DE AMOSTRA E CONTAGEM DE CÉLULAS

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Das células do sangue

As células do sangue podem ser classificadas em três grupos: células vermelhas (hemácias) , glóbulos brancos (leucócitos) e plaquetas (tro bócitos) . Como o sangue permeia todo o corpo animal, estas células são transferidas para outras partes do mesmo, em particular para os fluidos corporais.

Os leucócitos representam um grupo importante de células que estão envolvidas na defesa do organismo, contra agentes infecciosos e substâncias estranhas. Por isso, elas estão presentes nos diversos fluidos corporais, além do sangue, a urina, , o liquor (liquido céfalo-raquidiano) , os líquidos cavitários, como o ascítico, o pleural, o peritoneal e o sinovial; os fluidos alimenticeos, como o leite. O excesso de leucócitos no leite animal, por exemplo, pode representar um grande problema de saúde pública ou prejuízos financeiros, pois indica a presença de diferentes infecções que podem contaminar todo o lote de leite colhido, por causa de um animal doente Pyõrãlã (2003) ; Instrução Normativa n°51 de 2011 do Ministério da Agricultura. Portaria Anvisa.

O sangue humano em estado de normalidade contém de 4000 a 10000 leucócitos por milímetro cúbico de sangue. Em condições normais de saúde, os mamíferos contam com cinco tipos de leucócitos: neutrófilos, basófilos, eosínófilos, linfócitos e monócitos (MIRCIC, 2006; RAWAT, 2015). Os leucócitos que contém grânulos são chamados granulócitos, representados pelos neutrófilos, eosinófilos e basófilos. As células sem grânulos são chamados agranulócitos, representadas pelos linfócitos e monócitos {MARIEB, 2011), dos quais os neutrófilos ocorrem entre 40% e 60%; linfócitos entre 20% e 40%; os monócitos entre 2% e 8%; os eosinófilos entre 1% e 4%; e os basófilos 0,5% e 1%, conforme descrito por MATHUR et al, 2013. Variações na quantidade total dos leucócitos è/ou das proporções de cada tipo são indicativas da presença de uma grande quantidade de doenças.

As concentrações especificas de leucócitos nos diferentes fluidos corporais ajudam os especialistas a discriminar a presença ou a ausência de grandes grupos de patologias que são importantes para a determinação do estado de saúde do individuo (PIURI, 2004) . Quando uma infecção ocorre, a produção destas células aumenta (MARIEB, 2011) . Segundo Ducrest (2005) a contagem diferencial dos leucócitos" tem uma longa tradição como uma ferramenta de diagnóstico em Medicina humana ou veterinária, auxiliando na tomada de decisões por parte do clinico. Contagens elevadas ou abaixo dos números normais podem indicar a presença de muitas formas e diferentes tipos de doença.

Os neutrófilos são, de longe, os leucócitos mais abundantes no sistema imunológico humano (CARRERAS, 1994) . São células arredondadas, com tamanho que varia de 12 a 14 μπι de diâmetro · (RAWAT et al, 2015) , Apresenta núcleo lobulado, que geralmente contém de dois a cinco lóbulos, ligados por um fino fio de cromatina. O neutrófilo maduro é definido pelos lóbulos redondos apresentando cromatina condensada, e em algumas vezes o fio da cromatina pode não estar visível, pois são sobrepostos pelos lóbulos nucleares. A cromatina é grosseira, agrupada em porções e cora-se em púrpura. O citoplasma é claro e contém vários grânulos pequenos rosados distribuídos uniformemente pela célula, entretanto podem não ser visíveis, quando estão sobre o núcleo. Estes : grânulos são peroxidase-positivos e peroxidase-negativos em uma proporção de dois para um (BEU LER et ai, 2001).

Os linfócitos representam um grupo heterogéneo de células que podem ser diferenciadas de outros leucócitos facilmente, por sua morfologia nuclear e citoplasmática características. - Porém, a morfologia geral é compartilhada por seus três principais tipos: as células T, as células B e as células NK "assassinas naturais" {BEUTLER et ai, 2001) . Estudos clássicos do sangue evidenciam os linfócitos como células esféricas e ou ovóides com diâmetro variando de 5 um a Π um (RAWAT et ai, 2015) . São considerados pequenos linfócitos as células com 6 a 9 um de diâmetro, enquanto que linfócitos grandes apresentam diâmetro de 9 a 17 um. Os linfócitos pequenos quando corados pelos derivados de Romanowsky ( right, Giemsa, ou outro) tem um núcleo oval ou em forma de rim, que se cora em púrpura, e ocupa cerca de 90% da área da célula. A pequena borda citoplasmática se cora de azul claro. Eles são dotados de nucléolos, que raramente são observados nas , lâminas de distensões sanguíneas quando são coradas com Giemsa (BEUTLER et al, 2001) .

Os monócitos■ são as maiores células normais no sangue, cujo diâmetro varia de 14 um a 24 um {RAWAT et al, 2015) . 0 núcleo mostra-se de várias formas, desde arredondados, em forma de rim, ovais ou lobulados e podem, ainda, aparecer dobrados. A cromatina é organizada em fios finos com margens bem definidas. Quando corados com derivados de Romanowsky o citoplasma é azul claro ou cinza e frequentemente vacuolizado, especialmente em lâminas executadas a partir de sangue coletado com o anticoagulante EDTA. A cor cinza do citoplasma (em oposição ao azul) é devida à granulação fina contendo RNA (coloração azul) e ajuda a distinguir entre monócitos e \ linfócitos reativos. A cromatina nuclear dos monócitos contém uma estrutura fina, diferentemente dos aglomerados mais grosseiros da cromatina linfóide (BEUTLER et al, 2001) .

Os eosinófilos foram descritos pela primeira vez em 1846 por Jones (McEWEN, 1992) , e desde então sua presença é associada às infecções parasitárias, assim como em várias outras doenças, incluindo dermatoses, alergias, poliarterite e algumas doenças neoplásicas (BASTEN et al, 1970) . DE LA RUE (2001) descreve os eosinófilos como células ligeiramente maiores que os neutrófilos. Seu diâmetro está entre 12 um e 15 um (RAWAT et al, 2015) . Normalmente o núcleo apresenta apenas dois lobos. O padrão da cromatina é o mesmo encontrado nos neutrófilos, mas o núcleo tende a ser mais, levemente corado. A principal característica de diferenciação destas células é a presença de muitos grânulos refringentes, que os derivados de Romanowsky coram em laranja avermelhado e estão distribuídos uniformemente por toda a célula (BEUTLER et al, 2001) . Os grânulos contêm principalmente a proteína básica maior (PBM) , a proteína catiônica eosinofílica (PCE) e a peroxidase eosinofílica (POE) (SPRY, 1985; McEWEN, ^" 1992; SPRY, 1992; STEVENS, LOWE 1993; TIZARD, 1998).

Os basófilos representam uma população de células granulociticas morfologicamente distinta no sangue e são os principais mediadores da inflamação alérgica (KURIMOTO, 1989 ; FALCONE, 2000) . Os basófilos são menos numerosos, representam menos de 1% da contagem diferencial. Seu tamanho é intermediário entre os granuíócitos neutrófilos e eosinófiios, variando de 10 um a 14 um de diâmetro (RAWAT et al, 2015). Na coloração de Wright (que também é um derivado de Romanowsky) são facilmente reconhecíveis em função dos seus grânulos grandes e abundantes. Estes grânulos são basofílicos e se coram em azul-escuro (OVALLE, NAHIR EY, 2014)?. 0 núcleo, geralmente irregular ou bilobulado é menos evidenciado, pois se encontra escondido pelos grânulos (ANDRÉO FILHO, 2009) .

Classificar e contar as células do sangue e nos demais fluidos corporais (em especial os leucócitos, que são indicativos ^' de muitos processos infecciosos) é importante para avaliar o estado de saúde do individuo em inúmeras condições.

Como exemplos de critérios utilizados classificar os leucócitos em exames por imagens pode-se citar diferenças de textura, afinidade com diferentes corantes, tamanho, conteúdo e morfologias do núcleo e citoplasma de cada tipo de célula. j

A contagem e caracterização das células do sangue, ou hemograma, é o exame laboratorial mais solicitado para o acompanhamento e a triagem do estado de saúde do paciente. A contagem e avaliação morfológica das células do sangue têm sido uma ferramenta importante, não somente para o diagnóstico de doenças, mas também como um "atestado" da saúde geral do paciente em exames periódicos e nos check-ups (ROSENFELD, 2012). Em particular, a contagem diferencial dos leucócitos tem uma longa tradição como ferramenta de diagnóstico na medicina, auxiliando a tomada de decisões por parte do clinico {DUCREST, 2005) . Por isso, ao longo dos anos, as informações derivadas da contagem diferencial dos leucócitos tornaram-se fundamentais na avaliação diagnostica do paciente, e também sendo utilizadas rotineiramente para a triagem e o acompanhamento de doenças hematológicas e não hematológicas.

