基于蛋白 A亲和模型构建的免疫球蛋白 G的亲和配基多肽库及其应用

技术领域

本发明涉及利用分子模拟仿生设计目标蛋白质 的亲和配基技术， 以及利用亲和色谱技术纯化目标 蛋白质， 属于生物技术中的计算机模拟和蛋白质分离纯 化技术领域。 背景技术

抗体 （免疫球蛋白， Ig) 是位于动物血液和组织液中， 由 B淋巴细胞在对抗原的免疫应答中产生 的一类糖蛋白。抗体与抗原具有的高亲和性使 其广泛应用于生物学研究和临床治疗领域。特 别是随着基 因技术和克隆技术的逐渐成熟， 单克隆抗体已成为治疗炎症、 肿瘤和传染类疾病的有效药物。 目前， 已 有大约 20种单克隆抗体药物被 FDA批准上市， 至少 300个还在研发之中， 2006年单克隆抗体类药物 的产值达到了 206亿美元。抗体在医疗领域中日益显现的重要 性亟需高效、稳定和低廉的生产工艺。 由 于抗体表达的复杂性以及对医用抗体的高质量 要求， 抗体纯化已成为整个生产过程的关键步骤。 其中 IgG是血清中主要的抗体成分， 约占血清 Ig的 75%， 也是需求量最大的一类抗体。

抗体纯化通常采用盐析、 凝胶过滤色谱、 疏水作用色谱、 离子交换色谱和亲和色谱等分离手段进 行多步纯化。其中亲和色谱因能对目标分子进 行高效特异性纯化已成为抗体纯化后期最常用 的色谱方法 之一。亲和色谱是利用亲和配基能与目标分子 特异且可逆结合的特性，从复杂的生物样品中 分离纯化目 标分子， 具有选择性强， 纯化效率高的优点。亲和色谱法的纯化效果取 决于目标分子与配基之间的亲和 性。 因此， 针对特定的目标分子， 开发合适的亲和配基是构建一个亲和色谱体系 所首要解决的问题。

金黄色葡萄球菌蛋白 A(SpA) 、蛋白 G和蛋白 L作为亲和配基已广泛用于制备高纯度抗体。� �类 配基的优点在于特异性高，而缺陷是过高的亲 和力需要较苛刻的洗脱条件，容易导致目标蛋 白变性和配 基脱落， 吸附容量较低； 此外这类配基的制备也比较困难， 价格昂贵， 蛋白经固定化后一般会失去部分 活性。 这些弱点使得上述蛋白类配基的应用受到限制 。

亲和肽配基的研究始于 1986年 Geysen对合成肽库的研究， 他提出： 含有关键残基的短肽能够模 拟蛋白质上的决定簇。而且在多数情况下，几 个关键残基与对应目标分子间的非共价作用构 成了复合物 结合的主要作用力。这两个观点奠定了亲和肽 配基的理论基础。肽配基通常仅由很少的氨基 酸组成， 不 会在产品使用时引起免疫中毒反应。而且其分 子量小， 即使从固定相上脱落、掺入产品中也很容易从 终 产物中除去。 此外肽配基与蛋白质的作用条件温和， 有利于控制分离条件， 避免目标蛋白的变性。 和蛋 白类等具有高亲和力的配基相比，亲和肽配基 也具有足够高的亲和力结合目标蛋白。肽配基 的构象和理 化性质更稳定，能承受分离操作中较强的酸碱 洗脱和再生条件，可实现在 GMP条件下大规模无菌生产。 近些年来涌现出的一批肽配基都对抗体具有较 好的分离纯化效果，如 TG 19318、 Peptide H、 A1P、A2P 、 8/7、 线性肽配基 （HWRGWV等）。

