Sector Técnico La presente invención está relacionada con la rama de la medicina, particularmente con el desarrollo de nuevas formulaciones inmuno-potenciadoras que permitan el aumento en cantidad y calidad de la respuesta inmune a antígenos vacunales.

El objetivo técnico que se persigue con la invención propuesta es precisamente el desarrollo de formulaciones capaces de elevar y/o modular la respuesta inmune del organismo a antigenos vacunales.

Técnica Anterior Los adyuvantes son sustancias que aumentan u optimizan la respuesta inmune a los antígenos inoculados por via mucosal o sistémica. Los adyuvantes o sus formulaciones se combinan con el inmunógeno para generar o potenciar el tipo de respuesta deseada, disminuir el número de inoculaciones y reducir la cantidad de antigeno necesario para obtener y mantener la protección (McElrath, M. C. 1995 Seminars in Cancer Biology 6 : 375-385).

Los adyuvantes se han desarrollado como una necesidad del avance de la biotecnologia moderna al obtenerse antigenos solubles puros, recombinantes y sintéticos. En general estos antigenos han resultado seguros, pero de una menor inmunogenicidad en comparación con aquellos del organismo de origen. Una función importante de los adyuvantes o sus formulaciones es incrementar la complejidad del antigeno presentado al sistema inmune, de manera segura, aumentando asi su inmunogenicidad (Alving, R. C. 1992 AIDS Res. Hum. Retroviruses 8 (8) : 1427-1430).

En la actualidad la búsqueda de nuevos adyuvantes e inmunoestimulantes, asi como el desarrollo de nuevos sistemas de envio de antigenos y fármacos, es una de las primeras lineas de la investigación mundial en el campo de la farmacéutica y, en especial, de las vacunas. El desarrollo de los adyuvantes para uso mucosal constituye actualmente una necesidad en el campo de las vacunas (Report of the Expert Panel VI : Concerted efforts in the field of mucosal immunology 1996 Vaccine 14 : 644-664).

Los adyuvantes se pueden clasificar como adyuvantes mucosales y sistémicos teniendo en cuenta que las caracteristicas fisiológicas en cuanto a la toma y procesamiento del antigeno para ambas vias de inoculación generan procederes diferentes de adyuvación. La ruta mucosal, de acuerdo a las caracteristicas del antigeno, exige procedimientos de unión o recubrimiento con ligandos especificos que envien el antigeno a células M. La adyuvanticidad para antigenos mucosales se logra mediante estrategias que ayuden a que el antigeno pueda cruzar las barreras que la

propia ruta impone. Las caracteristicas físicas del antigeno pueden favorecer su fagocitosis. Una vez asimilado el antigeno, el adyuvante puede influir en la respuesta por cualquiera de los mecanismos conocidos : la adsorción del antigeno, el efecto depósito, la inducción de citoquinas, la activación del complemento, el reclutamiento de distintas poblaciones de células del sistema inmunológico, el envio del antigeno a diferentes células presentadoras de antigenos, la regulación de la expresión via clase I o clase II y la estimulación de la producción de diferentes subtipos de anticuerpos (McElrath M. C. 1995 Seminars in Cancer Biology 6 : 375-385).

Algunos de los inmunoestimulantes conocidos, como los muramil-dipéptidos (MDP), monofosforil-lipido A (MPL), la amina lipoidal Avridina y las conocidas toxinas de V. cholerae (CT) y de E. coli (HLT), son reconocidos adyuvantes para antigenos administrados por via de mucosas (Walker, R. I. 1994 Vaccine 12 (5) : 387-400).

Los MDP y MPL se han estudiado en formulaciones liposomales con fines terapéuticos y profilácticos, sin embargo, las toxinas o sus subunidades (en especial CT y CTB), son los adyuvantes mucosales más estudiados. La capacidad de CT de actuar como adyuvante oral ha sido confirmada por un número grande de investigadores (McGhee, J. R. et al. 1992 Vaccine 10 (2) : 75-88). La toxina del cólera no cumple con la definición clásica de un adyuvante porque estimula una respuesta inmune contra ella misma y su actividad adyuvante es dependiente de su inmunogenicidad (Elson, C. O. 1987 Fed.

Proc. 46 : 1778). Los efectos inmunomoduladores de CT y HLT que explican su fuerte actividad adyuvante incluyen el incremento de la presentación de antigenos por varios tipos de células B, el incremento en la diferenciación de células B a isotipo IgA, la interacción con células T y la producción de citoquinas (Lintermans, P. 1995 Advanced Drug Delivery Reviews 18 : 73-89).

Desde el punto de vista práctico no es factible el uso de la holotoxina en humanos debido a su toxicidad. Una estrategia más acertada es la detoxificación de CT, por escisión de la subunidad A o por mutaciones del gen que la codifica. Tanto CT como CTB subunidad no tóxica-pueden potenciar la respuesta inmune a varios antigenos acoplados covalentemente debido a interacciones especificas con células M (Holmgren, J. et al. 1993 Vaccine 11 : 1179-1184).

Los sistemas de envio de antigenos han alcanzado un nivel de desarrollo suficiente para hacer impacto en la práctica de la inmunización. Se espera que los sistemas particulados sólidos tanto para administración parenteral como no parenteral estén dentro de los primeros productos a licenciar (Li Wan Po et al. 1995 Advanced Drug Delivery Reviews 18 : 101-109).

Por las posibilidades que brindan los sistemas de envio de antigenos en la particulación de antigenos solubles, y aprovechando las caracteristicas fisiológicas de la via mucosal, estos sistemas han sido ensayados y han mostrado actividad adyuvante. En la literatura se han clasificado como : a) sintéticos/inactivados y b) vivos (Report of the Expert Panel VII : Vaccine Delivery Systems 1996 Vaccine 14 : 644-664).