Hemograma e 'métodos de corar e contar células

A identificação e a diferenciação dos leucócitos nos diversos fluidos corporais, humano ou animal, tais como o sangue, a urina, o leite, o liquor {liquido céfalo- raquidiano) , os líquidos cavitários, como o ascítico, o pleural, o peritoneal, o sinovial, exigem que sejam feitos diferentes tipos .de exames. Todos esses fluídos são meios aquosos, no entanto, todos os corantes que são usados para diferenciar os leucócitos estão disponíveis somente em soluções alcoólicas. Como os corantes diferenciais estão em meio alcoólico é : necessário que . o fluido corporal a ser corado seja distendido numa lâmina, seja seco e fixado, para depois se proceder a coloração diferencial dos leucócitos.

Quando essas soluções corantes são inseridas diretamente nos fluidos que são aquosos a coloração pode até ocorrer, como acontece com soluções de Leishiman, Wrigth e Giemsa, no entanto, ocorre o aglutinamento de partículas que inviabiliza a contagem ou classificação adequada das células.

Há corantes que fazem a coloração diferencial dos leucócitos em meio aquoso, mas eles são usados em citômetros de fluxo para diferenciação apenas no sangue (Patente da Sysmex BR 11 2013 ^' 027349. Tais corantes não servem para realizar a diferenciação das células em microscópio, como é feito nas lâminas de distensão e não servem para diferenciar leucócitos em outros fluidos, que não seja o sangue. Por isso nunca foram usados de acordo com a proposta deste invento .

ESTADO DA TÉCNICA

Corantes e métodos de corar células

Todos os corantes que permitem realizar a leitura diferencial dos leucócitos, de forma confiável, em microscópio ~ são , roduzidos em meio alcoólico. Os únicos resultados confiáveis, com esses corantes, são obtidos quando eles são aplicados era distensões dos fluidos, sobre uma lâmina de vidro, e fixadas com algum permeabilizante, como o metanol .

Alguns desses corantes podem realizar a coloração diferencial em meio liquido alcoólico, no entanto, quando o fluido corporal é colocado no meio liquido alcoólico ocorre a coagulação ou a aglutinação de sólidos, formando grumos, como apresentado a imagem de câmara de Neubauer mostrada na Figura 4. Os resultados dessas colorações não têm utilidade prática, pois a aglutinação das partículas inviabiliza a contagem e a classificação correta das células, Não é possível separar as células contidas no aglutinado de modo a realizar a contagem.

Uma forma de coloração de leucócitos em meio liquido não alcoólico é feita principalmente com Azul de Metileno ou seus derivados, formando, por exemplo, o "liquido de Turk". Porém, esse tipo de coloração não permite a diferenciação dos leucócitos em seus tipos e subtipos. Essa classe de corantes só permite detectar a presença dos leucócitos, sem diferenciá-los.

A preparação da distensão exige mão de obra qualificada e experiente, além de levar um tempo considerável para ser concluída. Por isso, em casos de atendimentos de urgências ou emergências os médicos são levados a tomar decisões sem o exame de hemograma. Adicionalmente, nas consultas de rotina, quando é feita ' uma requisição do exame o paciente deve realiza-lo futuramente num laboratório de análises clínicas e deve retornar? ao consultório com o resultado, para que seja avaliado pelo médico. Essa conduta implica em grande dispêndio de tempo por todos os envolvidos.

Para realizar a diferenciação entre os leucócitos pelo método de contagem manual é necessário preparar uma distensão do sangue total em lâmina nova. Os grandes laboratórios dispõem de equipamentos automáticos para realizar e preparar a distensão sanguínea. No entanto, este é um recurso para poucos. Tipicamente a distensão é preparada por um 'laboratorista ou biomédico. Para realizar a

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distensão com qualidade aceitável esse profissional deve ter treinamento específico e boa experiência com a técnica. Após a realização da distensão ela deve ser seca naturalmente e em seguida fixada com algum tipo de álcool (etanol ou metanol, por exemplo). Depois de fixada a distensão deve ser corada por corantes específicos-

Os corantes utilizados . para esse fim foram desenvolvidos pelo médico russo Dmitri L. Romanowsky (1861- 1921) no final doj século XIX. Depois dele surgiram diversos derivados do mesmo corante, que atuam de acordo com os mesmos princípios, com os quais se obtém resultados semelhantes. São eles os corantes de Wright, Giemsa, Leshiman, May-Grunwald, dentre outros. Esses corantes são tão antigos que não há qualquer patente em vigor protegendo- os. Além de serem' derivados de Romanowsky, todos tem outra característica em ^* comum, só atuam em distensão sanguínea fixada. Nenhum s deles ou qualquer outro conhecido até o momento é capaz ' de corar os leucócitos em meio liquido de modo a permiti sua diferenciação pela avaliação visual de especialista ou por processamento de imagens. Esses corantes e o método manual utilizado para diferenciar os leucócitos são largamente utilizados em hematologia. No entanto/ a coloração para (diferenciação visual não sofre evoluções metodológicas á várias décadas.

Outro fato 'importante é que nenhum desses corantes ou método utilizado para contagem diferencial manual elimina a presença das hemácias, que são coradas também. A presença das hemácias atrapalha o trabalho dos especialistas, que precisam buscar^ leucócitos dispersos em meio a uma infinidade de hemácias (a proporção normal é de 1000 hemácias para cada leucócito) . A presença das hemácias afeta pouco o trabalho de especialistas experientes, que aprenderam a ignora-las. No entanto, afeta drasticamente os algoritmos de segmentação e reconhecimento dos leucócitos em programas de processamento de imagens. Então se houver um corante que elimina ou que não core as hemácias e preserve os leucócitos corados diferenciadamente já seria um grande avanço.

As colorações derivadas de Romanowsky têm como principio básico que as estruturas celulares ácidas coram-se pelos corantes básicos e que estruturas básicas se deixem corar por corantes ácidos. Os corantes básicos são representados pelo azul de metileno e seus derivados, enquanto a eosina é normalmente o elemento ácido da solução de corantes (BAIN, 2007; OLIVEIRA, 2007) . Não existe um consenso sobre qual destas combinações é a ideal para ser usada na coloração e identificação das células sanguíneas (WI.TTEKIND, ^' 1979) . ..

Tais corantes contém entre seus componentes essenciais, uma mistura na qual um componente básico, de caráter catiônico còmo o, azur-B, confere a cor azul ou azul-violácea aos ácidos nucléicos, DNA e RNA. Isso ocorre porque eles fixam aos grupos fosfatos encontrados nos ácidos, às nucleoproteínas, aos grânulos dos basófilos e em menor proporção aos grânulos dos eosinófilos. Um corante ácido, de caráter aniônico, também presente na mistura, confere cor alaranjada à hemoglobina, aos grânulos eosinófilos e também ajuda na coloração do núcleo, pois se combina ainda com as proteínas nucleares. A eosina é um corante que atende esta solicitação e é normalmente combinada com o azur-B (WITTEKIND, '1979) ou azul de metileno, produzindo um dos corantes satisfatórios, derivados de Romanowsky . (MARSHALL et al, 1975) . As colorações produzidas com estas misturas são dependentes do pH, incluindo o da água de lavagem das lâminas. Eles também necessitam de filtração antes do uso, caso contrário formam depósitos particulados sobre as distensões, o que pode levar a' erros de leitura, como a visualização de corpúsculos nos eritrócitos. Estas combinações de corantes usam como solvente e diluente o metanol, tornando-as inadequadas para a coloração das células sanguíneas, em meio liquido, pois coagulam o sangue e não permitem a visualização das ¹ células coradas.

Os dois principais corantes das soluções que compõem os derivados de_ Romanowisk são o Azul de metileno e a Eosina Y, cujas caracterizações são apresentadas. Segundo Poggere et al. (2011) o azul de metileno, cuja estrutura química é apresentada abaixo, é um corante básico que pertence à classe das fenotiazinas . Apresenta as seguintes características:' é orgânico, aromático, heterocíclico, solúvel em água ou álcool (LIMA. et ai., 2007). Corantes básicos são solúveis em água e produzem cátions coloridos em solução. Assim, geralmente são referidos como corantes catiônicos (POGGÈRE et ai, 2011). Apresenta absorção máxima em 661 nm em solução aquosa e em 656 nm quando em solução de metanol (H0R0BIN> 2008) .

A Eosina Y ,é um corante aniônico ácido hidroxixanteno que apresenta absorção máxima em 516 nm em solução aquosa alcalina ou neutra (HOROBIN, 2008) . Em solução alcoólica absorve em 524 nm. Sua estrutura química está apresentada na figura abaixo. Ela é amplamente usada para corar o citoplasma e as estruturas citoplasmáticas como os grânulos eosinofílicos .

