Die Erfindung betrifft 3- (Aminoacyl-amino) -saccharide und Verfahren zu ihrer Herstellung aus 3-Amino-allo-saccharose.

Verknüpfungen von Aminosäuren und Sacchariden liegen haupt¬ sächlich in Glycopeptiden bzw. Glycoproteinen und in geringem Anteil auch in bakteriellen Lipopolysacchariden vor. Bei Gly¬ copeptiden handelt es sich um Partialstrukturen, die als Ver¬ knüpfungsregion von Sacchariden und Proteinen in Glycoprotei¬ nen vorkommen. Glycoproteine, die in löslicher Form im Blut und in zahlreichen Sekreten sowie in fixierter Form in Mem¬ brandoppelschichten zu finden sind, haben in letzter Zeit an Interesse gewonnen, seit ihre Funktion in biologischen Steue¬ rungsprozessen erkannt und untersucht wurde. In vielen Fällen dienen die Kohlenhydrat-Seitenketten als Erkennungssignal.

Die Art der kovalenten Bindung zwischen Protein und Kohlenhy¬ drat-Seitenkette unterscheidet sich trotz der großen Vielzahl der natürlich vorkommenden Glycoproteine jedoch kaum, was durch die Biosynthese der Glycoproteine bedingt ist. Die bei¬ den Komponenten sind über eine glycosidische Bindung ver¬ knüpft, wobei man N-Glycoproteine und O-Glycoproteine unter¬ scheidet. Bei den N-Glycoproteinen ist meist die Seitenket- ten-Amidgruppe eines Asparagin-Bausteins mit 2-Acetamido-2- desoxy-D-glucose ß-N-glycosidisch verknüpft. Daneben sind in neuerer Zeit jedoch auch N-Glycosyl- und N-Galactosyl-Struk¬ turen gefunden worden. Bei den O-Glycoproteinen liegt meist eine α-O-glycosidische Verknüpfung von 2-Acetamido-2-desoxy- D-galactose oder eine ß-O-glycosidische Verknüpfung von D- Xylose mit einer Hydroxylgruppe von Serin oder Threonin vor

(H. Paulsen, Synthesen, Konformationen und Röntgen-Struk¬ turanalysen von Saccharidketten der Core-Regionen von Glyco- proteinen, Angew. Chem. 102 (1990) 851-867; H. Kunz, Synthese von Glycopeptiden - Partialstrukturen biologischer Erken¬ nungskomponenten, Angew. Chem. 99 (1987) 297-311; J. Mon- treuil, Primary Structure of Glycoprotein Glycans, Adv. Car- bohydr. Chem. Biochem. 37 (1980) 157-223) .

Auch in Lipopolysacchariden bakteriellen Ursprungs wurden vereinzelt Aminosäuren nachgewiesen, die über eine Amidbin- dung mit Aminozuckern verknüpft sind, z.B. N-Acetylglycin, das über die Aminogruppe des 4-Amino-4,6-didesoxy-D-glycopy- ranosyl-Rests an die 0-spezifische Seitenkette des Lipopoly- saccharids von Shigella dysenteriae Typ 7 gebunden ist (Y. A. Knirel et al. , Carbohydr. Res. 179 (1988) 51-60), oder N-Ace- tyl-L-serin, das über die Aminogruppe des 3-Amino-3,6-dides- oxy-D-glucopyranosyl-Rests mit der O-spezifischen Seitenkette der Lipopolysaccharids von Escherichia coli 0114 verknüpft ist (V. L. L'vov et al. , Carbohydr. Res. 112 (1983) 233-239) . Diese Stoffe wirken als Antigene.