Con respecto al primer grupo, se han estudiado con diferentes resultados las particulas poliméricas artificiales que comprenden : las microesferas copoliméricas de ácido láctico y glicólico, además polimeros alternativos como polifosfacenos, polimeros de acetato de celulosa, iminocarbonatos, polimeros de etilenvinilacetatos, microesferas proteinoides, polianhidridos y nanosferas de dextranas; las particulas producidas de materiales naturales : alginatos, gelatina, y semillas de plantas y además los liposomas y sus variantes : proteoliposomas, virosomas e ISCOMs (Li Wan Po et al. 1995 Advanced Drug Delivery Reviews 18 : 101-109).

El tamano de las particulas está dentro de los factores de importancia para el envio de antigenos. Para el caso de la via mucosal de inmunización se ha reportado que particulas de un diámetro mayor de 10 jum no son absorbidas (Eldridge J. H. 1990 J.

Control. Release 11 : 205-214). En experimentos en ratas se observó que, luego de administración oral, sólo las particulas de 5 pm penetraron profundo en las placas de Peyer y las de 1 um de diámetro penetraron a los linfonodos, el higado y pasaron a la circulación sanguinea (Jani, P. et al 1990 J. Pharm. Pharmacol. 42 : 821-826) (Alpar, H. O. et al. 1989 J. Pharm. Pharmacol 41 : 194-196).

La extrapolación de estos resultados a humanos aún no está definida y a veces la absorción por el tracto gastrointestinal no es un prerequisito de la adyuvanticidad aunque se ha comprobado que, con la adsorción del toxoide diftérico en semillas de plantas de hasta 2 mm de diámetro, se potenció la respuesta inmune (Mirchamski, H. et al. 1994 Vaccine 12 : 1167-1172).

La determinación de la talla óptima de los sistemas de liberación controlados para via nasal, rectal o vaginal es actualmente motivo de investigación (Li Wan Po et al. 1995 Advanced Drug Delivery Reviews 18 : 101-109).

Otro factor que afecta a las particulas es el balance hidrofobicidad-hidrofilicidad, el cual puede modificarse para obtener una modulación de la respuesta inmune (Jani, P. et al 1990 J. Pharm. Pharmacol. 42 : 821-826).

Recientemente ha sido patentado el uso en vacunas de los cocleatos proteicos descritos en 1975 (Papahadjopoulos D. et al 1975 Biochem. Biophys. Acta 394 : 483).

Los cocleatos constituyen complejos de liposomas y cationes divalentes fundamentalmente calcio que, mediante la interacción calcio-fosfolipido, posibilitan la formación de una estructura de liposoma enrollado sobre si mismo, permitiendo la inmunización por diferentes rutas (Gould Foguerite, S. WO 95/09648). Con esta estructura se estimula tanto la respuesta inmune de anticuerpos como la mediada por células (Gould Foguerite, S. 1994 AIDS Res. Hum. Retroviruses 10 (Supl. 2) : S99- S 103).

La absorción y el tránsito del antigeno por células especializadas del epitelio asociado a foliculo linfoide, las células M (Microfold) es el paso critico en la generación de una respuesta inmune por el epitelio simple intestinal, lo que es generalmente aceptado por todos los autores. Mediante este proceso los antigenos son enviados al bolsillo basal de las células M, constituyendo el primer contacto del antigeno prácticamente sin degradar-con células B, T y macrófagos. La principal función del bolsillo consiste en proveer al organismo de un ambiente protegido de la influencia moduladora de factores humorales externos (Neutra, R. M. 1996 Annu. Rev. Immunol. 14 : 275-300).

En las vias respiratorias, el epitelio varia desde pseudoestratificado a simple. En los bronquios, zona de epitelio simple, los espacios intercelulares están sellados por uniones estrechas y el mecanismo principal de toma de antigenos es a través de las células M. A nivel de amigdalas, el epitelio predominante es el epitelio estratificado. En el mismo, el mecanismo de absorción del antigeno está muy asociado a una red de macrófagos y células dendriticas móviles, provenientes de médula ósea, de hasta 700 células por mm2. Estas células son capaces de migrar a tejido linfoide organizado asociado a mucosa (0-MALT) o a linfonodos, presentando al antigeno procesado que se fagocitó en la superficie de las amigdalas. Bajo condiciones normales este constituye el principal mecanismo de presentación de antigenos por MHC clase II del tracto respiratorio (Neutra, R. M. 1996 Annu. Rev. Immunol. 14 : 275-300).

La diferencia en la absorción del antigeno a nivel de mucosas oral y nasofaringea, nos permite comprender el por que la inoculación de un adyuvante por ambas vias no necesariamente produce iguales resultados. Por tal motivo no es obvio que un adyuvante efectivo por via oral, sea o no efectivo por via nasofaringea. Los adyuvantes pueden tener efectos distintos en diferentes sitios mucosales, dado que diferentes superficies mucosales tienen distintos microambientes. El progreso en el conocimiento de la fisiologia de las mucosas y el modo de acción de los adyuvantes puede ayudar en el desarrollo de vacunas mucosales más efectivas, además, características propias del antigeno como : tamano, presencia de ligandos mucosales, carga eléctrica, lipofilicidad

y T dependencia también pueden influir en la respuesta inmunológica. (Report of the Expert Panel VI : Concerted efforts in the field of mucosal immunology 1996 Vaccine 14 : 644-664).

A su vez otros elementos propios del organismo, como las fluctuaciones hormonales durante el ciclo menstrual, afectan la asimilación del antigeno a nivel de vagina. Este hecho muestra la estrecha colaboración entre células dendriticas y epiteliales y explica la amplia variación en la efectividad de las vacunas por via vaginal (Parr, E. L., Parr, M. B. 1992 Vaccine Res. 1 : 221-25).

Para el caso del tejido epitelial simple del intestino, el envio de vacunas no vivas a células M ha sido dificil, dado que las macromoléculas no protegidas son fácilmente digeridas o arrastradas por las secreciones y la motilidad del tracto gastrointestinal.