Estrutura química do corante Eosina Y

Outra classe; de corantes conhecidos, que são utilizados principalmente para coloração de cortes histológicos, mas que também cora as células do sangue, são os que possuem seletividade para os ácidos desoxirribonucleico (DNA) e ribonucleico (RNA) , como por exemplo, o Verde de Metil (VM) e a Pironina (P)

O VM possui um forte caráter catiônico, que o leva a ser atraído eletrostaticamente pelos grupos fosfatos, que estão localizados na parte externa da cadeia do DNA. Isso resulta em núcleos de leucócitos corados em azul-esverdeado . A Pironina é levemente catiônica, o que lhe confere maior afinidade com estruturas planas e menos polimerizadas, tendo alta afinidade com moléculas de ácido ribonucleico. Assim, ela cora os nucléolos e as áreas contendo RNA em tons rosados (pink) (PERRY et al, 1956; KIERNAN, 1999/ HOROBIN, 2008) .

Outro corante que pode integrar este grupo é a fluoresceína que cora os grânulos citoplasmáticos e outras estruturas que possuem conteúdo em proteínas básicas, por conta do seu caráter aniônico. Desta forma, grânulos eosinofílicos assumem uma coloração amarelo alaranjado. Esse agrupamento de corantes produz três grupos de cores, cuja combinação permite a diferenciação dos leucócitos em distensões sanguíneas.

Os três corantes descritos acima apresentam características desejáveis para a diferenciação dos leucócitos em exames manuais, pois fornece outra via de reconhecimento, que vai além da análise morfológica, que é a principal característica para se fazer a diferenciação, nas colorações com derivados de Romanowsky. As únicas descrições destes corantes, em distensão sanguínea, foi apresentada por Ornsteien et al. (1974), TYCKO et al., 1976. De acordo com Tycho et al. esta coloração tem potencial para diferenciar os leucócitos por processamento de imagens. No entanto, ela não prosperou porque o tempo de atuaçâo em distensão sanguínea é longo (maior que 30 minutos) e a coloração resultante é menos contrastante do que aquelas obtidas com os derivados >de Romanowsky para análise visual. Nesses trabalhos não foram apresentados nenhum detalhe de como estes corantes são preparados e nem como eles atuam.

Um trabalho publicado em 2014, por Nascimento, Moraes e Oliveira (2014) retoma esta combinação de corantes, agora em meio liquido e numa concentração cerca de 10 vezes superior à dos corantes comerciais, novamente para propor um método de processamento de imagens para diferenciação dos leucócitos. A coloração resolveu o problema do tempo de ação dos corantes, que passou a ocorrer em menos de um minuto. Mas, apesar de ter potencial para utilização em processamento de imagens, como já havia sido documentado por Tycho et al . (1976), o corante não resolve o problema da formação de aglutinados de partículas, pois tem componentes alcoólicos em excesso na formulação. Além disso., o corante não apresenta equilíbrio osmótico adequado, o que resulta em rompimento das células após alguns minutos na solução. Por isso tanto o corante, quanto o ; método foram considerados inadequados para a contagem e a classificação dos leucócitos em exames com valor diagnóstico.

Realizando novas investigações com este grupo de corantes foi possível chegar à invenção de uma nova formulação e forma de preparação desses corantes, que não produz os aglutinados de partículas (grumos) , mas, ao contrário, produz' uma solução límpida, possibilitando a visualização ^! apenas dos leucócitos corados diferenciadamente.; As imagens dos leucócitos obtidas com esta solução de corantes são isentas de grumos, de outras células como as ;hemácias e de restos celulares, o que torna viável a coloração diferencial em meio liquido.

Além disso;, foi possível estabelecer o equilíbrio osmótico de modo què as células permanecem viáveis para classificação e contagem por mais de 30 minutos. Os resultados obtidos demonstram que o corante e o método são adequados à prática de diagnósticos. Essa nova formulação dispensa a preparação da distensão sanguínea e permite a contagem global e diferencial simultaneamente dos leucócitos em equipamentos ápropriados, como a câmara de Neubauer.

Métodos de contagem de células

Os métodos de contagem se modernizaram nas últimas décadas, com a sofisticação tecnológica laboratorial. Exames como eritrograma, leucograma e plaquetograma foram substituídos pelo hemograma completo automatizado, em que é apresentada a contagem diferencial dos leucócitos nos cinco tipos, dentre outras inúmeras■ informações. Os métodos incorporados aos equipamentos de contagens automatizadas realizam a contagem diferencial em menos de um minuto (ROSENFELD, 2012) . Por outro lado o método manual de contagem global e diferencial dos leucócitos se manteve estagnado e não apresenta qualquer evolução a mais de 30 anos. Tentativas, para realizar a contagem diferencial automatizada utilizando o método clássico em lâminas ou Câmara de Neubauer foram realizadas sem sucesso pratico. (Tycho et al . 1976, Referências de processamento de imagens Adollah et al. (2008), Mahajan et al. (2014), Oliveira (2007) Oliveira et al. 2014), pois ^* estes métodos permitem as leituras dos leucócitos corados em distensão ou fazem a coloração inadequada no meio liquido. As leituras em distensão são muito trabalhosas e representam custo elevado 00191

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para os laboratórios de análises clínicas e até o momento não há alternativas a este método,- uma vez que as leituras automatizadas não cobrem todos os resultados possíveis de serem obtidos nos exames.

Portanto, atualmente há somente dois métodos disponíveis para realizar a contagem global e diferencial dos leucócitos -em fluidos corporais: o manual, que é realizado a partir da distensão da amostra do fluido e o automatizado que utiliza citometria de fluxo. Ambos necessitam de pelos menos duas etapas: a coleta, que é feita por um profissional junto ao paciente e a preparação e leitura do sangue, que são feitas por outro profissional no laboratório de análises clínicas. Mesmo num centro de saúde, que seja dotado de amplos recursos financeiros e equipamentos automáticos modernos o tempo entre a coleta e a obtenção dos resultados raramente se dá com menos de 60 minutos, sendo que na situação típica, quando o paciente recebe o pedido médico e se dirige ao laboratório, o resultado é obtido no período de 48 horas a 72 horas após a coleta do sangue.

Além disso, quando o exame é realizado em equipamentos automáticos e os resultados apontam desvios dos valores normais torna-se necessário preparar nova amostra de sangue para realizar a leitura manual. Os equipamentos automatizados não, permitem verificação dos resultados com a amostra de sangue que foi utilizada, pois ela é descarta após as contagens, ou seja, não preservam nem as células nem suas imagens para! avaliação futura. Isso exige a repetição da leitura pela técnica manual por um especialista. E, quando isso ocorre, vale lembrar que as leituras manuais são trabalhosas, lentas e requer pessoal treinado e experiente, o que acaba elevando os custos e retardando os resultados (BAIN, 2007) . No estado atual da técnica a contagem manual em valores absolutos é feita em câmara de Neubauer, corando os leucócitos de forma indiferenciada em meio liquido com liquido de Turk ou derivados. A contagem diferencial percentual é feita em distensão sanguínea, único método confiável e aceito pelos profissionais de saúde e órgãos reguladores. Tentativas de coloração diferencial em meio liquido resultam na aglutinação de partículas (Fig. 1) que, apesar de realizar a coloração, impede a contagem correta das células, pois não há meios para se determinar as células que estão nos aglutinados do liquido. Além disso, essas colorações exigem longo tempo de exposição ao corante para se efetivarem.

ABORDAGEM DÁ SOLUÇÃO PARA O PROBLEMA

Em vista dó acima exposto, é evidente que obter o hemograma com maior agilidade durante as consultas de rotina ou em atendimentos de urgências ou emergências é uma barreira tecnológica de longa data e, até o desenvolvimento da presente invenção, sem perspectiva de aperfeiçoamento significativo, apesar de ser essencial para avaliar o estado de saúde do paciente (GROTTO, 2009) .

Com descrito anteriormente, as técnicas manuais de coloração e contagem diferencial dos leucócitos não apresentam evolução á décadas, apesar de serem largamente utilizadas. Nenhum método de coloração dos leucócitos, que seja utilizado nas técnicas manuais, realiza a coloração diferencial em meio liquido de forma que se obtenham resultados com valor diagnóstico. Todos os tipos e combinações de corantes só realizam colorações viáveis em distensões fixadas em lâmina. Além disso, tanto as técnicas quanto os corantes utilizados até o momento mantém as hemácias integras nas lâminas, o que dificulta a contagem dos leucócitos, especialmente em métodos de processamento de imagens . < !. · .

