Nouveaux composés chimiques, leurs procédés de synthèse et leur utilisation à titre de médicament

La présente invention se place dans le domaine de la pharmacie, particulièrement dans le domaine de la cytoprotection.

Elle concerne une famille de composés chimiques nouveaux, le 4- azacholest-4-ène N-oxide et certains de ces dérivés, leurs procédés de synthèse ainsi que certains intermédiaires de synthèse.

La présente invention concerne également l'utilisation desdits composés à titre de médicaments, particulièrement dans la préparation d'un médicament cytoprotecteur.

Les processus dégénératifs cellulaires sont caractérisés par le dysfonctionnement des cellules entraînant souvent des activités cellulaires indésirables ou des pertes de fonction, et la mort cellulaire. Les cellules ont développé des mécanismes d'adaptation, en réponse au stress, qui allongent leur durée de vie ou retardent ou empêchent la mort cellulaire (mécanismes cytoprotecteurs).

Cependant, ces mécanismes cytoprotecteurs sont parfois insuffisants, inadéquats, ou induits trop tard pour être efficaces et les cellules meurent. Il peut donc s'avérer intéressant de disposer de nouveaux médicaments, cytoprotecteurs, qui favoriseraient la cytoprotection. C'est un des buts de la présente invention.

Le terme «cytoprotecteur» fait référence à la capacité d'agents, par exemple des composés chimiques, naturels ou non, à maintenir les interactions des cellules entre elles ou avec les autres tissus, à protéger les cellules contre les phénomènes de dégénérescence conduisant à une perte de fonction cellulaire ou à des activités cellulaires indésirables, avec ou sans mort cellulaire, et/ou contre les dysfonctionnements cellulaires et/ou contre les maladies ou affections dégénératives conduisant à ces dysfonctionnements cellulaires, lesdits dysfonctionnements ou lesdites maladies ou affections conduisant ou non à la mort cellulaire.

Les termes "neuroprotecteur" ou cardioprotecteur" font référence aux mêmes propriétés desdits agents mais spécifiquement pour les cellules du

système nerveux ("neuroprotecteur") soit spécifiquement pour les cellules du système cardiaque ("cardioprotecteur").

On comprend donc qu'un composé cytoprotecteur ou neuroprotecteur ou cardioprotecteur est un composé qui présente les propriétés précédemment décrites.

Ces dysfonctionnements cellulaires peuvent être par exemple d'origine mitochondriale, comme une réduction de la capacité à générer de I ¹ ATP, une incapacité à capter et/ou retenir le calcium, ou la génération de radicaux libres.

Parmi les mécanismes principaux de mort cellulaire, on distingue essentiellement la nécrose, l'apoptose et la nécroptose.

La nécrose est une mort cellulaire dite "accidentelle" qui survient lors d'un dommage tissulaire. C'est la membrane plasmique de la cellule qui est la plus touchée, entraînant une modification de l'homéostasie de la cellule. Les cellules vont se gorger d'eau au point que cela va entraîner la lyse de leur membrane plasmique. Cette lyse cellulaire conduit au largage dans le milieu environnant du contenu cytoplasmique. La nécrose est à l'origine du processus inflammatoire.

La nécrose peut toucher un ensemble de cellules ou un tissu alors que les autres parties de voisinage restent vivantes. La transformation qui en résulte est une mortification des cellules ou des tissus. Autrement dit, la nécrose se définit par des modifications morphologiques survenant lorsqu'une cellule arrive en fin de vie à la suite d'événements tels qu'un traumatisme important comme un arrêt ou une diminution de la circulation sanguine au niveau d'un organe, l'hyperthermie (élévation importante de la température), une intoxication par un produit chimique, un choc physique, etc.. Une des nécroses les plus connues est celle du myocarde lors de l'infarctus

(arrêt d'apport circulatoire au niveau du muscle cardiaque) due à une oblitération (obstruction) d'une artère coronaire.

L'apoptose fait partie intégrante de la physiologie normale d'un organisme. C'est une forme physiologique de mort cellulaire hautement régulée et elle est nécessaire à la survie des organismes multicellulaires. L'apoptose est un processus qui joue un rôle primordial au cours de l'embryogenèse.

Les cellules en apoptose ou apoptotiques vont s'isoler des autres cellules. L'apoptose implique habituellement des cellules individuelles dans un tissu et ne

provoque pas l'inflammation. L'un des points morphologiques caractéristiques de l'apoptose est l'importante condensation à la fois du noyau et du cytoplasme ce qui induit une diminution significative du volume cellulaire. Le noyau se fragmente ensuite, chaque fragment est entouré d'une double enveloppe. Des corps apoptotiques (éléments cytoplasmiques et nucléaires) sont ensuite libérés et vont être absorbés par phagocytose par les cellules voisines.

L'apoptose peut être induite de différentes façons. Par exemple, une radiation, la présence d'un composé chimique ou d'une hormone sont des stimuli susceptibles d'induire une cascade d'événements apoptotiques dans la cellule. Des signaux intracellulaires comme une mitose incomplète ou un dommage à l'ADN peuvent aussi induire l'apoptose.

L'apoptose intervient aussi après l'action d'un génotoxique ou au cours d'une maladie. Certaines pathologies sont caractérisées par une apoptose anormale, entrainant la perte de certaines populations cellulaires, comme par exemple l'hépatotoxicité, les rétinopathies, la cardiotoxicité.

On distingue donc l'apoptose physiologique et l'apoptose pathologique. L'invention s'adresse essentiellement à l'apoptose pathologique.

Il existe d'autres mécanismes de mort cellulaire, comme par exemple la nécroptose, qui présente des caractéristiques de la nécrose et de l'apoptose. Une cellule mourant par nécroptose présente des caractéristiques similaires à celles d'une cellule mourant par nécrose, mais les étapes biochimiques de ce mécanisme s'assimilent plus à celles de l'apoptose. Ce mécanisme de mort cellulaire intervient par exemple dans l'ischémie.

C'est donc aussi un des buts de la présente invention que de disposer de nouveaux médicaments qui pourraient permettre de prévenir et/ou traiter la nécrose et/ou l'apoptose pathologique et/ou la nécroptose (médicaments antinécrotiques et/ou antiapoptotiques et/ou antinécroptotiques).

Les processus dégénératifs cellulaires peuvent résulter, entre autres, de situations pathologiques regroupées sous le terme de maladies ou affections dégénératives, de traumatismes, ou d'exposition à divers facteurs.

Ces traumatismes et facteurs peuvent inclure, par exemple, l'exposition aux radiations (UV, gamma), l'hypoxie ou la privation d'oxygène, une exposition prolongée à un taux élevé de calcium, la privation de nutriments, la privation de

facteurs de croissance, des poisons, des toxines cellulaires, des déchets, des toxines environnementales, des radicaux libres, des oxygènes réactifs ou encore certains événements et/ou procédures médicaux comme par exemple les traumatismes chirurgicaux incluant les transplantations. On peut citer également des agents chimiques ou biologiques utilisés comme agents thérapeutiques dans le contexte de traitements médicaux comme par exemple des agents cytostatiques ou des agents anti-inflammatoires.

Les mitochondries sont les cibles de nombreux stress cellulaires, conduisant entre autres à une diminution de la synthèse d'ATP, ou encore à une augmentation de la production de radicaux libres.