Die Erfindung bezieht sich auf neue 3- (Aminoacyl-amino) -sac- charide der folgenden Formel I,

in der R ¹ Wasserstoff, eine Carboxylgruppe oder eine Phenylgruppe oder eine Alkylgruppe mit 1 - 10 C-Atomen, die ggf. durch eine Phenyl-, Carboxyl-, Hydroxyl-, Mer¬ capto- oder Aminogruppe substituiert ist, wobei die genannten Substituenten ggf. mit Schutzgruppen versehen sind, bedeutet,

R ² Wasserstoff, eine in der Peptidchemie übliche Amino- schutzgruppe oder eine Peptidgruppe ist und

R ³ Wasserstoff oder einen Fructosylrest darstellt, n = 0 oder 1 ist,

insbesondere die 3- (L-Aminoacyl-amino) -D-allopyranosyl-ß-D- fructofuranoside, im folgenden mit 3- (Aminoacyl-amino) -allo- saccharose bezeichnet, und 3- (L-Aminoacyl-amino) -D-allopyra- nosen. Die Erfindung umfaßt ferner Herstellungsverfahren für diese Stoffe ausgehend von 3-Amino-3-desoxy-D-allo-pyranosyl- ß:-D-fructofuranosid, kurz 3-Amino-allo-saccharose genannt.

Bei den erfindungsgemäßen 3- (Aminoacyl-amino) -allo-sacchari- den handelt es sich um Stoffe, in denen die Carboxylgruppe einer Aminosäure über eine Säureamidbindung an die Amino¬ gruppe der 3-Amino-allo-Saccharose gebunden ist. Diese Ver¬ bindungen enthalten somit im Gegensatz zu den Glycoproteinen keine glycosidische Bindung zwischen Kohlenhydrat und Amino¬ säure, sondern weisen eine ähnliche Verknüpfungsstruktur auf wie die oben erwähnten Lipopolysaccharide.

Die 3- (Aminoacyl-amino) -allo-Saccharosen ermöglichen mit Hilfe der Methoden der Glycopeptidsynthese die Herstellung neuartiger Glycopeptide, in denen Kohlenhydrat und Protein nicht über eine N-glycosidische Bindung, sondern über eine Säureamidbindung verknüpft sind. Hierfür sind als Ausgangs¬ verbindungen insbesondere saure und basische Aminosäuren geeignet, da der Aminosäurerest in den Aminosäure-sacchariden jeweils noch zwei funktionelle Gruppen enthält, also die Pep- tidkette an zwei Seiten aufgebaut werden kann.

Die Herstellung von Glycopeptiden ist normalerweise aufgrund der Polyfunktionalität beider Ausgangskomponenten sehr pro¬ blematisch und erfordert meist den Einsatz von Schutzgruppen

sowohl am Saccharid als auch an der Aminosäure bzw. dem Pep- tid. Durch den Einsatz der 3-Amino-allo-saccharose, die ohne Einführung von Schutzgruppen erhalten werden kann, ist es nun möglich, für die Synthese der 3-Aminoacylgruppe im Saccha- ridteil ganz auf Schutzgruppen zu verzichten.

Über die Abspaltung des Fructosylrests der 3- (Aminoacyl- amino) -allo-saccharosen kann man auch zu 3- (Aminoacyl-amino) - allose gelangen, die ihrerseits zur Herstellung von Glycopep¬ tiden dienen kann. In diesem Fall läßt sich sowohl eine Pep- tidkette aufbauen, indem an den Aminosäurerest weitere Amino¬ säuren geknüpft werden, als auch über die Allose eine Oligo- saccharidkette herstellen.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen sowie daraus hergestellte Derivate sind in der interdisziplinären Forschung und Anwen¬ dung einsetzbar, z. B. zur Aufklärung der biologischen Funk¬ tion von Glycoproteinen, zur Induktion von Antikörpern, zur Erforschung der biologischen Erkennung und Selektivität und zur Entwicklung von pharmazeutischen Wirkstoffen sowie als potentieller Hemmstoff für Enzyme und Mikroorganismen.

Die Herstellung der 3- (L-Aminoacyl) -amino-allo-saccharide geht von Saccharose aus. In dieses polyfunktionelle Molekül wird durch eine mikrobielle Oxidation mit Agrobacterium tumefaciens eine Ketogruppe am C-3 des Glucosylrests einge¬ führt, die anschließend mittels reduktiver Aminierung, z.B. mit Ammoniak, Hydroxylamin oder Hydrazin mittels Wasserstoff und Metallkatalysator, selektiv in eine Aminogruppe überführt werden kann. Nach chromatogaphischer Reinigung erhält man das Aminierungsprodukt 3-Amino-allo-saccharose (M. Pietsch, Dis¬ sertation TU-Braunschweig, 1993) . Dieser Syntheseweg ist in ähnlicher Weise bereits für die Herstellung von Diaminen aus reduzierenden Sacchariden in EP 0 399 448 A2 beschrieben.