É desejável; o desenvolvimento de um terceiro método que reúna a agilidade e o baixo custo da leitura automatizada com a possibilidade de avaliação dos resultados, pelo biomédico, >visualizando as imagens das células, quando necessário. ;

Atendendo a tal necessidade técnica, a presente invenção fornece, em uma modalidade, uma composição de corantes capaz ' de corar células em meio liquido, particularmente leucócitos, de forma diferenciada entre os respectivos = tipos, sem formar aglutinados de partículas e simultaneamente jjrealizar a lise das hemácias. Esta nova forma de coloração proporciona que esta invenção também contemple um novo método de contagem dos leucócitos em meio liquido, que dispensa a preparação da distensão sanguínea, realizando o procedimento de contagem global e diferencial das células simultaneamente em câmara de Neubauer ou num dispositivo similar.

Para atender a esses desejos é necessário suprimir a preparação da distensão sanguínea e realizar a preparação e a contagem < total e diferencial dos leucócitos em meio liquido, como é feito nos citômetros automatizados, mas com as mesmas características das imagens obtidas numa distensão corada. Então, o que se pretende com este invento é a realização da contagem global e diferencial dos leucócitos em uma etapa, fazendo a preparação do sangue e a coloração diferencial das células em meio líquido, para que sejam contadas diretamente ao microscópio e fotografadas para verificação ou avaliação futura dos resultados, sem a necessidade de repetições das leituras. Para isso foi desenvolvida uma composição corante que penetra e cora diferenciadamente os leucócitos.

A composição aqui revelada compreende os corantes Verde de Metila (VM) , Pironina (P) e Fluoresceina (F) que são associados com um agente lisante, formando um complexo corante/agente lisante que atua em uma etapa em meio liquido

A composição corante da presente invenção permite a diferenciação dos leucócitos sem a necessidade de realizar análise morfológica das células, o que representa um grande avanço para o reconhecimento por processamento de imagens, por isso as células podem ser classificadas em ampliações menores lOOOx, dispensando o uso de óleo de imersão, o que simplifica ainda mais o processo de contagem.

O método utiliza informações simples obtidas dos histogramas e uma lógica de classificação que também é simples, tornando possível obter uma classificação automatizada que é equivalente a um, citômetro de impedância

Atuação dos corantes

O Verde de Metila atua como um corante catiônico triarilmetano que apresenta absorção máxima em 635 nm e um pico subsidiário em 410 nm, quando diluído em água (HOROBIN, 2008) . Uma de suas estruturas químicas é apresentada na abaixo .

Estrutura química do corante VM

coloração das células. Os derivados de Romano sky resultam nas cores róseo-azuladas para quase todas as células (exceto o eosinófilo) , _^ implicando que a diferenciação entre elas fica por conta, principalmente da análise morfológica. Por outro lado os CSC resultam em -três grupos de cores, cuja combinação permite selecionar o tipo de célula (TYCHO et al . , 1976). 2) solubilidade em líquidos polares. Os derivados de Romanowsky são solubilizados em solventes apoiares, tipicamente em soluções alcoólicas. Enquanto os CSC são. solúveis; tanto em solventes polares quanto apoiares. Essa característica permite a coloração do sangue em meio líquido sem que ocorra a sua coagulação.

A demonstração de DNA pode ser realizada por diferentes técnicas como as que evidenciam a desoxirribose, ou pela técnica do VMP em que os grupamentos fosfatos se combinam com a base do corante VM, em pH ácido ou. ainda, pode ser exibido por métodos fluorescentes, utilizando corantes como laranja de acridina. Já a demonstração do RNA, pode ser realizada por intermédio da coloração com laranja de acridina, ou outras formas de que exigem processos complexos de extração. Assim, o método de escolha para a evidenciação tanto o DNA quanto o RNA é a técnica do VMP conforme descrito por Bancroft (2013) .

0 princípio da técnica é que ambos os corantes utilizados em combinação, são catiônicos e o VM liga-se preferencialmente e especificamente ao DNA, deixando a Pironina para se ligar a RNA. A reatividade específica do VM é atribuída ao alinhamento espacial de seus grupos NH ₂ com os radicais de fosfato na dupla hélice do DNA. A coloração

s

pela Pironina por outro lado, não mostra esta afinidade espacial, portanto, outros constituintes carregados negativamente coram-se de vermelho (pink) . Além deste fato, como estes corantes são solúveis em água ou solução aquosa de acetato, e também não coagulam o sangue quando utilizados em meio liquido, possuem características úteis quando se deseja realizar a coloração neste meio.

OBJETIVOS DA INVENÇÃO

Em uma' primeira modalidade, a presente invenção tem o objetivo de fornecer a composições aquosas compreendendo corantes de células ou sais e complexos dos mesmos. Tais composições podem compreender ainda um ou mais agente (s) lisante(s) de células e uma concentração alcoólica menor ou igual a 35% em volume.

Em uma segunda modalidade, a presente invenção se refere a um processo de preparação de uma composição compreendendo uma mistura de corantes e, opcionalmente, um ou mais agente(s) lisante(s).

Em uma terceira modalidade, a presente invenção tem o objetivo de fornecer um método de contagem de células oriundas de fluidos corporais coradas com a composição corante de células acima descrita.

Em uma quarta modalidade, a presente invenção apresenta um método de contagem celular compreendendo (i) obtenção de uma imagem das células suspensas na composição corante; (ii) contagem global de tipos celulares e contagem diferencial de subtipos celulares em uma única etapa, em que tais contagens podem ser feitas por métodos tradicionais, ao microscópio, ou por processamento da imagem obtida na etapa

(i). ^:

Em uma quinta modalidade, a presente invenção se referte ao uso das composições corantes para a preparação de uma amostra de células para análise celular. Portanto, as composições, os métodos e os usos da presente invenção consistem na evolução da técnica atual, método manual por meio da coleta de uma micro amostra de fluido corporal ₍ que é diluído numa solução de corantes e agente lisante (quando for o caso) , que permite a preparação e disponibilização das células para leitura em uma etapa. As contagens global e diferencial podem ser feitas automaticamente, [ por processamento de imagens, ou pelo profissional de saúde diretamente em microscópio. As imagens digitais das células podem ser arquivadas para possíveis avaliações futuras, sem a necessidade de nova coleta e realização do exame.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Conforme acima descrito, a presente invenção se refere, em um primeiro aspecto a composições corantes de células compreendendo uma mistura de corantes em meio aquoso.

Tal mistura _, tem a principal vantagem de possibilitar a preparação de uma amostra de células límpida, sem a presença de artefatos, fragmentos ou grumos de hemácias lisadas que possam prejudicar a contagem de células de interesse. Além disso, as compoàições da presente invenção coram tipos e subtipos celulares de maneira diferencial.

Opcionalmente, as composições da presente invenção compreendem os ^' corantes Verde de Metila, Pironina e Fluoresceína, ou ^* sais e complexos dos mesmos, em meio aquoso. Um indivíduo com conhecimento técnico no assunto sabe que existem vários subtipos de corantes e os três tipos citados acima podem, ser [ substituídos por corantes de propriedades físico-químicas equivalentes, por exemplo, os corantes do grupo químico dos Triarilmetanos (ou trifenilmetanos) , onde se encontra o verde de metila, e os corantes do grupo químico dos Xantenos onde estão as diferentes formas da Pironina, tais como as Pironinas G, Y, B que fazem parte do subgrupo Fluoreno . e as diferentes formas da Fluoresceína, tais como a Fluoresceína ácida, Fluoresceína sódica, Diacetato de Fluoresceína que fazer parte subgrupo Fluorona.

As composições da presente invenção podem opcionalmente compreender um agente lisante celular sélecionado dentre agentes quaternários capazes de romper as membranas das hemácias e cianeto, de sódio ou de potássio.

Portanto, as composições da presente invenção compreendem de 0,3 mM a 8 mM de Verde de Metila ou corante equivalente, preferivelmente de 4,0 mM a 7,0 mM, 0,5 mM a 7 mM, de 5 mM a 8, 0 mM ou de !, 0 mM a 6 mM, ou, por exemplo, de 2,0 mM a 5 mM, ^' opcionalmente de 3,0 mM a 4 mM.

A prionina pode estar presente em uma concentração de 0,3 mM a 8 mM, preferivelmente de 0,5 mM a 7 mM, ou de 1,0 M a 6 mM, ou> por exemplo, de de 2,0 mM a 5 mM, opcionalmente de 13,0 mM a 4 mM.

A concentração de fluoresceína pode variar dentro da faixa de 0,lmM a 3mM, opcionalmente de 0,3mM a 2,5mM ou, por exemplo, de 0,5 mM a 2mM: ou l,0mM a l,„5mM.

