METHODE, PROCEDE, ET KIT DE DIAGNOSTIC, PRONOSTIC, SUIVI D'UN CANCER

La présente invention concerne une méthode, un procédé et un kit permettant la mise en évidence précoce d'un cancer, en vue de son diagnostic, son pronostic ou lors de son suivi thérapeutique.

Plus particulièrement, la présente invention se rapporte à une nouvelle méthode, aux amorces d'amplification et aux sondes d'hybridation qui peuvent être mises en œuvre dans ce procédé, ainsi qu'un kit de diagnostic/pronostic/suivi d'un cancer chez les vertébrés.

Un «diagnostic» se définit comme la détermination d'une affection d'une personne atteinte d'une pathologie donnée ; un «pronostic» comme le degré de gravité permettant de prévoir l'évolution ultérieure d'une pathologie, et «thérapeutique» signifie un traitement à visée curative ou palliative proposé à un individu.

Le plus souvent un cancer rénal, par exemple, est asymptomatique et le diagnostic se réalise via des examens radiologiques tels une échographie, tomodensimétrie (scanner), urographie, ou imagerie par résonance magnétique (IRM) etc.

Cependant aux stades très précoces, il est difficile de détecter les petites tumeurs et d'affirmer leur nature cancéreuse par l'imagerie. La répétition des examens d'imagerie et/ou un examen histologique ou cytologique après biopsie ou ponction seront nécessaires.

Ces examens sont coûteux, manquent de sensibilité et certains prélèvements biologiques sont très invasifs et/ou douloureux.

II existe des tests de biologie moléculaire axés sur la recherche de l'ARN messager (ARNm) ou le dosage de la protéine d'un gène MN/CA9 présent dans les cellules malignes d'un individu atteint d'un cancer.

Le MN/CA9 est un marqueur moléculaire efficace pour la détection des cellules cancéreuses. Il est également appelé anhydrase carbonique 9 ou CA9. Ce gène encode une oncoprotéine antigène de membrane MN, l'isoenzyme MN/CA9 (genebank accession number : NM 000009). Le gène CA9 a pour fonction principale de réguler le pH et il est exprimé dans de nombreux cancers, et plus particulièrement dans le cancer du rein, notamment dans le type de tumeur le plus fréquent, le Carcinome Rénal à Cellules Conventionnelles (CRCC).

Les recherches actuelles tentent de mettre en évidence et de quantifier les ARNm des gènes impliqués dans un cancer dans les cellules tumorales circulantes, à partir d'extraits de cellules, ou la présence de la protéine CA9 dans un échantillon biologique.

Cependant ces études sont limitées soit aux échantillons prélevés dans une tumeur soit à une sensibilité très faible dans le sang des individus cancéreux. Ces tests ne sont donc pas toujours pertinents en tant que test de diagnostic.

De plus, ces tests ne permettent pas de dépister des stades précoces lors du diagnostic initial ou lors d'une récidive.

La demande de brevet américain n ^c US2007224606 se ra pporte à une méthode de pronostic comprenant la détection de la présence des produits d'expression du gène CA9. Il y est divulgué une corrélation de l'expression du gène CA9 avec le pronostic du cancer du rein. Cependant,

la valeur seuil utilisée correspond à 50% de cellules positives dans un échantillon de tumeur.

La demande de brevet internationale n° WO0110910, m ontre une méthode permettant d'utiliser la protéine d'expression du gène CA9 comme marqueur en vue d'améliorer le diagnostic cytologique.

Le procédé selon la présente invention permet notamment de déterminer la présence ou non d'un cancer, d'évaluer sa gravité, de déterminer le traitement le plus adapté ainsi que d'assurer le suivi des individus traités.

La présente invention pallie les inconvénients de l'art antérieur en proposant une nouvelle méthode, un procédé et un kit permettant la mise en évidence d'un cancer, en vue du diagnostic, du pronostic ou de son suivi thérapeutique.

La méthode selon l'invention est plus spécifique et beaucoup plus sensible.

De surcroît la méthode selon l'invention est simple et reproductible tout en étant à moindre coût.

Le procédé selon l'invention permet d'être également non invasif et non douloureux.