Die 3-Amino-allo-saccharose dient nun ihrerseits als Aus¬ gangsprodukt für die 3- (Aminoacyl-amino) -allo-saccharide: Die Umsetzung gelingt überraschenderweise in Anlehnung an das von M. Kiyozumi et al . , Carbohydr. Res. 14 (1970) 355-364 beschriebene Verfahren. Dazu wird die 3-Amino-allo-Saccharose mit N-terminal geschützten Amino- und Diaminosäuren bzw. mit N- und C-terminal geschützten Aminodicarbonsäuren oder ent¬ sprechend geschützten Peptiden in einem Pyridin-Wasser- Gemisch unter Aktivierung der Carboxylfunktion der Aminosäure mittels N,N' -Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) umgesetzt. Anschließend können die Schutzgruppen abgespalten werden. Eine Reinigung der Reaktionsprodukte ist z. B. durch Säulen¬ chromatographie möglich. Der Strukturnachweis der gereinigten Substanzen erfolgt mittels ¹³ C-NMR-Spektroskopie und Fast- Atom-Bombardment-Massenspektrometrie (FAB-MS) .

Als Verfahren für die Herstellung der 3- (Aminoacyl- amino) saccharide werden folgende Schritte vorgeschlagen:

1. Oxidation von Saccharose z. B. mit Bakterien des Stammes Agrobacterium tumefaciens NCPPB 396 zu 3-Keto-saccharo- se.

2. Reduktive Aminierung der 3-Keto-saccharose sowie Aufar¬ beitung und Trennung des entstehenden Produktgemisches und Isolierung der 3-Amino-allo-saccharose.

3. N-Acylierung der 3-Amino-allo-saccharose mit Aminosäuren oder Peptiden mit einer aktivierten Carboxylgruppe, de¬ ren übrige Amino- und Carboxylgruppen mittels in der Peptidchemie üblichen Schutzgruppen ggf. geschützt sind.

4. Abspaltung einer oder mehrerer Schutzgruppen vom Amino¬ säurerest der Substanz und/oder des Fructosylrests aus der Saccharosegruppe sowie Isolierung und Reinigung des Produktes.

Für die Aktivierung der Carboxylgruppe wird Dicyclohexylcar- bodiimid (DCC) bevorzugt, jedoch sind auch 1, 2-Dihydro-2- ethoxychinolin-1-Carbonsäureethylester (EEDQ) als Kopplungs¬ reagenz und andere aktivierte Carboxylgruppen, wie Anhydride, Ester, Azide oder Halogenide, verwendbar, soweit sie nicht in größerem Maße mit den Hydroxylgruppen des Saccharids reagieren.

Als Aminoschutzgruppen sind alle aus der Peptidchemie bekann¬ ten Gruppen verwendbar, die sich in schonender Weise wieder abspalten lassen. Beispielsweise seien Benzyloxycarbonyl (CBZ) , t-Butyloxycarbonyl (BOC) und Triphenylmethyl (Trt) genannt, die durch katalytische Hydrierung bzw. saure Hy¬ drolyse mit Halogenwasserstoffsäuren, insbesondere aber mit Trifluoressigsäure wieder abgespalten werden.

Als Carboxylschutzgruppen sind beispielsweise Alkylester, und insbesondere Benzylester zu nennen, die sauer oder alkalisch abgespalten werden können. Die Benzylgruppen sind darüber- hinaus besonders schonend durch Hydrogenolyse zu entfernen.

Als Aminosäuren werden die in großen Mengen durch Hydrolyse von Proteinen erhältlichen "natürlichen" L-Aminosäuren bevor¬ zugt, jedoch können für bestimmte Zwecke auch synthetisch hergestellte racemische oder D-Aminosäuren oder in der Natur nicht vorkommende Aminosäuren verwendet werden. Weiterhin kann statt einer Aminosäure auch ein entsprechendes Peptid eingesetzt werden.

