Derivados 4-aciloiloxi-2H-l,4-benzoxacin-3(4H)-ona con actividad fítotóxica.

Dominio de la técnica

La invención pertenece al campo de los compuestos químicos aplicables al control de plagas en agricultura.

Estado anterior de la técnica

La existencia de una gran variedad de plagas en agricultura (malas hierbas, plantas parásitas, insectos, hongos, bacterias) afecta al rendimiento y a la calidad de los cultivos agrícolas.

Actualmente se dispone de una gran cantidad y variedad de plaguicidas químicos cuya utilización plantea problemas relacionados con la falta de selectividad sobre las distintas plagas, la aparición de variedades de plagas resistentes y la contaminación medioambiental.

Los agentes aleloquímicos y sus análogos sintéticos constituyen una interesante alternativa a los plaguicidas químicos tradicionales, ya que presentan nuevos modos de acción, poseen una interacción más específica con las plagas y causan un menor daño al medio ambiente. Desde este punto de vista, los agentes aleloquímicos y sus análogos con actividad fitotóxica reúnen las cualidades necesarias para adaptarse a las nuevos requerimientos sobre el control de plagas, relacionados con el desarrollo de modelos de agricultura sostenible.

Es por ello que la obtención de nuevas sustancias químicas destinadas al control racional de plagas en agricultura presenta un gran interés.

Explicación de la invención

La invención comprende compuestos con la fórmula general I (Figura 1) dónde R es una cadena o ciclo, saturado o insaturado, que puede contener átomos de carbono, hidrógeno y/o heteroátomos, y R ₁ , R ₂ , R ₃ y R ₄ son átomos de hidrógeno y/o cadenas o ciclos, saturados o insaturados, que puede contener átomos de carbono, hidrógeno y/o heteroátomos. Estos compuestos constituyen modelos de desarrollo de nuevos fítosanitarios basados en el esqueleto de l,4-benzoxazin-3-ona, implicado en diversas interacciones ecológicas de defensa química en plantas (ver, por ejemplo: Niemeyer, H; Phytochemistry 1988, 11, 3349-3358) y que presentan como característica fundamental la presencia de una función aciloiloxi en la posición 4

(Fórmula general I, Figura 1).

La preparación de los compuestos con fórmula general 1, con R, Ri, R ₂ , R ₃ y R ₄ tal y como se han definido, se lleva a cabo empleando el siguiente procedimiento:

Partiendo de un fenol de fórmula general II (Figura 2), con Ri, R ₂ , R ₃ y R ₄ tal y como se han definido, es posible obtener, por reacción de sustitución nucleofílica con bromoacetato de etilo en N,N-dimetilformamida, ariloxiacetatos de etilo de fórmula general III (Figura 2), que por reducción con borohidruro sódico catalizado por paladio soportado sobre carbón activo suspendido en soluciones acuosas de 1,4- dioxano genera los compuestos de fórmula general IV (Figura 2).

El tratamiento de los compuestos con fórmula general IV con haluros de acilo en medio básico da lugar a los compuestos de fórmula general I.

Sobre los sustituyentes R, R¡, R ₂ , R ₃ y R ₄ de los compuestos de fórmula general I, II, III y IV pueden realizarse diversas transformaciones (adiciones, eliminaciones, sustituciones, oxidaciones, reducciones, reagrupamientos) que den lugar a distintos compuestos de fórmula general I manteniendo su esqueleto base.

Los compuestos de fórmula general I presentan niveles de fítotoxicidad adecuados para su empleo en el control de malas hierbas, dada su influencia sobre el desarrollo de radícula de especies objetivo estándar {Standard Target Species, STS) y malas hierbas modelo. Estos niveles de actividad los hacen candidatos para el desarrollo de nuevas moléculas bioactivas con gran variedad de aplicaciones.

Breve descripción de las figuras

Al texto de la presente memoria se acompañan varias figuras que describen los compuestos a los que se hace referencia y las transformaciones químicas en las que están implicados.

Asimismo, se incluyen tablas de datos espectroscópicos para los compuestos seleccionados como ejemplo. Los datos de actividad biológica aportados se presentan en forma de gráfico de barras, en los que el valor cero representa el control, valores positivos estimulación y valores negativos inhibición de los parámetros medidos correspondientes. El efecto fitotóxico observado también se describe en base al IC _5O (concentración que provoca el 50% del efecto observado), y se correlaciona con el Log P (logaritmo del coeficiente de partición agua/n-octanol) como medida de la lipofilia de los compuestos ensayados.

Modo de realización de la invención. Ejemplos de preparación y actividad.

Ejemplo 1. Obtención de los compuestos VIII y IX ( ^" Figura 3).

El compuesto VIII se prepara en tres etapas, en las cuales se obtienen los compuestos VI y VII como precursores sintéticos de VIII. El compuesto IX se obtiene en tres etapas análogas, siendo también VI y VII sus precursores sintéticos.