La présente invention a pour but de remédier aux inconvénients précédemment évoqués et consiste pour cela en un procédé ou méthode pour le diagnostic/pronostic/suivi d'un cancer chez les vertébrés, comprenant les étapes suivantes : i) extraction d'un matériel nucléique d'un échantillon biologique ; ii) utilisation d'au moins une paire d'amorces d'amplification en vue d'obtenir des amplicons d'au moins une séquence cible ;

iii) utilisation d'au moins une sonde de détection pour détecter la présence desdits amplicons ; caractérisé en ce que l'étape d'extraction est réalisée à partir d'un matériel nucléique extracellulaire d'un échantillon biologique.

Plus précisément ledit matériel nucléique correspond à l'ARN ou l'ADN du gène CA9 circulant à l'état libre dans un échantillon biologique.

Avantageusement, lorsque ledit matériel nucléique est de l'ARN, il subit une transcription inverse. De plus, dans ce cas, les étapes de transcription inverse et l'étape ii) sont effectuées en même temps (RT-PCR).

Ladite étape ii) selon l'invention est une PCR conventionnelle ou quantitative.

De manière avantageuse, les étapes ii) et iii) du procédé selon l'invention sont réalisées en même temps.

Ladite sonde de détection peut également comprendre un marqueur.

De manière plus précise, ladite paire d'amorces et/ou ladite sonde de détection comprend au moins 15 motifs nucléotidiques d'une séquence nucléotidique du gène CA9 choisie parmi les SEQ ID n° 1 à 6.

La présente invention concerne aussi : au moins une amorce d'amplification pour le diagnostic/pronostic/suivi d'un cancer comprenant au moins 15 motifs nucléotidiques d'une séquence nucléotidique choisie parmi les SEQ ID n°1 à 6 ;

une sonde de détection pour le diagnostic/pronostic/suivi d'un cancer comprenant au moins 15 motifs nucléotidiques d'une séquence nucléotidique choisie parmi SEQ ID n° 1 à 6.

Avantageusement, l'invention se rapporte également à un kit pour le diagnostic/pronostic/suivi d'un cancer comprenant au moins une paire d'amorces citées ci-dessus et/ou au moins une sonde de détection citée ci-dessus.

L'invention sera bien comprise à la lumière de la description qui suit, se rapportant à des exemples illustratifs, et en aucun cas exhaustifs, de la présente invention, en référence aux dessins, ci-joints, dans lesquels :

- la figure 1 illustre les taux d'ARNm CA9 de différents individus ;

- la figure 2 est un gel d'électrophorèse montrant les résultats d'une PCR conventionnelle ;

- la figure 3 représente les taux pré et post-opératoires d'ARNm CA9 chez des individus présentant un CRCC ; la figure 4 est une courbe ROC démontrant l'utilité diagnostique du taux d'ARNm CA9.

La présente invention propose une méthode, un procédé, un test et un kit permettant la mise en évidence d'un cancer, en vue du diagnostic, du pronostic ou du suivi thérapeutique, basés sur la mise en évidence d'un biomarqueur tumoral spécifique sur un simple prélèvement d'un échantillon biologique.

Un «échantillon biologique» est prélevé chez un individu en vue d'une quête de dépistage/diagnostic/suivi d'un cancer et notamment du rein. Cet échantillon, contenant des cellules et du matériel nucléique, peut être son sang, ses selles, sa salive, son urine, sa bile, son sérum, son plasma, son sperme, etc. ou un échantillon de tumeur.

Le «matériel nucléique» composé de séquences d'acides désoxyribonucléiques (ADN) ou ribonucléiques (ARN), ainsi prélevé chez ledit individu via ledit échantillon biologique comprend une séquence cible. Une «séquence cible» est une séquence nucléotidique spécifique d'un gène cible qu'il soit simple ou double brin, tel que le gène CA9.

Une «séquence nucléotidique» est un enchaînement de motifs nucléotidiques, c'est-à-dire une séquence d'acides nucléiques ou de polynucléotides ou de fragments de ces derniers.

On entend par «motif nucléotidique» un nucléotide naturel d'acide nucléique ou un nucléotide modifié (base, phosphate, sucre).

Les structures et les modifications de ces enchaînements sont soit naturelles, soit les résultantes d'une recombinaison génétique ou d'une synthèse chimique.

