PLANTAS

CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN Esta invención generalmente se refiere al campo de la agricultura y más específicamente a un compuesto derivado de triptófano, asi como sus posibles subderivados que mantengan esta estructura como núcleo, teniendo actividad anti-viral correctiva y preventiva contra begomovirusa dosis bajas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

Actualmente, los virus son el primer factor limitante en la producción de productos hortícolas en los cultivos protegidos de invernadero y al aire libre.

La definición de virus es algunas veces arbitraria, por lo que muchas definiciones han sido propuestas basadas primordialmente en algunas características que presentan estos patógenos. Es por eso que la definición de estos patógenos se designará tomando como base sus características descriptivas. Por lo que “virus” son entidades submicroscópicas, de naturaleza nucleoprotéica, que se multiplican intracelularmente y que tienen la capacidad de acusar infección.

Los virus son simplemente agentes cuya composición es de ácido nucléico (ARN o ADN)y una cubierta proteica; en estos casos el encargado de la infección es el ácido y la proteina solo le sirve al virus para protegerse. Por otra parte, estos patógenos complejos son de gran importancia ya que se le encuentra afectando diversos organismos entre los que destacan plantas, humanos, microorganismos, insectos, entre otros. Las enfermedades causadas por virus hortícolas constituyen las de mayor impacto en los años recientes debido fundamentalmente a los graves daños que por temporada hortícola se han venido manifestando.

Las causas principales de la disminución en la producción del tomate es la aparición de nuevas enfermedades virales especial causadas por virus del género Begomovirus (familia

Gem iniviridae) .

La mayoría de los Begomovirus tienen genomas bipartitos (ADN- A y B) empaquetados en partículas geminadas. Uno de los virus más importantes que se reportan para tomate son el virus de la hoja enrollada amarilla del tomate (rizado amarillo) (TYLCV).

Los sí ntomas de la enfermedad del rizado amarillo de la hoja del tomate referida como TYLCV (por sus siglas en i nglés) fueron descritos i nicialmente por Avidov a fi nales de 1930 en Israel y publicados por primera vez en 1964 por Cohén y Harpaz. En las Américas, el mismo virus que causa la enfermedad fue reportado en la cuenca del Caribe en el año 1994 en plantas de tomate e identificado como una nueva enfermedad en el hemisferio Occidental. Después, fue identificada su presencia en el Sur de la Florida en 1997. En el Valle Imperial en California, se identificó este virus en plantas de Tomate bajo i nvernadero en el año 2007. Esta enfermedad es considerada la más seria amenaza en la producción de tomate a nivel mundial. Actualmente el virus que provoca el rizado amarillo de la hoja del tomate se encuentra distribuido a nivel global en las áreas tomateras de Oceanla, Norte y Sud-América, cuenca del Caribe, algunos países de la Unión Europea, África y sureste de Asia. En el cercano Oriente ha causado severos daños en cultivos de tomate especialmente en Israel .

En México, se ha reportado la presencia de esta enfermedad en los campos de tomate de Sinaloa, San Luis Potosí, Baja California, Coahuila, Durango, y Nayarit. En Sonora, se ha detectado este problema en plantas de tomate en el valle de Guaymas-Empalme y muy recientemente en la región agrícola de Caborca.

También se ha reportado en las distintas áreas tomateras con clima tropical y subtropical; causa daños de un 5% hasta un 10% .

Síntomas v Daños de la Planta

Los sí ntomas foliares son lo más distintivo del rizado amarillo de la hoja del Tomate (TYLCV). Los síntomas se pueden confundir con deficiencias de fósforo y magnesio. Una planta infectada con el virus (TYLCV) pudiera mostrar los síntomas de 2 a 4 semanas después de haber sido i nfectada. Los sí ntomas en plantas de tomate son más severos cuando son atacadas en etapas tempranas. Las plantas de tomate presentan un acaparamiento general de la planta, folíolos pequeños y enrollados, clorosis por los bordes (margi nal) e intervenía, flores no desarrolladas y frutos pequeños y reducidos. Además, las plantas de tomate tienden ser achaparradas aparentando ser plantas arbustivas debido a entren udos cortos con hojas marcadamente pequeñas de color amarillos entre las venas, arrugadas y curvadas de las márgenes hacia arriba de color amarillo aparentando la forma de una cuchara.

Transmisión del virus

El rizado amarillo de la hoja del tomate (TYLCV) es disemi nado únicamente por la mosquita blanca de la papa Bemis i atabaco

Gen n. biotipo B= Bemisiaargentifolii Bellows & Puring causante de la hoja plateada de las cucurbitáceas y otros biotipos. Este insecto ocupa alimentarse al menos durante 15 min utos y el periodo de transmisión es de 15 a 30 mi nutos. La transmisión se incrementa si el insecto dura más tiempo alimentándose; el biotipo B y Q de Bemisiatabaci son eficientes transmisores, pero es más eficiente el biotipo Q. Puede ser adquirido por las ni nfas y adultos, pero solo lo transmite el estado adulto, el virus es localizado en el floema de las plantas y no es transmisible por savia, por el polen, por forma mecánica ni por semilla. Descripción del virus

El virus pertenece a la familia Gem in iviridae y al grupo de los Begomovirus. El virus posee partículas geminadas (isométricas)de 20x30 nm; tiene u na cadena simple de ADN. Manejo v Control de Virus

Actualmente, es difícil y costoso combatir el rizado amarillo de la hoja del tomate con métodos convencionales q ue no siempre son eficaces. El uso de insecticidas permitidos contra la mosq uita blanca B. tabaci: Biotipo By algunas prácticas culturales tendientes a combatir las malezas en tomate de campo y en casas sombra pudieran ser utilizados con el propósito de red ucir la incidencia de esta enfermedad.

Algunas de las sugerencias para control del virus TYLCV son: a) No transplantar plantas infectadas del i nvernadero al campo; b) Destrucción de socas, c) Destrucción de malezas sobre todo toloache, sida, petu nia, tomatillo, malva, etc; d) Monitorear con frecuencia mediante trampas para insectos la presencia de la mosquita blanca B. tabaci ; e) Combate constante contra la mosquita blanca B. tabaco; asperjando i nsecticidas aprobados para su uso como: I midacloprid, Buprofezi n, Thiametoxan, Bifentrin, Pyriproxifen, entre otros; f) Asepsia general dentro y fuera de las naves de invernaderos o casas sombra. I dentificar y elimi nar las hospederas nativas portadoras del virus que transmite el rizado amarillo de la hoja del tomate; y g) Utilizar hí bridos de tomate resistentes o tolerantes al ataque de virus.