Existe muy poca información disponible con respecto a los componentes de la membrana apical de las células M que pudieran servir como receptores. Los liposomas y las microparticulas pueden adherirse a superficies mucosales por interacciones hidrofóbicas, pero la entrada de los antigenos a células M es ineficiente debido a que son rápidamente atrapados en los geles mucosales y muchos no llegan a alcanzar la mucosa. Las macromoléculas o particulas que se conjugan o recubren con ligandos como CTB, tienen como factor limitante la accesibilidad a los receptores (Neutra, R. M.

1996 Cell 86 : 345-348).

Experimentos recientes en ratones, usando particulas de oro coloidal recubiertas con CTB de una talla de 28.8 nm, mostraron que las mismas eran capaces de adherirse y penetrar selectivamente a células M del epitelio asociado a foliculo mucosal, siendo incapaces de penetrar a los enterocitos del llamado borde en cepillo. Particulas mayores; de aproximadamente 1.13 gm ; también recubiertas con CTB, fueron incapaces de adherirse a células M, mientras que particulas de CTB-FITC, de aproximadamente 6.4 nm, pudieron adherirse y ser internalizadas por ambos tipos celulares. Este experimento demostró el papel del glicocáliz en la adherencia e internalización de antigenos por células M. La subunidad B de la toxina del cólera tiene receptores tanto en los enterocitos como en las células M. El uso de ligandos unidos a particulas puede resultar en una adherencia especifica a células M, pero sólo dentro de un rango de tallas restringido por el glicocáliz. Particulas de 1 um o mayores requieren de ligandos dirigidos especificamente a componentes de las células M. La identificación de estos componentes se encuentra aún en investigación (Frei, A. et. al.

1996 J. Exp. Med. 184 : 1045-1059).

Un grupo de bacterias patógenas es capaz de sobrepasar las dificultades de los sistemas no vivos al ser asimiladas eficientemente por falta de receptores a nivel de células M. Estas bacterias explotan este mecanismo para infectar los tejidos mucosales y diseminarse sistémicamente antes de ser detenidas por el sistema inmune. Los patógenos bacterianos que se adhieren a la superficie de las células M inician eventos de transducción de señales a nivel epitelial que promueven su internalización. La más estudiada de las cepas bacterianas atenuadas es S. typhi ty21a, para la cual se ha descrito una interacción tipo lectina con receptores de naturaleza polisacaridica de la membrana celular de las células M. También se consideran seguras y efectivas las cepas vivas atenuadas de V. cholerae y poliovirus para inmunización oral. Las cepas genéticamente manipuladas de estos microorganismos, comienzan a ser usadas en humanos como portadoras de antigenos heterólogos (Mekalanos, J. J. 1992 Adv. Exper. Med. Biol. New York Plenum Press : 43- 50).

La biologia de estos vectores vivos introduce nuevos retos. Las cepas vacunales de V. cholerae, que no poseen los genes para la toxina, pueden aún causar diarreas, al parecer porque las células epiteliales liberan citoquinas simplemente en respuesta a la adherencia bacteriana (Mekalanos, J. J. 1992 Adv. Exper. Med. Biol. New York Plenum Press : 43-50). El mayor reto en el uso de las cepas genéticamente manipuladas de S. typhi y S. typhimurium consiste en obtener una atenuación suficiente que brinde seguridad conservando la adherencia a células M y la proliferación en mucosas, para asi mantener su inmunogenicidad. Las cepas atenuadas de Shigella, también son internalizadas por las células M, pero han perdido la capacidad de diseminarse célula- célula. Este fenómeno es la base de la atenuación, pero aún se produce una liberación local de citoquinas y factores quimiotácticos que puede causar una ruptura en la función normal de la barrera epitelial (Sansonetti, P. J. 1991 Rev. Infect. Dis. 13 : 285- 292).

Los virus se encuentran también en estudio. El hecho de que el polio-virus tipo 1 y la cepa atenuada de Sabin utilicen el transporte a través de células M para cruzar la barrera epitelial, los convierten en importantes candidatos de vacuna oral para el envio de antigenos foráneos en humanos. El virus vaccinia y otros poxvirus son asimilados por las superficies mucosales pero su interacción con las células M no ha sido aun documentada (Report of the Expert Panel VI : Concerted efforts in the field of mucosal immunology 1996 Vaccine 14 : 644-664).

Muchos carbohidratos complejos de origen natural estimulan las células del sistema inmune y reticuloendotelial (Davis, S. E. 1975 Am. Chem. Soc. Sympos. Series 15, Jeanes A. Hodge J. Eds. Am. Chem. Soc. Washington D. C.). Entre ellos están los polimeros de plantas y hongos como son los glucanos, dextranas y lentinanos todos ellos polimeros de glucosa y los mananos, entre los que se encuentran glucomananos y galactomananos. También se encuentran los levanos y xylanos (Tizard,. I. R. et al.

1989 Mol. Biother 1 : 290-296). La actividad de muchos de estos poliglicanos sobre los macrófagos que tienen receptores de glucanos y mananos incluyen la inducción de fagocitosis y secreción de citoquinas, leucotrienos y prostaglandinas. El lentinan, un glucano común de las setas, estimula la respuesta celular y de anticuerpos a eritrocitos de carnero, mientras el levano es mitogénico para células B, y activador de macrófagos (Simon, P. M. 1994 Exp. Opin. Invest. Drugs 3 (3) : 223-239).

El Acemanano es un manano compuesto por manosas con O-acetilaciones en aproximadamente 8 de cada 10 restos. Se extrae como componente mayoritario de la sustancia mucilaginosa o gel de la hoja de Aloe barbadensis Miller, planta medicinal usada desde la antigüedad. Distintas pruebas in vitro indican que los mananos activan monocitos y macrófagos induciendo la elaboración de interferón-y, factor-a de necrosis tumoral, factor estimulador de colonias de monocitos y granulocitos, IL-1 (3 e IL-6 (Peng, S. Y. et al. 1991 Mol. Biother. 3 : 79-87). El Acemanano potencia la generación de linfocitos T citotóxicos (CTL) (Womble, D. et al. 1988 Int. J. Immuno- pharmacol. 10 : 967-974), la actividad citotóxica de células Natural Killer (NK) (Marshall G. D. et al. 1993 J. Immunol. (part II) 150 : Abstr 1381), y también, modestamente, la alorrespuesta humana in vitro.