Les présents inventeurs ont axé leurs recherches sur le dosage des acides nucléiques d'un gène spécifique circulant à l'état libre dans un échantillon biologique, afin de créer un biomarqueur dans la détection d'un cancer.

Par exemple, la présence d'ARN ou d'ADN tumoral directement dans un échantillon biologique, telle l'analyse d'ARNm d'un gène dans le sérum d'un vertébré.

En effet, à titre illustratif, ils ont pu montrer que l'ARNm du gène CA9 pouvait être détecté directement dans le sérum ou le plasma d'un individu atteint d'un cancer rénal.

La figure 1 montre les taux d'ARNm CA9 chez des individus atteints de cancer du rein (CRCC), de tumeur bénigne (Oncocytome) et chez des individus sains. Ce schéma montre que les taux d'ARNm du gène CA9 chez les individus présentant un CRCC sont significativement plus élevés que chez les individus sains ou présentant une tumeur bénigne.

Jusqu'à présent, les acides nucléiques, tels les ADN ou ARN extracellulaires, étaient considérés comme trop fragiles et rapidement détruits par des enzymes ou par la congélation. Ainsi ils ne pouvaient résister dans de telles conditions, ce qui est un préjugé vaincu important.

Les présents inventeurs ont pu démontrer également la présence d'acides nucléiques du gène MN/CA9 dans des échantillons de sérum fraîchement recueilli, mais aussi après une simple coagulation du sang ou leur congélation.

Le procédé selon l'invention se rapporte à l'utilisation d'un nouveau marqueur moléculaire le gène CA9, et plus particulièrement ses acides nucléiques circulants extracellulaires dans un échantillon biologique.

Plus précisément il est recherché l'ARNm ou l'ADN du gène CA9 extracellulaire ou circulant à l'état libre, en opérant par une extraction de l'ARN OU l'ADN puis par une étape d'amplification (PCR conventionnelle ou quantitative) d'un échantillon biologique.

II est possible d'utiliser d'autres méthodes pour quantifier l'ARNm ou l'ADN du gène CA9.

De plus, le procédé selon l'invention concerne également de nouvelles séquences nucléotidiques d'une séquence cible, et plus particulièrement celle du gène CA9, qui peuvent être utilisées en tant qu'amorces

d'amplification ou de sondes d'hybridation afin de détecter et/ou pronostiquer et/ou suivre un individu atteint d'un cancer.

Plus particulièrement, les inventeurs ont découvert que lesdites séquences nucléotidiques cibles extracellulaires étaient présentes dans des échantillons biologiques, prélevés de manière non invasive, chez des individus atteint d'un cancer, notamment de type rénal.

De manière plus précise, ladite séquence nucléotidique selon l'invention comprenant au moins 15 motifs nucléotidiques d'une séquence choisie parmi les SEQ ID n°1 à nº6 est très pertinente :

- en tant qu'amorce d'amplification pour amplifier les séquences cibles, tel que le gène CA9,

- en tant que sonde d'hybridation pour une hybridation spécifique sur des séquences cibles, tels que le gène CA9.

Selon la présente invention, une «amorce d'amplification» est une séquence nucléique comprenant 15 à 200 motifs nucléotidiques, préférentiellement de 15 à 25 paires de bases d'au moins une séquence cible de matériel génétique.

Une «hybridation» est un processus par lequel deux séquences nucléiques, comme par exemple, une amorce et une séquence cible se lient dans des conditions spécifiques et bien connues de l'homme du métier.

Une «sonde d'hybridation» est une séquence nucléique de 15 à 200 motifs nucléotidiques, préférentiellement de 100 à 190 paires de bases d'au moins une séquence cible de matériel génétique. Cette sonde possède une spécificité d'hybridation dans des conditions spécifiques et déterminées afin qu'elle s'hybride avec la séquence nucléique cible.