El control de virus está orientado a disminuir las poblaciones del ventor mediante el uso de i nsecticidas, pero la mosca blanca ha desarrollado resistencia a los i nsecticidas tradicionales y los nuevos productos son costosos y no logran controlar las altas poblaciones de B. tabaci.

Por lo que una mayor proporción de compuestos para el control de virus en humanos y animales tienen una estructura de aminoácido. En el control de virus en plantas, especialmente en el control de virus del mosaico del tabaco, los compuestos que contienen una estructura de ami noácidos son altamente activos por lo que la actividad de virus en plantas por derivados de aminoácidos contiene una estructura de di nitrotrifl uorotolueno. Dichos comp uestos se forma mediante la reacción: En donde se pesa una cantidad equimolar de 4-cloro-3, 5- di nitrobenzotrifloruro y triptófano, así como de bicarbonato de sodio, dependiendo de la escala de síntesis que se desee realizar. Agregar cada uno de los componentes en un matraz de tres bocas y agregar 10mL de agua destilada (si la escala de sí ntesis es no mayor a 2mmol). Verificar que el pH se encuentre por arriba de 8.0 usando una tira reactiva, Conectar un termómetro al matraz y comenzar a calentar el sistema. NOTA: se sugiere conectar a u n sistema de refl ujo para evitar la pérdida de vol umen o i nhalación de vapores. Llevar el sistema hasta 80°C en agitación vigorosa, una vez que se alcance dicha temperatura mantener el sistema de calentamiento y agitación por 1 hora, monitorear el pH cada 10 mi nutos.

Una vez concluido el procedimiento de calentamiento, se filtra la suspensión por papel filtro, reci biendo la suspensión en un matraz frío, se formará u n precipitado marrón, el cual se purificará por recristalización en ag ua. Asi mismo la patente CN 102702107 B de los i nventores Cao Yongsong, He Shun et al. siendo el solicitante la Universidad Agricultura de China describe un derivado deaminoácido que contiene una estructura di nitrobenzotrifl uoro:

< : 3 Donde R puede ser seleccionado del siguiente grupo: Además, menciona un método de preparación de un derivado de aminoácido que contiene una estructura di nitrobenzotrifloruro, el cual comprende un ami noácido y 3, 5 - d i nitro-4-cloro- trifluorotolueno como materia prima, y usando una base como catalizador bajo calentamiento, que comprende los siguientes pasos:

En un reactor, el aminoácido y 3, 5 - d i nitro-4-cloro- trifluorotolueno están dispersamente separados en un solvente y la temperatura de reacción es controlada, y u na solución alcalina es añadida gota a gota la sol ución de reacción bajo agitación para mantener un cierto sistema. El valor de pH se agita aún más durante 1 a 2 horas. Después que la reacción es completada, u n precipitado sólido amarillo se filtra y es lavado tres veces con etanol al 75% y 10 m I de agua desionizada, y entonces se recristaliza para la p urificación. El proceso de reacción es como se muestra:

Los ami noácidos pueden seleccionarse del grupo de: glicina, ácido aspártico, cistei na, ácido glutámico, histidi na o fe n i l al a n i n a . La proporción molar de 3,5-dinitro-4-cloro-trifl uorotolueno, aminoácido y una base en el sistema de reacción anterior es 1 : (1.0-2.0): (1.0: 1.5). El solvente es agua, metanol, etanol, isopropanol, butanol, acetonitrilo, tetrahidrofurano, acetato de etilo, metiletil cetona, cilcohexanona, éter glicol, benceno, tolueno, xileno, dimetilformamida, dioxano, metilnaftaleno, dimetilsulfoxido y N-metilpirrolidona, uno o más de ellos.

La base usada es agua amoniacada, hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, carbonato de potasio, acetato de sodio, etilendiami na, dietilami na, trietilamina, diisopropilamina, n- propilamina, di-n-propilamina,,tri-n-propilami na, n-butilami na, di-n-butilami na, tri-n-butilami na, uno o más de ellos. La temperatura de reacción es de 50°C a 100°C, y el pH del sistema es mantenido de 7 a 12 con una base como catalizador. El uso del derivado de ami noácido que contiene u na estructura de di nitrobenzotrifloruro para preparar un pesticida en contra del virus del rizado amarillo de la hoja del tomate, en donde se nota q ue a mayor concentración del derivado de aminoácido es mayor el efecto para combatir el virus del rizado amarillo de la hoja del tomate.

Por lo q ue a diferencia de la presente invención es que el comp uesto presente ácido 2-[2,6-dinitro-4-

(trifluorometil)fenilami no]-3-(1 H-indol-3-il)propiónico el cual es un derivado químico de u n aminoácido aromático como triptófano asi como sus posi bles sub-derivados que mantengan esta estructura como núcleo, en donde se utiliza como agente anti viral que reconoce específicamente el origen de la replicación del virus rizado amarillo de la hoja del tomate (TYLCV).

Uno de los documentos de literatura científica es de los autores Deng Yufang, QianqianGeng, DuanYonghengetal. “Síntesis y

Evaluación de la actividad biológica de un nuevo derivado de aminoácido como un potencial elicitor contra el virus rizado amarillo de la hoja del tomate (TYLCV)” Aminoacids, Julio 2015, V o 147 , Pp.2495-2503 en donde reportan la sí ntesis de derivados de histidi na y de arginina utilizando 4-cloro-3, 5- di nitrobenzotrifloruro, en donde estos compuestos muestran ACTIVI DAD BI OLÓGI CAPREVENTIVA contra el virus de rizado amarillo de la hoja del tomate, dentro de su i nvestigación los autores reportan que estos compuestos i ncrementan la expresión de genes relacionados a defensa como peroxidasa y polifenol oxidasa, así mismo su actividad anti-viral al inducir la defensa. Los autores muestran que la actividad protectora de estos comp uestos se logra a dosis de 1 y 2 g/L del compuesto puro, y desde nuestra experiencia analítica, al probar la i nvención, estas concentraciones i ndujeron al estrés oxidativo en las plantas, además de que se consideran fuera de los parámetros del diseño racional de agroquímicos, donde se busaca dismin uir la concentración del activo liberado a campo. Aunque muestran que la protección con estas moléculas ayuda a disminuir el título del virus, entra a discrepancia por la tendencia que muestra su control de infección denominado “CK” al disminuir su título viral a los 30 días de estudio, cuando se espera que este se incremente o se mantenga superior y estable.