Die Erfindung wird durch folgende Beispiele näher erläuter .

Beispiel 1;

Kopplung von 3-Amino-allo-saccharose mit Aminosäuren, die reine Kohlenwasserstoff-Seitenketten enthalten

3- (L- eucyl-amino) -a o-sacc arose

200 mg 3-Amino-allo-saccharose werden zusammen mit 137 mg N- BOC-L-Leucin (0,059 mmol) in 13 ml Lösungsmittel (Pyridin/ H ₂ 0, 4:1) gelöst und im Eisbad gekühlt. Unter Kühlung wird anschließend DCC (1,0 mmol gelöst in 0,5 ml Lösungsmittel) unter Rühren und Kühlung langsam zugetropft . Nach einiger Zeit wird die Kühlung beendet. Nach ca. 17stündiger Reakti¬ onszeit (mit Rührung) wird die Reaktion durch Zugabe eines Tropfen Eisessig zur Reaktionsmischung abgebrochen und nach 15minütigem Rühren der entstandene unlösliche Dicyclohexyl- harnstoff abfiltriert. Das Lösungsmittel wird unter Zusatz von Toluol schonend am Rotationsverdampfer (40 °C, Vakuum) entfernt. Das Reaktionsprodukt wird mit Wasser und Diethyl- ether in einen Schütteltrichter überführt und die wäßrige Phase mehrmals mit Diethylether extrahiert. Das Reaktions¬ produkt in der wäßrigen Phase wird gefriergetrocknet und das Produkt mittels Säulenchromatographie (stat. Phase: Kiesel¬ gel, Eluent: Essigsäureethylester/ Ethanol/Wasser, 5:3:1) gereinigt. Man erhält 3- (N-t-BOC-L-Leucyl-amino) -allo-saccha- rose in 35 %iger Ausbeute.

^C 23 ^H 42 ^N 2°13 ( ^{M= 554} g moD

¹³ C-NMR-Daten (75,5 MHz, D ₂ 0/Aceton-d ₆ ) : =178,0 (Cl' '), 158,3 (C7' ^* ), 105,0 (C2'), 93,0 (Cl) , 82,6 (C5-) , 82,2 (C8 ^* ') , 77,5 (C3 ' ) , 74,6 (C4 ' ) , 69,4/66,1/65,7 (C2,4,5) , 62,9/62,4 (C6\l ^* ) , 60,8 (C6) , 55,3/53,4 (C3,2 ^» *) , 40,8 (C3' ') , 28,5 (CS ^{1 1} -!! ^{1 1} ), 25,1 (C4 ^{1 1} ) , 23,1 (C5 ^■ ',6 ^{, ,} )

FAB-Massenspektrum (pos., Matrix Glycerin) : m/z= 555 [M+H] ⁺ , 393 [M-Fructosylrest+H] ⁺ , 761 [M+2Glycerin+Na] ⁺ Die Abspaltung der t-Butyloxycarbonyl (BOC) -Schutzgruppe erfolgt mit 90 %iger Trifluoresssigsäure: Hierzu wird das Reaktionsprodukt in kalter 90 %iger Trifluoressigsäure gelöst und 20 bis 30 min bei 4 °C stehen gelassen. Anschließend wird die Substanz durch Zugabe von kaltem, trockenen Diethylether ausgefällt, abfiltriert und mehrmals mit Di-ethylether nachgewaschen. Nach säulenchromatographischer Reinigung erhält man 3- (L-Leucyl-amino) -allo-saccharose.