Por fim, a concentração do agente lisante celular, caso este esteja presente na composição pode variar de 25 g/L a 80 g/L associado a um Cianeto na proporção de 2 g/L a 9g/L, ambos previamente^ diluídos em meio aquoso

As composições da presente invenção tem a particularidade de que os corantes, por exemplo, Verde de Metila, Pironina, e Fluoresceína e, opcionalmente, um agente lisante, formam um complexo em meio aquoso, com concentração alcoólica menor ou igual a 35%. Em uma segunda modalidade, á presente invenção revela o processo de obtenção das composições corantes. Tal processo envolve três etapas básicas, quais sejam:

- Preparar uma solução de Verde de Metila e Pironina, obtendo uma solução VMP;

- Adicionar Fluoresceina à solução VMP, obtendo uma solução denominada VMPF; e

- Opcionalmente, adicionar um agente lisante, obtendo uma solução VMP (H) .

Mais especificamente, Verde de Metila e Pironina são misturados em concentrações entre 0,3 mM e 8 mM cada, preferivelmente de 0,5 mM a 7 mM, ou de 1,0 mM a 6 mM, ou, por exemplo, de de 2,0 mM a 5 mM, opcionalmente de 3, 0 mM a 4 mM tendo a solução VMP um pH de 3, 8 a 5, 5.

Preferencialmente, a Fluoresceina é adicionada em uma proporção entre , uma parte de VMP para duas partes de Fluoresceina na concentração de 0, ImM a 3 mM, opcionalmente de 0,3mM a 2,5itiM'ou, por exemplo, de 0,5 mM a 2mM ou l,0mM a l,5mM, e duas partes e meia de VMP para uma parte de Fluoresceina, obtendo-se assim a solução VMPF com pH entre 4,8 e 6,4.

Opcionalmente, o agente lisante pode ser adicionado à composição da presente invenção em uma proporção entre uma parte de agente . lisante (na proporção de 25 g/L a 80 g/L associado a um Cianeto na proporção de 2 g/L a 9g/L, ambos previamente diluídos em meio aquoso INFORMAR FAIXAS DE CONCENTRAÇÃO) para duas partes da solução VMPF até duas partes de lisante para uma parte de solução VMPF, em que a solução corante final de VMPF(H) dever permanecer com pH entre 5, 5 e 6, 6. Conforme brevemente descrito acima, a presente invenção se refere ainda a um método de preparação de amostra de células caracterizado por compreender lise celular e coloração diferencial de tipos celulares em meio aquoso em etapa única. Tal método compreende a etapa de misturar uma amostra de células com uma composição corante e lisante, conforme descrita acima.

Preferencialmente, uma amostra de células é misturada com uma composição corante e lisante na proporção de uma parte de fluido corporal para 5 a 200 partes da composição corante, conforme o tipo de fluido corporal a ser analisado. Opcionalmente uma parte de fluido corporal para 10 a 150 partes da composição corante, ou uma parte de fluido corporal para 20 a 130 partes da composição corante, uma parte de fluido corporal para 40 a 100 partes da composição corante ou, por exemplo, uma parte de fluido corporal para 60 a 90 partes da composição corante.

Em uma quarta modalidade, a presente invenção se refere a um método de contagem de células compreendendo as etapas de misturar uma amostra de células com uma composição corante e lisante, colocar a mistura de amostra de células com a composição corante e lisante em um equipamento para contagem de células e, finalmente, realizar a contagem do valor total das unidades de células, identificação determinação das proporções de cada subtipo celular na amostra de fluido corporal em uma única etapa.

Particularmente, o método de contagem celular da presente invenção é caracterizado pelo fato de compreender (i) obtenção de uma imagem das células suspensas na composição corante; (ii) contagem global de tipos celulares e contagem diferencial de subtipos celulares em uma única etapa.

Mais particularmente, a contagem do método de contagem celular da presente invenção é feita por processamento de imagens, ou por um individuo através de um microscópio, sendo assim tal método pode ainda compreender a etapa de registrar imagens das células coradas e lisadas e arquivar tais imagens para avaliações futuras da amostra.

Em modalidades preferenciais da invenção, as amostras celulares utilizadas em qualquer um dos métodos da invenção consistem em ou são obtidas de um fluido corporal de um animal e podem compreender hemácias, leucócitos e trombócitos, em que há subtipos celulares selecionados de neutrófilos, basófilos, eosinófilos, linfócitos (Tipos B e T) e monócitos. ^;

Em uma última modalidade, a presente invenção se refere ao uso de uma composição conforme definida acima para a preparação de uma amostra de células para análise celular.

De acordo com esses conceitos, foram desenvolvidas diversas composições obtidas por diferentes processos e resultando em satisfatórios métodos de preparação de amostra e contagem de células. Alguns exemplos de composições e métodos que se enquadram no escopo da presente invenção são fornecidos no presente relatório descritivo, sem, entretanto, ter o intuito de limitar o escopo de proteção, uma vez que a presente invenção e seus conceitos permitem o desenho de composições compreendendo diferes combinações de corantes e lisantes celulares.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1 - Aglutinação de partículas do sangue corado por corantes preparados em meio alcoólico. Figura 2 - formação de grumos de sangue diluído e corado com Leishman em meio alcoólico.

Figura 3 - Espectros de absorbância dos componentes individuais da solução corante proposta e da solução final.

Figura 4 - Espectros de absorbância da solução final de VMPF(H) lidos em 19/09/2104 e 06/03/2015.

Figura 5 - Eosinófilos em distensão sanguínea corado com VMPF. (a) com ampliação de 400X; (b) com ampliação de 1000X

Figura 6 - Basófilo em distensão sanguínea corado com

VMPF

Figura 7 - Amostras de neutrófilos, corados em meio liquido. Imagens realizadas com ampliação de lOOOx

Figura 8 - . Amostras de linfócitos, corados em meio liquido. Imagens realizadas com ampliação de lOOOx

Figura 9 - Amostras de monócitos, corados em meio liquido. Imagens realizadas com ampliação de lOOOx

Figura 10 - Amostras de eosinófilos, corados em meio liquido. Imagens realizadas com ampliação de lOOOx

Figura 11 - Amostra de basófilo, corado em meio liquido. Imagem realizada com ampliação de lOOOx

Figura 12 - Análise de Blend-Altman comparando as contagens globais realizadas por equipamento automático no LAC e manual com VMPF(H)

Figura 13 — Análise de Blend-Altman comparando as contagens globais em câmara de Neubauer com liquido de Turk e com VMPF(H)

Figura 14 - Análise de Blend-Altman comparando as contagens diferenciais de Neutrófilo realizadas por equipamento automático no LAC e manual com VMPF{H) . Figura 15 - Análise de Blend-Altman comparando as contagens diferenciais de Neutrófilos em meio liquido corado com VMPF(H) e em* distensão sanguínea corada com Leis man.

Figura 16 - Análise de Blend-Altman comparando as contagens diferenciais de Linfócito realizadas por equipamento automático no LAC e manual com VMPF(H) .

Figura 17 Análise de Blend-Altman comparando as contagens diferenciais de Linfócitos em meio liquido corada com VMPF(H) e em distensão sanguínea corada com Leishman.

Figura 18 - Análise de Blend-Altman comparando as contagens diferenciais de Monócitos realizadas por equipamento automático no LAC e manual com VMPF(H) .

Figura 19 - Análise de Blend-Altman comparando as contagens diferenciais de Monócitos em meio liquido corado com VMPF(H) e em distensão sanguínea corada com Leishman.

Figura 20 - Histogramas RGB obtidos a partir de imagens de neutrófilos.

Figura 21 - Histogramas RGB obtidos a partir de imagens de linfócitos.

Figura 22 - Histogramas RGB obtidos a partir de imagens de monócitos.

Figura 23 - Histogramas RGB obtidos a partir de imagens de eosinófilos.

Figura 24 - Histograma RGB obtido a partir de imagem de basófilo .

EXEMPLOS

Estes Exemplos são apresentados a titulo meramente ilustrativo e não devem ser de forma alguma considerados como limitativos do âmbito e do alcance da presente invenção.

Exemplo 1. Preparação da composição corante Para se obter a coloração viável em meio liquido, a preparação da solução de corantes e do agente lisante é dividida em cinco etapas. O objetivo de fazer a divisão do preparo em etapas é conseguir uma solução corante equilibrada que atenda a três requisitos para obtenção da coloração diferencial aceitável para diagnóstico: 1) não produzir coagulação ou aglutinação de partículas; 2) mantenha a integridade dos leucócitos por tempo suficiente para a realização das caracterizações e contagens; 3) que, no caso da coloração dos leucócitos a partir de sangue total, permita a hemólise sem a presença de restos celulares importantes, que possam atrapalhar o reconhecimento e a contagem dos leucócitos. Em seguida aplica-se o protocolo de coloração diferencial em meio liquido:

Etapa 1: Preparação e purificação do VM:

Na primeira etapa prepara-se uma solução tampão em meio aquoso parcialmente isotônico. que tenha poder tamponante na faixa de pH que não seja inferior a 3,5 e não superior a 5,5 para que se obtenha a atuação do corante verde de metila. A solução tampão deve ser ajustada para cada tipo fluído corporal de modo que os requisitos de coloração e contagem sejam satisfeitos. Então o verde de metil é preparado na solução tampão aquosa parcialmente isotônica numa concentração não menor que 0,3 mM e não maior que 8,0mM, conforme o tipo de coloração desejada e o tipo de fluido corporal em que será aplicado. Dependendo da origem e formulação do verde de metila é necessário fazer sua purificação. Quando necessária a purificação deve retirado o contaminante de cristal violeta, que é comum nas formulações do verde de metila, comercializado em pó. 0 protocolo de purificação pode variar de acordo com a qualidade do produto que é fornecido por cada fabricante.