尽管多肽作为亲和配基具有如此多的优越性， 但自然界中与目标蛋白有亲和力的多肽数量十 分有 限。 上述所讨论的小分子配基虽然在抗体纯化研究 中显现出了很大优势， 但与 SpA亲和介质相比， 也 存在着不足， 如特异性和亲和力较差等。 因此在亲和色谱的实际应用中， 配基的筛选和设计至关重要。 如何选择合适的多肽序列作为亲和配基， 以及如何提高多肽的亲和力和选择性的问题， 已成为影响多肽 亲和色谱应用的关键。现有的筛选和设计方法 主要分为实验筛选和理性设计两类方法。实验 筛选是基于 组合库技术进行高通量实验筛选， 根据构建多肽文库方法的不同， 亲和配基的筛选技术主要分为： 组合 化学合成肽库筛选， 如上述提到的 TG19318/D-TG19318、 Peptide H、 MAbSorbent A1P、 A2P和 8/7; 噬 菌体展示肽库筛选， 如 HWRGWV、 HYFKFD和 HFRRHL; 核糖体展示肽库筛选这三类。 理性设计主 要是基于目标蛋白或已有配基的结构和性质设 计新配基。随着计算机技术、计算化学和药物 化学的发展， 亲和配基的设计已进入以计算机辅助设计为主 导的理性设计阶段。计算机辅助配基设计的各 种虚拟设计 方法包括分子对接， 3D-QSAR, 药效团模型， 分子动力学 (molecular dynamics, MD)模拟和从头设计等。

分子对接是两个分子之间通过几何匹配和能量 匹配而相互识别的过程。 分子对接计算是把配基分 子放在目标蛋白结合位点的位置，然后按照几 何互补、能量互补和化学环境互补的原则来实 时评价配基 与目标蛋白结合的好坏，并找到两个分子之间 最佳的结合构象。由于分子对接考虑了目标蛋 白与配基相 互作用的信息， 因此从原理上讲， 分子对接是一种基于受体的直接设计方法。近 年来随着蛋白晶体结构 信息的快速增长以及小分子数据库的不断更新 ， 分子对接已经成为基于结构设计中的最为重要 的方法。 常用软件有 DOCK, Autodock和 FlexX等。

分子动力学是建立在牛顿力学基础上的一种分 子模拟方法， 用于研究多粒子体系中各粒子的运动 过程。 MD模拟的基本步骤可以分为如下四步： （1 ) 初始化； （2 ) 计算原子受力； （3 ) 更新原子坐标 和速度。根据上一步的原子坐标、 速度和受力， 即可得到原子在下一时刻的坐标和速度。 不断循环进行 ( 2 )和（3 )步得到体系状态随模拟时间的变化情况； （4 )分析轨迹。 常用的分子动力学模拟软件主要 有 GROMACS、 NAMD、 AMBER和 CHARMM等。 通过分析 MD模拟轨迹可以获得模拟体系的各 种性质， 包括构象、 能量、 动力学性质以及配基-目标蛋白质之间的相互� �用力等。

采用多种理性设计方法， 通过设计合理的组合策略可以实现降低成本和 更高精度的配基设计。 在 前期采用一些计算速度快但精度有限的方法以 富集可能的候选分子， 如分子对接法。 随后再采用 MD 模拟等计算量大但更精确的方法进一步挑选最 佳的配基分子。在后期阶段则采用比较耗时和 高成本的实 验方法做最后验证。 发明内容

本发明的目的在于提出一种基于蛋白 A亲和模型构建免疫球蛋白 G的新型亲和配基多肽库及设计 方法的应用。 本发明所述的抗体亲和短肽配基的仿生设计方 法是首次建立的， 并经验证是有效的。

本发明基于蛋白 A亲和模型构建免疫球蛋白 G的新型亲和配基多肽库， 其依据为 6个 SpA关键残 基： F 132、 Y133、 H137、 E143、 R146和 Κ154。 为了配基的固定， 在多肽序列中间位置添加一个半胱 氨酸。 该肽库共有以下 8种序列：

FYCHXXXE , FYXHCXXE , FYCHXXR, FYXHCXR、 FYXCRXE , YFXCRXE , HXYFCXR和 HXYFCXK;