Parmi les situations pathologiques caractérisées par un processus dégénératif les plus importantes, on trouve :

" les maladies des os, des articulations, du tissu conjonctif et du cartilage, telles que l'ostéoporose, l'ostéomyélite, les arthrites dont par exemple Postéoarthrite, l'arthrite rhumatoïde et l'arthrite psoriatique, la nécrose avasculaire, la fibrodysplasie ossifiante progressive, le rachitisme, le syndrome de Cushing ;

- les maladies musculaires telles que la dystrophie musculaire, comme par exemple la dystrophie musculaire de Duchenne, les dystrophies myotoniques, les myopathies et les myasthénies ;

• les maladies de la peau, telles que les dermatites, l'eczéma, le psoriasis, le vieillissement, ou encore les altérations de la cicatrisation ;

" les maladies cardiovasculaires telles que l'ischémie cardiaque et/ou vasculaire, l'infarctus du myocarde, la cardiopathie ischémique, l'insuffisance cardiaque chronique ou aiguë, la dysrythmie cardiaque, la fibrillation auriculaire, la fibrillation ventriculaire, la tachycardie paroxystique, l'insuffisance cardiaque, l'anoxie, l'hypoxie, les effets secondaires dus à des thérapies avec des agents anticancéreux ; ^» les maladies circulatoires telles que l'athérosclérose, les scléroses artérielles, et les maladies vasculaires périphériques, les accidents vasculaires cérébraux, les anévrismes ;

• les maladies hématologiques et vasculaires telles que : l'anémie, Pamyloïdose. vasculaire, les hémorragies, la drépanocytose, le

syndrome de la fragmentation des globules rouges, la neutropénie, la leucopénie, l'aplasie médullaire, la pancytopénie, la thrombocytopénie, l'hémophilie ;

• les maladies du poumon incluant la pneumonie, l'asthme ; les maladies chroniques obstructives des poumons comme par exemple les bronchites chroniques et l'emphysème ;

• les maladies du tractus gastro-intestinal, telles que les ulcères ;

• les maladies du foie incluant les hépatites virales et les cirrhoses, les maladies du foie dues à des toxines ou des médicaments ; " les maladies du pancréas comme par exemple les pancréatites aiguës ou chroniques ;

• les maladies métaboliques telles que les diabètes mellitus et insipide, les thyroïdites ;

• les maladies des reins telles que par exemple les désordres rénaux aigus ou la glomérulonéphrite ;

• les infections virales et bactériennes telle que la septicémie ;

• les intoxications sévères par des agents chimiques, des toxines ou des médicaments ;

^» les affections dégénératives associées au Syndrome Immuno Déficitaire Acquis (SIDA) ;

• les désordres associés au vieillissement, tel que le syndrome du vieillissement accéléré ;

• les maladies inflammatoires, telles que la maladie de Crohn, la polyarthrite rhumatoïde ; • les maladies auto-immunes telles que le lupus érythémateux ;

• les cancers ;

» les désordres dentaires tels que ceux aboutissant à la dégradation des tissus comme par exemple les périodontites ;

• les maladies ou désordres ophtalmiques incluant les rétinopathies diabétiques, le glaucome, les dégénérescences maculaires, la dégénérescence rétinienne, la rétinite pigmentaire, les trous ou déchirures rétiniennes, le décollement rétinien, l'ischémie rétinienne, les rétinopathies aiguës associées à un traumatisme, les dégénérescences

inflammatoires, les complications post chirurgicales, les rétinopathies médicamenteuses, la cataracte ;

• les désordres des voies auditives, tels que l'otosclérose et la surdité induite par des antibiotiques ; " les maladies associées aux mitochondries (pathologies mitochondriales), telles que l'ataxie de Friedrich, la dystrophie musculaire congénitale avec anomalie mitochondriale structurelle, certaines myopathies (syndrome des MELAS, syndrome de MERFF, syndrome de Pearson), le syndrome de MIDD (diabètes mitochondriaux et surdité), le syndrome de Wolfram, la dystonie ;

• les affections neurologiques ou neurodégénératives caractérisées par la mort ou le dysfonctionnement des neurones entraînant la perte des fonctions neurologiques médiées par le cerveau (système nerveux central, SNC), la moelle épinière et le système nerveux périphérique (SNP), telles que

- les maladies chroniques neurodégénératives, héréditaires ou sporadiques, notamment la maladie d'Alzheimer, la maladie de Huntington, la maladie de Parkinson, la sclérose latérale amyotrophique, les amyotrophies spinales, la maladie de Creutzfeldt-Jakob, la sclérose en plaque, l'adrénoleucodystrophie, l'épilepsie, les démences, la schizophrénie, et les syndromes neurologiques associés au SIDA ;

- les lésions neuronales liées au vieillissement ;

- les neuropathies périphériques héréditaires ou lésionnelles, comme les maladies de Fabry, de Charcot-Marie-Tooth, de Krabbe, les leucodystrophies, les neuropathies diabétiques et celles induites par les traitements anti-cancéreux et anti-rétroviraux ;

- les traumatismes du cerveau, des nerfs périphériques ou de la moelle épinière ; - les ischémies du cerveau ou de la moelle épinière suite à un accident cérébro-vasculaire, ou induites par un manque d'irrigation sanguine ;

- les dégénérescences, héréditaires, lésionnelles ou liées au

vieillissement des neurones sensoriels de la vision, comme les dégénérescences maculaires, les rétinites pigmentaires, ou les dégénérescences du nerf optique induites par les glaucomes ;

- les dégénérescences, héréditaires, traumatiques ou liées au vieillissement des neurones sensoriels de l'ouïe entraînant une diminution ou une perte de l'audition.

Dans le cadre du système nerveux, une approche thérapeutique pour protéger les neurones contre les phénomènes de dégénérescence est l'apport de protéines neurotrophiques. Ces protéines, telles que BDNF (brain-derived neurotrophic factor), CNTF

(ciliary neurotrophic factor), NGF (nerve growth factor), GDNF (glia-derived neurotrophic factor), IGF-1 (insulin-like growth factor), sont synthétisées au cours du développement embryonnaire ou après lésion chez l'adulte. Ces facteurs de croissance favorisent la survie, la maturation et la différentiation des cellules neuronales. De plus, ils inhibent les mécanismes apoptotiques, activent de multiples voies de survie et protègent un grand nombre de populations neuronales. Leur utilisation est proposée dans la plupart des dégénérescences neuronales.

De même, une protection des cellules non-neuronales dans l'environnement des neurones peut permettre de protéger les neurones en réduisant la toxicité extracellulaire et en augmentant la production de facteurs trophiques.

Des composés qui activeraient l'expression de facteurs neurotrophiques ou qui mimeraient l'action de ces facteurs, ont un potentiel thérapeutique pour le traitement des syndromes neurodégénératifs.

Ces composés présenteraient donc un effet bénéfique dans un grand nombre de pathologies en particulier dans les pathologies touchant les systèmes nerveux périphérique et central. .

Par ailleurs, dans le cadre ci-dessus, les motoneurones sont des neurones notamment présents dans la moelle épinière et le tronc cérébral. Leur dégénérescence ou leur mort peut conduire à une faiblesse progressive des muscles des membres, puis à une atrophie et éventuellement à une spasticité

(c'est à dire une contraction permanente) du muscle.

Les pathologies les plus importantes qui résultent de la dégénérescence et de la mort des motoneurones spinaux et/ou bulbaires sont la sclérose latérale amyotrophique, (SLA ou ALS pour Amyotrophic Latéral Sclerosis), également connue sous le nom de maladie de Charcot ou encore maladie de Lou Gehrig, et les amyotrophies spinales infantiles, également connues sous les noms de maladie de Werdnig-Hoffmann ou maladie de Kugelberg-Welander.