L'ARNm du gène cible CA9 a pour séquence (genebank accession number : NM 001216): gcc cgt aca cac cgt gtg ctg gga cac ccc aca gtc agc cgc atg gct ccc ctg tgc ccc agc ccc tgg ctc cet ctg ttg atc ceg gcc cet gct cca ggc etc act gt g caa ctg ctg ctg tca ctg ctg ctt ctg atg cet gtc cat ccc cag agg ttg ccc cgg atg cag gag gat tec ccc ttg gga gga ggc tet tet ggg gaa gat gac cca ctg ggc gag gag gat ctg ccc agt gaa gag gat tca ccc aga gag gag gat cca ccc gga gag gag gat cta cet gga gag gag gat cta cet gga gag gag gat cta cet gaa gtt aag cet aaa tca gaa gaa gag ggc tec ctg aag tta gag gat cta cet act gtt gag gct cet gga gat cet caa gaa ccc cag aat aat gcc cac agg gac aa a gaa ggg gat gac cag agt cat tgg cgc tat gga ggc gac ceg ccc tgg ccc cgg gtg tec cca gcc tgc gcg ggc cgc ttc cag tec ceg gtg gat atc cgc ccc cag ctc gcc gcc ttc tgc ceg gcc ctg cgc ccc ctg gaa ctc ctg ggc ttc cag ctc ceg ceg ctc cca gaa ctg cgc ctg cgc aac aat ggc cac agt gtg caa ctg ace ctg cet cet ggg cta gag atg gct ctg ggt ccc ggg cgg gagt ace ggg ctc tgc agc tgc atc tgc act ggg ggg ctg cag gtc gtec ggg ctc gga gea cact gtg gaa ggc cac cgt ttc cet gcc gag atc cac gtg gtt cac ctc agc ace gcc ttt gcc aga gtt gac gag gcc ttg ggg cgc ceg gga ggc ctg gcc gtg ttg gcc gcc ttt ctg gag gag ggc ce g gaa gaa aac agt gcc tat gag cag ttg ctg tet cgc ttg gaa gaa atc gct gag gaa ggc tca gag act cag gtc cca gga ctg gac ata tet gea ctc ctg ccc tet gac ttc agc cgc tac ttc caa tat gag ggg tet ctg act aca ceg ccc tgt gcc cag ggt gtc atc tgg act gtg ttt aac cag aca gtg atg ctg agt gct aag cag ctc cac ace ctc tet gac ace ctg tgg gga cet ggt gac tet cgg cta cag ctg aac ttc ega gcg acg cag cet ttg aat ggg ega gtg att gag gcc tec ttc cet gct gga gtg gac agc agt cet cgg gct gct gag cca gtc cag ctg aat tec tgc ctg gct gct ggt gac atc cta gcc ctg gtt ttt ggc et cet ttt tgc tgt cac cag cgt cgc gtt cet tgt gea gat gag a ag gea gea cag aag ggg aac caa agg ggg tgt gag cta ceg ccc agc aga ggt agc ega gac tgg agc cta gag gct gga tet tgg aga atg tga gaa gcc agc cag agg cat ctg agg ggg agc cgg taa ctg tec tgt cet gct cat tat gcc act tec ttt taa ctg cca aga aat ttt tta aaa taa ata ttt ata at

i) La 1 ^ere étape consiste en une extraction du matériel nucléique d'un échantillon biologique.

La mise en évidence de la présence d'ARN ou d'ADN tumoral, à partir d'un échantillon biologique, nécessite l'extraction de l'ARN ou de l'ADN total dudit échantillon.

Cette extraction est réalisée par tout protocole d'extraction d'acides nucléiques d'échantillon biologique de type connu en soi. Cette étape est une purification consistant à séparer et à concentrer les acides nucléiques des autres constituants.

Par exemple, l'échantillon biologique peut être du sang (5ml) qui est ensuite centrifugé à 1200 g pendant 10 minutes à 4°C. Ainsi le sérum est séparé avant l'extraction de l'ARN total.

L'extraction d'ARN total peut être effectuée en utilisant par exemple le kit «RNeasy de Qiagen» conformément aux recommandations du fournisseur.

Les échantillons d'ARN sont ensuite stockés à -80ºC

Bien entendu, l'homme de l'art sait adapter l'extraction, la purification et la conservation des acides nucléiques en fonction des échantillons biologiques dont ils sont issus.