Por lo que en contraste, la presente invención del derivado del triptófano, se muestra que tiene una ACTIVIDAD ANTI-VIRAL

CORRECTIVA, es decir, utilizar el producto derivado del triptófano, una vez que la infección se encuentra instalada, los resultados de la presente invención muestran que la dosis experimental de 50mg/L, muestra una protección contra el progreso de la enfermedad causada por el virus de rizado amarillo de la hoja del tomate. Por lo que a esta dosis las plantas no mostraron señal de estrés oxidativo o fitotoxicidad aguda, el título viral de las plantas infectadas disminuyó significativamente respecto al control de infección el cual mostró la tendencia esperada, además de mejorar el fenotipo de las plantas infectadas, así como su productividad y cantidad de azúcares en el fruto. Por lo que la presente invención se destaca en poder utilizarse a dosis no fitotóxicas y de manera correctiva una vez que la infección viral se encuentre en la planta, lo que ayudaría a incrementar la producción en campo.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION

En un aspecto, la presente invención proporciona un compuesto derivado de triptófano, así como sus posibles subderivados que mantengan esta estructura como núcleo, teniendo actividad anti- viral correctiva y preventiva contra begomovirus a dosis bajas, no fitotóxico en concentraciones de campo, no tóxico a humanos a concentraciones de campo probadas, inductor de crecimiento, en donde el acoplamiento del 4-cloro-3,5-dinitrobenzotrifloruro incrementa al triptófano formando un compuesto que permite una buena translocación hacia el tejido vegetal, la presencia de tres anillos aromáticos favoreciendo la actividad antiviral a dosis bajas. En otras modalidades el compuesto y sus posibles subderivados de triptófano que mantengan esta estructura como núcleo para usarse como un antiviral correctivo y preventivo contra Begomovirus en plantas, en donde la dosis de dicho antiviral sea a dosis bajas.

BREVE DESCRIPCION DE FIGURAS

La Figura 1 se refiere a los elementos necesarios para la realización de un Bioensayo en invernadero: del derivado químico de triptofáno como viricida de TYLCV en tomate, en donde se muestra la reacción con el modelo atómico de Triptófano más el derivado químico 4-cloro-3,5- di nitrobenzotrifloruro, asi como la estructura del virus rizado amarillo de la hoja del tomate (TYLCV) y una foto de las plantas de tomate variedad Rio Grande, la cual es susceptible al virus TYLC y nos asegurarla una infección favorable. La Figura 2 representa un diagrama de distribución de tratamientos en i nvernadero, en donde los colores representan: Azul (control sano); Rojo (control sano) Actigrad (Syngenta); Morado (Control de infección sin tratamiento); Amarillo (Control infectado con Actigard) (Syngenta); Café (Tratamiento Correctivo); Negro (Tratamiento preventivo TDNFB) y Verde (control sano TDNFB).

La Figura 3 muestra como hay un establecimiento e infección del bioensayo en donde comprende dos pasos: A)Marcaje de Tratamientos y B)l nfección del virus.

La Fig ura 4 muestra cómo se aplica el tratamiento TDNFB (45mg/L) a saturación en las plantas a los 2 d p i . En donde el inciso A) representa el activo de TDNFB, el inciso B) C) y D) muestra la dil ución del activo de TDNFB en bomba y el i nciso E) muestra la aplicación de TDNFB.

La Figura 5 muestra fotografías de la planta en donde nos permite observar la severidad de la enfermedad causada por virus del rizado de la hoja amarilla del tomate (TYLCV) medido por la escala que comprende desde el nivel 0 a nivel 4. La Figura 6 muestra una gráfica que representa el promedio de las plantas sintomáticas por surco en donde se encuentran los diferentes tratamientos: el Tratamiento con Actigard, el tratamiento preventivo de TDNFB, el Tratamiento correctivo de TDNFB y el Control de i nfección. La Fig ura 7 muestra la si ntomatologí a en hoja ocasionada por TYLCV en los diferentes tratamientos por medio de fotografías en donde son a 30 dias post-i nfección en A) hojas de plantas a los 30 d p i y a los 60 dias post-i nfección en B) las hojas de plantas a los 60 d p i .

La Figura 8 muestra la sintomatologia en las plantas ocasionada por TYLCV en los diferentes tratamientos por medio de fotografías en donde son de 30 dias post i nfección en a) plantas a los 30 dpi y a los 60 dias post-i nfección en B) plantas a los 60 d p i .

La figura 9 muestra los resultados graficados en donde tiene mayor relevancia el n úmero de moléculas virales de TYLCV en cada tratamiento a los Odpt, 7 d p t , 15 d p t y 21 d p t .

Tratamientos: — ·- Control de i nfección; b-Actig ard; Preventivo TDNFB; Correctivo TDNFB.

La figura 10 muestra el efecto de TDNFB sobre parámetros de cosecha, en donde se observa el rango de color para primer corte de fruto en tomate.

La Figura 1 1 muestra el efecto visual de la producción en el 25% de las plantas de cada uno de los tratamientos de las plantas con el mayor número de frutos que fueron tratadas con TDNFB, preventivo y curativo.

La Figura 12 muestra los resultados graficados del número de frutos por planta en cada uno de los tratamientos. La Figura 13 muestra los resultados graficados del n úmero de frutos por cada 10 frutos colectados.

La Figura 14 muestra cómo se realiza la medición de azúcares en fruto, medióles con refractómetro. La Figura 15 muestra los resultados graficados de grados Brix encontrados en cada u no de los tratamientos, en donde i ndica que los frutos cuentan con mayor cantidad de azúcar gracias a una eficiente fotosí ntesis, lo que otorga al fruto un mejor sabor y una mayor calidad. La Figura 16 muestra dos cromatog ramas de la residuabilidad de TDNFB en hoja y fruto. El primer cromatograma es un estándar analítico de TDNFB y el segundo cromatograma es de un extracto metanólico de tomate (hoja y fruto), en donde no se observa picos significativos a 14 minutos, ni el tejido foliar ni en fruto, bajo la longitud de onda especifica para el compuesto. La Figura 17 muestra la realización de la i nyección i ntradérmica del compuesto en los ratones.

La Figura 18 muestra cómo se realizó la i nyección intradérmica de 100 m L de cada una de las concentraciones de 500, 50 y 0.5mg/mL de la solución acuosa de TDNFB (esterilizado por filtración).

La Figura 19 muestra los resultados de la prueba de irritación y corrosión dérmica, en donde se evaluó el efecto corrosivo o irritante, y la formación de lesiones de 24 horas, 48 horas, 72 horas y 12 dias. La Figura 20 muestra una gráfica que representa el monitoreo de peso de los ratones tras ingesta del producto en alimento a dosis de campo (50mg/L), en donde se observa una dismin ución en su peso (por reducción de alimentación debida a una afección directa en el tracto digestivo).

