Le virus de l'hépatite C (HCV) est l'agent responsable de la majeure partie des hépatites infectieuses de type non A non B. La séroprévalence des infections à VHC varie entre 0,3 et 1,5 % dans la population mondiale, pouvant atteindre jusqu'à 18 % dans certains pays en voie de développement. Des centaines de millions de personnes seraient ainsi infectées dans le monde. Neuf types et trente sous-types de VHC ont été décrits. Les sous-types peuvent tre associés à une distribution géographique définie, le type I b étant le plus répandu à travers le monde. L'évolution vers la forme chronique survient dans 50 % des cas, environ 5 ans après la primo-infection. L'Hépatite Chronique Persistante qui est asymptomatique mais qui présente un titre élevé de virus circulant, est d'abord observée, puis l'Hépatite Chronique Active s'installe. Vingt pour cent des hépatites chroniques progressent en cirrhose du foie en une dizaine d'années. L'hépatocarcinome peut se développer dans les foies cirrhotiques.

Le virus de l'hépatite C (HCV) est un virus à ARN simple-brin positif. Sur la base de ressemblances structurales, le HCV a été rapproché des familles des flavivirus et des pestivirus.

Lors d'un événement infectieux, le génome du HCV est d'abord traduit en une polyprotéine précurseur d'environ 3000 acides aminés. Cette polyprotéine subit ensuite des clivages post-traductionnels pour donner différents précurseurs et protéines virales matures. Les protéines structurales du HCV sont localisées dans la région N-terminale de la polyprotéine. Tel que montré dans la figure 1, il s'agit plus particulièrement de la protéine de capside ou core (C), des protéines d'enveloppe El et E2, qui sont présentes dans l'ordre suivant : NH2-C-EI-E2. Cette partie est clivée par les protéases de la cellule hôte.

La numérotation des acides aminés de la polyprotéine ainsi que de ses dérivés, qui est adoptée ci-après, est celle couramment utilisée et notamment présentée par Choo et al PNAS [vol. 88 : p. 2451 (1991)]. Ainsi, la protéine C correspond aux acides aminés en positions I à 191 de la polyprotéine et la protéine E 1, aux acides aminés en positions 192 à 380. Dans la suite du texte, on convient de numéroter les acides aminés de la séquence de

la protéine E1, de la position 192 à la position 380, 381, 382 ou 383. Dans la suite du texte, par souci de simplicité, on se réfère uniquement à la position C-terminale 380.

La protéine C issue du clivage direct de la polyprotéine comporte 191 acides aminés.

Cette protéine C, aussi dénommée C191, peut elle-mme tre tronquée vers son extrémité C-terminale par clivage enzymatique pour donner une protéine de 173 acides aminés, dénommée C 173. Dans la suite du texte, le terme"protéine ou polypeptide C"désignera de préférence la forme C 191.

La protéine C est un bon candidat vaccinal dans la mesure où c'est bien sûr une protéine de structure du virus et dans la mesure où la région codant pour cette protéine est relativement bien conservée par les différentes souches du HCV. On sait qu'une région de la protéine C capable de générer une forte réponse anticorps correspond aux 120 premiers acides aminés ; les 48 premiers acides aminés constituant le domaine antigénique majeur.

Cependant, un obstacle majeur à son utilisation en tant que vaccin réside en ce que cette protéine est capable de transactiver des gènes appartenant à la cellule hôte, en particulier des gènes tels que des oncogènes, ce qui pourrait avoir entre autre pour conséquence d'induire un événement de carcinogenèse.

En effet, on a en particulier montré que la forme C 173 était capable de translocation dans le noyau de la cellule-hôte et de transactivation. La région de la protéine C responsable de la translocation dans le noyau et de l'activité régulatrice semble tre localisée dans la partie N-terminale (123 premiers acides aminés).

Ainsi, la région de la protéine C qui présente un intért d'un point de vue vaccinal, est d'autre part responsable d'un effet toxique à l'égard de la cellule-hôte.