Comme il est recherché des acides nucléiques circulant à l'état libre, c'est- à-dire à extracellulaires, il n'est pas nécessaire de réaliser une lyse des cellules tumorales circulantes. Ce qui résulte en un procédé plus simple, moins coûteux en termes de temps et d'argent.

S'il s'agit de dosage d'ARN, l'étape i-bis) consiste en une transcription inverse.

L'étape de transcription inverse consiste à synthétiser un brin d'ADN complémentaire (ADNc) à partir d'ARNm. La synthèse d'un ADNc double brin, résultante d'une amplification ultérieure, permet de cloner des gènes souhaités afin de les utiliser comme sondes nucléotidiques pour la détection ou le dosage des ARNm correspondants.

Après purification, les ARNm subissent une étape de transcription inverse en ADNc simple brin en utilisant une enzyme à activité réverse transcriptase. Cette étape peut être réalisée à l'aide de kits commerciaux comme le kit « SuperScript™ First-Strand Synthesis System for RT-PCR » commercialisé par Invitrogen ou par toute méthode connue en soi.

ii) La 2 ^e étape est l'amplification par PCR (Polymerase Chain Reaction) de l'ADN ou de l'ADNc.

Le processus d'amplification par polymérisation enzymatique (technique de réplication ciblée, in vitro, dite «PCR», Polymerase Chain Reaction), permet d'obtenir à partir d'un échantillon contenant de l'ADN ou de l'ADNc, d'importantes quantités d'un fragment d'ADN spécifique, tel un marqueur tumoral, et de longueur définie en utilisant une paire d'amorces nucléotidiques.

Cette étape se réalise via l'utilisation d'amorces d'amplification afin de générer des amplicons d'au moins une séquence cible du matériel nucléique.

Ladite amorce et/ou ladite sonde comprend au moins 15 motifs nucléotidiques d'une séquence choisie parmi :

- une séquence de SEQ ID n°1 à 6 ;

- une séquence homologue de SEQ ID n°1 à 6 complém entaire ou suffisamment complémentaire ; ou présentant une homologie suffisante pour s'hybrider à SEQ ID n°1 à 6 ou à le urs séquences complémentaires ;

- une séquence comprenant une séquence de SEQ ID n°1 à 6, qui aurait la même fonction que l'amorce d'amplification.

Les séquences d'amorces et/ou des sondes comprenant au moins 15 motifs nucléotidiques d'une séquence nucléotidique du gène CA9 sont choisies parmi :

- GGA CAA AGA AGG GGA TGA CC (SEQ ID N°1 )

- AGT TCT GGG AGC GGC GGG A (SEQ ID N°2)

- CAG AGT CAT TGG CGC TAT GGA (SEQ ID N°3) - CGA GCT GGG GGC GGA TA (SEQ ID N°4)

- gga caa aga agg gga tga cca gag tca ttg gcg cta tgg agg cga c ce gec ctg gec ceg ggt gtc ecc age ctg ege ggg ceg ctt cca gtc ecc ggt gga tat ceg ecc cca gct ege ege ctt ctg ecc ggc cet gcg ecc ce t gga act cet ggg ctt cca gct ecc gec gct ecc aga act (SEQ ID N°5) - cag agt cat tgg ege tat gga ggc gac ceg ecc tgg ecc cgg gtg tec cca gec tgc gcg ggc ege ttc cag tec ceg gtg gat atc ege ecc cag etc g (SEQ ID N°6)

Ces amorces sont conçues en vue de recouvrir la jonction d'épissage afin d'éliminer les signaux engendrés par une contamination génomique.

A titre illustratif, la PCR conventionnelle peut être réalisée à l'aide du kit «Eppendorf MasterMix», selon les recommandations du fournisseur ou par toute méthode connue en soi.

Par exemple, les amorces utilisées de la séquence cible CA9 (186 pb) sont les SEQ ID N°1 et 2.

Le cycle PCR suivant peut être utilisé pour réaliser l'amplification génique de toute séquence spécifique à l'aide d'un thermocycleur (« Perkin Elmer » par exemple).