In gleicher Weise werden hergestellt :

3- (N-BOC-T,-Alanγl-amino) -allo-saccharose C ₂₀ H _3g N ₂ O ₁₃ (M= 512 g/mol)

¹³ C-NMR-Daten (75,5 MHz, D ₂ 0/Aceton-d ₆ ) :

6=170,8 (Cl ^{1 1} ) , 154,9 (C4 ' ' ) , 104,2 (C2 ¹ ) , 91,6 (Cl) , 82,7 (C5') , 78,2 (C5' ') _; 76,4 (C3 ^• ) , 73,7 (C4') , 69,0/65,5/65,0 (C2,4,5) , 61,8 (C6M ¹ ) , 60,1 (C6) , 55,3 (C3) , 49,5 (C2 ¹ ') ,

28,1 (C6 ' ' -8 ' ^■ ) , 17,9 (C3 ' ' )

3- (N-BOC-L-Phenvlalanvl-amino) -allo-saccharose C^H^^O-^ (M= 588 g/mol)

¹³ C-NMR-Daten (75,5 MHz, D ₂ 0/Aceton-d ₆ : δ=176,3 (Cl ^{1 1} ) . 158,0 (C10' ¹ ), 137,0 (C4 ' ' ) , 128,9/128,5/ 128,1 (CS ¹ '-^ ^* ) , 104,5 (C2') , 92,5 (Cl) , 82,4 (C5 ' ) , 81,0 (Cll* *) , 77,4 (C3-) , 74,3 (C4 ^• ) , 69,2/65,7/65,4 (C2,4,5) , 66,5 (C6') , 62,4 (Cl ¹ ) , 60,5 (C6) , 56,0/53,0 (C3,2' ') , 40,5 (C3 ' ' ) , 28,1 (C12 ^* '-14' ' )

FAB-Massenspektrum (pos., Matrix Glycerin) : m/z= 589[M+H] ⁺ , 427 [M-Fructosylrest+H] ⁺ , 611 [M+Na] +

Auch aus diesen Verbindungen kann die BOC-Gruppe mit Triflu- oressigsäure abgespalten werden.

Beispiel 2

Kopplung von 3-Amino-allo-saccharose mit sauren und basischen

Aminosäuren

3- (4-L-Aspartyl -amino) -allo-saccharose C ₁₆ H ₂₈ N ₂ θ ₁₃ (M= 456 g/mol)

Dazu werden 150 mg 3-Amino-allo-saccharose (0,44 mmol) zusam¬ men mit 142 mg N-t-BOC-L-Asparaginsäure- -benzylester in 13 ml Lösungsmittel (Pyridin/H ₂ 0, 4:1) gelöst und im Eisbad gekühlt. Unter Kühlung wird anschließend DCC (0,7 mmol gelöst in 0,5 ml Lösungsmittel) unter Rühren und Kühlung langsam zugetropft. Nach einiger Zeit wird die Kühlung beendet. Nach ca. 17stündiger Reaktionszeit (mit Rührung) wird die Reaktion durch Zugabe eines Tropfens Eisessig zur Reaktionsmischung abgebrochen und nach 15minütigem Rühren der entstandene unlösliche Dicyclohexylharnstoff abfiltriert. Das Lösungsmit¬ tel wird unter Zusatz von Toluol schonend am Rotationsver¬ dampfer (40 °C, Vakuum) entfernt. Das Reaktionsprodukt wird mit Wasser und Diethylether in einen Schütteltrichter über¬ führt und die wäßrige Phase mehrmals mit Diethylether extra¬ hiert. Das Reaktionsprodukt in der wäßrigen Phase wird gefriergetrocknet.

Die Abspaltung der Benzyl-Schutzgruppe an der α-Carboxyl- gruppe des Asparaginsäure-Rests erfolgt durch Hydrogenolyse. Hierzu wird das gefriergetrocknete Rohprodukt (200 mg) in einem Dreihalskolben mit Rückflußkühler in 22 ml Methanol gelöst . Die Lösung wird in Gegenwart eines Katalysators (Palladium/Aktivkohle, 10 % Pd) unter Rühren 3 h bei einer Temperatur von 30 bis 40 °C mit durchstömendem Wasserstoff behandelt, nachdem vorher der Luftsauerstoff durch Stickstoff

verdrängt worden ist. Nach Abfiltrieren des Katalysators und Entfernen des Lösungsmittels am Rotationsverdampfer (30 °C, Vakuum) wird das Produkt mittels Säulenchromatographie (stat. Phase: Kieselgel, Eluent : Essigsäureethyl-ester/Ethanol/Was- ser, 5:3:1) gereinigt. Man erhält 3- (N-BOC-4-L-Aspartyl- amino) -allo-saccharose in 44 %iger Ausbeute.