Afin de surmonter cette difficulté, une solution couramment envisagée dans le milieu scientifique serait d'utiliser une protéine C191 dont le site de clivage en position 173/174 aurait été rendu inopérant par mutation. Comme on le verra ci-après, une telle protéine se révèle malgré tout capable d'activité régulatrice, mme si c'est à un degré moindre.

De manière surprenante, on a maintenant mis en évidence qu'il était possible d'abolir l'activité régulatrice de la protéine C en la modifiant et en l'associant dans certaines conditions avec la protéine El. La présente invention fournit des moyens pour abolir l'activité régulatrice en empchant la migration de la protéine C dans le noyau. Cette

migation n'a plus lieu en présence de la protéine El qui possède entre autre la propriété de s'ancrer dans le cytoplasme, au niveau du réticulum endoplasmique, et qui de manière innattendue, à la capacité d'y retenir la protéine C lorsque certaines conditions sont réalisées. La migration peut tre abolie en réalisant par exemple une fusion des deux protéines, clivable ou non ; dans le cas ou elle est clivable, les produits générés doivent tre capables d'interagir entre eux pour qu'il n'y ait pas fuite de l'un d'entre eux dans le noyau ; le complexe formé par le produit de clivage étant capable de s'ancrer dans le cytoplasme. L'équivalent d'une fusion peptidique clivable est un mélange en quantité équimolaire des éléments constituant la fusion.

C'est pourquoi l'invention a pour objet une composition pharmaceutique comprenant : (i) Un polypeptide qui comporte : (a) une première région correspondant à tout ou partie du polypeptide C du virus de l'hépatite C ; et (b) une deuxième région correspondant à tout ou partie du polypeptide El dudit virus et, se révèle en tant que tel ou par l'intermédiaire de ses produits de clivage, incapable d'activité régulatrice à l'encontre d'un ou plusieurs gènes ; (ii) Un mélange (de préférence) en quantité substantiellement équimolaire, (a) d'un premier polypeptide comportant une région qui correspond à tout ou partie du polypeptide C du HCV et (b) d'un deuxième polypeptide comportant une région correspondant à tout ou partie du polypeptide El du HCV ; et qui se révèle incapable d'activité régulatrice à l'encontre d'un ou plusieurs gènes ; ou (iii) Une molécule d'ADN comprenant une séquence codant pour le polypeptide tel que décrit en (i) de la présente revendication, placée sous le contrôle des éléments nécessaire à son expression dans une cellule de mammifère ; et

un support ou un diluent acceptable d'un point de vue pharmaceutique.

Sous un autre aspect de l'invention, 1'invention a aussi pour objet une méthode de traitement ou de prévention d'une infection induite par le HCV selon laquelle on administre une composition pharmaceutique selon l'invention, à un mammifère, de préférence un humain, ayant besoin d'un tel traitement.

Par"polypeptide", on entend toute chaîne d'acides aminés liés entre eux de manière covalente, quelque soit la longueur de la chaîne et quelque soit les modifications post traductionnelles qui peuvent avoir lieu comme par exemple une lipidation. On peut également utiliser le terme protéine, de manière interchangable.

Par"polypeptide C du HCV", on entend notamment un polypeptide C qui possède la séquence d'acides aminés telle que divulguée par Choo et al ainsi que tout autre polypeptide C provenant de toute autre souche et dont la séquence différerait de celle de Choo et al. Par exemple, il peut s'agir des polypeptides C décrits dans Takeuchi K et al [Nucleic Acids Research 18 : 4626 (1990)], Houghton M et al. [Hepatology 14 : 381 (1991)], Delisse et al. [J. Hepatology. 13, suppl. 4 (1991)], Bukh J et al [PNAS 91 : 8239 (1994)] et Hiroaki O et al [Intervirology 37 : 68 (1994)].