其中 X代表除去半胱氨酸以外的 19种氨基酸。

本发明的新型的亲和多肽设计方法的应用， 是在上述肽库的基础上， 进一步利用氨基酸定位方法， 确定 X所代表的氨基酸种类。

X所代表的氨基酸种类如下表所示：

多肽构建模式& X代表的氨基酸种类

条数

FYCHXXXE X— 1 : A, R, N, D, Q, E, H, I, L, K, M, T, W, Υ, V (15)

990 X— 2: A, Q, E, I, L, K (6)

X— _3 : A, R, D, Q, E, L, K, M, P, S, T (11)

FYXHCXXE X— 1 : A, R, N, D, I, P, T, W, Y (9)

594 X— —2: A, Q, E, I, L, K(6)

X— _3 : A, R, D, Q, E, L, K, M, P, S, T (11)

FYCHXXR X— 1 : N, D, Q, E, H, I, K, M, F, P, T, W, Y, V (14)

112 X— —2: Q, E, H, I, K, M, F, W (8)

FYXHCXR X 1 : A, R, N, D, I, P, T, W, Y (9) 72 X—2: Q, E, H, I, K, M,F,W(8)

FYXCRXE X— 1: A, R, N, D, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, W, Y, V (17)

153 X— —2: N, D, Q, E, L, M, S,T,W(9)

YFXCRXE X— 1: N, D, E, H, I, L, K, M,P, S, T, Y, V (13)

117 X— —2: N, D, Q, E, L, M, S,T,W(9)

HXYFCXR X— 1: A, R,N, D, I, P, T,W,Y(9)

54 X— —2: Q, H, K, S,W,Y(6)

HXYFCXK X— 1: A, R,N, D, I, P, T,W,Y(9)

81 X— —2: A, R, Q, H, K, F,W,Y,V(9)

具体的短肽序列如表 5所示。

将多肽库进行分子对接筛选、 均方根偏差比较以及分子动力学模拟复筛， 获得与 hlgG具有较高亲 和性的多肽配基： FYWHCLDE, FYFCRWE, FYIHCLPE, FYYHCKKE, FYCHWALE, FYCHWQDE, FYCHTIDE, FYRHCQRE, FYCHHKTE, FYCHLQKE, FYCHRKAE, FYCHNQDE, FYCHRQEE和 FYNHCASE。

需要强调的是， 上述仿生肽库中包含的所有多肽分子 （2173条）， 理论上都有可能是 hlgG的亲和 肽配基；而进行分子对接筛选以及分子动力学 模拟复筛，是为了富集与 hlgG有较高亲和性的多肽分子， 有效缩小候选多肽数量便于进行后续实验验证 ； 经过依次筛选最后得到的 14 个多肽分子， 是与 hlgG 具有较高亲和性的概率最大的多肽分子。虽然 计算机模拟技术发展至今不断趋于成熟和完善 ，但对生物 分子间的相互作用的预测还不能达到与实际情 况完全一致的水平，因此分子模拟软件就不可 避免地具有 各种局限性 （如利用不同的分子模拟软件或采用不同的参 数就可能会产生不同的结果）， 只能做到与实 际情况尽可能地趋于接近。所以应用分子模拟 软件进行筛选时， 会出现两种情况： 一是筛选得到的多肽 分子是 hlgG的亲和肽配基的命中率随筛选次数不断增� �； 二是漏筛的、 排除掉的可作为 hlgG的亲和 肽配基的多肽分子也会随筛选次数增多。所以 ， 不排除多肽库中其余的 2161条多肽分子也可能是 hlgG 的多肽亲和配基。