La Figura 21 muestra la eval uación visual de las heces en 48 horas post ingesta de alimento envenenado, en donde no se observan alteraciones en materia fecal como presencia de sangre, moco o cambio de coloración y olor. La Figura 22 muestra la evaluación conductual a 48 horas post ingesta de alimento envenenado, en donde no se observan alteraciones conductuales como depresión, ansiedad, pilo- erección, sensi bilidad del tacto, ojos llorosos y lagañosos, incremento de respiración, vasodilatación de orejas nariz. La Figura 23 muestra la preparación del alimento envenenado en donde el stock de TDNFB (2mg/ml) disuelto en agua destilada y esterilizado por filtración. Alimento envenenado en una solución 50mg/L (flecha verde). Las croquetas fueron colocadas en la jaula de los ratones si n otra fuente de alimento, forzando a los ejemplares a comer.

D E SC RI PCI Ó N D ETALLADA D E LA I NVE N CI Ó N

El virus del rizado amarillo del tomate (TYLCV)es un virus patógeno de plantas que es responsable de una dismin ución grave del rendimiento en plantas de tomate. Actualmente es muy difícil y costoso combatir el rizado amarillo de la hoja de tomate con métodos convencionales que no siempre son eficaces. El uso de insecticidas permitidos contra la mosquita blanca B. tabaci, biotipo B y algu nas prácticas culturales tendientes a combatir las malezas en tomate de campo y encasa pudieran ser utilizados con el propósito de reducir la i ncidencia de esta enfermedad, Además existen varios viricidas derivados de argi nina y de histidina utilizando 4-cloro- 3, 5 - d i nitrobenzotrifloruro, en donde estos compuestos muestran Actividad biológica preventiva contra el virus del Tomato yellow leafcurl virus y reportan q ue los compuestos incrementan la expresión de genes relacionados a defensa como peroxidasa y polifenol oxidasa, así mismo su actividad anti-viral al i nducir la defensa. Otro viricida es un derivado de aminoácido en donde se ocupa un ami noácido del grupo que consiste de: glicina, ácido aspártico, cisteí na, ácido glutámico, histidina o fenilalanina que reacciona con 3, 5-di nitro-4-cloro-trifl uorotol ueno y una base para obtener un derivado que contiene una estructura di nitrobenzotrifloruro, él cual actúa como un compuesto que combate al virus del rizado amarillo de la hoja del tomate, en donde a mayor concentración del derivado tiene una mayor efectividad .

Sin embargo, el derivado del triptófano tiene una actividad antiviral correctiva, ya que una vez que la i nfección está instalada, los resultados muestran como a continuación se explicara que a la dosis de 50mg/L muestra protección contra el progreso de la enfermedad causada por el virus del rizado amarillo de la hoja del tomate, y además las plantas no muestran señales de estrés oxidativo o fitotoxicidad aguda, y mejora el fenotipo de las plantas infectadas, asi como su productividad y cantidad de azúcares en el fruto. Y además, destaca q ue el compuesto al utilizarse en dosis no fitotóxicas y de manera correctiva una vez que la infección viral se encuentre en la planta, lo que ayudarla a i ncrementar la producción en campo.

El compuesto derivado de triptófano es ni fitotóxico en concentraciones de campo, no tóxico a humanos a concentraciones de campo, no tóxico a humanos a concentraciones de campo probadas, inductor de crecimiento, el acoplamiento del 4-cloro-3, 5 - d i nitrobenzotrifloruro incrementa al triptófano forma un compuesto que permite una buena translocación hacia el tejido vegetal, la presencia de tres anillos aromáticos favorece la actividad antiviral a dosis bajas. Por primera vez, la i nvención proporciona un compuesto derivado de triptofáno (TDNFB) con efecto viricida en plantas de tomate i nfectadas con el virus del rizado amarillo del tomate, en donde se realiza un diseño del experimento para comprobar su efectividad y su actividad antiviral y correctiva en donde se utilizo como material vegetal plantas de tomate de la Var. Rio grande (ver fig ura 1 ), ya que es susceptible al virus TYLCV (ver figura 1 ) y nos aseguraría una infección favorable. Se establecieron siete tratamientos en siete bloques, con 5 plantas cada tratamiento (ta b I a 1 ) . Se colectó la muestra de dos plantas por bloque de tratamiento que representa al 30% de la población total (señaladas con una “X” en la figura 2).

Tabla 1. Descripción de tratamientos

El tratamiento de TDNFB se aplicó en plantas a una concentración de 45mg/L a saturación.

I noculación de TYLCV en plantas de tomate Preparación del i noculo viral (TYLCV)

-Cepa del virus TYLCV Var Guasave i ncl uida dentro de Agrobacteriumtumef andes G V 3101 . -Medio liquido Luria Bertani -Anti bióticos: Kanamicina, Rifampicina, Tetraciclina.

-Buffer de infiltración.

Metodología El virus TYLCV variedad Guasave se encuentra clonado con Agrobacteriumtumefaciens G V 3101 , una azada de la bacteria congelada fue crecida en 5ml de medio LurisBretani suplementado con los antibióticos Kanamicina, rifampici na y tetracicli na a una concentración fi nal de 50 microgramos/mL, en condiciones de agitación vigorosa (250rpm), durante 48 horas. Del cultivo anterior se preparó una suspensión bacteriana con concentración de densidad óptica de 1.0 para 1 L del vol umen final, esta suspensión fue centrifugada a 8000 g por 10 mi nutos, se descartó el sobrenadante y el pellet bacteriano fue resuspendido en 10mL de buffer de i nfiltración, suspendido y centrifugado a 8000 g por 5 minutos, nuevamente el sobrenadante fue descartado y el pellet fue suspendido en 20 mL de buffer de infiltración, eta suspensión fue aforada hasta 1 L con buffer de infiltración, esta suspensión fue utilizada para agroi nfectar.

-I noculación del virus TYLCV

Antes de la i nfección con el virus se aplicó en las plantas dos tratamientos preventivos, preventivo de Actigard y preventivo

TDNFB a saturación. Con la suspensión fi nal preparada en el apartado anterior se inocularon las plántulas de tomate de 4 semanas, previamente transplantados directo a suelo. Dos mililitros de la suspensión (con D. O. de 1.0) fue i noculando mediante infiltración por el envés de la hoja de tomate utilizando una jeri nga si n aguja, 3 hojas por planta. Teniendo cuidado de no sobre afectar mecánicamente el tejido. (Ver figura 3).

-Sintomatoloqía viral de TYLCV en plantas de tomate La sintomatología presente en las plantas infectadas de los tratamientos control y correctivo mostraban i ndicios de enchi namiento y acucharamiento a los 21 d p i , nivel 1 en escala de si ntomatología ( F í g u r a 4 , 5 y 6). Mientras que los tratamientos preventivos con TDNFB y Actigard no manifestaban sí ntomas foliares de TYLCV, Actigard solo presentaba ligero enanismo.