Par"polypeptide El du HCV", on entend notamment un polypeptide El qui possède la séquence d'acides aminés telle que divulguée par Choo et al ainsi que tout autre polypeptide El provenant de toute autre souche et dont la séquence différerait de celle de Choo et al. Par exemple, il peut s'agir des polypeptide El décrits dans Hiroaki O et al [Intervirology 37 : 68 (1994), Grakoui et al. [J. Virol. 67 : 1385 (1993)], et Spaete et al.

[Virology 188 : 819 (1992)], Matsumia et al. [J. Virol. 66 : 1425], ou dans Kohara et al.

[J. Gen. Virol. 73 : 2313 (1992)].

Ainsi, la séquence d'acides aminés du polypeptide C et celle du polypeptide El du HCV peut varier en fonction de la souche virale ; reflétant le phénomène de variance allélique. Par exemple, un virus est usuellement représenté par un ensemble de souches qui diffèrent entre elles par des caractéristiques alléliques mineures. Un polypeptide qui remplit la mme fonction biologique dans différentes souches peut avoir une séquence

d'acides aminés qui n'est pas la mme pour toutes les souches. Une telle variation allélique se retrouve également au niveau de l'ADN.

Au niveau de la séquence d'acides aminés, les différences alléliques peuvent tre constituées par une ou plusieurs substitutions, délétions ou additions d'acides aminés, qui n'altèrent pas la fonction biologique.

En ce qui concerne le polypeptide compris dans la composition pharmaceutique selon l'invention, on se doit d'envisager deux cas : soit le polypeptide est incapable d'tre clivé par une protéase dans une cellule de mammifère, soit il est susceptible d'un tel clivage.

Lorsque le polypeptide est incapable d'tre clivé par une protéase dans une cellule de mammifère, il comporte avantageusement : (a) une première région correspondant au moins à la partie du polypeptide C du virus du HCV, responsable de l'activité régulatrice dudit polypeptide C à l'encontre d'un ou plusieurs gènes ; et (b) une deuxième région correspondant au moins à une partie du polypeptide El dudit virus responsable de l'ancrage cytoplasmique du polypeptide El.

Lorsque le polypeptide est susceptible d'tre clivé par une protéase dans une cellule de mammifère, il comporte avantageusement : (a) une première région correspondant au moins à une partie du polypeptide C du HCV, responsable de l'activité régulatrice dudit polypeptide C à 1'encontre d'un ou plusieurs gènes et à la partie dudit polypeptide C responsable de l'interaction dudit polypeptide C avec le polypeptide E I dudit virus ; et (b) une deuxième région correspondant au moins à une partie du polypeptide E1 dudit virus responsable de l'interaction du polypeptide El avec le polypeptide C dudit virus et à une partie du polypeptide El dudit virus responsable de l'ancrage cytoplasmique du polypeptide El.

Par"partie du polypeptide C du HCV, responsable de l'activité régulatrice dudit polypeptide C à 1'encontre d'un ou plusieurs gènes", on entend notamment toute partie du polypeptide C du HCV capable d'activer, de transactiver ou de supprimer la transcription ou 1'expression d'un gène quelconque, selon un mécanisme quelconque. Ce gène peut tre un gène eucaryote, un gène viral, un oncogène, ou un proto-oncogène.

Une partie du polypeptide C du HCV responsable de l'activité régulatrice dudit polypeptide peut notamment correspondre aux acides aminés en positions 38 à 43,58 à 64, 66 à 71,6 à 23, 39 à 74,99 à 102,101 à 121,101 à 122,58 à 121,1 à 120,1 à 121,1 à 122,1 à 123,1 à 173 De manière préférée, une partie du polypeptide C du HCV responsable de l'activité régulatrice peut tre une partie du polypeptide C allant de l'acide aminé en position 1 à l'acide aminé dans l'une des positions 48 à 191. A cette fin, une des positions 48 à 191 peut tre par exemple, la position 119,120, 121,123 et 173.

Une partie du polypeptide C du HCV responsable de l'interaction dudit polypeptide C avec la protéine El du HCV peut notamment correspondre aux acides amines en positions 151 à 173 ou en positions 173 à 191 du polypeptide C du HCV.