本发明利用分子模拟和实验手段获得 IgG亲和短肽配基的方法如下 1-5步：

1. 应用分子力学 /泊松 -波尔兹曼溶剂可及表面积 (molecular mechanics-Poisson-Boltzmann surface area, MM/PBSA)自由能计算和自由能分解方法计算得到� ��白 A与 hlgGl结合 （图 1) 的关键残基， 得 到蛋白 A简化的亲和结合模型（图 2): 首先使用 MM/PBSA方法计算了 SpA和 hlgGl复合物的绝对结 合自由能。 然后， 采用一种基于 MM/PBSA的自由能分解方法解析 SpA和 MgGl的高亲和性分子机理 并分析 SpA-hlgGl 复合物的结合表面的残基对结合自由能的贡献 。 根据每个残基的自由能贡献和残基 作用对的分析确定 SpA和 hlgGl相互作用的热点残基。

2. 根据亲和结合模型中 6个离散的热点残基的构象和相对位置， 应用 Autodockvina (简称 vina) 分子对接软件计算出多肽序列的长度和需要插 入的氨基酸残基种类;在多肽序列中间位置加� �一个半胱 氨酸（Cys)， 便于方便地、有选择性地将多肽固定到色谱介 质一 Thiopropyl (硫丙基） Sepharose 6B上， 从而使多肽两端的热点残基有充分的自由度， 使其能与 hlgG发挥关键的亲和作用， 不至于在多肽固定 到介质上后而减弱其与 hlgG的亲和作用。 最后得到包含一系列七肽和八肽序列的多肽库 。

具体操作是从 hlgGl-SpA复合物的晶体结构 (PDB ID: 1FC2)中分别选取 Fc片段和 SpA的 B结构 域的三维坐标文件；从 SpAB结构域的坐标文件中再单独取出 6个热点残基 (F132， Y133, H137, E143, R146和 K154)的坐标结构， 计算两两热点残基之间相应 C和 N端之间的距离， 根据插入氨基酸数目的 原则， 计算热点残基之间应插入的氨基酸残基个数， 确定多肽序列模式， 见表 1; 然后将多肽序列中间 位置的氨基酸确定为 Cys， 见表 2; 之后选取两两热点残基之间对应的 Fc片段， 使其包含在 vina对接 软件的格栅盒子之中。 选择好盒子之后， 将 19种氨基酸（除去 Cys)依次与盒子包含的 Fc片段进行对 接， 选择打分最高的前 20个构象。 按照氨基酸选取的基本原则进行筛选： 1) 构象合适， 即氨基酸残基 对接构象的 C和 N末端必须与相应热点氨基酸残基的 N和 C端首尾相接形成肽键； 2) 亲和结合自由 能< -2.0 1«£11/ ₀ 1 ₀ 1。 结果： 得到多肽中未知氨基酸残基（X)的种类， 见表 3。 利用 perl脚本调用 charmm 构建多肽库， 其共包含 2173条序列， 见表 5， 每条序列都包含 4个热点残基。