A continuación se describen los aspectos más relevantes de cada etapa. Los datos espectroscópicos de los compuestos preparados se recogen en la Tabla 1 (compuesto

VIII) y en la Tabla 2 (compuesto IX).

• Preparación del compuesto VI (Figura 3).

500 mg del compuesto VI se disuelven en 10 mL de tetrahidrofiirano seco en atmósfera inerte. A continuación se añaden 29,6 mL de una disolución de hidróxido potásico 0,1 N en etanol absoluto. Tras 30 minutos de reacción y por destilación a presión reducida se obtiene el alcóxido potásico correspondiente, que se disuelve en

100 mL de N,N-dimetilformamida seca. A la disolución se añaden 320 μL de bromoacetato de etilo en atmósfera inerte. Tras 16 horas de reacción, se añaden 100 mL de acetato de etilo a la disolución, y se retira la N,N-dimetilformamida por extracción con 5 porciones de 100 mL de agua destilada. La fase orgánica resultante se trata con sulfato sódico anhidro, se filtra y se destila a presión reducida para obtener el compuesto VI.

• Preparación del compuesto VII:

Se preparan 12 mL de una disolución de 1,4-dioxano en agua al 50%, a la que se añaden 30 mg de paladio sobre carbono al 10% y 300 mg de borohidruro sódico con agitación. A continuación se disuelven 300 mg del compuesto VI en 1,4-dioxano (5 mL) y se añaden gradualmente a la suspensión antes preparada. Tras dos horas de reacción, se retira el catalizador por filtración a vacío y al filtrado se añade una disolución de ácido clorhídrico 0,1 N hasta alcanzar un valor de pH=4. La disolución así obtenida se lleva a un embudo de decantación y se extrae con 3 porciones de 50 mL de acetato de etilo. Las fases orgánicas resultantes se combinan y se tratan con sulfato sódico anhidro. Tras filtración y evaporación a presión reducida, el crudo de reacción resultante se purifica por cromatografía en columna de gel de sílice con elución con una disolución de hexano y acetato de etilo al 40% para dar el compuesto VIL

• Preparación del compuesto VIII:

1 g del compuesto VIII se disuelve en 15 mL de piridina seca, tras lo cual se añaden 1124 μL de cloruro de butanoílo. La disolución se mantiene con agitación magnética y en atmósfera inerte durante 12 horas. Transcurrido este tiempo, se añaden 15 mL de acetato de etilo y la fase orgánica obtenida se lava con tres porciones de una disolución de ácido clorhídrico al 10 %. Posteriormente se seca por tratamiento con sulfato sódico anhidro, se filtra y se destila a presión reducida, obteniéndose un aceite que se purifica por cromatografía en columna de gel de sílice, eluyendo con mezclas de hexano y acetato de etilo de polaridad creciente hasta obtener el compuesto IX con un rendimiento del 95 %. Sus datos espectroscópicos se muestran en la Tabla 2.

• Preparación del compuesto IX:

1 g del compuesto VII se disuelve en 15 mL de piridina seca, tras lo cual se añaden 1242 μL de cloruro de lauroílo. La disolución se mantiene con agitación magnética y en atmósfera inerte durante 12 horas. Transcurrido este tiempo, se añaden 15 mL de acetato de etilo y la fase orgánica obtenida se lava con tres porciones de una disolución de ácido clorhídrico al 10 %. Posteriormente se seca por tratamiento con sulfato sódico anhidro, se filtra y se destila a presión reducida, obteniéndose un aceite que se purifica por cromatografía en columna de gel de sílice, eluyendo con mezclas de hexano y acetato de etilo de polaridad creciente hasta obtener el compuesto IX con un rendimiento del 95 %.

Ejemplo 2. Ensayos de fítotoxicidad en Placa Petri para los compuestos VIII y IX.

Los bioensayos de fítotoxicidad para los compuestos VIII y IX se realizan mediante el protocolo de bioensayos de fitotoxicidad en Placa Petri desarrollado por el Grupo de Alelopatía de Cádiz (ver, por ejemplo: Macías, F.A.; Castellano, D.; Molinillo, J.M.G.; J. Agrie. FoodChem. 2000, 48, 6, 2512-2521.).

Este ensayo trata de imitar las condiciones naturales de actuación de los productos a ensayar sobre las semillas de especies de plantas seleccionadas, por lo que los productos se suministran en forma de disolución acuosa en una Placa Petri en la que se introduce un determinado número de semillas de cada especie receptora. El rango de concentraciones utilizado permite observar la relación entre la actividad fitotóxica del producto y su concentración. Las diluciones ensayadas fixeron 1 mM, 0,5 mM, 0,1 mM, 0,05 mM y 0,01 mM. Estas disoluciones están tamponadas a pH=6 empleando para ello una solución de ácido 2-[N-morfolino]-etanosulfónico (MES) 10 mM cuyo pH se ajusta al valor deseado mediante la adición de una disolución de NaOH IM. El blanco de este experimento es agua destilada y desionizada tamponada también con MES pero en la que no hay disuelto ningún producto. La selección de las especies vegetales receptoras para el bioensayo se realizó en base a un amplio estudio llevado a cabo por nuestro grupo, que se detalla en la publicación anteriormente mencionada, resultando las especies escogidas la especie monocotiledónea Allium cepa L. (cebolla), y la dicotiledónea Lepidium sativum L. (berro). Para completar el perfil de fitotoxicidad se añaden al ensayo de bioactividad las especies de malas hierbas monocotiledóneas Avena fatua L. (avena loca) y Lolium rigidum L. (vallico). Todas las semillas están en la oscuridad durante el período en que se realiza el bioensayo y a 25 ⁰ C de temperatura. El tiempo de incubación y el número de semillas y réplicas a ensayar para cada dilución han sido optimizados teniendo en cuenta las características de cada semilla.