Une partie du polypeptide El du HCV responsable de l'ancrage cytoplasmique du polypeptide El peut tre un domaine hydrophobe du polypeptide El. De tels domaines hydrophobes sont par exemple localisés en positions 262 à 291,370 à 380 et 330 à 380 du polypeptide El.

Une partie du polypeptide El du HCV responsable de l'interaction du polypeptide C avec la protéine El peut tre notamment le domaine C-terminal du polypeptide El, de préférence le domaine en positions 330 à 380 ou en positions 370 à 380.

Dans un polypeptide utile aux fins de la présente invention, la première région peut tre localisée du côté N-ou C-terminal du polypeptide, avantageusement du côté N- terminal ; de mme la deuxième région peut tre localisée du côté C-ou N-terminal, avantageusement du côté C-terminal. Selon un mode préféré, l'extrémité C-terminale de la première région peut tre fusionnée par liaison peptidique à l'extrémité N-terminale de la deuxième région.

Lorsque le polypeptide compris dans la composition pharmaceutique selon l'invention comprend la région correspondant au moins aux acides aminés en positions 172

à 175 du polypeptide C du HCV, ce polypeptide comporte avantageusement une mutation rendant inopérant le site de clivage en position 173/174. Selon un mode préféré, une telle mutation est une mutation ponctuelle, réalisée dans l'une des positions 172 à 175. Elle peut tre obtenue par exemple par délétion, addition ou substitution d'un ou plusieurs acides aminés, notamment par délétion, addition ou substitution d'un ou plusieurs acides aminés en positions 172 à 175. De préférence, la mutation sera réalisée par substitution d'un ou deux acides aminés ; une double mutation par substitution étant tout particulièrement préférée. Selon un exemple particulier, le résidu existant naturellement en position 173 (serine) pourra tre notamment substitué par le résidu méthionine et le résidu existant naturellement en position 173 (phénylalanine) pourra tre notamment substitué par le résidu leucine. D'une manière générale, il est à la portée de l'homme du métier de réaliser une ou des mutations capable de rendre inopérant le site de clivage en position 173/174 du polypeptide C du HCV.

Lorsque le polypeptide compris dans la composition pharmaceutique selon l'invention comprend la région correspondant au moins aux acides aminés en positions 190 à 193 de la polyprotéine du HCV, ce polypeptide comporte avantageusement une mutation rendant inopérant le site de clivage en position 191/192 de la polyprotéine du HCV. Selon un mode préféré, une telle mutation est une mutation ponctuelle réalisée dans l'une des positions 190 à 193. Elle peut tre obtenue par exemple par délétion, addition ou substitution d'un ou plusieurs acides aminés, notamment par délétion, addition ou substitution d'un ou plusieurs acides aminés en positions 190 à 193. De préférence, la mutation sera réalisée par substitution d'un ou deux acides aminés ; une double mutation par substitution étant tout particulièrement préférée. Selon un exemple particulier, le résidu existant naturellement en position 191 (alanine) pourra notamment tre substitué par le résidu valine et le résidu existant naturellement en position 192 (tyrosine) pourra notamment tre substitué par le résidu asparagine. D'une manière générale, il est à la portée de l'homme du métier de réaliser une ou des mutations capable de rendre inopérant le site de clivage en position 191/192.

Lorsque le polypeptide utile aux fins de la présente l'invention comprend à la fois la région correspondant au moins aux acides aminés 190 à 193 de la polyprotéine du HCV et la région correspondant au moins aux acides aminés 172 à 175 du polypeptide C du HCV, un seul des deux sites de clivage 191/192 et 173/174 peut tre rendu inopérant, de préférence les deux seront rendus inopérants. Lorsque seul le site 173/174 est rendu inopérant, le polypeptide est susceptible d'tre clivé et dans ce cas-là, il est nécessaire que

ce polypeptide possède une première région qui corresponde entre autre à la partie du polypeptide C responsable de l'interaction dudit polypeptide avec le polypeptide El et une deuxième région qui corresponde entre autre à la partie du polypeptide El responsable de- l'interaction dudit polypeptide avec le polypeptide C.