Para realizar a purificação do verde de metila efetuam- se lavagens sucessivas da solução em clorofórmio. A lavagem é realizada pela adição de clorofórmio na solução de verde de metila. Por agitação os cristais violetas se dissolvem no clorofórmio. Deixando a solução em repouso, o clorofórmio com os cristais violetas se separam em fases que são separadas em funil de separação. Ao final deve-se obter uma solução purificada com pH não inferior a 3,8 e não superior a 5, 5.

Etapa 2 : Adição da Pironina

Na segunda etapa realiza-se a adição do corante Pironina na solução de VM já purificada em concentração não menor que 0,3mM e não maior que 7,0mM. Após homogeneização, a solução deve ser filtrada para obter uma solução (VMP) com pH não inferior a 3,8 e não superior a 5,5.

Etapa 3: Preparação da Fluoresceína

Na terceira etapa faz-se a preparação da Fluoresceína, em meio alcoólico a quente, em concentração não menor que 0,lmM e não maior que 3,0mM, . Após filtração é obtida uma solução com pH não inferior a 9 e não superior a 10.

Etapa 4: Preparação da solução VMPF com adição de Fluoresceína

Na quarta etapa é obtida a solução de VMPF, pela mistura da solução de VMP com a solução de fluoresceína na proporção não menor que uma parte de VMP para duas partes de fluoresceína e não maior que duas partes e meia de VMP para uma parte de fluoresceína, obtendo-se assim a solução VMPF com pH não inferior a 4,8 e não superior a 6,4. A mistura da solução de VMP com a solução de fluoresceína deve ser equilibrada de modo a se evitar, de forma segura, a coagulação ou á formação de aglutinados de partículas no meio. O equilíbrio da solução deve ser otimizado para fluido corporal em que será utilizada. Esta solução é utilizada para coloração das células em distensão sanguínea ou em meio liquido, porém sem a hemólise. Nesta etapa a solução corante já apresenta viabilidade de uso, pois é possível corar os leucócitos presentes na maioria dos fluidos corporais que não possuem quantidades demasiadas de hemácias, como a urina, o liquor (líquido céfalo-raquidiano) , os líquidos cavitários, como o ascítico, o pleural, o peritoneal e o sinovial; os fluidos alimenticeos, como o leite.

Etapa 5: Preparação da solução final VMPF(H) com adição do agente lisante

A adição do agente lisante é uma alternativa para a coloração do leucócitos em sangue total. O agente lisante pode ser composto amónio quaternário na proporção de 25 g/L a 80 g/L associado a um Cianeto na proporção de 2 g/L a 9g/L, ambos previamente diluídos em meio aquoso. Esta solução é incorporada à solução VMPF, produzindo a solução VMPF(H). A proporção entre VMPF e o agente lisante pode ser realizada na faixa de uma parte de agente lisante para duas partes da solução corante até a proporção duas partes de agente lisante para uma parte de solução corante. A proporção deve garantir a hemólise sem danos aos leucócitos e permitindo sua coloração. A solução corante final de VMPF(H) dever permanecer com pH não inferior 5,5 e não superior 6,6.

Exemplo 2: Método de preparação e leitura das células. Conforme preconiza a técnica usual de leitura das quantidades de leucócitos em meio liquido dilui-se uma amostra de sangue total na solução corante na proporção de uma parte de sangue para 20 partes da solução corante. Colocando esta solução em câmara de Neubauer realiza-se a contagem das células são coradas diferenciadamente. Assim, a contagem ocorre tanto para o valor global (total de leucócitos por milímetro cúbico de sangue) quanto para as proporções de cada tipo celular.

O protocolo' completo pode ser realizado em menos de dois minutos, coletando-se um volume preciso de sangue por punção digital e apresenta os mesmos resultados que as contagens realizadas em contador automatizado e pela metodologia manual, que demanda até 60 minutos até se obter o resultado de cada exame.

A mesma solução corante, sem a adição do agente lisante, (VMPF) também realiza a coloração da distensão sanguínea em uma etapa, porém com tempo de ação no intervalo de 15 a 30 minutos. O tempo de ação depende das condições de pH, temperatura e técnica de fixação que foram utilizadas.

Exemplo 3. Caracterização e avaliação da estabilidade das soluções corantes

As soluções corantes que deram origem ao invento, que é a solução final ^: denominada VMPF(H) foram avaliadas em espectrofotômetro . em duas datas. A primeira avaliação ocorreu no dia 'seguinte à sua preparação inicial em 19/09/2014. A mesma solução foi avaliada novamente nas mesmas condições em 06/03/2015.

A verificação da estabilidade química das soluções de corantes foi realizada em duas etapas por espectrofotometria de absorção. Na primeira todas as soluções individuais de corantes foram lidas no espectrofotômetro, para que fosse avaliada a composição individual de cada um componente. Também foram lidas as absorções das soluções corantes intermediárias e da solução final em duas versões VMPF (sem agente lisante) e VMPF(H) (com agente lisante) . Para saber se as soluções individuais reagem entre si e formam outras substâncias. Na segunda etapa foi avaliada a estabilidade química temporal, ou seja, se há degradação da solução corante final depois de longos períodos de tempo. No gráfico da figura 3 são apresentados valores relativos das absorções de cada solução, e de suas combinações, em função do comprimento de onda (entre 350nm e 750 nm) . Os valores relativos das absorções variam em função das diluições, que foram necessárias para que o espectrofotômetro operasse dentro da sua faixa de trabalho. Portanto, as absorções apresentadas não podem ser interpretadas como valores absolutos. Analisando as curvas de absorção apresentadas na figura 3 tem-se que o VM em solução tampão de acetato tem banda de absorção entre 590nm e 680 nm, com pico em 640nm. A Pironina na solução tampão absorve na banda de 480nm a 570nm, com pico em 505nm. A Fluoresceína em meio alcoólico absorve na faixa de 440nm a 520nm, com pico em 490nm. No entanto, cabe ressaltar que para obter este espectro tanto o VM quanto a Pironina foram diluídos em 25 vezes, enquanto a fluoresceína não necessitou de diluição. Quando se analisa a absorbância da combinação dos dois corantes catiônicos VM e P (VMP) , observa-se que há picos de absorção em 640 nm (correspondendo ao comprimento de onda do VM) e picos subsidiários em 550 e 505 nm (correspondendo ao comprimento de onda da P) . O mesmo acontece quando observamos a combinação dos corantes VM, P e F (VMPF) . Então, quando os dois corantes são associados a fluoresceína, esta não deve ficar evidente. A associação dos três corantes foi lida com a presença do agente lisante (linha vermelha mais espessa) e sem a presença do agente lisante (linha cinza, que está sob a linha vermelha) . Comparando as linhas vermelha e cinza nota-se que não há diferenças entre elas, o que indica que a presença do agente lisante não interfere na solução. Assim, foi verificado que a atividade de coloração de cada corante isoladamente foi mantida e que cada corante reage com a estrutura celular ou com as moléculas com a qual tem afinidade .

Além disso, a linha vermelha do VMPF(H) é a sobreposição das linhas de VM diluído 25x com Pironina (P) diluída 25x. E como esperado a linha da Fluoresceína (F) (não diluída) não pode ser observada na sobreposição do gráfico. Porém, nenhum outro pico aparece na linha de absorção do VMPF(H), indicando que nenhuma outra substância foi formada na associação. Os espectros de absorção individuais e os picos são similares aos obtidos por Tycho et al. (1976) e por Horobim (2008). A absorbância do agente lisante é desprezível nesse intervalo do espectro, conforme observado na figura 3 Ele não reage com os demais componentes da solução, portanto ele não aparece no espectro da solução final.