Die Abspaltung der BOC-Schutzgruppe erfolgt mit 90 %iger Trifluoresssigsäure: Hierzu wird das Reaktionsprodukt in 0 , 7 ml kalter 90 %iger Trifluoressigsäure gelöst und 15 bis 20 min bei 4 °C stehen gelassen. Anschließend wird die Substanz durch Zugabe von kaltem, trockenen Diethylether ausgefällt, abfiltriert und mehrmals mit Diethylether nachgewaschen. Nach säulenchromatographischer Reinigung erhält man 3- (4-L-Aspar- tyl-amino) -allo-saccharose (77 % Ausbeute) .

¹³ C-NMR-Daten (75,5 MHz, D ₂ 0/Aceton-d ₆ ) :

6=174,7/174,1 (Cl ¹ ' , 4' ') , 104,8 (C2') , 93,2 (Cl) , 82,7

(C5 ¹ ) , 77,3 (C3 ^* ) , 74,9 (C4 ^* ) , 69,6/66,2/65,9 (C2,4,5) , 63,2/62,3 (C6 ^* , 1') , 61,1 (C6) , 53,5/52,5 (C3,2' ') , 37,3

(C3 ' ' )

FAB-Massenspektrum (pos., Matrix Glycerin) : m/z= 457[M+H] ⁺ , 295 [M-Fructosylrest+H] ⁺ , 913 [2M+H] +

In gleicher Weise wird 3-(Nα -BOC-N -CBZ-L-Lysyl) amino-allo- saccharose C31H49N3O15 (M=703 g/mol) hergestellt.

¹³ C-NMR-Daten (75,5 MHz, D ₂ 0/Aceton-d ₆ ) :

6 =176,3 (Cl ^{1 1} ) , 158,0/157,9 (C7 ¹ ' , 12' ') , 137,0 (C14 ^{* 1} ) , 128,9/128,1/128,0 (C15 ' ' -19 ' ' ) , 104,5 (C2') , 92,5 (Cl) , 82,4 (C5 ¹ ) , 81,0 (C8 ^* ') , 77,4 (C3 ^* ) , 74,3 (C4 ' ) , 69,2/65,7/65,4 (C2,4,5) , 66,5 (C6 ¹ ) , 62,4 (Cl') 60,5 (C6) , 56,1/53,0 (C3,2 ^{, r} ) , 40,5/40,6 (C3' '-6' ' , 13 ' ' ) , 28,1 (C9 ' ' -11 ' ' )

FAB-Massenspektrum (pos., Matrix Glycerin) : m/z= 726 [M+Na] ⁺

Durch Abspaltung der Schutzgruppen mit Trifluoressigsäure und katalytische Hydrierung erhält man daraus 3- (L-Lysyl) amino- allo-saccharose.

Beispiel 3

Hydrolytische Spaltung der Glycosidbindung der 3- (4-L-Aspar- tyl-amino) -allo-saccharose

Durch saure Hydrolyse erhält man aus der 3- (4-L-Aspartyl- amino) -allo-saccharose die 3- (4-L-Aspartyl-amino) -allose. Hierzu werden 150 mg 3- (4-L-Aspartyl-amino) -allo-saccharose mit 5 ml Salzsäure (0,5 N) 10 min auf 60 °C erhitzt. An¬ schließend wird die Reaktionslösung sofort auf 20 °C abge¬ kühlt und mit Natronlauge neutralisiert. Die Abtrennung des Produkts von dem Reaktionsgemisch erfolgt mittels präparati- ver Flüssigchromatographie an einem Kationenaustauscher in der Ca ²⁺ -Form (Eluent: H ₂ 0, 70 °C) . 3- (4-L-Aspartyl-amino) - allose wird mit einer Ausbeute von 80 % bezogen auf die ein¬ gesetzte 3- (4-L-Aspartyl-amino) -allo-saccharose erhalten.