3. 利用 vina和 Rosetta Flexpepdock (简称 Flexpepdock)分子对接软件将多肽库中的多肽分子 依次 与 hlgGl的 Fc片段进行对接， 然后根据打分排名获得与 Fc片段具有较高结合能的多肽分子。 这里需 要说明的是， 1 ) 打分的分数标准是根据打分分布人为设定的， 是根据经验值选择的最有可能富集有效 分子的数值； 2 ) 利用分子对接软件进行筛选是为了富集与 hlgG具有亲和性的多肽分子的数目， 剔除 可能性较低的分子， 从而节省后续验证实验的操作成本； 而不是将未通过筛选标准的多肽分子作为非 hlgG亲和肽配基摒弃掉， 这些多肽分子只是不符合本次研究设定的标准 。 相关技术人员可根据实际需 要， 适当地提高或降低这一分数标准， 虽然会改变筛选得到的分子数目 （提高或降低筛选标准会使进入 下一轮筛选的候选分子数目相应地减少或增加 ，后者会减少漏筛的可能性，但另一方面也会 增加整个研 究过程的复杂性。最佳情况是能找到一个平衡 点， 使得既不会漏筛掉过多的潜在分子， 也不会使最后得 到的多肽库中无效或效果弱的分子较多）， 但这与本发明目的一致， 也符合本发明精神。 vina对接盒子 恰好包含 Fc和 SpA的结合区域一 CH2和 CH3之间的 "一致性结合位点（consensus-binding site, CBC)"， 固定好盒子后， 依次将多肽库里的多肽分子与 vina盒子包含的 Fc片段进行对接。 选取结合自由能（打 分分数）低于 -6.5 k _C al/mol 的多肽分子， 共计 754个多肽。 在这里值得注意的是， 配基筛选采用的是打 分分数低于 -6.5 kcal/mol的标准，选取这一标准的理由会在下文� ��有详细说明。利用 GROMACS分子模 拟软件自带的 g_rms程序计算 vina对接得到的 754条多肽序列与 SpA中相应的热点残基之间的均方根 偏差 (rmsd)，据此比较 vina对接后多肽中的热点残基与 SpA中的热点残基构象之间的差异。 选择 Encad 全原子力场， 对除去氢原子之外的热点残基计算 rmsd值。 rmsd值越小， 表示多肽包含的热点残基的对 接构象与 SpA中热点残基构象越接近。 结果表明， rmsd值主要分布在 0.2 0.6 nm之间， 选择 rm _S d<0.4 mn的 150个多肽进行下一步的研究。 在这里值得注意的是，筛选肽配基的 rmsd值标准也是可根据实际 情况进行适当更改的， 相关技术人员在相似的研究背景和情况下， 可参照本发明设置合适的 rmsd值标 准使得筛选得到的多肽分子数目适中又不至于 漏筛掉过多的潜在分子。将 vina对接得到的多肽 -Fc复合 物构象作为初始构象，利用 Flexpepdock对上一轮筛选得到 150个多肽与 Fc进行逐个对接。 Flexpepdock 对接参数为 flexpepdockflags :

-pep refine

-use input sc

-exl

-ex2aro

-ignore unrecognized res

-nstruct 1

-out:suffix pepdock

-lowres_preoptimize

-scorefile flexpepdock.se

进行两次平行分子对接， 以减少只进行一次对接的结果的随机性。 结果发现只有少数几个多肽不 能与 Fc结合， 大部分多肽序列都能结合到 Fc上。 对接打分分数 (结合界面能量分数， I_sc )分布在 -4~-22 之间， 其中 I_sc在 -14 -16之间的分布最多， 选取 I_sc≤-16为筛选标准， 这样既可使候选多肽数目不太 多从而避免计算资源浪费 （考虑到下一轮分子动力学模拟复筛比较消耗 计算机资源， 速度慢)， 又不至 于漏筛掉过多的潜在分子。当然相关技术人员 可根据自己研究的实际情况更改为更适合自己 研究的 I_sc 筛选标准。 共有 15个多肽分子与 hlgGl的 Fc片段之间的 I_sc在两次平行分子对接中均小于 -16， 挑选 这 15条多肽分子进行下一轮筛选。

4. 将步骤 3中筛选得到的 15条多肽分子与 hlgGl的 Fc片段进行 MD模拟， 再次筛选多肽配基， 得到在模拟时间尺度内能与 Fc片段稳定结合的多肽分子， 即这些多肽分子有可能与 hlgG具有较高的 亲和作用。 将步骤 3 中利用 Flexpepdock对接获得的多肽 -hlgGl 复合物的构象作为初始构象， 利用 GROMACS 4.5.3软件包， 选择 G53a6力场， 将 15个候选多肽的 pdb坐标结构利用 pdb2gmx命令转化 为 GROMACS专用的 gro结构； 利用 editconf命令将多肽-蛋白复合物置于矩形水盒子 中心， 使它们距 离盒子边缘最小为 0.9 nm _; 然后用 genbox命令来向模拟盒子中添加水分子， 水分子采用 SPC216 7 模 型； 然后用 grompp命令将 mdp文件中标明的参数整合为结构和拓扑文件从 而生成 tpr文件， 以及应用 genion命令加入平衡系统净电荷所需的离子种类 和数量；之后进行能量最小化，去除体系中的 原子间的 碰撞和不正确的几何构型；接下来用 mdrun命令依次进行 100 ps的正则（NVT)系综和等温等压（NPT) 系综下的限制动力学平衡， 最后仍然利用 mdrun命令进行 20 ns的无限制 MD模拟。 相关技术人员可根 据自己研究的实际情况更改相应参数， 使其更适合特定的、 不同的研究情况。