El aumento de la actividad citotóxica y la secreción de interferón-y apoya el uso terapéutico como antiviral y antitumoral del Acemanano. En animales se ha evidenciado su actividad antiretroviral en el caso del virus de la leucemia felina (Sheets, M. A. et al. 1991 Mol. Biother. 3 : 41-45). Actualmente se encuentran en curso ensayos clinicos en pacientes con SIDA y cáncer.

Recientemente se han solicitado patentes para el uso del Acemanano como adyuvante para vacunas. (McAnalley, B. H. EP 0 619 117 A2, Nordgrem, R. M. WO 93/14195), pero en ninguno de los dos casos se protege el uso del acemanano por via nasofaringea. En ambas patentes se inoculan los antigenos por via sistémica (subcutánea e intramuscular). Los resultados obtenidos con una formulación del acemanano por via oral (que se muestran en la primera patente) pueden considerarse pobres comparados a los obtenidos por la via sistémica de inoculación. La segunda

patente amplia su uso a gotas oculares. Como se explicó anteriormente, los adyuvantes pueden tener diferentes efectos en diferentes sitios mucosales por la fisiologia de la asimilación del antigeno y por el ambiente diferente de cada ruta, que puede influir en la actividad del inmunopotenciador (Report of the Expert Panel VI : Concerted efforts in the field of mucosal immunology 1996 Vaccine 14 : 644-664).

Además de las diferencias entre las distintas rutas mucosales, también se han obtenido resultados diferentes cuando se usa un mismo adyuvante tanto por via sistémica como mucosal. Este es el caso del adyuvante sistémico más universalmente utilizado, la alúmina. Este adyuvante no ha sido más efectivo que el PBS cuando se inoculan ratones por via oral y nasal con antigenos para los cuales constituye el adyuvante tradicional para uso sistémico como por ejemplo el toxoide tetánico (Alpar H. O. et al. 1992 Int. J. of Pharm. 88 : 335-344). Por tanto tampoco es obvio que un adyuvante sistémico sea necesariamente un adyuvante mucosal.

Descripción detallada de la invención En el trabajo objeto de la presente invención se reporta por primera vez una formulación vacunal de administración por via nasofaringea, cuyos componentes fundamentales son el antigeno de superficie del virus de la hepatitis B (HBsAg) y el acemanano, en proporciones adecuadas.

Esta formulación es novedosa por las propiedades que resultan de la administración mucosal de la misma, que son : generar para dosis similares de antigeno una inmunidad sistémica de similar intensidad y superior calidad a la que se obtiene con formulaciones vacunales convencionales que usan alúmina como adyuvante. Además se genera una potente respuesta a nivel de mucosas, la cual no se obtiene por inoculaciones sistémicas del HBsAg.

También demostramos que con el uso sistémico de la formulación de HBsAg con acemano se incrementó significativamente la respuesta inmune cuantitativa y cualitativamente en comparación con formulaciones vacunales convencionales que usan alúmina como adyuvante.

Esta es la primera vez que se reporta el uso del antigeno de superficie del virus de la Hepatitis B (HBsAg) como sistema de envio de antigeno por via nasofaringea en combinación con polisacáridos activadores de la inmunidad inespecifica. Con este sistema se obtuvo una respuesta proporcionalmente incrementada para los epitopes dispuestos en su superficie con respecto a la proporción obtenida para los mismos con otros adyuvantes. Este hallazgo permite la formulación de vacunas combinadas usando el HBsAg como sistema de envio de antigenos a través de mucosas y avala el

uso de esta estrategia para la combinación ulterior antigeno soluble-antigeno particulado y su uso con polisacáridos de estas caracteristicas por rutas mucosales de inoculacion.

En este trabajo se pudo generalizar que formulaciones liquidas de sistemas de envio de antigenos particulados junto al acemanano inoculados por via nasofaringea potenciaban preferencialmente la respuesta inmune con respecto al propio antigeno soluble hasta superar el nivel de respuesta sérica obtenido por via sistémica con otros adyuvantes. Se demuestra el incremento en la calidad de la respuesta al elevarse el nivel de anticuerpos de la subclase IgG2a en ratones Balb/C. Este aspecto constituye una superioridad cualitativa con respecto a la alúmina, posibilitando el diseño de vacunas antitumorales y contra microorganismos frente a los cuales se necesite la inducción de respuesta Th 1. Recientemente se ha observado que las citoquinas producidas por las células Th2 son las asociadas a la inmunidad de mucosas y que las células T en linfonodos mucosales tienen una mayor propensión a producir citoquinas de tipo Th2 (Meeusen, E. N. T. 1996 Immunology Today 17 (9) : 421-424) lo que reafirma el valor de este hallazgo.

En la presente invención también se describe la actividad inmunomoduladora de formulaciones combinadas antigeno-acemanano. Reportamos por primera vez la actividad potenciadora especifica de la respuesta Th 1 con respecto a otros adyuvantes de uso general, por via nasofaringea y sistémica, tanto para antigenos particulados como solubles. Para estos últimos la respuesta humoral es de similar intensidad a la obtenida con alúmina, pero cualitativamente diferente, de ahi el efecto inmunomodulador que se reporta. Estos resultados avalan su introducción en formulaciones vacunales dirigidas a la inmunoprofilaxis e inmunoterapéutica de enfermedades causadas por patógenos intracelulares y cáncer.