En outre, on observe une dégénérescence des motoneurones dans les cas de traumatismes avec écrasement et/ou section de la moelle épinière ou des nerfs moteurs périphériques. Plus généralement, on parle d'amyotrophies spinales pour les maladies où est impliquée la dégénérescence ou la mort des motoneurones de la moelle épinière.

La sclérose latérale amyotrophique est une maladie neurodégénérative associée à différents types d'inclusions tels les corps de Lewis et caractérisée par une dégénérescence des motoneurones spinaux et corticaux dont l'issue fatale est parfois associée à une démence frontale. Au cours du développement de l'ALS, les phénomènes dégénératifs se produisent non seulement dans le cerveau mais également dans la moelle épinière et en conséquence dans le muscle, par défaut d'innervation. Sans toutefois dénigrer les traitements connus actuellement, il n'existe pas à ce jour de traitement efficace pour enrayer les dégénérescences cellulaires, particulièrement les dégénérescences neuronales. Ainsi il existe toujours une demande de composés cytoprotecteurs, particulièrement de composés neuroprotecteurs ou cardioprotecteurs, actifs. La présente invention répond à cette demande de composés cytoprotecteurs, particulièrement neuroprotecteurs ou cardioprotecteurs. En effet, la demanderesse a découvert que le 4-azacholest-4-ène N-oxide et certains de ces dérivés sont doués de remarquables propriétés cytoprotectrices, particulièrement des propriétés neuroprotectrices ou cardioprotectrices. Ainsi l'invention a pour objet des composés chimiques nouveaux répondant à la formule

dans laquelle

X représente un groupement méthyle ou éthyle A et B représentent un atome d'hydrogène ou un groupement méthyle C et D représentent un atome d'hydrogène ou forment ensemble une liaison carbone-carbone.

R représente un groupement choisi parmi

ou l'un de leurs sels d'addition avec les acides pharmaceutiquement acceptables, à l'exception du composé pour lequel X est un groupement éthyle et A, C et D sont des atomes d'hydrogène, B un groupement méthyle, et R est un groupement R1. Les composés nouveaux préférés selon l'invention sont

Ie 4-azacholest-4-ène N-oxide, le 4-azacholest-4,24-diène N-oxide,

Ie 4-aza-24-éthylcholest-4-ène N-oxide, le 4-azacholest-4,21-diène N-oxide, le 4-aza-24-éthylcholest-4,21-diène N-oxide, le 4-aza-24-méthylcholest-4,21-diène N-oxide le 3-diméthyl-4-azacholest-4-ène N-oxide, le 3-diméthyl-4-azacholest-4,24-diène N-oxide, le 3-diméthyl-4-aza-24-éthylcholest-4-ène N-oxide, le 3-diméthyl-4-azacholest-4,21-diène N-oxide,

Ie 3-diméthyl-4-aza-24-éthylcholest-4,21-diène N-oxide, le 3-diméthyl-4-aza-24-méthylcholest-4,21-diène N-oxide

Ie 4-azacholest-4,6-diène N-oxide, le 4-azacholest-4,6,24-triène N-oxide, le 4-aza-24-éthylcholest-4,6-diène N-oxide, le 4-azacholest-4,6,21-triène N-oxide, le 4-aza-24-éthylcholest-4,6,21-triène N-oxide, le 4-aza-24-méthylcholest-4,6,21-triène N-oxide le A-nor-3~azacholest-3(5)-ène N-oxide, le A-nor-3-azacholest-3(5),24-diène N-oxide, le A-nor-3-aza-24-éthylcholest-3(5)-ène N-oxide, le A-nor-3-azacholest-3(5),21~diène N-oxide, le A-nor-3-aza-24-éthylcholest-3(5),21-diène N-oxide, le A-nor-3-aza-24-méthylcholest-3(5),21-diène N-oxide ou l'un de leurs sels d'addition avec les acides pharmaceutiquement acceptables.

Selon l'invention, les sels d'addition avec les acides pharmaceutiquement acceptables peuvent être par exemple des sels formés avec les acides chlorhydrique, bromhydrique, nitrique, sulfurique, phosphorique, acétique, formique, propionique, benzoïque, maléique, fumarique, succinique, tartrique, citrique, oxalique, glyoxylique, aspartique, alcane sulfoniques tels que les acides méthane ou éthane sulfoniques, arylsulfoniques, tels que les acides benzène ou paratoluène sulfoniques, ou carboxyliques.

Parmi les composés ci-dessus décrits on retient préférentiellement le composé de formule I pour lequel R représente une chaîne R1 et A et B représentent des atomes d'hydrogène, ainsi que ses sels d'addition avec les acides pharmaceutiquement acceptables, c'est-à-dire le 4-azacholest-4-ène N-oxide, le 4- azacholest-4,6-diène N-oxide et le A-nor-3-azacholest-3(5)-ène N-oxide.

La présente invention a également pour objet un procédé de préparation des composés de formule I tels que définis ci-dessus ainsi que de leurs sels.

Lorsque X est un groupement éthyle et A et B représentent des atomes d'hydrogène, le procédé de synthèse des composés de formule I est caractérisé en ce que l'on fait réagir un composé de formule II

dans laquelle X est un groupement éthyle, A et B représentent des atomes d'hydrogène, et R, C et D peuvent avoir les significations précédemment décrites, avec un halogénure d'hydroxylamine comme le chlorhydrate d'hydroxylarnine pour obtenir le composé de formule I attendu.

Dans les conditions préférentielles de mise en œuvre du procédé ci-dessus décrit, le composé de formule II est solubilisé dans un minimum de solvant adapté comme par exemple la pyridine. On fait réagir un excès d'halogénure d'hydroxylamine, comme par exemple le chlorhydrate d'hydroxylamine en une quantité comprise entre 1,1 et 10 équivalents, sous agitation pendant environ 16h à température ambiante (20-30 ⁰ C).

Les composés de formule II, qui servent d'intermédiaires de synthèse, sont nouveaux.

Ainsi l'invention a aussi pour objet les composés nouveaux répondant à la formule II dans laquelle X est un groupement éthyle, A et B représentent des atomes d'hydrogène, et R, C et D peuvent avoir les significations précédemment indiquées, leur utilisation en synthèse chimique ainsi que leur procédé de synthèse.

Ledit procédé de synthèse des composés de formule II est caractérisé en ce

que l'on fait réagir un composé répondant à la formule

dans laquelle dans laquelle X est un groupement éthyle, A et B représentent des atomes d'hydrogène, et R, C et D peuvent avoir les significations précédemment décrites, avec un halogénure de tosyle comme le chlorure de tosyle, en présence d'une base pour obtenir le composé de formule II attendu.

Dans les conditions préférentielles de mise en oeuvre du procédé ci-dessus décrit, le composé de formule III est solubilisé dans un minimum de solvant adapté comme par exemple le dichlorométhane. On fait réagir

- un excès d'halogénure de tosyle comme le chlorure de tosyle, en une quantité comprise entre 1 ,01 et 5 équivalents,

- en présence d'une base comme la triéthylamine, en une quantité comprise entre 1,01 et 5 équivalents, - sous agitation pendant environ 16h à température ambiante (20-30 ⁰ C).

Les composés de formule III, qui servent d'intermédiaires de synthèse, sont connus, leur synthèse est décrite dans la littérature.