En este punto de la enfermedad se aplicó el tratamiento TDNFB (45mg/L) a saturación en las plantas.

Diete días post-tratamei nto: las plantas del tratamiento control de i nfección presentaban sí ntomas foliares con nivel 2 de acuerdo con la escala propuesta, las plantas tratadas con

TDNFB presentaban escala 1 y recuperación paulatina, en este momento todos los tratamientos mostraron floración .

15 días post tratamiento: las plantas del tratamiento control de infección presentaron escala sintomática 3, con indicios de aborto floral, las plantas tratadas de manera correctiva con TDNFB mostraron recuperación paulati na, disminuyendo sí ntomas foliares y aumento de floración si n abortos evidentes, las plantas Mock de TDNFB presentaron abundante floración e inicio de fructificación al igual que sus homólogos infectados y tratados con este compuesto, los tratamientos preventivos presentan floración abundante, sin embargo las plantas tratadas con Actigar presentan ligero enanismo.

21 dias post-tratamiento: las plantas del control de i nfección presentan abundantes síntomas de TYLCV, escala 4 con abundantes abortos foliares y poco fructificación, las plantas de tratamiento correctivo muestran recuperación en un 80% se encontraron plantas sintomáticas con una escala e 1 mostrando abundante floración y fructificación, los tratamientos preventivos muestran plantas sintomáticas con escala 1 y 2, alto í ndice de floración y fructificación, el tratamiento Actigard presenta i ncidencia sintomática nivel 2 y raramente 3 (Fíguras7 Y 8).

-Concentración viral de TYLCV en plantas de tomate Extracción de ADN de hojas de tomate mediante método CTAB El CTAB (bromuro de hexadeciltrimetilamonio) o Bromuro de cetiltrimetilamonio (CC16H33(N(CH3)3Br) es una sal de amonio cuaternario, uno de cuyos grupos alquilo es de gran longitud, con actividad detergente. Se le conoce también por las siglas CTAB, del i nglés CetyITrimethylAmmoni umBromide. Es u n surfactante catiónico. Sus usos incl uyen la utilización como solución tamponante para la extracción de ADN. El CTAB es u n detergente catiónico que tiene la propiedad de precipitar ácidos nucléicos y polisacáridos ácidos en soluciones de baja concentración iónica. Bajo estas condiciones las proteínas y los polisacáridos neutros permanecen en solución. En sol uciones de alta concentración iónica el CTAB forma complejos con las proteí nas y polisacáridos, pero no precipita ácidos nucléicos. Por esta razón es especialmente útil para solubilizar ADN genómico de organismos que prod ucen grandes cantidades de polisacáridos como las plantas.

Metodología

En un tubo de microcentrifuga de 1 o 2 mL macerar mínimo 20mg de tejido vegetal en 200 m L de buffer CTAB completo. Una vez macerado, agregar 600 m L extras de buffer y agitar por inversión varias veces, incu bar 30 min a 60°C, Una vez transcurrido el tiempo de incubación agregar 600 m L de cloroformo: alcohol isoamilico 24: 1 prei ncubado a -20° C. Una vez agregado agitar vigorosamente y centrifugar 10 minutos a 13000rpm a temperatura ambiente. Durante el tiempo de centrifugación, rotular un tu bo nuevo (1 por muestra) y reci bir en este el sobrenadante del tejido centrifugado, teniendo cuidado de no tocar la fase i nferior.

Agregar el sobrenadante recuperado, 10 - 15 m L de RNAasa (1 g/ L) e i ncu bar 30 mi nutos a 37°C, transcurrido el tiempo de incu bación agregar nuevamente 6 O O m L de cloroformo: alcohol isoamilico 24: 1 preincubado a -20° C y agitar vigorosamente después centrifugar 10 min utos a 13, 000rpm, temperatura ambiente. Recuperar el sobrenadante en un tubo nuevo previamente rotulado, teniendo cuidado no tocar la fase inferior. Adicionar el sobrenadante recuperado aproximadamente 400- 600 m L de isopropanol prei ncubado a -20° C, agitar por inversión 6 a 7 veces y centrifugar inmediatamente por 8 minutos a 13000rpm. Descartar sobrenadante y conservar la pastilla de ADN formada. Agregar 1 mi de etanol 70% preincubado a -20°C y agitar hasta que la pastilla se despegue, una vez despegada, centrifugar a 13000 rpm por 4 minutos, descartar nuevamente el sobrenadante y escurrir el tubo conteniendo la pastilla sobre un papel absorbente dejándolo en posición i nvertida sobre dicho papel para eliminar el alcohol y permitir que el ADN se seque por no más de una hora, suspender la pastilla en 50 m L de agua destilada estéril y correr un gel de agarosa al 0.8% para observar calidad, asi como realizar lectura espectrofotométrica en NanoDrop para eval uación de cantidad y pureza.

Cuantificación de virus mediante PCR tiempo real (gPCR)

La reacción en cadena de la polimerasa es u na reacción enzimática in vitro que amplifica millones de veces una secuencia especifica de ADN d urante varios ciclos repetidos en los que la secuencia blanca es copiada fielmente. Para ello, la reacción aprovecha la actividad de la enzima ADN polimerasa que tiene la capacidad de si ntetizar naturalmente el ADN en las células. Los elementos importantes en la reacción son el templado o el molde (ADN o ADNc), la enzima, los oligonucleótidos o primers. Los desoxirribonucleótidos trifosfatados (dNTPs: adenina, timina, citosi na y guani na), el ión magnesio (Mg+), una solución amortig uadora o buffer y H2O. Todos estos elementos interactúan en tres etapas pri ncipales de las que se compone la PCR: desnaturalización, hibridación y extensión. Los equipos en donde se realiza la reacción son llamados termocicladores, los cuales están diseñados para establecer un sistema homogéneo en donde las condiciones de temperatura y tiempo necesarios no se modifiquen en cada uno de los ciclos. La PCR en tiempo real tienen como objetivo detectar y cuantificar las secuencias especificas de ácidos nucleicos mediante el uso de reporteros fl uorescentes en la reacción . La cuantificación puede ser relativa a un gen de referencia o de expresión constitutiva en la planta, o bien, cuantificar absol utamente en gen mediante el uso de una curva estándar. Para realizar la curva estándar, el gen puro o región de i nterés a cuantificar pura, se diluye hasta una concentración conocida y se realizan dil uciones seriadas en base 10 ( I o g 10 ) con un mí nimo de 5 dil uciones para poder obtener u n patrón de li nea recta. Las dil uciones del producto estándar se usaran como templados en el sistema de reacción y la fluorescencia será directamente proporcional a la cantidad estándar de templado que se ha agregado, generándonos entonces una curva de intensidad de señal q ue es linealmente dependiente de la concentración, esta recta estará denominada por la ecuación y = mx + b, donde m= pendiente de la recta, b= ordenada al origen, y= Ct o Cq (valor del corte umbral donde es posible detectar una amplificación significativa comparada al umbral de fondo, este dato es el que el termociclador tiempo real arroja y con el cual se calcula la concentración de la muestra problema) y x = concentración déla muestra en número de copias o partículas o ng. El reportero fl uorescente más comúnmente usado es el SYBRgreen que se unirá a estructuras de doble cadena de ADN, y conforme estas incrementan en la reacción, la fluorescencia incrementará. Metodología