En la actualidad los mecanismos de acción del acemanano y otros polisacáridos inmunoestimulantes aun no están esclarecidos totalmente. Un mecanismo propuesto involucra a los macrófagos y células dendriticas, los cuales poseen receptores especificos para patrones antigénicos presentes en la superficie de los patógenos, discriminando asi entre lo que es"peligroso"y lo que no lo es. De acuerdo a esto se genera, en el sitio de la inoculación sistémica, una fuerte monocitemia. La asimilación antigénica a nivel de nasofaringe, y más específicamente a nivel del anillo de Waldeyer de acuerdo con el mecanismo de asimilación para tejido epitelial estratificado, puede potenciarse con la activación de los macrófagos y células dendriticas presentes en la

zona y con la atracción hacia esta zona de un número incrementado de células inmunocompetentes.

Un importante porciento del peso seco de la hoja del gel de Aloe lo constituyen los cristales de Oxalato de Calcio (Carpenter, H. R. P. N. 5 118 673). Los mismos han sido objeto de estudio recientemente por su presencia mayoritaria en los cálculos renales, patologia frecuente de los rinones (Lieske, J. C. et. al. 1994 Proc. Natl. Acad. Sci.

U. S. A. 19; 91 (15) : 6987-91). A partir de 1993 se describen determinadas macromoléculas que pueden ser adsorbidas por el cristal (Stapleton, A. M. et. al. 1993 Kidney Int. 44 (4) : 817-24). Más recientemente se han encontrado otras proteinas : Nefrocalcina, Proteina de Tamm-Horsfall, Uropontina y Litostatina Renal (Berland, Y. et al. 1993 Nephrologie 14 (4) : 183-7).

Experimentos realizados por nuestro grupo demostraron la adsorción del HBsAg al cristal de oxalato de calcio, obteniendo tamanos de particula reducidos por caracteristicas inherentes a la sal y por procesos de inhibición de la aglutinación de los cristales que ocurren en un medio rico en polisacárido como lo es el acemanano.

Para la inoculación sistémica del HBsAg, la combinación de los componentes del gel del Aloe también generó resultados superiores a los obtenidos con los elementos por separado.

En el caso de utilizarse los sistemas de envio de antigenos, la particulación del antigeno constituye un primer paso del procesamiento del mismo, el segundo paso lo constituye la adición del polisacárido activador del sistema inmune.

La consistencia viscosa del acemanano lo convierte en un vehiculo activo que incrementa la permanencia de la particula antigénica en el sitio de inoculación. No se descartan otras actividades como la inducción de citoquinas, la activación de mecanismos de toma de antigenos a nivel de célula M, el reclutamiento de distintas poblaciones de células del sistema inmunológico y el incremento de la actividad presentadora de antigenos.

La formulación objeto de esta invención presenta, de acuerdo al tamano de la especie a inmunizar un volumen de inóculo capaz de banar nasofaringe hasta subglotis. La dosis puede dividirse en 2 partes para su aplicación o introducirse de una vez. La concentración del polisacárido que garantiza un óptimo de respuesta inmunológica y a la vez una viscosidad adecuada para la mejor retención del antigeno en la mucosa está en un rango de 1 mg/mL a 12 mg/mL. Dentro de los requerimientos del antigeno se encuentra su carácter particulado ya que hemos comprobado que esta formulación nasal no resulta igualmente efectiva con el mismo antigeno soluble o sin actividad

como ligando especifico de mucosas. Por tanto el resultado positivo con un determinado tipo de antigenos no presupone un buen resultado para otro tipo, por lo que las caracteristicas del antigeno de ser particulado o tener actividad ligando para células epiteliales constituye un fuerte requerimiento del antigeno, lo cual se logra con los metodos de particulación previamente presentados.

La baja reactogenicidad a nivel de mucosas con respecto a los adyuvantes tipo toxina y microorganismos atenuados, junto al menor costo, la respuesta T independiente para el propio adyuvante y su actividad moduladora hacia una respuesta Thl, permiten generar respuestas superiores en calidad. A1 lograrse una mayor inmunogenicidad de los antigenos se pueden reducir el número de inoculaciones y la cantidad de antigeno por dosis.

EJEMPLOS DE REALIZACION Ejemplo 1 : El polisacárido acemanano se obtuvo a partir del extracto acuoso total de la hoja de Aloe barbadensis Miller. Las hojas se colectaron de plantas de 2 a 3 anos de edad y se mantuvieron por espacio de 2 a 3 días a 4O C en un lugar obscuro. Posteriormente se eliminaron las puntas de las hojas y sus bordes. Las hojas se dividieron en pequeñas porciones y se molieron adicionando una minima cantidad de agua estéril, a ratos, para facilitar dicho proceso. Para la obtención del acemanano también se partió del mucilago, como se conoce al gel interior de la hoja.

Las hojas o el gel, una vez molidos, se centrifugaron a 10 000 rpm, eliminando todos los restos insolubles, provenientes en su mayoria del tejido epidérmico y fibroso de la hoja. El sobrenadante liofilizado se nombró extracto total (Et). El Et se resuspendió a conveniencia para una posterior precipitación etanólica al 80% en agitación lenta. La temperatura de precipitación fue 4O C. A las 24 h se centrifugó la solución 20 min a 10 000 rpm y se desechó el sobrenadante. El precipitado se resuspendió en agua destilada estéril y se liofilizó. Este producto se denominó precipitado etanólico.

Para la obtención del acemanano con un alto grado de pureza se escogió la cromatografla de exclusión molecular en Sefarosa CL-4B. Se usó solución tamponada de fosfato salino (PBS) o NaCl 0.2 M para la corrida, al igual que para resuspeder la muestra. En la figura 1 se muestra el cromatograma de una cromatografía HPLC en una columna de gel filtración TSK G6000PW antes del paso de gel filtración en Sefarosa CL-4B. En dicho cromatograma se señala el punto que corresponde al volumen de elución del Azul Dextrana (AD), de PM=2000 kDa, y al final el punto que

corresponde al volumen de elución total (VET). El primer pico (M), de peso molecular superior al AD resultó positivo por el método colorimétrico de la Antrona (Trevelyan W. E. y Harrison J. S. 1952 Biochem J. 23 : 1824).