Lorsqu'un polypeptide utile aux fins de la présente l'invention, est incapable d'tre clivé par une protéase, il peut comporter un site de clivage à condition toutefois que ce site de clivage ne soit pas fonctionnel. Par exemple, dans le cas particulier d'un polypeptide constitué par le polypeptide Cl 91 fusionné au polypeptide El et comportant une mutation rendant inopérant le site de clivage en position 191/192, le site de clivage en position 173/174 peut ne pas tre muté ; toutefois, il ne sera pas fonctionnel ou peu, dans la mesure où le clivage en position 191/192 n'est plus possible. En effet on sait que le clivage en position 191/192 doit tre réalisé pour que puisse avoir lieu le clivage en position 173/174.

Selon un mode particulier, un polypeptide utile aux fins de la présente invention est incapable d'tre clivé par une protéase et comporte : (a) une première région qui correspond substantiellement au domaine du polypeptide C allant de l'acide aminé en position 1 à l'acide aminé dans l'une des positions 120 à 173 ; et (b) une deuxième région qui correspond substantiellement à un domaine du polypeptide El comportant au moins une région hydrophobe, par exemple au domaine du polypeptide El allant de l'acide aminé en position 192 à l'acide aminé en position 380, ou de l'acide aminé en position 330 à l'acide aminé en position 380, ou de l'acide aminé en position 260 à l'acide aminé en position 290, ou de l'acide aminé en position 260 à l'acide aminé en position 380.

Selon un autre mode particulier, un polypeptide utile aux fins de la présente invention est incapable d'tre clivé par une protéase et comporte : (a) une première région qui correspond substantiellement au domaine du polypeptide C allant de l'acide aminé en position 1 à l'acide aminé dans l'une des positions 120 à 191 ; et

(b) une deuxième région qui correspond substantiellement à un domaine du polypeptide El comportant au moins une région hydrophobe, par exemple au domaine du polypeptide El allant de l'acide aminé en position 192 à l'acide aminé en position 380, ou de l'acide aminé en position 330 à l'acide aminé en position 380, ou de l'acide aminé en position 260 à l'acide aminé en position 290, ou de l'acide aminé en position 260 à l'acide aminé en position 380 ; à condition que ledit polypeptide ne comporte pas de site de clivage 191/192 ou bien lorsque le site de clivage est reconstitué, alors une mutation est introduite pour le rendre inopérant.

De manière avantageuse, la première région du polypeptide utile aux fins de présente invention correspond aux acides aminés en positions I à 191 du polypeptide C du HCV et/ou la deuxième région de ce polypeptide correspond au moins aux acides aminés en positions 192 à 380 du polypeptide El du HCV. De manière particulièrement préférée, la première et la deuxième région sont comme définies ci-avant dans ce mme paragraphe, l'acide aminé en position 191 étant fusionné par liaison peptidique à l'acide aminé en position 192. Selon un mode particulier, le polypeptide est constitué par la première et la deuxième région telles que définies ci-avant dans ce mme paragraphe.

Lorsque le polypeptide utile aux fins de présente invention est tel que décrit au paragraphe précédemment, il comporte impérativement une mutation rendant inopérant le site de clivage en position 191/192 ou en position 173/174. De préférence, les deux sites de clivage sont rendus inopérants.

Un mélange utile aux fins de la présente invention comprend avantageusement : (a) un premier polypeptide comportant une région qui correspond au moins à la partie du polypeptide C du virus du HCV responsable de l'activité régulatrice dudit polypeptide C à 1'encontre d'un ou plusieurs gènes et à la partie dudit polypeptide C responsable de l'interaction dudit polypeptide C avec le polypeptide E 1 dudit virus ; et (b) un deuxième polypeptide comportant une région correspondant à une partie du polypeptide El dudit virus responsable de l'interaction du polypeptide El avec

le polypeptide C dudit virus et à une partie du polypeptide El dudit virus responsable de l'ancrage cytoplasmique du polypeptide El.