5. 合成筛选得到的多肽分子， 将其固定到 Thiopropyl Sepharose 6B色谱介质上制成亲和介质并装 柱， 进行亲和色谱实验验证。 研究脉冲进样 hlgG溶液以及对人血清中 hlgG的分离和电泳情况。

本方法首先利用 MM/PBSA自由能计算和自由能分解方法获得与人 IgG具有高亲和性的蛋白 A的 热点残基， 并以此为基础构建蛋白 A与 hlgG结合的亲和结合模型。 然后利用氨基酸定位、 分子对接、 均方根偏差比较以及在多肽序列中间位置添加 一个半胱氨酸的方法，构建多肽库，之后将多 肽库进行分 子对接筛选以及分子动力学模拟复筛， 获得与 hlgG具有较高亲和性的多肽配基， 已经确定的能有效分 离纯化 hlgG的多肽分子有两个， 分别是 FYWHCLDE和 FYCHWALE。 并应用亲和色谱、 聚丙烯酰胺 凝胶电泳 （SDS-PAGE ) 和分光光度法等一系列实验手段进行了 IgG的分离纯化及其表征的研究。

值得提出的是， 多肽库中的全部 2173条多肽分子理论上都有可能是 hlgG的亲和配基， 但由于分 子模拟自身的局限性， 不可能完全模拟实际情况， 而只能是与实际情况尽可能地趋于接近， 所以最终需 要实验进行实际情况的验证。 由于时间人力物力的限制， 本发明不可能将全部多肽依次进行实验验证。 本发明只在最终筛选得到的 14条多肽中随机挑选两个进行实验表征， 主要目的在于阐述如何用实验方 法进行多肽作为 hlgG亲和配基有效性的验证， 而不是指只有本发明提到的两个多肽有效。 相关技术人 员可根据本发明所述的实验方法对多肽库中其 它多肽进行验证。 附图说明

图 1为蛋白 A与 hlgGl Fc片段复合物的三维结构； helix I和 helix II是蛋白 A的 B结构域的两个 螺旋结构， 它们与 Fc片段的 CH2和 CH3铰链区结合， 结合位点称为 "一致性结合位点 (CBCf

图 2为蛋白 A的简化亲和结合模型； helix I包含三个热点残基 (F132、 Y133和 H137 ) ; helix II包 含三个热点残基 (E143、 R146和 K154 )

图 3是氨基酸插入图示； 虚线框内表示插入的氨基酸残基

图 4为多肽分子与 Fc的 vina对接打分数值分布； 结合自由能数值越负表示配基与 Fc之间的亲和 性越高

图 5为 SpA的热点残基与多肽对接构象的相对应的热点 残基之间的均方根偏差数值分布， 数值越 小， 表示两者的构象越接近

图 6为肽分子与 Fc片段的第一次 Flexpepdock对接打分数值分布； 结合界面能量分数数值越负， 表示结合越牢固

图 7是肽配基亲和柱分离纯化人血清样品中的 IgG。平衡缓冲液： 20 mM磷酸钠盐缓冲液， pH 6.0； 再生缓冲液： 0.1 M Gly-HCl缓冲液， pH 2.4。 A图表示偶联有肽配基 FYWHCLDE的亲和柱对人血清 样品中 IgG的分离，洗脱缓冲液 : 50 mM柠檬酸钠盐缓冲液， pH 3.0 ; B图表示偶联有肽配基 FYCHWALE 的亲和柱对人血清样品中 IgG的分离， 洗脱缓冲液： 平衡缓冲液， 包含 0.2 M NaCl， pH 6.0