Preparar u n mastermix de acuerdo a las i nstrucciones de la casa comercial, a continuación, se menciona el sugerido por la casa comercial ThermoScientific, Máxima SYBR qPCR.

Tabla 2 Componentes para la reacción de qPCR

*EI ADN será depositado hasta que la placa de PCR esté previamente cargada con 8pL de Mezcla de reacción por pozo

NOTA: SE SUGIERE SE REALICEN DUPLICADOS O TRIPLICADOS TÉCNICOS DE CADA MUESTRA O ESTANDAR ANALÍTICO

Una vez que los pozos de la placa sean cargados con mezcla de reacción y con la muestra de ADN problema o las muestras de curva estándar se procederá a colocar la placa en el termociclador para su amplificación bajo las condiciones especificadas en la tabla 3. Tabla 3. Condiciones de amplificación de TYLCV en q PCR.

El equipo detectará automáticamente el i ncremento de fluorescencia por el SYBR cuando este ha sido programado previo al inicio de la reacción .

Una vez alcanzado los 40 ciclos de amplificación obtener los valores de Ct que el equipo arrojará y usarlos para calcular la concentración de gen de interés, de acuerdo con la ecuación de la recta obtenida por la curva estándar. La concentración será el valor despejado de X en dicha ecuación.

NOTA: Si el valor de Eficiencia en la curva estándar es menor a 98 o mayor a 105% considerar realizar nuevamente dicha curva, este valor es dado por los termocicladores.

Resultados Se realizó un análisis estadístico de comparación múltiple ANOVA. Los resultados se muestran graficados en la figura 9 y se describen a contin uación:

21 días post i nfección (Tiempo 0 del tratamiento) los tratamientos preventivos de TDNFB y Actigard son significativamente diferentes a los tratamientos control de infección y correctivo de TDNFB.

Siete dias post tratamiento, ninguno de los tratamientos es significativamente diferente. Pero 15 d p t , los tratamientos Actigard y Correctivo son diferentes significativamente al tratamiento Control de infección.

21 dpt los tres tratamientos (Actigard, Preventivo TDNFB, Correctivo TDNFB) son diferentes al control de infección, y entre ellos no hay una diferencia sig nificativa. En esta etapa se encontró q ue el tratamiento control de i nfección tenia 3 veces más moléculas virales de TYLCV que el resto de los tratamientos (ver figura 9).

Residuabi lidad de TDN FB en hoja y fruto

La cromatografía liquida de alto rendimiento, HPLC, es una técnica analítica de tipo cromatográfica, que se basa en el uso de un eluyente liquido pasando a través de una col umna super empacada con la fi nalidad de separar comp uestos que tenga la capacidad de retenerse en la col umna y ser arrastrados paulatinamente de acuerdo con su peso o afinidad hacia el el uyente. A diferencia de la cromatografía convencional, las técnicas de alta presión utilizan un sistema de bombeo de alta presión, que permite i ncrementar el fl ujo y velocidad con la que el el uyente cruza el sistema cromatográfico de la columna, de esta manera acelerar los procesos de separación y además incrementar las posibilidades de obtener una molécula en su estado más puro. Además, el uso de esta técnica para separación, es u na técnica analítica que permite identificar y cuantificar compuestos con relación a un estándar analítico. En las columnas de fase de reversa (RP), los compuestos son retenidos con base a tu polaridad de estos a la matriz de la columna, un compuesto puede ser identificado de acuerdo con su tiempo de retención y absorción específica en una determinada longitud de onda dentro del espectro UV-l is o propiedades fluorescentes o masa (figura 16) Materiales

Acetonitrilo grado HPLC

Agua miliQ (cond uctividad 18.2mOhms)

TFA 1 %

Viales de i nyección 2mL Metanol grado HPLC.

Columna Fase reversa C18

Procedí mi en tos

Preparación de estándar analítico Se sintetizó el compuesto TDNFB como se menciona en el apartado de síntesis, el producto bruto fue lavado y posteriormente se preparó una sol ución de dicho producto a 1 mg/mL, este producto fue inyectado en una col umna C18, con un gradiente lineal de acetonitrilo 0-100% por 20 minutos, el comp uesto fue detectado con UV-Vis acoplado al HPLC con una longitud máxima de absorción de 264nm, todos los picos resultantes fueron colectados separadamente, una vez colectados se determinó mediante ESI-MS el peso molecular esperado, con la finalidad de caracterizar el tiempo de retención específico para el TDNFB. SE realizaron varias corridas para colectar al menos 1 mg de producto puro sólido y usarse como referencia analítica interna.

-Extracción de superficie

Se colectaron hojas de tomate a 15 días post tratamiento con TDNFB, de distintos puntos de la planta, aproximadamente 1 gramos por hoja, estas fueron transportadas al laboratorio, una vez en el laboratorio las hojas fueron directamente colocadas en un vaso de precipitados conteniendo 10mL de metanol grado reactivo (1 g de hojas/10mL de metanol) y se mantuvieron en agitación por 10 minutos para solublilizar cualquier residuo remanente en la superficie del tejido. Se colectó el sobrenadante y este fue inyectado a la columna C18 para observar presencia de compuestos con tiempo de retención similar al estándar de TDNFB así como absorción a su mima longitud de onda.

-Extracción de tejido interno

De forma similar al apartado anterior se colecto un gramo de hojas de tomate por planta y además se colectaron frutos. Se pesó un gramo de tejido foliar y se lavó con abundante agua destilada para eliminar residuos en superficie. Del tejido de fruto este fue colocado y se pesó 1 gramo de tejido frutal, ambos tejidos se maceraron de manera separada en 10mL de metanol grado reactivo, se colectó el homogeneizado y se centrifugó para separar el debris, se colectó el sobrenadante y este se usó para i nyectar a la columna C18, comparando presencia de picos con el mismo tiempo de retención que el estándar de TDNFB, así como su absorción a su misma longitud de onda de 264nm.