Lorsque X est un groupement méthyle, et A, B, C et D représentent des atomes d'hydrogène, le procédé de synthèse des composés de formule I est caractérisé en ce que l'on fait réagir un composé de formule IV

dans laquelle dans laquelle X est un groupement méthyle, et A, B, C et D

représentent des atomes d'hydrogène, et R, peut avoir les significations précédemment décrites, avec un halogénure d'hydroxylamine comme le chlorhydrate d'hydroxylamine pour obtenir le composé de formule I attendu. Dans les conditions préférentielles de mise en œuvre du procédé ci-dessus décrit, le composé de formule IV est solubilisé dans un minimum de solvant adapté comme par exemple la pyridine. On fait réagir un excès d'halogénure d'hydroxylamine, comme par exemple le chlorhydrate d'hydroxylamine en une quantité comprise entre 1,1 et 10 équivalents, sous agitation pendant environ 16h à température ambiante (20-30 ⁰ C).

Les composés de formule IV, qui servent d'intermédiaires de synthèse, sont nouveaux.

Ainsi l'invention a aussi pour objet les composés nouveaux répondant à la formule IV dans lesquels X, R, A, B, C et D peuvent avoir les significations précédemment indiquées, leur utilisation en synthèse chimique ainsi que leur procédé de synthèse.

Ledit procédé de synthèse des composés de formule IV est caractérisé en ce que l'on fait réagir un composé répondant à la formule V

dans laquelle R, X, A, B, C et D peuvent avoir les significations précédemment décrites, avec la N,N-diméthylglycine sous forme libre ou d'halogénure comme le chlorhydrate de N,N-diméthylglycine pour obtenir le composé de formule IV attendu. Dans les conditions préférentielles de mise en oeuvre du procédé ci-dessus décrit, le composé de formule V est solubilisé dans un minimum de solvant adapté comme par exemple le dichlorométhane. On fait réagir à froid sous agitation

pendant environ 10 minutes

> un excès d'agent de couplage activant la fonction acide, comme par exemple le chlorhydrate de 1-(3-diméthylaminopropyl)-3- éthylcarbodiimide en une quantité comprise entre 1 et 2 équivalents, > un excès d'une base, comme par exemple la 4-diméthylaminopyridine en une quantité comprise entre 1 ,1 et 10 équivalents. Après retour à température ambiante (20-30 ⁰ C), est ajoutée au mélange réactionnel sous agitation pendant environ 48h

> la diméthylglycine sous forme libre ou d'halogénure comme le chlorhydrate de N,N-diméthylglycine en une quantité comprise entre 1 et 5 équivalents.

Les composés de formule V, qui servent d'intermédiaires de synthèse, sont nouveaux.

Ainsi l'invention a aussi pour objet les composés nouveaux répondant à la formule V dans lesquels X, R, A, B, C et D peuvent avoir les significations précédemment indiquées, leur utilisation en synthèse chimique ainsi que leur procédé de synthèse.

Ledit procédé de synthèse des composés de formule V est caractérisé en ce que l'on fait réagir un composé répondant à la formule Vl

dans laquelle R, A, B, C et D peuvent avoir les significations précédemment décrites, avec une solution acide comme par exemple l'acide acétique pour obtenir le composé de formule V attendu. Dans les conditions préférentielles de mise en œuvre du procédé ci-dessus décrit, le composé de formule Vl est solubilisé dans un minimum de solvant adapté comme par exemple un mélange tétrahydrofurane-eau. On fait réagir un excès

d'acide comme par exemple l'acide acétique glacial en une quantité comprise entre 1 et 100 équivalents sous agitation à température ambiante (20-30 ⁰ C) pendant environ 16h.

Les composés de formule Vl, qui servent d'intermédiaires de synthèse, sont nouveaux.

Ainsi l'invention a aussi pour objet les composés nouveaux répondant à la formule Vl dans lesquels X, R, A, B, C et D peuvent avoir les significations précédemment indiquées, leur utilisation en synthèse chimique ainsi que leur procédé de synthèse. Ledit procédé de synthèse des composés de formule Vl est caractérisé en ce que l'on fait réagir un composé répondant à la formule VII

dans laquelle R, C et D peuvent avoir les significations précédemment décrites, avec un hydrure comme par exemple l'hydrure de lithium-aluminium pour obtenir le composé de formule Vl attendu.

Dans les conditions préférentielles de mise en œuvre du procédé ci-dessus décrit, le composé de formule VII est solubilisé dans un minimum de solvant adapté comme par exemple le tétrahydrofurane. On fait réagir un excès d'hydrure comme par exemple de lithium-aluminium en une quantité comprise entre 1 et 10 équivalents sous agitation à froid (0 ⁰ C) pendant environ 1h.

Les composés de formule VII, qui servent d'intermédiaires de synthèse, sont nouveaux.

Ainsi l'invention a aussi pour objet les composés nouveaux répondant à la formule VII dans lesquels X, R, C et D peuvent avoir les significations précédemment indiquées, leur utilisation en synthèse chimique ainsi que leur procédé de synthèse.

Ledit procédé de synthèse des composés de formule VII est caractérisé en ce que l'on fait réagir un composé répondant à la formule VIII

dans laquelle R, C et D peuvent avoir les significations précédemment décrites, avec du triméthylorthoformate pour obtenir le composé de formule VII attendu.

Dans les conditions préférentielles de mise en œuvre du procédé ci-dessus décrit, le composé de formule VIII est solubilisé dans un minimum de solvant adapté comme par exemple le méthanol. On fait réagir sous agitation au reflux du solvant pendant environ 5h

> un excès d'acide comme par exemple l'acide paratoluène sulfonique en une quantité comprise entre 1 et 10 équivalents

> un excès de triméthylorthoformate en une quantité comprise entre 1 et 10 équivalents

Les composés de formule VIII, qui servent d'intermédiaires de synthèse, sont connus.

Selon un autre aspect, l'invention a pour objet l'utilisation des composés de formule I ₁ y compris les composés pour lesquels A, C et D sont des atomes d'hydrogène, B un groupement méthyle, X est un groupement éthyle, et R est un groupement R1 , comme médicament. Ainsi l'invention a aussi pour objet l'utilisation de composés de formule I

dans laquelle

X représente un groupement méthyle ou éthyle A et B représentent un atome d'hydrogène ou un groupement méthyle C et D représentent un atome d'hydrogène ou forment ensemble une liaison carbone-carbone.

R représente un groupement choisi parmi

ou l'un de leurs sels d'addition avec les acides pharmaceutiquement acceptables, y compris les composés pour lesquels A, C et D sont des atomes d'hydrogène, B un groupement méthyle, X est un groupement éthyle,et R est un groupement R1 comme médicament.

Les intéressantes propriétés cytoprotectrices de ces composés, et particulièrement du 4-azacholest-4-ène N-oxide, du 4-azacholest-4,6-diène N- oxide, et du A-nor-3-azacholest-3(5)-ène N-oxide ainsi que du composé 3- méthyl-4-azacholest-4-ène N-oxide, justifient leur utilisation comme médicament, particulièrement pour la préparation d'un médicament cytoprotecteur, très particulièrement neuroprotecteur ou cardioprotecteur.