Les parties des polypeptides C et El responsables des propriétés nommées aux points (a) et (b) du paragraphe précédent peuvent tre telles que décrites ci-avant pour le polypeptide de fusion.

De manière préférée, le premier polypeptide du mélange comporte et de manière tout particulièrement préférée est constitué par, une région correspondant aux acides aminés en positions 1 à 191 du polypeptide C (C191) du HCV. Dans ce dernier cas, le site de clivage en position 173/174 doit tre rendu inopérant par mutation. Cette mutation peut tre mise en oeuvre comme cela est décrit ci-avant pour le polypeptide de fusion.

De manière préférée, le deuxième polypeptide du mélange comporte et de manière tout particulièrement préférée est constitué par, une région correspondant aux acides aminés en positions 192 à 380 du polypeptide El du HCV.

Aux fins de la présente invention, une molécule d'ADN peut tre un simple fragment d'ADN linéaire, ou bien un plasmide ou bien encore un vecteur viral tel qu'un vecteur pox.

Un polypeptide, un mélange ou une molécule d'ADN tels que décrits dans la présente demande, sont d'un intért tout particulier lorsqu'ils sont utilisés pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement ou à la prévention des infections induites par le HCV. Ils sont notamment utiles en immunothérapie des infections induites par le HCV, tout particulièrement une molécule d'ADN.

Enfin l'invention concerne une méthode d'induction d'une réponse immunitaire à 1'encontre du HCV chez un mammifère, selon laquelle on administre audit mammifère une quantité efficace d'un point de vue immunologique d'une composition selon l'invention afin de développer une réponse immunitaire. L'invention concerne également une méthode de prévention ou de traitement d'une infection induite par le HCV, selon laquelle on administre à un individu une quantité prophylactiquement ou thérapeutiquement efficace d'une composition selon l'invention.

Les méthodes et les compositions pharmaceutiques selon l'invention peuvent traiter ou prévenir des infections à HCV et par conséquent, les maladies hépatiques associées à de

telles infections. I1 s'agit en particulier, des hépatites chroniques persistantes ; des hépatites chroniques actives ; des cirrhoses du foie et des hépatocarcinomes.

Une composition selon l'invention peut tre administrée par n'importe quelle voie conventionnelle en usage dans le domaine des vaccins, en particulier par voie parentérale (e. g. sous-cutanée, intradermique, intramusculaire, intraveineuse, ou intrapéritonéale). Le choix de la voie d'administration dépend d'un certain nombre paramètres tel que la nature du principe actif, polypeptide ou molécule d'ADN, I'adjuvant associé au polypeptide ou à la molécule d'ADN.

Une composition selon l'invention peut comprendre outre un polypeptide ou un mélange de polypeptide utiles aux fins de la présente invention, au moins un autre antigène du HCV tel que la protéine E2 ou encore tel qu'une protéine non structurale NSI, NS2, NS3, NS4 ou NS5, ou une sous-unité, fragment, homologue, mutant ou dérivé de ces antigènes.

Un polypeptide, un mélange ou une molécule d'ADN utiles aux fins de la présente invention peut tre formulé dans ou avec des liposomes, de préférence des liposomes neutres ou anioniques, des microspères, des ISCOMs ou des pseudo-particules virales (VLPs), afin de favoriser le ciblage de la protéine ou du polypeptide ou d'augmenter la réponse immunitaire. L'homme du métier dispose de ces composés sans difficulté ; par exemple voir Liposomes : A Practical Approach, RRC New ED, IRL press (1990).