El análisis por espectroscopia infraroja de ambos picos mostró la presencia de bandas caracteristicas del acemanano en el primer pico de la cromatografía (M). Estos máximos, cercanos a 1250 y 1750 cm-1, denotan la presencia de acetilaciones propias del estado nativo de dicho polisacárido. Dichas bandas no se observaron en el pico correspondiente al volumen de elución total de la columna (VET).

Ejemplo 2 : Con el objetivo de evaluar la actividad inmunopotenciadora del extracto de la hoja de Aloe barbadensis Miller sobre el antigeno de superficie del virus de la Hepatitis B (HBsAg), se realizaron esquemas de inmunización por via intraperitoneal en ratones machos Balb/c de 6 a 8 semanas de vida. La comparación se hizo tomando como referencia la vacuna Heberbiovac-HB (producida en el CIGB, Cuba) cuyo antigeno está adsorbido en hidróxido de aluminio. Los esquemas de inmunización utilizados se especifican para cada caso (Figuras 2a y 2b).

La detección de la respuesta inmune al HBsAg se realizó por ELISA anti-HBsAg total, establecido para el control de calidad de la vacuna. Los titulos de anticuerpos se expresaron en unidades internacionales por litro. El análisis estadistico de los resultados se realizó por el test de Student : p<0.05 se consideró diferencia significativa.

En los dos esquemas hubo diferencias significativas entre ambos grupos. Se demostró con este ejemplo que es posible potenciar la respuesta inmune al HBsAg de manera significativa con respecto a la alúmina luego de una y dos inoculaciones por via intraperitoneal.

Ejemplo 3 Con el objetivo de evaluar dos de los componentes del extracto en base a sus posibilidades de potenciar la respuesta inmune, se seleccionaron el acemanano y el oxalato de calcio. Como controles del experimento se usaron alúmina y el Et. Las cantidades ensayadas y los resultados por grupo experimental se muestran en la tabla de la figura 3.

Esta prueba de inmunogenicidad fue precedida por experimentos de adsorción del HBsAg al oxalato de calcio, donde se evidenció que era posible esta unión. La adsorción al oxalato de calcio (presente en forma de sol coloidal en el Et del Aloe)

podria generar un efecto sinérgico con el acemanano en la potenciación de la respuesta inmune.

La extracción de la sangre se realizó a los 28 dias por punción retro-orbital. La evaluación de los resultados se realizó por el ELISA anti HBsAg total antes mencionado.

El grupo 6, el cual contiene la combinación del acemanano y el oxalato de calcio, tuvo una respuesta de anticuerpos significativamente superior al resto de los grupos.

Se evidenció un sinergismo entre el oxalato de calcio y el acemanano, con ellos se pudo reconstituir y superar la actividad inmunopotenciadora del extracto total. En este caso se muestra que la particulación del HBsAg sobre el sol de oxalato de calcio favorece la presentación de este antigeno al sistema inmunológico.

Ejemplo 4 : Para determinar la actividad inmunopotenciadora del acemanano por via mucosal, se realizaron pruebas de inmunogenicidad en ratones Balb/c de 7 a 10 semanas de nacidos, usando como modelo al antigeno de superficie del virus de la hepatitis B (HBsAg). La inoculación se realizó por via nasofaringea en volúmenes de 50 L en ratones anestesiados. La extracción se realizó por punción retro-orbital a los 28 dias de iniciado el esquema. La determinación de los titulos se realizó por el ELISA anti- HBsAg total. El análisis estadistico de los resultados se realizó por el test de Student : p<0.05 se consideró diferencia significativa.

Se ensayaron diferentes niveles de dosis del Acemanano, como control se usó el HBsAg en PBS. El antigeno se trabajó a un solo nivel : 5 pg/dosis. Los resultados se muestran en la tabla de la figura 4.

Se evidenció una fuerte actividad inmunopotenciadora en los grupos en que se adicionó el Acemanano. Todos los grupos fueron significativamente superiores al control de HBsAg en PBS. El incremento excesivo de la concentración del acemanano generó un efecto inhibitorio (Grupo 5). Esto pudiera deberse a un incremento de la viscosidad resultante.

Ejemplo 5 Con el objetivo de comparar la actividad inmunopotenciadora del acemanano para el HBsAg con otro adyuvante mucosal de referencia, se realizó un esquema de inmunización en el que se comparó con una formulación del HBsAg y toxina del cólera (CT) (Figuras 5a-d). Se ensayaron varias dosis de antigeno y se usó como control además la inoculación sistémica del HBsAg en alúmina. El esquema se realizó en ratones hembras Balb/c de 6 a 8 semanas de edad con cuatro inoculaciones en los

dias 0, 14,28 y 56. Se realizaron extracciones los dias 26,42 y 70. La evaluación de los sueros se realizó con el ELISA convencional para la detección de anticuerpos IgG de ratón especificos. Se analizaron los sueros a los 14 dias de la segunda, tercera y cuarta dosis.

Otro objetivo de este ensayo fue comparar la cinética de la respuesta inmune humoral en los grupos involucrados en el estudio.

Un análisis estadistico luego de una segunda dosis, no evidenció diferencias significativas entre el grupo control de alúmina (G4) y el grupo nasal con la misma cantidad de antigeno y acemanano (G1). El grupo de ratones inmunizados por via nasofaringea con CT como adyuvante (G5) generó una respuesta de anticuerpos superior a la del grupo con la menor cantidad de antigeno y no se diferenció significativamente del grupo con igual cantidad de antigeno vacunal (G2) (Figura 5a).