Avantageusement, ces composés peuvent être utilisés pour la préparation d'un médicament destiné au traitement ou à la prévention de la nécrose et/ou de l'apoptose et/ou la nécroptose (médicaments antinécrotiques et/ou antiapoptotiques et/ou antinécroptotique) ou encore des affections comme les maladies des os, des articulations, du tissu conjonctif et du cartilage, les maladies musculaires, les maladies de la peau, les maladies cardiovasculaires, les maladies circulatoires, les maladies hématologiques et vasculaires, les maladies du poumon, les maladies du tractus gastro-intestinal, les maladies du foie, les maladies du pancréas, les maladies métaboliques, les maladies des reins, les infections virales et bactériennes, les intoxications sévères, les affections dégénératives associées au Syndrome Immuno Déficitaire

Acquis (SIDA), les désordres associés au vieillissement, les maladies inflammatoires, les maladies auto-immunes, les cancers, les désordres dentaires, les maladies ou désordres ophtalmiques, les maladies des voies auditives,

les maladies associées aux mitochondries (pathologies mitochondriales), les maladies neurologiques et neurodégénératives,

Les médicaments selon la présente invention trouvent leur emploi en raison de leurs propriétés neuroprotectrices par exemple dans le traitement ou la prévention des affections neurodégénératives, comme par exemple la maladie de Huntington, les maladies chroniques neurodégénératives, héréditaires ou sporadiques, les lésions neuronales liées au vieillissement, les neuropathies périphériques héréditaires ou lésionnelles, les neuropathies diabétiques ou induites par les traitements anticancéreux ou anti-rétroviraux, les traumatismes du cerveau, des nerfs périphériques ou de la moelle épinière, les ischémies du cerveau ou de la moelle épinière, les dégénérescences héréditaires, lésionnelles ou liées au vieillissement des neurones sensoriels de la vision ou les dégénérescences du nerf optique, les dégénérescences héréditaires, traumatiques ou liées au vieillissement des neurones sensoriels de l'ouïe, les atrophies lobaires et les démences vasculaires, et notamment les amyotrophies spinales, la sclérose latérale amyotrophique et les pathologies dues aux traumatismes de la moelle épinière ou des nerfs moteurs périphériques.

Ils trouvent notamment en raison de leurs propriétés neuroprotectrices vis à vis des motoneurones, leur emploi particulièrement dans le traitement des amyotrophies spinales, notamment de la sclérose latérale amyotrophique ou des amyotrophies spinales infantiles, et dans le traitement des traumatismes de la moelle épinière ou des nerfs moteurs périphériques comme évoqué ci-dessus.

Ces propriétés sont illustrées ci-après dans la partie expérimentale. Elles justifient l'utilisation des composés selon l'invention, ainsi que de leurs sels d'addition avec les acides pharmaceutiquement acceptables, à titre de médicament.

Avantageusement, les composés de formule I, particulièrement le 4- azacholest-4-ène N-oxide, ainsi que les composés 4-azacholest-4,6-diène N- oxide, A-nor-3-azacholest-3(5)-ène N-oxide et 3-méthyl-4-azachoIest-4-ène N- oxide, peuvent être utilisés dans la préparation d'un médicament destiné à la protection des neurones (médicament neuroprotecteur), des cellules cardiaques (médicament cardioprotecteur) ou d'un médicament destiné au traitement ou à la prévention des maladies associées aux mitochondries.

Les composés de l'inveηtion sont avantageusement présents dans le médicament cytoprotecteur à des doses physiologiquement efficaces ; lesdits médicaments renferment notamment une dose cytoprotectrice efficace d'au moins un des composés de formule I. A titre de médicaments, les composés de l'invention leurs esters, leurs sels d'addition avec les acides pharmaceutiquement acceptables ainsi que les sels d'additions avec les acides pharmaceutiquement acceptables desdits esters peuvent être formulés pour la voie digestive ou parentérale.

Les médicaments selon l'invention peuvent comprendre en outre au moins un autre ingrédient thérapeutiquement actif, pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps, notamment lors d'un traitement chez un sujet atteint d'une affection telle que définie ci-dessus.

Selon l'invention, le composé de l'invention peut être utilisé dans le médicament, en mélange avec un ou plusieurs excipients ou véhicules inertes, c'est à dire pharmaceutiquement inactifs et non toxiques. On peut citer par exemple des solutions salines, physiologiques, isotoniques, tamponnées, etc., compatibles avec un usage pharmaceutique et connues de l'homme du métier. Les compositions peuvent contenir un ou plusieurs agents ou véhicules choisis parmi les dispersants, solubilisants, stabilisants, conservateurs, etc. Des agents ou véhicules utilisables dans des formulations (liquides et/ou injectables et/ou solides) sont notamment la méthylcellulose, l'hydroxyméthylcellulose, la carboxyméthylcellulose, les cyclodextrines, le polysorbate 80, le mannitol, la gélatine, le lactose, des huiles végétales ou animales, l'acacia, etc. Les compositions peuvent être formulées sous forme de suspension injectable, de gels, huiles, comprimés, suppositoires, poudres, gélules, capsules, etc., éventuellement au moyen de formes galéniques ou de dispositifs assurant une libération prolongée et/ou retardée. Pour ce type de formulation, on utilise avantageusement un agent tel que la cellulose, des carbonates ou des amidons.

L'administration peut être réalisée par toute méthode connue de l'homme du métier, de préférence par voie orale ou par injection, typiquement par voie intra-péritonéale, intra-cérébrale, intra-thécale, intra-veineuse, intra-artérielle ou intra-musculaire. L'administration par voie orale est préférée. S'agissant d'un traitement à long terme, la voie d'administration préférée sera sublinguale, orale

ou transcutanée.

Pour les injections, les composés sont généralement conditionnés sous forme de suspensions liquides, qui peuvent être injectées au moyen de seringues ou de perfusions, par exemple. Il est entendu que le débit et/ou la dose injectée, ou de manière générale la dose à administrer, peuvent être adaptés par l'homme du métier en fonction du patient, de la pathologie, du mode d'administration, etc. Il est entendu que des administrations répétées peuvent être réalisées, éventuellement en combinaison avec d'autres ingrédients actifs ou tout véhicule acceptable sur le plan pharmaceutique (tampons, solutions saline, isotonique, en présence d'agents stabilisants, etc.).

L'invention est utilisable chez les mammifères, notamment chez l'être humain.

En général la dose journalière du composé sera la dose minimale pour obtenir l'effet thérapeutique souhaité. Les doses des composés ci-dessus décrits et par exemple du 4-azacholest-4-ène N-oxide, seront en général comprises entre 0,001 à 100 mg par kilo par jour pour l'homme.

Si nécessaire, la dose journalière peut être administrée en deux, trois, quatre, cinq, six ou plus, prises par jour ou par sous-doses multiples administrées par intervalles appropriés pendant la journée. La quantité choisie dépendra de multiples facteurs, en particulier de la voie d'administration, de la durée d'administration, du moment de l'administration, de la vitesse d'élimination du composé, du ou des différents produits utilisés en combinaison avec le composé, de l'âge, du poids et de la condition physique du patient, ainsi que de son histoire médicale, et de toute autre information connue en médecine.

La prescription du médecin traitant pourra commencer à des doses inférieures à celles généralement utilisées, puis ces doses seront progressivement augmentées afin de mieux maîtriser l'apparition d'éventuels effets secondaires. Les exemples qui suivent illustrent la présente demande sans toutefois la limiter.

Exemple 1 : préparation du 4-azacholest-4-ène N-oxide

Exemple 1A : synthèse de l'acide 3,5-seco-4-nor-5-oxocholestane-3-

toluènesulfonique

200mg de 3,5-seco-4-nor-5-oxocholestane-3-ol (0,51 mmol) (Ring-chain tautomerism of 5-oxo-3,5-seco-A-norcholestan-3-ol. Edward, J.T.; Kaufman, M.; Wojtowski, R. K.; Wheeler, D. M. S.; Barrett, T. M., Canadian Journal of Chemistry 1973, 51(10), 1610-16) sont mis en solution dans 1,7 ml_ de dichlorométhane. De la triéthylamine (1,1 éq., 78μL, 0,56mmol) et du chlorure de tosyle (1,1 éq., 107mg, 0,56mmol) sont ajoutés à 0 ⁰ C, puis le milieu réactionnel est agité à température ambiante pendant une nuit. Le milieu réactionnel est alors dilué par du dichlorométhane, lavé à l'eau, puis par une solution saturée de chlorure de sodium, séché sur sulfate de magnésium anhydre, filtré et concentré sous vide pour obtenir une huile. Une chromatographie (éther de pétrole / acétate d'éthyle 95/5 à 9/1) sur gel de silice conduit à l'obtention de 86mg d'acide 3,5-seco-4-nor-5-oxocholestane-3-toluènesulfonique attendu sous forme d'huile (rdt = 31%).