Os espectros de absorbância da primeira etapa foram obtidos em 19/09/2014. Para a segunda etapa foi realizada uma leitura no mesmo espectrofotômetro, nas mesmas condições de temperatura e: humidade relativa em 06/03/2015 da solução final. Os espectros comparando a solução final lida em 19/09/2014 com a mesma solução lida em 06/03/2015 estão apresentados na figura 4. Exemplo . Aplicação da solução corante e do método de preparação e contagem

Exemplos dos resultados de coloração são apresentados nas figuras 5 e 6, nas quais também é possível observar que uma grande vantagem dessa solução corante é a ausência de artefatos, de fragmentos ou grumos de hemácias lisadas, que possam prejudicar a contagem por desvio de atenção do profissional, ou no caso de processamento de imagens, simplificação na etapa de segmentação. Vale ressaltar que em meio líquido, a coloração não excedeu mais que um minuto, além do tempo inerente a confecção da lâmina ou da câmara, totalizando dois minutos.

Exemplo 5. Avaliação de células e das estruturas celulares nas imagens obtidas em distensões sanguíneas coradas com VMPF

OBS: Imagens e descrições de todas as outras células serão acrescentadas neste tópico. ??

Eosinófilos

Os Eosinófilos foram corados com a solução corante VMPF, conforme observado na figura 5 (a) e (b) . As lâminas contendo as distensões sanguíneas foram previamente fixadas em metanol, o que facilita a entrada do corante Fluoresceína nas células e a coloração dos grânulos característicos deste tipo celular.

Como relato por Stankiewicz et al. (1996) os métodos disponíveis não permitem a visualização dos grânulos eosinofílicos em células viáveis. Na maioria das técnicas, os eosinófilos são corados depois de serem fixados e tratados por fixadores que podem mudar a aparência e a função celular. Assim, a capacidade de observação de eosinófilos viáveis com seus grânulos corados pode oferecer importantes informações sobre as atividades dessas células. 0 completo reconhecimento dos eosinófilos depende da boa coloração pela Fluoresceina.

Basófilos

Quando os basófilos são encontrados em distensão corada com VMP conforme visualizado na figura 6, os grânulos coram- se em pink, devido ao seu conteúdo em histamina e principalmente em função da presença de heparina, um heteropolissacarideo do tipo glicosaminoglicano (Andréo Filho, 2009) , pois eles possuem afinidade com a Pironina (TYCHO et al, 1976) .

Este deve ser um comportamento morfológico e de coloração esperado também em meio liquido, pois o componente Pironina da solução corante VMPF mostrou que penetra satisfatoriamente na célula demonstrando, por exemplo, o conteúdo de RNA nos linfócitos corados em meio liquido. Assim, espera-se que ela marque o conteúdo de heparina dos basófilos, por sua afinidade. Entretanto, este detalhamento deverá ser investigado em pesquisas futuras, com técnicas de separação e concentração celular, em função de seu baixo número nas condições de normalidade do paciente (0 a 1 %) (ANEXO B)

Exemplo 6. Avaliação das células e das estruturas celulares nas imagens obtidas em meio liquido

Para exemplificar os resultados obtidos com este invento os leucócitos do sangue periférico foram identificados, classificados e contados em cinco tipos morfológicos: neutrófilos, linfócitos, monócitos, eosinófilos e basófilos.

A observação e a descrição das células a seguir correspondem ao que foi encontrado nas leituras realizadas em meio líquido, entre lâmina e lamínula, coradas com VMPF(H) utilizando-se do aumento de 1000X.

As células ¹ foram visualizadas em seu tamanho e forma esférica característica, não apresentando ruptura das membranas celulares . As imagens apresentadas nas figuras 7 até 11 tiveram seus tamanhos relativos preservados, ou seja, considerando que todas as imagens tiveram a mesma ampliação (1000X) , as áreas recortadas ao redor da célula foi sempre a mesma (500x500 pixels) . Portanto, a área da célula é proporcional ao tamanho da janela de corte.

Neutrófilos

Nesta célula, o citoplasma _: se mostrou claro, límpido sem granulações. O núcleo apareceu em sua forma característica de segmentação. Neste trabalho, tanto os bastonetes quanto as células polimorfonucleares foram classificadas sob a denominação de neutrófilos. Núcleos com de 2 a 4 segmentações puderam ser observados, conforme se pode observár nos exemplos apresentados na figura 7. Devido a afinidade do componente VM com o DNA, os segmentos nucleares se coraram em verde-azulado .

Linfócitos

Nesta célula pode-se observar a característica de alta relação núcleo citoplasma, com evidente observação nuclear corada em azul intenso como visto na figura 8. Durante as contagens foi possível observar nítidos nucléolos em algumas células, conforme visto na figura 8 (d) . Os nucléolos apresentaram uma coloração mais avermelhada que se destacou no núcleo, a qual se pode relacionar com a afinidade da Pironina pelo RNA, presente em tal estrutura. Em lâminas de distensões sanguíneas coradas com Giemsa, este achado não é comum (BEUTLER, 2001) . Faixas citoplasmáticas coradas com diferentes intensidades de rosa (pink) confirmaram a afinidade do componente Pironina da solução VMPF{H) pelo RNA, caracterizando diferenças na atividade celular. Não foram observadas granulações citoplasmáticas importantes.

Monócitos

Estas células se mostraram com uma grande variedade de formas nucleares e citoplasmáticas como observamos na figura 9. Geralmente, apareceram como células grandes, confirmando a descrição como em RAWAT et al. (2015). Os núcleos foram visualizados com diversas formas, que variaram desde arredondadas, reniformes, ovais, lobuladas e ainda dobrados. Nucléolos não foram evidenciados. O citoplasma por vezes apareceu vacuolizado e com uma fina granulação corada em avermelhado (pink) , pela afinidade com a Pironina, pois representa seu conteúdo em RNA. Esta coloração tende a ser menos intensa que nos linfócitos reativos o que pode auxiliar na diferenciação visual entre monócitos e estes linfócitos (BEUTLER, 2001) .

Eosinófilos

A identificação destas células levou em consideração algumas de suas características normalmente relatadas, como o tamanho celular, ^■ considerado médio entre os granulócitos : neutrófilos e basófilos, a baixa relação núcleo citoplasma, a localização do núcleo, geralmente excêntrica, com segmentação bilobulada na maioria das vezes e ausência de nucléolos visíveis, conformé observado na figura 10.

Basófilos

Em função do baixo número deste leucócito, que ocorre em condições de normalidade a descrição das características morfológicas e de coloração deste tipo celular, corado com VMPF{H) em meio 'líquido ainda é insuficiente {OBS: Novas leituras estão sendo realizadas para se ampliar a segurança da descrição) . As características similares às da literatura clássica, foi encontrada e a imagem relatada na figura 11. Em função da presença de grânulos citoplasmáticos ricos em heparina que o basófilo possui e da sua afinidade que o componente Pironina da solução tem por este glicosaminoglicano a célula retratada é um basófilo.

Exemplo 7. : Avaliação da solução de corantes por meio da comparação entre as contagens de células com protocolos consagrados e com o novo corante.

Para avaliar a aplicabilidade da solução corante VMPF(H) como instrumento de evidenciação diferencial dos leucócitos, visando a contagem para hemograma é necessário determinar se as ^' contagens realizadas são compatíveis com as contagens realizadas pelas metodologias consagradas. Então, foi avaliada a contagem global e a contagem diferencial pela análise de variância ANOVA e pela análise de concordância Blend-Altman.

Contagem Global

Para cada amostra de sangue foram realizadas três contagens globais, uma pelo Laboratório de Análises clínicas (LAC) , a segunda feita pela autora em câmara de Neubauer com Liquido de Turk e a terceira feita pela autora utilizando VMPF(H) .

Os resultados dessas contagens são apresentados na tabela 1. Em seguida à tabela são apresentados os resultados obtidos pela análise de ANOVA. Nas figuras 12 e 13 são apresentadas as analises de Blend-Altman para VMPF(H) x LAC e VMPF(H) x Turk. Tanto por ANOVA quanto por Blend-Altman não foram encontradas diferenças estatísticas significantes entre as técnicas de contagem, revelando que elas são equivalentes.

Tabela 1 - Resultado da contagem global de leucócitos por três técnicas: Automática _/ realizada por um Laboratório de Análises Clinicas independente. Manual em câmara de Neubauer com Liquido de Turk. Manual em câmara de Neubauer com VMPF(H) . Valores expressos em /mm ³

Amostra LAC Turk VMPF(H) pacientei 7000 7750 7400

paciente2 5000 5075 4875

paciente3 7300 8150 8200

paciente4 7000 7825 6100

paciente5 6800 6725 6800

paciente6 6800 6588 6867

paciente7 5600 6750 6650

paciente8 5800 7300 7350

paciente9 6100 5825 4400

pacientelO 6800 6450 7650

Os resultados do teste A OVA foram: P = 0,63, com F critico maior que 3,35, sendo que o F obtido foi 0,46. O valor de P»0,05 e de F menor do que o F critico indicam que as contagens não apresentam diferenças estatísticas, ou seja, elas podem ser consideradas equivalentes.