Luego de tres inmunizaciones, no existieron diferencias estadisticamente significativas entre el grupo de ratones inmunizados intranasalmente y sistémicamente con 2 p. g (G 1 y G4). De igual forma, no existieron diferencias significativas entre el grupo de ratones inmunizados con CT como adyuvante (G5) y la formulación en ensayo equivalente (G2), ambos con 10 ug de HBsAg (Figura 5b).

Teniendo en cuenta el fuerte incremento en los titulos de una segunda a una tercera dosis, nos dimos a la tarea de comprobar si este incremento siguió la misma pendiente para los distintos grupos ensayados luego de una cuarta dosis, aplicada al mes de la tercera inoculación. Los resultados se muestran en la figura 5c.

Es posible obtener, usando como adyuvante al acemanano, luego de cuatro dosis, una respuesta superior a la obtenida con CT en suero como se evidencia comparando G2 y G5.

La cinética de la respuesta muestra un incremento consistente que supera luego de tercera y cuarta dosis la respuesta generada por CT. Los niveles de anticuerpos generados por inoculación intranasal de 2 jug de Ag por dosis (G1) fueron significativamente superiores a los obtenidos por igual cantidad de antigeno administrado con alúmina por via sistémica (G4). Esta es la primera evidencia de que es posible alcanzar a través de inoculaciones nasofaringeas de antigenos particulados inactivos, adyuvados con polisacáridos, respuestas capaces de superar en cantidad y calidad a la respuesta generada por inoculaciones sistémicas usando alúmina.

Adicionalmente el hecho de que la potente respuesta mucosal sólo se logró inducir por la via nasofaringea, convierte en una posibilidad real la inoculación eficiente y potencialmente inocua en humanos del HBsAg. Este antigeno es un caso especial de

antigeno particulado de naturaleza proteoliposomal. Otros antigenos pueden usar esta via, con vistas a lograr respuestas sistémicas de tanta intensidad y mayor calidad. De este resultado se deduce que otros antigenos producidos en levaduras y que generalmente se particulan con tamanos similares al HBsAg se pueden usar con buenos resultados via nasal.

Cuantificacion de IgA a nivel de vagina (dia 70) Lograr una respuesta mucosal es de gran importancia si se considera que una de las vias de transmisión de la hepatitis B y otras enfermedades es la sexual.

Con el objetivo de comparar la respuesta de IgAs anti-HBsAg a nivel vaginal, se realizaron lavados vaginales de 100 p. L con PBS al dia 70 de la primera inoculación y posteriormente se analizó la respuesta de anticuerpos por ELISA anti-IgA convencional. Los resultados se cuantificaron relativos a un lavado vaginal con alto titulo que sirvió de control positivo, por tanto se consideraron unidades relativas (UR) (Figura 5d).

En la mucosa vaginal de los ratones inmunizados con alúmina como adyuvante por via sistémica (grupo 4) no se detectó respuesta de IgAs anti-HBsAg. Este resultado avala la importancia de la inmunización mucosal y especificamente la potencia del adyuvante, capaz de generar respuestas más fuertes en los grupos 2 y 3 aunque la diferencia no fue estadisticamente significativa. Los niveles de anticuerpos alcanzados con 2 ig y el polisacárido, no fueron estadisticamente diferentes a los alcanzados con 10 Fg y CT.

Ejemplo 6 Con el objetivo de demostrar la posibilidad de envio de antigenos a mucosas se utilizó el HBsAg para acoplar antigenos solubles conjugándolo quimicamente a un péptido multiantigénico (MAP) Th-B, formado por el epitope Th universal (830-843) de la toxina tetánica y un péptido B del lazo V3 de la gpl20 del VIH. La inoculación intranasal se efectuó según se describió con anterioridad y la extracción de la sangre se realizó también por punción retro-orbital a los 42 días de iniciado el esquema. La determinación de los titulos se realizó por ELISA anti IgG especifico para el péptido B.

Los titulos se determinaron en relación a un control positivo y por tanto se consideraron unidades relativas (UR) (Figura 6).

En el grupo B no hubo seroconversión. En el grupo A la seroconversión fue del 100%.

La presencia de dos ratones alto-respondedores afecta la visibilidad grana de otros dos que, aunque seroconvierten, tienen un menor titulo.

No obstante a estar mucho más representado el MAP (40pg) en el grupo B con respecto a lo que pudiese haber del mismo en los 20pg de conjugado HBsAg-MAP (grupo A), no hubo respuesta a nivel de suero en el grupo B. Como criterio de seroconversión se tomó el doble del promedio de las densidades ópticas de los controles negativos (ratones inmunizados por via nasofaringea con 20Rg de HBsAg Este resultado evidencia que la particulación, más allá de la presencia de epitopes Th, juega un papel importante para la respuesta al antigeno.

Como se conoce por la fisiologia de la ruta de inoculación, la particulación es importante, pero adyuvantes mucosales conocidos como CT subvierten esta necesidad. De aqui que podemos encontrar en la literatura numerosos ejemplos de la actividad inmunopotenciadora de CT para antigenos no particulados, entre ellos péptidos simples. Este efecto no se produce para el polisacárido sino con ayuda de la particulación.

Ejemplo 7 El polipéptido recombinante de la proteina Opc, una de las proteinas de la membrana externa de Neisseria meningitidis, fue incorporado en liposomas. Se evaluó su respuesta en ratones por via nasofaringea comparándola con la respuesta generada por el polipéptido soluble.

Inicialmente se demostró la actividad inmunopotenciadora sobre el liposoma. Se inmunizaron dos grupos de 10 ratones Balb/c. El grupo A se inmunizó con zig de proteina encapsulada en liposomas y el grupo B se inmunizó con 20pg de la misma preparación adicionándole acemanano a una concentración final de 6mg/mL. Se evaluó la respuesta humoral a nivel sistémico y en lavados pulmonares.

Los niveles de IgG se midieron por ELISA y se representaron como logaritmos de las unidades arbitrarias asignadas a cada suero. El grupo B mostró los mayores niveles de IgG sérico, la diferencia fue estadisticamente significativa (Figura 7a). Este experimento mostró la capacidad del acemanano para potenciar la respuesta inmune a formulaciones liposomales.