HPLC (détection DEDL) : colonne Thermo Betabasic RP C4, 5 μm, 150 x 4,6 mm ;

Gradient : eau (+0,05% TFA) / acétonitrile (+0,05% TFA) ; t = 0 min : 80% acétonitrile, 20% H ₂ O ; t = 5 min : 100% acétonitrile, 0% H ₂ O ; t = 9 min : 100% acétonitrile, 0% H ₂ O ; TR = 6,72 min, m/z = 562 [M+NH ₄ ]\ 1111 [2M+Na] ⁺ ;

RMN- ¹ H (CDCI ₃ , 250 MHz) δ 0,71 (s, 3H, 18-CH ₃ ), 0,85-0,88 (dd, 6H, 26- CH ₃ , 27-CH ₃ ), 0,92 (d, 1H, 25-CH) ₁ 1 ,04 (s, 3H, 19-CH ₃ ), 2,45 (s, 3H, tos-CH ₃ ), 3,97-4,09 (m, 2H, 3-CH ₂ ), 7,33 (d, 2H, tos-Ar), 7,78 (d, 2H, tos-Ar). Exemple 1 B : synthèse du 4-azacholest-4-ène N-oxide 86mg du l'acide 3,5-seco-4-nor-5-oxocholestane-3-toluènesulfonique (0,157mmol) préparé à l'étape 1A sont mis en solution dans 0,5mL de pyridine. 86mg de chlorhydrate d'hydroxylamine (1 ,24mmol) sont ajoutés en une fois à température ambiante. Le milieu réactionnel est agité durant environ 16h (suivi CCM CH ₂ CI ₂ / MeOH 95/5), puis concentré sous vide. Le résidu est repris dans de l'éther diéthylique, la phase organique est lavée 2 fois à l'eau, séchée sur sulfate de magnésium anhydre, filtrée et concentrée. On obtient ainsi 39mg de 4- azacholest-4-ène N-oxide sous la forme d'un solide blanc (rdt = 64%).

HPLC (détection DEDL) : colonne Thermo Betabasic RP C4, 5 μm, 150 x 4,6 mm ;

Gradient : eau (+0,05% TFA) / acétonitrile (+0,05% TFA) ; t = 0 min : 80% acétonitrile, 20% H ₂ O ; t = 5 min : 100% acétonitrile, 0% H ₂ O ; t ≈ 9 min : 100% acétonitrile, 0% H ₂ O ;

T _R = 3,10 min, m/z = 388 [M+H] ⁺ , 775 [2M+H] ⁺ .

RMN ¹ H : CDCI ₃ δ 0.65 (s, 3H, 18-CH ₃ ), 0,81-0,83 (dd, 6H, 26-CH ₃ , 27-

CH ₃ ), 0,86 (d, 1H, 25-CH) ₁ 1,11 (s, 3H, 19-CH ₃ ), 3,70-3,85 (m, 3H ₁ 3-CH ₂ , 6-CH). RMN ¹³ C : CDCI ₃ δ 12,34 (C18), 19,02 (C21), 19,43 (C1), 19,50 (C19),

21,77 (C11), 22,90 (C6), 22,92 (C26), 23,19 (C27), 24,16 (C23), 24,48 (C15),

28.38 (C25), 28,52 (C16), 30,69 (C7), 33,66 (C2), 35,26 (C8), 36,09 (C20), 36,47 (C22), 39,86 (C12, C24), 40,20 (C10), 42,74 (C13), 54,17 (C9), 56,12 (C14),

56.39 (C17), 58,78 (C3), 155,50 (C5). Exemple 2 à 6 : synthèses des composés 4-azacholest-4,24-diène N-oxide,

4-aza-24-éthylcholest-4-ène N-oxide, 4-azacholest-4,21-diène N-oxide, 4-aza-24- éthylcholest-4,21-diène N-oxide et 4-aza-24-méthylcholest-4,21-diène N-oxide.

Selon les mêmes protocoles que ceux décrits aux exemples 1A et 1 B, il est possible de synthétiser le 4-azacholest-4,24-diène N-oxide, le 4-aza-24- éthylcholest-4-ène N-oxide, le 4-azacholest-4,21-diène N-oxide, le 4-aza-24- éthylcholest-4,21-diène N-oxide, le 4-aza-24-méthylcholest-4,21-diène N-oxide.

Le tableau suivant indique les composés utilisés à chaque étape pour ces synthèses.

Exemple 7 : préparation du 3-méthyl-4-azacholest-4-ène N-oxide Exemple 7A : préparation du 3-méthyl-3,5-seco-4-nor-cholestan-5-one-3- N,N-diméthylglycine ester

1g (2,47mmol) du 3-méthyl-3,5-seco-4-nor-5-oxocholestan-3-ol sont mis en solution dans 1OmL de dichlorométhane à 0 ⁰ C, 521 mg (2,7mmol) de chlorhydrate de 1-(3-diméthylaminopropyl)-3-éthylcarbodiimide et 392mg (3,2mmol) de 4-diméthylaminopyridine sont ajoutés puis le milieu est agité 5min à O ⁰ C. 345mg (2,47mmol) de chlorhydrate de N,N-diméthylglycine sont ajoutés en une portion et la solution est agitée 24h à température ambiante. Le milieu est alors dilué par du dichlorométhane, lavé par une solution à 5% de bicarbonate de sodium dans l'eau puis par une solution 1N d'acide chlorhydrique et enfin par une solution saturée de chlorure de sodium. La phase organique est séchée sur sulfate de magnésium anhydre et concentrée sous vide. Le résidu obtenu est purifié par flash chromatographie sur gel de silice (éluant éther de pétrole 100% puis éther de pétrole / acétate d'éthyle 95/5 et enfin dichlorométhane/méthanol 97/3 à 95/5) ; 1g de 3-méthyl-3,5-seco-4-nor-cholestan-5-one-3-N,N- diméthylglycine ester sont ainsi obtenus (rdt=83%). m/z = 490 [M+Hf

Exemple 7B : préparation du 3-méthyl-3,5-seco-4-nor-cholestan-5-one oxime-3-N,N-diméthylglycine ester

1g (2,04mmol) de 3-méthyl-3,5-seco-4-nor-cholestan-5-one-3-N,N- diméthylglycine ester préparés à l'étape 7A sont mis en solution dans 12mL de pyridine ; 1g (14,4mmol) de chlorhydrate d'hydroxylamine sont ajoutés et le milieu est agité à température ambiante pendant 16h. La pyridine est concentrée sous vide, le résidu obtenu est repris dans de l'eau et extrait à l'acétate d'éthyle

trois fois. La phase organique est lavée par une solution saturée de chlorure de sodium, séchée sur sulfate de magnésium anhydre et concentrée sous vide. 900mg de 3-méthyl-3,5-seco-4-nor-cholestan-5-one oxime-3-N,N-diméthylglycine ester sont ainsi obtenus sous forme d'huile incolore (rdt = 87%) m/z = 490 [M+H] ⁺

Exemple 7C : préparation du chlorhydrate de 3-méthyl-3,5-seco-4-nor- choIestan-5-one oxime- 3-N,N-diméthylglycine ester

900mg (1,78mmol) de 3-méthyl-3,5-seco-4-nor-cholestan-5-one oxime-3- N,N-diméthylglycine ester 7B sont mis en solution dans 5mL de dichlorométhane à 0 ⁰ C sous azote. 2,7ml_ (2,7mmol) d'une solution 1 M de chlorure d'hydrogène dans l'éther diéthylique sont ajoutés goutte-à-goutte. Le milieu est agité 15min à O ⁰ C et concentré sous vide. On obtient ainsi 900mg de chlorhydrate de 3-méthyl- 3,5-seco-4-nor-cholestan-5-one oxime-3-N,N-diméthylglycine ester (rdt=94%).