Condiciones cromatográficas: 1 )Preparación de disolventes: Preparar 1 L de acetonitrilo grado

HPLC y filtrar a través de membrana compatible, sonicar el disolvente filtrado por 15 mi nutos. Obtener 1 Litro de agua milliQ y filtrar con membrana compatible a medio acuoso, sonicar el agua filtrada por 15 minutos. 2) Lavado y acondicionamiento de la columna: La columna se conecta al equipo de HPLC y se hace pasar al menos 5 volúmenes de cama de acetonitrilo 100% filtrado y sonicado, después de hacer pasar este volumen, dejar pasar al menos 10 volúmenes de cama de la columna de ag ua hasta que la linea base quede en cero de manera estable.

3) La cromatografía del estándar analítico, así como de las muestras problema se realizó de la manera q ue se especifica en la tabla 4. Tabla 4. Condiciones de Gradiente línea Acetonitrilo-agua, columna C 18

^* Se preparó un estándar analítico de TDNFB de 10O g/mL, inyectando 50 m L de muestra por corrida de estándar y problemas. Tanto para muestras problemas como estándar analítico ES NECESARIO filtración con filtro de jeringa de 0.45mM, previo a la inyección en la columna.

Resultado

Al realizar el cromatograma para detección de TDNFB en hoja y fruto, no se observó picos significativos bajo la longitud de onda específica para el compuesto. Efecto de TDNFB sobre parámetros de cosecha Se realizó colecta de frutos del 25% de plantas en cada tratamiento. El rango de color para la cosecha se especifica en la fig ura 1 1.

Los tratamientos con el mayor número de frutos fueron las plantas tratadas con TDNFB, preventivo y curativo (ver figuras 10, 1 1 , 12 y 13).

En cuanto al peso, se realizó el pesaje a 10 tomates por tratamiento con tres repeticiones, en la fig ura 13 se puede observar como los tratamientos control y las plantas tratadas con TDNFB obtuvieron tomates con mayor peso. Esto nos indica que las plantas infectadas no solo producen menos frutos, sino también frutos de menor tamaño. Medición de azúcares en fruto(Grados Brix)

Materiales

Refractómetro portátil

Mortero

Espátula Agua destilada Piseta

Metodología

Se maceró aproximadamente 1 gramo de fruto (3 frutos por tratamiento) con ayuda de un mortero o pistilo, hasta una consistencia completamente homogénea. Previo a la medición el refractómetro fue ajustado y cali brado al vacío y con agua destilada, hasta aj ustar a ceros. Una vez ajustado acero, se colocó una cantidad de muestra macerada, que fuera suficiente para cubrir en totalidad al prisma, una vez depositada, se registró la lectura mostrada en la pantalla del equipo. (ver figura 14) Entre cada muestra el prisma fue lavado con agua destilada contenida en piseta y secado con papel seda. Para nuevamente colocar un nuevo analito.

Resultados

Se obtuvo mayor porcentaje de grados Brix en el control sano y en el preventivo de TDNFB. Esto i ndica que sus frutos cuentan con mayor azúcar gracias a una eficiente fotosíntesis, lo que otorga al fruto un mejor sabor y una mayor calidad (fig ura 15).

Ensayos toxicológicos en modelo muri no Fu ndamento

Toxicidad local y sistémica

La toxicidad local es la capacidad de una sustancia o producto químico de producir u n daño en el sitio de contacto con el organismo. Este se manifiesta generalmente como corrosividad o irritación de piel y de mucosas (por ejemplo, ocular). La toxicidad sistémica es la propiedad de una sustancia de producir un efecto de carácter generalizado o que ocurre en disti nto lugar de aquel por el que el agente penetró en el cuerpo. Requiere la absorción y distri bución del tóxico por el cuerpo. Estos efecto pueden ser generalizados o específicos de un órgano principal (órgano diaria) o sistema (hepatotóxicos, neurotóxicos, nefrotóxicos, inmunotóxicos, reprotóxicos, carcinógenos, etc).

I rritación v corrosión dérmica

La corrosión cutánea implica la formación de una lesión irreversi ble de la piel, tal como necrosis visible a través de la epidermis hasta la dermis, como consecuencia de la aplicación de u na sustancia de ensayo durante un período de hasta 4 horas.

Las reacciones corrosivas se caracterizan por úlceras, sangrado, escaras sangrantes y, tras un período de observación de 14 días, por decoloración debió al blanq ueo de la piel, zonas completas de alopecia y cicatrices. Cuando la lesión es reversible se habla de irritación cutánea. La reversibilidad de las lesiones cutáneas es un elemento para considerar al eval uar las respuestas de irritación. Una sustancia debería considerarse irritante cuando persistauna i nflamación al final del período de observación en dos o más animales y aparezcan alopecia (zona limitada), hiperqueratosis, hiperplasia y escamación . Categorías de peligro para la toxicidad especifica de órganos diana tras una exposición única.

CATEGORÍA 1 : Sustancias que producen toxicidad significativa en seres humanos o de las q ue, en base a estudios en animales de experimentación, se puede esperar que produzcan una toxicidad significativa en humanos tras una exposición única. Se basará en : a) datos fiables y de buena calidad obtenidos mediante el estudio de casos en humanos o a partir de estudios epidemiólogicos; o b) estudios apropiados con animales de experimentación donde los efectos tóxicos significativos y/o graves q ue puedan considerarse relevantes para los humanos, se observaron a concentraciones de exposición generalmente bajas.

CATEGORÍA 2: Sustancias de las que, en base a estudios en animales de experimentación, se puede esperar que sean nocivas para la sal ud humana tras una exposición única. Se basará en estudios apropiados con animales de experimentación donde los efectos tóxicos significativos y/o graves que puedan considerarse relevantes para los humanos, se observaron a concentración es de exposición generalmente moderadas.

CATEGORIA 3: Efectos transitorios en los órganos diana. Son efectos que provocan alteraciones funcionales en h umanos durante un corto período de tiempo tras la exposición, y revierten en un plazo razonable sin dejar secuelas estructurales o funcionales apreciables. Esta categoría sólo comprende los efectos narcóticos y la irritación de las vías respiratorias.

Material y métodos utilizado -Evaluación de irritación y corrosión dérmica 3 ratones blancos, 3 semanas de edad Jeringas para punción dérmica

Solución acuosa de TDNFB puro, 500,50, y 0.5mg/L (esterilizado por filtración) Método:

Se rapó el lomo de los 3 ratones con la fi nalidad de hacer más visi ble un efecto tóxico del compuesto de prueba. Una vez rapado, se realizó la inyección i ntradérmica de 100 m L de cada una de las concentraciones mencionadas arri ba (ver figura 17), en puntos específicos del lomo del animal, como se i ndica en el siguiente esquema (ver fig ura 18).