Un segundo experimento comparó el efecto potenciador del polisacárido sobre la proteina Opc en liposomas (A) y sobre la proteina Opc renaturalizada en octilglucósido 10 mg/mL (B). El uso de este detergente incrementó el reconocimiento de la proteina por cuatro anticuerpos monoclonales especificos para la proteina Opc natural. Dos de estos anticuerpos reconocen epitopes conformacionales y dos epitopes lineales. Según el criterio de reconocimiento por los anticuerpos monoclonales, la proteina Opc renaturalizada en octilglucósido presenta una conformación más cercana a la natural.

Se inmunizaron dos grupos de 10 ratones Balb/c por via intranasal. Se cuantificaron los niveles de anticuerpos en los sueros y en los lavados pulmonares y se representaron como logaritmos de las unidades arbitrarias asignadas a cada muestra (figura 7b).

Tanto en suero como en lavados mucosales se observó que la combinación de los liposomas con el polisacárido dio lugar a los titulos de inmunoglobulinas más altos y a la menor dispersión en la respuesta. El acemanano potencia significativamente la respuesta al antigeno cuando este es presentado al sistema inmune por el liposoma (sistema de envio de antigenos particulados).

Ejemplo 8 Con el objetivo de analizar cualitativamente la respuesta, se cuantificaron los niveles de IgGl, 2a y 2b mediante un ELISA convencional, con el empleo de conjugados especificos anti IgGl, 2a y 2b. En el experimento se compararon las respuestas obtenidas con acemanano como adyuvante por via IN (IN/Aloe) y con el antigeno inoculado por via intraperitoneal en polisacarido y oxalato de calcio (IP/Aloe), con la obtenida adyuvando con alúmina (IP/Alum) como control (Figura 8a).

El incremento de los niveles de anticuerpos IgG2a asociado al grupo del inmunoestimulante en estudio permite el uso de este tipo de formulaciones en el campo de las vacunas terapéuticas y preventivas que requieran una fuerte respuesta celular.

De acuerdo a lo anterior, es posible lograr un incremento en los niveles de respuesta inmune al antigeno de superficie por un incremento en los niveles de IgG2a e IgG2b.

Dentro de los elementos que pueden ser determinantes en la obtención de una respuesta inmune protectora se encuentran, no sólo los que tienen que ver con la intensidad de la misma sino también su calidad, es decir, que tipo de respuesta se genera como resultado de la inmunización. En los últimos anos uno de los temas que se abordan con más frecuencia en la inmunologia es el del tipo de respuesta T auxiliadora (Thl/Th2). Muchos autores han demostrado que la respuesta efectiva para patógenos intracelulares y virus es del tipo Thl, lo que se correlaciona con la respuesta citotóxica y con un incremento en la subclase IgG2a con respecto al resto de las subclases.

Con el objetivo de analizar si existe el mismo comportamiento para antigenos físicamente diferentes se realizó un esquema de inmunización usando un polipéptido multiepitópico (TAB9), compuesto por regiones del lazo V3 del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). La cuantificación de inmunoglobulinas anti TAB9 fue por ELISA convencional para la determinación de las subclases de IgG. Se inocularon 10 p. g de la proteina por via intraperitoneal con diferentes adyuvantes (Figura 8b).

De acuerdo a los resultados mostrados se evidencia un desplazamiento del equilibrio Th 1/Th2 hacia el tipo de respuesta Thl. El nivel de IgG2b con la combinación acemanano/oxalato de calcio es mayor al generado usando Quil A.

Este resultado es novedoso tanto para la formulación como para el polisacárido y permite su uso no sólo para potenciar respuestas sino también para modular las respuestas hacia Th 1, requerimiento de la inmunidad contra un alto número de patógenos y cáncer.

DESCRIPCION DE LAS FIGURAS Figura 1. Cromatografla HPLC. AD : Azul dextrana (2 000 kDa), M : muestra, VET : Volumen de elución total. Procesador cromatográfico BioCROM Versión 2.3 (1994).

Detector : Indice de Refracción (Knauer). Gel : TSK G6000PW (Rango de fraccionamiento : 500-50 000 kDa). Dimensiones : 7,5 x 600 mm. Flujo : 0,5 ml/min.

Buffer : PBS. Cantidad de muestra aplicada : 100 fui Figura 2a. Esquema de 2 dosis (0, 14 dias) y extracción a los 28 dias.

Figura 2b. Esquema de una dosis y extracción a los 28 dias.

Figura 3. Esquema de una dosis intraperitoneal y extracción a los 28 dias.

Figura 4. Esquema 0, 14 y extracción a los 28 dias.

Figura 5a. Evaluación de los sueros luego de segunda dosis.

Figura 5b. Evaluación de los sueros luego de la tercera dosis.

Figura 5c. Evaluación de los sueros luego de una cuarta dosis.

Figura 5d. Evaluación de los lavados vaginales (dia 70) Figura 6. El esquema usado fue 0, 14,28 y la extracción a los 42 dias. A : 20 pg de HBsAg conjugado a MAP+polisacárido (6mg/mL), B : 40 fig de MAP+ polisacárido (6mg/mL).

Figura 7a. Esquema de tres dosis : 0, 28,56 y extracción a los 63 dias.

Figura 7b. Esquema de tres dosis 0, 28,56 y extracción a los 63 dias.

Figura 8a. Esquema de tres dosis 0, 14,28 y extracción a los 42 dias. Los sueros de cada variante se agruparon para el análisis. La dilución de trabajo de las muestras fue 1 : 4000.

Figura 8b. Esquema de tres dosis 0, 14,28 y extracción a los 42 dias. Se muestran las medias geométricas de los titulos luego de una inmunización con la proteina multiepitópica TAB9 con diferentes adyuvantes.