RMN ¹ H : DMSO δ 0.75 (s, 3H, 18-CH ₃ ), 2,83 (s, 6H ₁ N-(CH ₃ ) ₂ , 3,19 (m, 1 H, 6-CH), 4,18 (s, CH ₂ NMe ₂ ), 4,90 (m, 1 H, O-CH).

Exemple 7D : préparation du 3-méthyl-4-azacholest-4-ène N-oxide 900mg (1 ,66mmol) du de chlorhydrate de 3-méthyl-3,5-seco-4-nor-cholestan- 5-one oxime-3-N,N-diméthylglycine ester 7C sont mis en solution dans 2OmL d'un mélange dichlorométhane/méthanol 1/1. Le milieu réactionnel est agité au reflux pendant 5 jours. Après concentration sous vide, le résidu obtenu est purifié par flash chromatographie sur gel de silice (éluant dichlorométhane/méthanol 98/2) ; 148mg de 3-méthyl-4-azacholest-4-ène N-oxide sont obtenus (solide blanc- beige, rdt=22%).

RMN ¹ H : CDCI ₃ δ 0.69 (s, 3H ₁ 18-CH ₃ ), 0,84-0,85 (dd, 6H, 26-CH ₃ , 27- CH ₃ ), 0,86 (d, 1 H, 25-CH), 1 ,14 (s, 3H, 19-CH ₃ ), 3,74-3,99 (m, 2H, 3-CH, 6-CH). Exemple 8: préparation de la A-nor-3-azacholest-3-ène N-oxide Exemple 8A: préparation du A-dinor-2,5~seco-5-méthoxy-cholest-5-ène-2- méthyl ester

500mg (1 ,28mmol) de l'acide A-dinor-2,5-seco-cholestan-5-one-2-oïque sont mis en suspension dans 7mL de méthanol et 12mg d'acide paratoluènesulfonique sec sont ajoutés. Le milieu est agité au reflux pendant 2h.

423μL de triméthylorthoformate sont alors ajoutés et l'agitation au reflux est poursuivie. Au bout de 2h30, 423μL de triméthylorthoformate sont rajoutés et le

milieu est agité au reflux 3h supplémentaires. Après refroidissement, du carbonate de calcium en poudre est ajouté au milieu réactionnel, puis ce dernier est concentré sous vide. Le résidu est repris dans l'eau et extrait à l'acétate d'éthyle. Les phases organiques sont réunies, lavées par une solution saturée de chlorure de sodium, séchées sur sulfate de magnésium anhydre et concentrées sous vide. Le résidu obtenu est purifié par flash chromatographie sur gel de silice (éluant éther de pétrole 100% puis éther de pétrole / acétate d'éthyle 95/5). 503mg de A-dinor-2,5-seco-5-méthoxy-cholest-5-ène-2-méthyl ester sont obtenus sous forme d'une poudre blanche (rdt=59%). /77/z = 419 [M+H] ⁺

RMN ¹ H : CDCI ₃ δ 0.67 (s, 3H, 18-CH ₃ ), 0,85-0,87 (dd, 6H, 26-CH ₃ , 27- CH ₃ ), 1 ,14 (s, 3H, 19-CH ₃ ), 2,31 (d, 1H, 1-CH _a ), 2,74 (d, 1 H, 1-CH _b ), 3,46 (s, 3H, OCH ₃ ), 3,60 (s, 3H, OCH ₃ ), 4,60 (d, 1H, 6-CH).

Exemple 8B: préparation du A-dinor-2,5-seco-5-méthoxy-cholest-5-ène-2-ol 1 ,95mL (1,95mmol) d'une solution 1M de d'hydrure de lithium-aluminium dans le tétrahydrofuranne sont introduits à 0 ⁰ C. 327mg (0.781 mmol) du A-dinor- 2,5-seco-5-méthoxy-cholest-5-ène-2-méthyl ester 8A en solution dans 4mL de tétrahydrofuranne sont ajoutés goutte-à-goutte. Le milieu réactionnel est agité 30 minutes à 0 ⁰ C puis hydrolyse par ajout au goutte-à-goutte d'une solution saturée de sulfate de sodium dans l'eau. La solution obtenue est extraite 3 fois à l'acétate d'éthyle et lavée par une solution saturée de chlorure de sodium. Les phases organiques sont réunies, séchées sur sulfate de magnésium anhydre et concentrées sous vide. 310mg du A-dinor-2,5-seco-5-méthoxy-cholest-5-ène-2-ol sont ainsi obtenus. m/z = 391 [M+H] ⁺

Exemple 8C : préparation du A-dinor-2,5-seco-cholestan-5-one-2-ol 305mg (0,781 mmol) du A-dinor-2,5-seco-5-méthoxy-cholest-5-ène-2-ol 8B sont mis en solution dans 4mL d'un mélange THF/eau 1/1 ; 6mL d'acide acétique sont alors ajoutés et le milieu réactionnel est agité à température ambiante pendant 16h. Le milieu est dilué à l'acétate d'éthyle, lavé par une solution de bicarbonate de sodium à 10% dans l'eau, puis par une solution saturée de chlorure de sodium. La phase organique est séchée sur sulfate de magnésium anhydre et concentrée sous vide. 245mg du A-dinor-2,5-seco-cholestan-5-one-2-

ol sont obtenus sous forme d'huile incolore qui cristallise (rdt=83%). m/z = 377 [M+H] ⁺

RMN ¹ H : CDCI ₃ δ 0,72 (s, 3H, 18-CH ₃ ), 0,84-0,86 (dd, 6H, 26-CH ₃ , 27- CH ₃ ), 3,91 (m, 2H, CH ₂ OH). Exemple 8D : préparation du A-dinor-2,5-seco-cholestan-5-one-2-N,N- diméthylglycine ester

70mg (0,183mmol) du A-dinor-2,5-seco-cholestan-5-one-2-ol 8C_sont mis en solution dans 1,5mL de dichlorométhane à O ⁰ C, 39mg (0,202mmol) de chlorhydrate de 1-(3-diméthylaminopropyl)-3-éthylcarbodiimide et 29mg (0,238mmol) de 4-diméthylaminopyridine sont ajoutés puis le milieu est agité

10min à O ⁰ C. 26mg (0,183mmol) de chlorhydrate de N,N-diméthylglycine sont ajoutés en une portion et la solution est agitée 48h à température ambiante. Le milieu est alors dilué par du dichlorométhane, lavé par une solution à 5% de bicarbonate de sodium dans l'eau puis par une solution 0,1 N d'acide chlorhydrique et enfin par une solution saturée de chlorure de sodium. La phase organique est séchée sur sulfate de magnésium anhydre et concentrée sous vide. Le résidu obtenu est purifié par flash chromatographie sur gel de silice