Après une étape préalable de dénaturation à 94ºC (2 minutes), trente cinq cycles PCR peuvent ainsi être réalisés afin d'amplifier suffisamment le matériel génique. Chaque cycle pourra comprendre une nouvelle étape de dénaturation à 94ºC (1 minute) suivie d'une étape d ite d'hybridation des amorces à 57ºC (1 minute) et enfin une dernière éta pe dite d'élongation à 72ºC (1 minute pour 1000 nucléotides à amplifier). Une étape finale à 72ºC (5 minutes) est également nécessaire afin de t erminer l'élongation de tous les fragments. La température d'hybridation des amorces devra être calculée en fonction du Tm de chaque amorce.

De manière alternative, lorsqu'il s'agit d'analyser l'ARNm issu d'un échantillon biologique, la transcription inverse et la PCR (RT-PCR) sont réalisées simultanément en une étape (étapes i-bis et ii simultanées). La RT-PCR en une étape est effectuée en utilisant par exemple, les kits «Super Script™ One-Step RT-PCR» et «Platinum tag » de la société Invitrogen conformément aux recommandations du fournisseur. La réaction de RT-PCR sera également réalisée sur un thermocycleur (« Perkin Elmer » par exemple) selon les conditions suivantes : une étape à 50ºC (30 min) permettant la transcription inverse suivie d'une étape de dénaturation à 94ºC (2 min), puis suivie de 35 cycl es de PCR comme décrit précédemment.

Pour chaque analyse PCR, des contrôles négatifs (sans acides nucléiques) et positifs (par exemple à partir d'un plasmide codant le gène CA9) sont réalisés en parallèle.

Avantageusement, la PCR opérée peut être quantitative. Ainsi la technique «SYBR green» est utilisée et basée sur la courbe standard obtenue à partir de plasmides codant le gène CA9.

Dans ce cas, les amorces de la séquence cible CA9 (100bp) peuvent être les SEQ ID N nº3 et 4.

La PCR quantitative est effectuée après la réaction de RT-PCR décrite précédemment à l'aide du kit «QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix» de la société Quiagen conformément aux recommandations du fournisseur. Les conditions de la réaction PCR réalisée à l'aide d'un thermocycleur (par exemple « Perkin Elmer ») sont les suivantes : une étape de dénaturation à 95ºC (10 minutes), suivie d e quarante cycles constitués d'une nouvelle étape de dénaturation à 95ºC (15 secondes), d'une étape d'hybridation à 58ºC (15 secondes) et d'une étape d'élongation à 72ºC (30 secondes). Un cycle final c onstitué d'une étape de dénaturation à 95ºC (15 secondes), d'une étape d'él ongation finale à 60ºC (1 minute) et d'une dernière dénaturation à 95ºC (1 5 secondes) doit être réalisée conformément aux recommandations du fournisseur.

iii) La 3 ^e étape est la détection.

Lors de l'étape de détection des acides nucléiques cibles, il peut être prévu d'utiliser une sonde de détection spécifique.

Bien entendu, cette étape de détection directe ou indirecte, peut être réalisée par tout autre mode de détection de type connu en soi.

De manière avantageuse, la sonde d'hybridation est une sonde de détection. En effet, la sonde d'hybridation peut comprendre un marqueur permettant sa détection. Ledit «marqueur» est un traceur capable de repérer, marquer ou distinguer ce qui est reconnaissable du fait de sa propriété physique ou chimique (radioactivité, fluorescence, masse, couleur, luminescence et autres... via des détections optique, électrique, etc.) en très faible quantité.

Les amorces fonctionnelles peuvent être analysées avec un fluorochrome ou un autre fluorescent ou «quencher» qui se lie spécifiquement au produit d'amplification (ADN double brin).

Ainsi on peut détecter une réaction d'hybridation entre une sonde de détection et la séquence cible.

De manière alternative, il peut être prévu que la sonde de détection soit une sonde de détection «molecular beacon».

La sonde d'hybridation peut également être une sonde de capture, où ladite sonde est immobilisée sur un support solide par tout moyen approprié (de type connu en soi). On détectera ensuite la réaction d'hybridation entre la sonde de capture et la séquence cible.

Pour la détection de la réaction d'hybridation, on peut également utiliser des séquences cibles marquées, directement ou indirectement de la séquence cible.

De manière alternative, l'étape d'hybridation peut être une étape de marquage et/ou de clivage de la séquence cible.