图 8亲和色谱洗脱结果的 SDS-PAGE分析，从左至右电泳条带依次为标准蛋� �� MarkerGO-120 kDa), 人血清样品 （feedstock), 流出峰 （F-T) 和洗脱峰 （Elution) 组分。 A图为 FYWHCLDE的电泳图， B 图为 FYCHWALE的电泳图 具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步详细地描述， 该实施例是用于解释、 而不以任何方式限制本发明。 实施例 1 获得 SpA的简化亲和结合模型

首先使用 MM/PBSA方法计算金黄色葡萄球菌蛋白 SpA和 hlgGl复合物的绝对结合自由能。然后， 采用一种基于 MM/PBSA的自由能分解方法解析 SpA和 hlgGl高亲和性的分子机理并分析 SpA-hlgGl 复合物的结合表面的残基对结合自由能的贡献 。根据每个残基的自由能贡献和对残基作用对 的分析确定 SpA和 hlgGl相互作用的热点残基。最后，基于以上解� ��获得的分子机理和热点残基构建了 SpA的亲 和结合模型。

SpA-hlgGl 复合物分子体系被用于分子动力学模拟。 每个复合物模型包含一条 Fc 片段的单链和 SpA的 B 结构域。 SpA-hlgGl的模型结构取自蛋白质数据库 (PDB ID: 1FC2) (图 1 )。 分子动力学模 拟使用 CHARMM软件以及 CHARMM27全原子力场完成。 首先采用 TIP3P水分子模型将 SpA-hlgGl 复合物溶解于长方体盒子中 (100x80x60 Κ)。 添加 Na ⁺ 或 C1—作为反离子以中和体系电荷。 体系经能量最 小化后， 采用 NPT系综平衡 200 ps， 最后采用 NVT系综继续模拟 15 ns。 体系的温度设为 298 K， 并 采用 Nose-Hoover法维持恒温。 所有的模拟都应用周期性边界条件。 计算非键作用时采用 12 A的距离 截断， 应用 Particle Mesh EwakUPME)计算长程静电作用。 SHAKE用于限制所有氢原子， 时间步长设 为 2 fs。 由于该体系只包含 Fc 片段的一条单链，故在 Fc 片段的两个终端残基上施加一个距离约束以 限制 CH2和 CH3域的弯曲。最后从平衡阶段的最后 3 ns 轨迹中以 40 ps为间隔均匀取样，共得到 75 帧构象供后续分析。

采用 MM/PBSA方法计算 SpA-hlgGl复合物的结合自由能 (AGbind)。 AGbind为气相作用能 (AGgas), 溶剂化作用能 (AGsol)和熵作用项 (-TS)的总和。

AGbind = <AGgas> + <AGsol> - <TAS>

括号 <...>表示所有模拟得到的能量项的平均值� �� T代表绝对温度， S是溶质熵。

Ggas包含分子间静电作用项 (Gelec)， 范德华作用 （vdw) 项 (Gvdw)和内能项 (Ginter)。

由于本研究采用"相同轨道方法 "进行取样分析， 因此内能项 （Ginter)为 0。故 AGgas对结合自由能 的贡献是 AGelec和 AGvdw 的总和。

AGgas = AGelec + AGvdw

溶剂化作用能包括以下两部分： 静电溶剂化能 (GPB)和非极性溶剂化能 (Gnp

Gsol = GPB + Gnp

GPB是使用 CHARMM程序的 PBEQ模块求解线性泊松-玻尔兹曼方程 (PB)得到的。 在所有的 PB 计算中， 溶质和溶剂介电常数分别设为 1和 80。 离子强度为 0， 溶剂分子半径设为 1.4 A。 Gnp是溶剂 空穴作用项和溶质 -溶剂范德华作用项之和， Οηρ = γ χ SASA + b， 常数 γ和 b分别设为 0.00542 kcal/(mol.A ² )和 0.92 kcal/moL SASA代表溶剂可及表面积。