Des adjuvants autres que les liposomes peuvent tre aussi utilisés. Un grand nombre sont connus de l'homme du métier. De tels adjuvants sont référencés ci-après : Pour administration parentérale, on cite notamment des composés d'aluminium tels que t'hydroxyde d'aluminium, le phosphate d'aluminium et t'hydroxyphosphate d'aluminium. L'antigène peut tre adsorbé ou précipité sur un composé d'aluminium selon des méthodes standards. D'autres adjuvants utiles pour administration parentérale, incluent notamment le polyphosphazène (WO 95/2415), le DC-chol (3 bétâ-[N-(N', N'-dimethyl aminométhane)-carbamoyl] cholestérol) (USP 5 283 185 et WO 96/14831), le QS-21 (WO 88/9336) et le RIBI d'ImmunoChem (Hamilton, MT).

L'administration peut avoir lieu en dose unique ou répétée une ou plusieurs fois après un certain délai. Le dosage approprié varie en fonction de divers paramètres, par exemple,

de l'individu traité (adulte ou enfant) de l'antigène vaccinal lui-mme du mode et de la fréquence d'administration, de la présence ou absence d'adjuvant et si présent, du type d'adjuvant et de 1'effet désiré (e. g. protection ou traitement), comme cela peut 6tre-- déterminé par l'homme de fart.

Une composition selon l'invention peut tre fabriquée de manière conventionnelle.

En particulier on associe un polypeptide, un mélange ou une molécule d'ADNcompris dans la composition selon l'invention avec un diluant ou un support acceptable d'un point de vue pharmaceutique e. g. de 1'eau ou une solution saline tel qu'un tampon de sel de phosphate (PBS). En général, le diluant ou le support est sélectionné sur la base du mode et de la voie d'administration et de pratiques pharmaceutiques standards. Des diluants et des supports acceptables d'un point de vue pharmaceutique ainsi que tout ce qui est nécessaire à leur usage dans des formulations pharmaceutiques sont décrits dans Remington's Pharmaceutical Sciences, un texte de référence standard dans ce domaine et dans le USP/NP.

L'invention est illustrée ci-après, par références aux figures suivantes.

La figure 1 est une représentation schématique du génome du HCV qui est constitué d'ARN avec ses régions 5'et 3'non traduites indiquées par des lignes, et la phase ouverte de lecture de la polyprotéine précurseuse indiquée sous la forme d'un rectangle.

La figure 2 représente les inserts dérivés du génome du HCV qui sont testés dans des plasmides pRC. Les séquences dérivées du génome du HCV sont représentées par un rectangle et les résidus mutés sont indiqués par des points.

La figure 3 est un diagramme représentant l'activité luciférase mesurée pour chacune des constructions dont certaines sont mutées au niveau d'un ou de plusieurs site (s) de clivage. L'identité de l'insert testé apparait en abscisse tandis que la quantité de luciferase produite par rapport à la quantité totale de protéines produites apparait en ordonnées.

EXEMPLE 1 : Construction de plasmides recombinants et mutagénèse dirigée Les constructions dénommées pRC/El, pRC/CElMl, pRC/CE ! M2 et pRC/CE I M I M2 (aussi appellé pRC/CE I DM), pRC/C 191 M I, et pRC/C 173, qui sont utiliséés ci-après dans 1'exemple 2, ont été décrites dans : Liu Q et al. J. Virol. 71 : 657 (1997). Les inserts utilisés sont représentés à la figure 2. Toutes les constructions sont réalisées dans le vecteur pRC qui provient de InVitrogen (ref : V780-20). Le vecteur pRC porte le gène de l'ampicilline et permet 1'expression des inserts sous le contrôle d'un promoteur CMV. Des mutations dénommées MI et M2 sont présentes dans les constructions pRC/C191Ml, pRC/CEIMI, pRC/CEIM2 et pRC/CElMIM2. Elles ont été générées par mutagénèse dirigée réalisée par PCR. La mutation dénommée M I correspond au remplacement des acides aminés Serine et Phel74 de la protéine C par les acides aminés methionine et leucine, respectivement. La mutation dénommée M2 correspond au remplacement des acides aminés alaninel9l et tyrosinel92 de la protéine CEI par les acides aminés valine et asparagine, respectivement.