La adquisición de datos y el tratamiento estadístico de los resultados se realizan empleando el soporte informático FITOMED ^® (Sistema automatizado para la adquisición simultánea y gestión informatizada de medidas de longitud variable), patentado por la Universidad de Cádiz (P9901565). Este sistema se compone de una tabla digitalizadora y un lápiz óptico (para adquirir las longitudes de radículas e hipocótilos) controlados por un ordenador personal dotado de un software que recopila los datos reduciendo el tiempo de adquisición de medidas y realiza el tratamiento estadístico de los mismos y su representación gráfica.

En la Figura 4 se ofrecen a modo de ejemplo los resultados de bioactividad para los compuestos VIII y IX en forma de gráfico de barras. Los parámetros mostrados son longitud de radícula a concentraciones 1 mM, 0,5 mM, 0,1 mM, 0,05 mM y 0,01 mM para las especies receptoras Allium cepa L, Lepidium sativum L. y las malas hierbas Avena fatua L. y Lolium rigidum L. Los datos de fitotoxicidad para malas hierbas se acompañan de los correspondientes valores de IC ₅₀ , expresados en milimoles por litro (Tabla 3). La presentación de los datos permite observar la evolución del efecto con la concentración. Los efectos sobre las especies receptoras A. cepa y L. sativum son significativos incluso a las concentraciones más bajas ensayadas, sobre todo en el caso del compuesto IX, evolucionando desde un 91 % hasta un 21 % de inhibición para L. sativum y desde un 81 % hasta un 8 % en el caso de A. cepa. El compuesto VIII produjo un efecto similar sobre la radícula de L. sativum, mientras que para A. cepa se mantuvieron efectos potentes sobre el parámetro estudiado hasta una concentración de 0,1 mM. Los efectos observados sobre las malas hierbas L. rigidum y A. fatua son especialmente destacables desde el punto de vista del campo de aplicación de los compuestos, ya que especialmente en el caso de A. fatua, hay una importante persistencia del efecto con la dilución del tratamiento, especialmente para el compuesto VIII. Para ambas malas hierbas, así como para las especies modelo, los datos obtenidos se ajustaron a un modelo de relación dosis-respuesta sigmoidal de pendiente constante, que proporcionó los valores de IC ₅₀ indicados en la Tabla 3. De estos valores, son especialmente destacables, en el caso de las malas hierbas, los obtenidos en el caso del compuesto

IX para L. rigidum (0,50 mM) y para el compuesto VIII en el bioensayo sobre A. fatua (0,18 mM).

Por otro lado, la introducción de cadenas laterales en la posición N-4 (Figura 1) da lugar a un incremento significativo de la actividad fitotóxica, como se describe en la Figura 5. Este incremento de la actividad es especialmente notable para cadenas laterales de más de cuatro átomos de carbono. En el gráfico se representa el logaritmo de la inversa del IC ₅₀ (L. sativum, longitud de radícula) frente al LogP (coeficiente de partición agua/n-octanol) que constituye una medida de la lipofilia de cada compuesto, parámetro de gran interés en el desarrollo de nuevos agentes fitotóxicos (ver, por ejemplo: Tice, C. M.; Pest. Manag. ScL 2001, 57, 3-16). En cada punto se indica la longitud de la cadena lateral introducida, siendo N=O el compuesto sin esterificar. La introducción de cadenas laterales de once o doce átomos de carbono (N=I l, N= 12) provoca un incremento altamente significativo de la actividad fitotóxica.

En conclusión, los perfiles fitotóxicos mostrados por los productos VIII y IX permiten proponerlos para su empleo en el control de malas hierbas y como modelo estable de desarrollo de nuevos productos fitosanitarios basados en el esqueleto de l,4-benzoxacin-3-ona. La introducción de cadenas laterales de más de cuatro átomos de carbono permite obtener nuevos derivados con actividades fitotóxicas óptimas para el desarrollo de nuevos modelos de herbicida. Por tanto, la preparación de análogos de estos productos con diferentes patrones de sustitución aromática y su esterificación con cadenas laterales de distintas longitudes, según la metodogía descrita, permitirá obtener una variedad de productos con propiedades químicas y biológicas adecuadas para su aplicación en el control de plagas en agricultura.