del Dr. Pablo Catalá (CECAV, Castellón,

España).

7, Cepas clínicas de Salmonella, por cortesía del servicio de Microbiología del Hospital General Universitario de Elche (Alicante, España).