Les plasmides exprimant les gènes rapporteurs de la luciferase et de la ß- galactosidase ont été construits par modification du vecteur pUC 18 (Appligene ; ref : 161131). L'expression des gènes est sous contrôle du promoteur immediate early 1 (iel) du CMV humain. Des sequences issues de la région 3'du gène bovin de l'hormone de croissance, ont par ailleurs été rajoutées en 3'des gènes pour stabiliser les ARNm. Ces plasmides portent de plus un gène de résistance à l'ampicilline.

EXEMPLE 2 : Transfection de cellules par les plasmides Des cellules CHO-K1 (ATCC CCL 61) sont conservées dans du milieu a-MEM [Nature 230 : 310 (1971)], supplémenté par 10 % de Sérum de Veau Foetal (SVF) (Hyclone, ref : Al 115-L) et 20 % de Diméthyl Sulfoxyde (DMSO) dans l'azote liquide. Ces cellules sont cultivées sous atmosphère humide à 37 °C avec 5 % de Cl, et 95 % d'air. Pour effectuer des sous cultures, le milieu éliminé et le tapis cellulaire est rincé avec 5 ml de tampon phosphate (PBS). Le surnageant est ensuite éliminé avant ajout de 1,5 ml de trypsine par flasques de 75 cm2 (trypsine à 0,025 %). Après une incubation de 10 mn à l'étuve à 37 °C, la réaction est arrtée par ajout de 10 ml de milieu a-MEM contenant 10 % SVF. Les cellules sont comptées sur cellule de Malassez après une dilution au demi en

bleu Trypan à 0, 02 %. 5.105 cellules sont ensuite ensemencées dans des boites de 6 cm de diamètre avec du milieu complet.

Les cellules CHO sont ensuite cotransfectées avec un des plasmides recombinants (pHCV) décrits ci-dessus et un plasmide rapporteur (pCMV) qui contient soit le gène de la -galactosidase sous le contrôle du promoteur CMV (pCMV (3-gal), soit le gène de la luciferase sous le contrôle du promoteur CMV (pCMV Luc).

Pour cela, 5 g d'ADN (4,5 g de plasmide pHCV/0,5 zig de plasmide pCMV) sont dilues dans 500 pll de milieu OPTI-MEM (Gibco), et mélanges avec 14 ptl de lipofectamine diluée dans 500 u1 du mme milieu. Les deux solutions sont mélangées et incubées 20 min à temperature ambiante pour permettre la formation des complexes ADN-liposomes.

Le mélange ADN-liposome dilué avec 2 ml d'OPTI-MEM est ensuite rajouté sur les cellules après élimination du milieu de culture et rinçage en PBS. Après une incubation de 5 heures, le milieu est de nouveau changé et 48 h après la transfection, il est alors possible de tester l'expression transitoire des gènes recombinants.

EXEMPLE 3 : Mise en évidence de t'activité régulatrice des constructions sur des gènes rapporteurs Les cellules transfectées sont lycées à l'aide du réactif"Luciferase Cell Culture Lysis Reagent" (Promega, Luciferase Assay System). 100 pI de substrat sont ajoutés à 100 ni de surnageant cellulaire, directement par l'injecteur du bioluminomètre (Lumat LB/9501/16 de Berthold) qui mesure la quantité de lumière émise (Relative Light Units) pendant 10 secondes. La quantité de lumière émise est ensuite convertie en nanogrammes de protéines par ml de lysat cellulaire, par comparaison avec une courbe standard établie à l'aide de luciferase purifiée.

Les résultats qui sont présentés à la figure 2 montrent qu'une mutation ponctuelle à l'acide aminé 191 dans la construction CE1M2 abolit l'effet transactivateur. Une mutation ponctuelle à l'acide aminé 173 (dans la construction CEIMI) abolit 1'effet transactivateur uniquement dans le cas ou C est fusionné à El. Une double mutation aux acides aminés 173 et 191 abolit l'effet transactivateur.