Afin de s'affranchir des dimères d'amorces qui se constituent spontanément, il peut être prévu de lier aux amorces sens et antisens une sonde taqman spécifique construite à l'aide de logiciels bien connus.

Les inventeurs de la présente invention, en vue de corriger toute variabilité d'efficacité enzymatique possible, ont normalisé l'expression du gène cible par la détermination d'un ratio gène-cible/gène de ménage (NADPH ou β- actine par exemple) dont l'expression est obligatoire et courante chez tous les individus. Les amorces du gène de ménage et plus particulièrement le NADPH sont par exemple:

- amorce sens 5' AAA GGA CAT TTC CAC CGC AAA 3'

- amorce antisens 5' GGT CGG GTC AAC GCT AGG CT 3'

De manière alternative, l'amplification, étape ii), (PCR conventionnelle ou quantitative) est réalisée en même temps que l'étape de la détection, étape iii).

A titre d'exemple, les produits de PCR ou amplicons peuvent être séparés par électrophorèse sur gel d'agarose 1.0%, puis visualisés par illumination sous UV après coloration de l'ADN par le bromure d'éthidium.

Le fragment attendu est identifié par comigration d'un marqueur de taille moléculaire.

La figure 2 montre ainsi la positivité de l'ARNm CA9 dans les cas de CRCC et la négativité dans les tumeurs bénignes (oncocytome) et les individus sains. M signifie marqueur de taille moléculaire.

Les résultats explicités ci-après sont illustratifs d'expériences de comparaison réalisées et en aucun cas limitatifs.

Le Tableau 1 , ci-dessous, décrit les caractéristiques des individus de l'étude, à titre d'exemple, pour la présente invention. 71 individus présentant un CRCC, 12 individus avec un oncocytome rénal et 44 individus sains.

Le Tableau 2 ci-dessus, donne les résultats d'une PCR quantitative dans les différents groupes. Les résultats indiquent que les taux d'ARNm CA9 ne sont pas liés à la taille de la tumeur.

Le Tableau 3 ci-dessus compare les résultats du test de détection selon l'invention d'ARNm du gène CA9 dans le sérum/plasma avec celui du test ELISA utilisant la protéine CA9 dans le sérum pour le diagnostic de cancer.

Dans ce but, un seuil de positivité de la technique ELISA a été au préalable calculé sur une population de 48 individus sains. Ce seuil de positivité est de 100 pg/ml et correspond classiquement à la moyenne des échantillons plus ou moins deux déviations standards (+/- 2DS). Les résultats de la technique de détection des ARNm CA9 sont bien meilleurs que ceux du test ELISA en termes de sensibilité, de spécificité et de valeur prédictive.

La figure 3 montre la diminution du taux d'ARNm CA9 après chirurgie (néphrectomie). En effet, les taux d'ARNm CA9 diminuent significativement ou s'annulent une semaine après l'ablation de la tumeur.

La figure 4 est la courbe ROC « Receiver Operating Characteristic » démontrant l'utilité diagnostique du taux d'ARNm CA9. Cette courbe permet d'analyser les modifications de la spécificité et de la sensibilité d'un test pour différentes valeurs du seuil de discrimination. L'aire sous la courbe ROC est un estimateur de l'efficacité globale. Dans le présent cas selon l'invention, l'aire sous la courbe est de 0.946 (intervalle de confiance 95% : 0,904-0,993) ce qui signifie que le test est parfaitement discriminatif.

Comparé aux tests actuellement commercialisés, le test selon la présente invention diffère par l'utilisation d'un nouveau marqueur moléculaire et plus particulièrement, les acides nucléiques du gène CA9 extracellulaires, avec une technique d'amplification et/ou détection et/ou de quantification (PCR ou RT PCR quantitative ou conventionnelle), d'un procédé non invasif tout en ayant un bon ratio coût/efficacité.

Bien entendu, la méthode et le test selon l'invention peuvent être combinés avec, ou inclure, d'autres marqueurs moléculaires en vue d'augmenter encore sa sensibilité et sa spécificité en fonction des cancers recherchés.

La présente invention permet, en outre, d'améliorer la stratégie de dépistage ainsi que les traitements des formes précoces de cancer ou précancéreuses.