Una vez inyectó el compuesto, en diferentes ratones, se eval uó el efecto corrosivo (si presentan lesiones en menos de 4 horas) o irritante, formación de lesiones después de 4, 24, 72horas y 12 di as.

-Evaluación de afección sistémica a dosis única por envenenamiento de comida 3 ratones blancos, 3 semanas de edad.

Jeringas de 1 mL Solución acuosa de TDNFB puro 50mg/L (esterilizado por filtración)

Báscula

Método Antes de comenzar con el envenenamiento, los ratones fueron pesados en una báscula para obtener el peso del tiempo 0. El alimento de los ratones se envenenó con compuesto TDNFB a la concentración de 50mg/L (concentración utilizada en campo), sumergiendo completamente 3 piezas de alimento hasta completa saturación de este con la solución de TDNFB. (Ver figura 23) Una vez envenenado, el alimento fue colocado en la jaula de los ejemplares, retirando todo resto de alimento no envenenado, de esta manera se forzó al animal a comer del alimento conteniendo la molécula. Se observó si el ratón presentó un efecto inmediato al ingerir el alimento, exami nación de heces y el peso de este fue monitoreado cada día durante 14 días. Dos ratones fueron usados como control negativo al envenenamiento, los cuales fueron alimentados con su dieta normal. La figura 19 muestra los Resultados de Prueba I rritación y corrosión dérmica.

Resultados de prueba de afección sistémica por ingesta Se monitoreó el peso de los ratones durante 12 días post envenenamiento, no se observó una dismin ución en su paso (por reducción de alimentación debida a una afección directa en el tracto digestivo), ver figura 20, se clasifica como No tóxico a ingesta sin afección directa al tracto digestivo, se recomienda se clasifique en categoría 3 para su etiquetado evitando cualquier i nconveniente. Además, se evaluó visualmente las heces de los ejemplares, las cuales no mostraron presencia de sangre, moco o cambio de coloración y olor (figura 21 ), no se observaron tampoco alteraciones conductuales en los ejemplares (figura 22).

Además el uso de el ácido-2-[2, 6-di nitro-4 (trifluorometil) fenilami no]-3-(1 H-i ndol-3-il) propiónico como agroquimico para la protección de enfermedades virales causadas por begomovirus.

EJ E M P LOS Para determinar la capacidad anti-viral del compuesto se realizó una prueba de actividad in vivo. Se infectaron plantas de tomate [N = 6] de 3 semanas de edad con TYLCV mediante la técnica de agroi noculación, una vez confirmada la infección sistémica en hojas apicales mediante la técnica de PCR, se procedió a realizar el tratamiento de las plántulas i nfectadas utilizando una concentración de 45mg/L de TDNFB, la solución fue infiltrada con jeri nga en las hojas apicales por el envés de las hojas, las plantas se mantuvieron en incubación por 15 dias post tratamiento, colectando muestras de los diferentes grupos de tratamiento (infectadas si n tratar, sanas e infectadas tratadas) para la extracción de DNA y cuantificación del título viral mediante de qPCR.

Tabla 1 Se determinó la capacidad antiviral del compuesto TDNFB en campo sobre un cultivar de tomate en condiciones de invernadero. Se germi naros plantas de tomate sobre sustrato inerte [perlita: vermiculita, 1 : 1 ) una vez desarrolladas un par de hojas verdaderas se transplantaron directamente a suelo en un invernadero de 1500 metros cuadrados, se mantuvo una separación promedio de 50 cm entre cada planta, estas fueron fertilizadas con una sol ución nutritiva fórmula tomatera P o I y - feed 20:20:20, una semana después del transplante, se realizó la asignación de grupos experimentales mediante distri bución por bloques aleatorios distri buidos en 7 surcos, con la finalidad de red ucir interferencias ambientales como temperatura, humedad, cantidad de l uz, calidad de suelo. Los grupos experimentales asignados fueron: 1 ) control sano sin tratamiento, 2) Control sano tratado con compuesto TDNFB, 3)Control sano tratado con Actygrad (Syngenta), 4) Control de infección sin tratamiento, 5) Control infectado tratado Actygard (Syngenta), 6)Tratamiento correctivo TDNFB, 7)Control infectado con tratamiento preventivo TDNFB, los siete grupos fueron distri buidos aleatoriamente por todo el surco utilizando u na N = 8 plantas por tratamiento en cada surco, con un total de 56 plantas por cada grupo experimental, sin mantener un patrón repetido de distri bución entre los surcos restantes. Una vez asig nado el grupo experimental, en un mismo día, los tratamientos 4 y 6 fueron agroi noculados con TYLCV mientras que los grupos 3 y 5 fueron tratados mediante aspersión con Actygrad y el grupo 7 fue asperjado con TDNFB 45mg/L, después de 8 horas, ese mismo día los tratamientos 5 y 7 fueron agroi noculados con TYLCV. La aspersión se realizó de manera foliar cu briendo haz y envés de las hojas a saturación . Después de 3 semanas post-inoculación, las plantas i noculadas de los tratamientos 4 y 6 comenzaron a manifestar síntomas de enchi namiento ligero, se tomó muestra de hojas apicales para extracción de DNA y se realizó la detección sistémica del virus mediante la técnica de PCR. Una vez confirmada la infección sistémica se procedió a realizar el tratamiento correctivo. Las plantas de tomate de los tratamientos 2 y 6 fueron asperjadas por todo el follaje utilizando una bomba mecánica, asegurando que el compuesto cubriera haz y envés y hasta escurrimiento. Posterior al tratamiento, las plantas fueron monitoreadas a los 7, 15 y 21 días post tratamiento para inspeccionar el desarrollo sintomático, así post tratamiento para inspeccionar el desarrollo sintomático, así como tomar muestras de hojas apicales de todos los tratamientos para la extracción de DNA y cuantificar al virus mediante PCR tiempo real .

Tabla 2 Análisis de la actividad anti-viral de TDNFB contr TYLCV in vivo. Tabla 3. Análisis de actividad antiviral de TDNFB contra TYLCV in vivo

Por lo tanto, se pretende que el alcance de invención esté limitado no por esta descripción detallada, sino por cualquiera de las reivi ndicaciones que se emiten en una solicitud basada en ésta. Por consiguiente, la descripción de la invención pretende ser ilustrativa, pero no limitante, al alcance de la invención, que se describe en las reivi ndicaciones.