(éluant éther de pétrole 100% puis éther de pétrole / acétate d'éthyle 95/5 et enfin dichlorométhane/méthanol 95/5) ; 25mg du A-dinor-2,5-seco-cholestan-5- one-2-N,N-diméthylglycine ester sont ainsi obtenus sous forme d'huile (rdt=29%). m/z = 462 [M+Hf

Exemple 8E : préparation de la A-nor-3-azacholest-3(5)-ène N-oxide 25mg (0,054mmol) du A-dinor-2,5-seco-cholestan-5-one-2-N,N-diméthylglycine ester 8D sont mis en solution dans 2mL de pyridine ; 25mg (0,36mmol) de chlorhydrate d'hydroxylamine sont ajoutés et le milieu est agité à température ambiante pendant 16h. La pyridine est concentrée sous vide, le résidu obtenu est repris dans de l'eau et extrait à l'acétate d'éthyle. La phase organique est séchée sur sulfate de magnésium anhydre et concentrée sous vide. Le résidu obtenu est purifié par flash chromatographie sur gel de silice (éluant dichlorométhane 100% puis dichlorométhane/méthanol 99/1). 12mg de A-nor-3- azacholest-3(5)-ène N-oxide sont obtenus sous forme de solide blanc- ]aune(rdt=60%).

RMN ¹ H : CDCI ₃ δ 0,69 (s, 3H, 18-CH ₃ ), 0,83-0,84 (dd, 6H, 26-CH ₃ , 27-

CH ₃ ), 0,86 (d, 1 H, 25-CH), 1,11 (s, 3H, 19-CH ₃ ), 3,05-3,13 (m, 1 H; 2-CH), 3,72- 4,05 (m, 2H, 2-CH, 6-CH).

Exemple 9: préparation de la 4-azacholest-4,6-diène N-oxide Exemple 9A : synthèse de l'acide 3,5-seco-4-nor-5-oxocholest-6-ène-3- toluènesulfonique

Le composé 9A est préparé selon la méthode décrite à l'exemple 1A à partir de 3,5-seco-4-nor-5-oxocholest-6-ène-3-ol.

RMN ¹ H : CDCI ₃ δ 0,75 (s, 3H, 18-CH ₃ ), 2,45 (s, 3H, tos-CH ₃ ), 3,95 (m, 2H, OCH ₂ ), 5,87 (d, 1H, 6-CH), 6,77 (d, 1H, 7-CH), 7,34 (d, 2H, tos-Ar), 7,77 (d, 2H, tos-Ar).

Exemple 9B : synthèse du 4-azacholest-4,6-diène N-oxide Le composé 9B est préparé selon la méthode décrite à l'exemple 1B à partir du 3,5-seco-4-nor-5-oxocholest-6-ène-3-toluènesulfonique 9A

RMN ¹ H : CDCI ₃ δ 0,69 (s, 3H, 18-CH ₃ ), 3,85 (m, 2H), 6,24 (d, 1H, 6-CH), 6,97 (m, 1 H, 7-CH).

Exemple 10. Effet des composés de formule I sur la survie des motoneurones

Pour mettre en évidence l'action neuroprotectrice des composés de formule

I, la demanderesse a étudié leur activité sur un modèle in vitro de privation trophique de motoneurones de rats. On pourra se référer utilement à la demande de brevet WO0142784 de la demanderesse sur la mise en culture des motoneurones de moelle épinière.

La moelle épinière d'embryons E14 de rat est disséquée et la partie ventrale est dissociée par trituration après trypsination. Les motoneurones sont séparés des autres cellules spinales par une méthode connue (Camu et al, 1993, Purification of spinal motoneurons from chicken and rat embryos by immunopanning. In «Immunoselection Stratégies for Neural cell culture», Neuroprotocols: A compaπion to Methods in Neurosciences 2, 191-199; Henderson et al., 1993, Neutrophins promote motor neuron survival and are présent in embryonic limb bud. Nature 363 (6426) : 266-70). Les cellules sont centrifugées sur un gradient de densité. Les motoneurones sont enrichis dans la fraction des grandes cellules (les moins denses). Les cellules de cette fraction sont incubées avec un anticorps anti-p75, un antigène de surface présent sur les motoneurones. Des anticorps secondaires couplés à des billes magnétiques sont

ajoutés et le mélange de cellules est passé à travers une colonne dans un aimant (Arce et al, 1999, Cardiotrophin-1 requires LIFRbeta to promote survival of mouse motoneurons purified by a novel technique. J. Neurosci Res 55(1) : 119-26). Seuls les motoneurones sont retenus : leur pureté est de l'ordre de 90%.

Les motoneurones sont ensemencés à faible densité dans des puits de culture sur un substrat de polyornithine-laminine dans un milieu Neurobasal

(GIBCO) supplémenté selon Raoul et al, 1999, (Programmed cell death of embryonic motoneurons triggered through the Fas death receptor. J CeII Biol 147(5) :1049-62).

Des contrôles négatifs (absence de facteurs trophiques) et positifs (en présence de BDNF (Brain-Derived Neurotrophic Factor) à 1 ng/ml, GDNF (Glial-

Derived Neurotrophic Factor) à 1 ng/ml et CNTF (Ciliary Neurotrophic Factor) à

10 ng/ml, commercialisés par la société PEPROTECH, Inc. USA et la société Sigma-AIdrich), sont inclus dans chaque série.

Les composés à tester sont ajoutés au milieu de culture 60 minutes après l'ensemencement et les cultures sont maintenues à 37°C sous 5% de CO ₂ pendant 3 jours.

Les motoneurones ont une tendance spontanée à mourir en l'absence de facteurs neurotrophiques (Pettmann et Henderson, 1998, Neuronal cell death.

Neuron 20(4) :633-47). Après 3 jours, la survie est évaluée par une mesure de fluorescence après incubation des cellules en présence de calcéine qui devient fluorescente dans les cellules vivantes.

Après 3 jours en culture à 37 ⁰ C, sous 5% de CO ₂ et en humidité saturante, jusqu'à 50% des motoneurones ensemencés initialement survivent dans le milieu additionné de facteurs neurotrophiques, alors que moins de 15% des motoneurones survivent en milieu de culture non additionné de facteurs neurotrophiques.

L'activité .neuroprotectrice des composés à tester a été évaluée par leur capacité à empêcher la mort des motoneurones quand ils sont ajoutés au milieu Neurobasal (GIBCO) en comparaison avec la survie des motoneurones en milieu additionné de facteurs neurotrophiques.

Les composés de formule I selon l'invention ont montré une activité

neuroprotectrice à une concentration capable de permettre un meilleur taux de survie des motoneurones dans le milieu Neurobasal. Ce taux de survie est exprimé par le nombre de cellules vivantes après traitement avec le composé à tester, rapporté au nombre de cellules vivantes lorsque cultivées en milieu additionné de facteurs neurotrophiques. Ce rapport représente donc le pourcentage de survie due au composé testé par rapport à la survie induite par les facteurs neurotrophiques. Si le rapport est supérieur à 0, l'effet des composés est positif sur la survie des motoneurones. Les résultats obtenus sont les suivants :

De par leur effet trophique sur les motoneurones spinaux, les composés de formule I selon l'invention présentent des propriétés qui permettent d'envisager leur utilisation comme médicament cytoprotecteur, notamment comme médicament neuroprotecteur, utilisable avantageusement dans le traitement des amyotrophies, en particulier dans le traitement de la sclérose latérale amyotrophique ou des amyotrophies spinales infantiles, et dans le traitement des traumatismes de la moelle épinière.