Contagem Diferencial

Para cada amostra de sangue foram realizadas as contagens diferenciais dos leucócitos por três técnicas, uma automatizada pelo LAC, a segunda feita pela autora manualmente utilizando VMPF(H) e a terceira feita pela autora manualmente, em distensão sanguínea corada com Leishman.

Neutrófilos

Os resultados dessas contagens são apresentados na tabela 2. Em seguida à tabela são apresentados os resultados obtidos com o teste ANOVA. Nas figuras 14 e 15 são apresentadas as analises de Blend-Altman para LAC x VMPF(H) e Leishman x VMPF(H) . Tanto no teste ANOVA quanto na análise de Blend-Altman não foram encontradas diferenças estatísticas significantes entre as técnicas de contagem, revelando que elas são equivalentes.

Tabela 2- Resultado da contagem diferencial de Neutrófilos por três técnicas: Automática, realizada por um Laboratório de Análises Clinicas independente. Manual em distensão sanguínea corada com Leishman. Manual com VMPF(H) . Valores expressos em %

Amostra LAC VMPF(H) Leish.

pacientei 59, 7 58,0 62, 5

paciente2 53, 1 59, 0 50, 0

paciente3 49, 0 55, 0 49, 0

pacíente4 58, 5 55,5 52, 5

paciente5 49, 5 54, 5 46, 5

paciente6 49, 4 57,5 43, 5

paciente7 50, 4 47, 0 51, 5

paciente8 60, 9 65, 0 65, 5

paciente9 43, 8 51, 0 48, 5

pacientelO 58, 7 53, 5 59, 5

Os resultados do teste ANOVA foram: P = 0,71, com F critico maior que 2,6, sendo que o F obtido foi 0,50, 0 valor de P»0, 05 e de F menor do que o F critico indicam que as contagens não apresentam diferenças estatísticas, ou seja, elas podem ser consideradas equivalentes.

Linfócitos

Os resultados dessas contagens são apresentados na tabela 3. Em seguida à tabela são apresentados os resultados obtidos com o teste ANOVA. Nas figuras 16 e 17 são apresentadas as analises de Blend-Altman para LAC x VMPF(H) e Leishman x VMPF(H). Tanto por ANOVA quanto por Blend- Altman não foram encontradas diferenças estatísticas significantes entre as técnicas de contagem, revelando que elas são equivalentes.

Tabela 3 - Resultado da contagem diferencial de Linfócitos por três técnicas: Automática, realizada por um Laboratório de Análises Clinicas independente. Manual em distensão sanguínea corada com Leishman. Manual com VMPF(H). Valores expressos em %

Amostra LAC VMPF(H) Leish .

pacientei 29, 8 31, 5 28, 0

paciente2 31, 7 30, 5 35, 5

paciente3 37, 5 36, 0 35, 5

paciente4 31, 7 33, 5 31, 5

pacientes 35, 1 36, 5 35, 0

paciente6 40, 3 37, 5 41, 5

paciente7 34, 1 41, 0 34, 5

paciente8 29,2 27, 0 28, 0

paciente9 41,3 39, 0 36, 5

pacientelO 30,2 33, 0 29, 0

Os resultados do teste ANOVA foram: P = 0,87, com F critico maior que 2,6, sendo que o F obtido foi 0,14. O valor de P>>0, 05 e de F menor do que o F critico indicam que as contagens não ^* apresentam diferenças estatísticas, ou seja, elas podem ser consideradas equivalentes .

Monòcitos

Os resultados dessas contagens são apresentados na tabela 4. Em seguida à tabela são apresentados os resultados obtidos com o ;teste ANOVA. Nas figuras 18 e 19 são apresentadas as analises de Blend-Altman para LAC x VMPF(H) e Leishman x VMPF(H) . Tanto por ANOVA quanto por Blend- Altman não foram encontradas diferenças estatísticas significantes entre as técnicas de contagem, revelando que elas são equivalentes.

Tabela 4 - Resultado da contagem diferencial de Monòcitos por três técnicas: Automática, realizada por um Laboratório de Análises Clinicas independentes. Distensão sanguínea corada com Leishman. Manual corada com VMPF(H).

Amostra LAC VMPF(H) Leish.

pacientei 7,4 9,5 9,0

pacíente2 8, 6 9,0 8, 5

paciente3 8, 6 9,0 9,5

paciente4 5, 3 7,5 11, 0

paciente5 9,3 9,0 12, 0

pacienteô 6, 3 3,5 11, 0

paciente? 10,5 9,5 11, 5

paciente8 8,7 6, 0 5, 5

paciente9 10, 0 7,0 10, 0

pacientei0 9,5 13, 0 9,5

Os resultados^ do teste ANOVA foram: P = 0,23, com F critico maior q e' 2,45, sendo que o F obtido foi 1,5. O valor de P»0,05 e'de F menor do que o F critico indicam que as contagens não apresentam diferenças estatísticas, ou seja, elas podem ser consideradas equivalentes.

Conforme oepke (1977) apud England (1979) a contagem de monócitos mostra uma variabilidade elevada, devido em grande parte a uma variação esperada, mas principalmente, devido às diferenças entre as técnicas de contagens, pois linfócitos normais ou reativos podem ser identificados erroneamente como monócitos, tornando a contagem de monócitos consequentemente, uma medição insatisfatória.

Eosinòfilos

Os resultados dessas contagens de Eosinófilos são apresentados na tabela 5. No entanto, devido à baixa quantidade de células disponíveis não é possível realizar uma análise estatística apropriada. Então, os dados das contagens são apresentados mas, a caracterização das células se limitou à análise visual.

Os mesmos comentários se aplicam aos Basófilos, cujos resultados das contagens são apresentados na tabela 6.

Tabela 5 - Resultado da contagem diferencial de Eosinófilos por três técnicas: Automática, realizada por um Laboratório de Análises Clinicas independentes. Distensão sanguínea corada com Leishman. Manual com VMPF(H) . Valores expressos em %

Amostra LAC VMPF(H) Leish.

pacientei 2,7 0, 5 0, 5

paciente2 6, 0 1,5 6, 0

paciente3 4,4 0,0 5,5

paciente4 4,2 3, 5 4,5

pacientes 5,9 0, 0 6, 0

paciente6 3, 8 1,5 3, 0

paciente7 4,7 2, 5 2,5 paciente8 0,8 2,0 1,0

paciente9 4,5 3,0 5,0

pacientelO 1,2 0,5 2,0

Tabela 6 - Resultado da contagem diferencial de Basófilos por três técnicas: Automática, realizada por um Laboratório de Análises Clinicas independentes. Distensão sanguínea corada com Leishman. Manual com VMPF(H) . Valores expressos em %

Amostra LAC VMPF(H) Leish .

pacientei 0,4 0,5 0, 0

paciente2 0, 6 0, 0 0, 0

paciente3 0, 5 0, 0 0,5

paciente4 0, 3 0, 0 0, 5

pacientes 0,2 0, 0 0, 5

paciente6 0,2 0, 0 1,0

paciente7 0, 3 0, 0 0, 0

paciente8 0,4 0, 0 0, 0

paciente9 0,4 0, 0 0, 0

pacientelO 0, 4 0, 0 0, 0

Exemplo 8: Avaliação da efetividade do método de classificação e contagem de células por processamento de imagens .

Para avaliar a efetividade deste método de classificação automática de leucócitos foram processadas 226 imagens de células, contendo amostras dos cinco tipos celulares de leucócitos e 20 artefatos que não eram células.

Avaliando métricas de histograma, tais como: largura das bases de intensidades; posição relativa dos picos de frequência; ordem de ocorrência das primeiras e das últimas frequências válidas em Vermelho (do inglês Red) , Verde (do inglês Green) e Azul (do inglês BJue) (RGB), ou seja, maior que 0 (Zero) ; deslocamento do pico à direita ou à esquerda, é possível caracterizar os tipos celulares.

As mesmas imagens foram avaliadas por biomédicos experientes na classificação de leucócitos. Os resultados comparativos da classificação e contagem automática com a classificação e contagem realizada pelos biomédicos são apresentados na -tabela TT1, cuja correlação R ² , entre a classificação realizada pelos biomédicos e pelo software, é igual a 0,998, demonstrando que as contagens são equivalentes .

Tabela 7 - Comparação das contagens dos Leucócitos realizada pelo biomédico e pelo software de processamento de imagens. Correlação linear (R ² ) igual a 0,998.

Classificação Classificação do

do Biomédico Software

Neutrófilo 97 96

Linfócito 65 63

Monócito 35 38

Eosinófilos 8 7

Basófilos 2 2

NC 19 20

Total 226 226

A figura 20 representa a uniformidade de comportamento dos histogramas para neutrófilos, que é diferente da uniformidade dos histogramas obtidos a partir de imagens de linfócitos (figura 21), a partir de imagens de monócitos (figura 22), a partir de imagens de eosinófilos (figura 23} e de imagens de basófilos (figura 24) ,

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