溶质熵 (S)可分解为平动熵 (St _ranS )、转动熵 (Srot)和振动熵 (Svib)。这三项由统计力学计算得到。 Stems 和 Srot分别是分子的质量和转动惯量的函数。 振动熵 (Svib)是使用 CHARMM程序的 VIBRAN模块做 标准模式分析 (normal mode analysis, NMA)得到。

每个残基的自由能贡献分解为极性 (Gpolar)和非极性作用 (Gnonpolai^

其中每一项继续分解为两个能量项之和。在接 下来的分析中， Gpolar被认为是残基的静电作用贡献， Gnonpolar可认为是疏水作用贡献。 需要注意的是， Gresidue只是分解为 Gpolar和 Gnonpolar (即不包 含熵）。 Gresidue = Gpolar + Gnonpolar, Gpolar = Gelec + GPB, Gnonpolar = Gvdw + Gnp。 每个残基的 静电作用能 (Gpolar)等于分子间静电作用能 (Gelec)和溶剂化静电作用能 (GPB)之和。线性 PB方程允许将 静电溶剂化能分解为每个原子的贡献。 SpA上每个残基的范德华作用能贡献等于该残基 与 Fc片段之间 范德华作用能的一半， 对于 Fc片段上每个残基的范德华作用能反之亦然。 每个残基的非极性溶剂化作 用能与该残基的溶剂可及表面积的损失成比例 。 通过以上分析即可计算得到 SpA-hlgGl复合物的结合 自由能 (AGbind)以及每个残基的自由能贡献， 进而得到 SpA与 hlgGl相互作用的热点残基。

在 SpA-hlgGl复合物中， 与 Fc片段接触的 SpA残基离散地分布于螺旋 I (K126至 H137)、 螺旋 II (E144至 D155)和不规则卷曲 (L138至 E143)上。在本研究中， 热点残基被定义为对结合自由能贡献较大 的残基以及参与形成重要的分子间作用以补偿 不利的溶剂化作用的残基。采用 ±2.5 kcal/mol的标准来识 别对自由能贡献较大的残基。为了识别复合物 中的重要残基来指导亲和配基的理性设计，本 研究所采用 的标准高于其他文献中常用的士 2.0 kcal/mol 的标准。 SpA中只有 F132, Y133, H137, R146和 K154这 5 个残基对结合自由能贡献较大。 SpA的 E143残基虽然只有较小的能量贡献 (-1.2 kcal/mol), 但其自由能 偏差却高达士 6.7 k _C al/mol。此外， E143的侧链带有一个带负电荷的羧基，主要提� �静电作用。因此， E143 的自由能贡献对残基的构象十分敏感。 SpA的 E143与 hlgGl的 K317之间有很强的分子间静电吸引作 用 (-24.0 kcal/mol)。 相反， 它与 hlgGl的 D280和 D315残基有较弱的静电排斥作用。 因此， 虽然 SpA 的 E143没有直接贡献较多的结合自由能， 但却为 hlgGl的 K317创造了一个有利的局部结合环境。 故 E143也被认为是 SpA的热点残基之一。

螺旋 I与 Fc片段通过疏水作用结合。特别是螺旋 I的热点残基 F132和 Y133提供了大部分的疏水 作用。 MD模拟结果表明 F 132和 Y133的芳香侧链紧密结合在 Fc片段疏水性口袋的浅槽。相反， 螺旋 Π通过静电作用与 Fc片段结合。 螺旋 II包含 3个极性热点残基 (E143， R146和 K154)， 与分布在结合 位点的疏水区域周围的极性残基 (H310， Q311 , D315, K317和 Κ338)有很强的静电吸引作用。 因此， 为开发新的拟蛋白 Α亲和配基，在理性设计过程中需要综合考虑� ��水作用和特殊的静电作用。根据 SpA 与 hlgGl的亲和机理和 SpA的热点残基分布， 构造了一个 SpA的简化的结合模型， 6个 SpA关键残 基为 F132, Y133, H137, E143， R146和 K154, 见图 2。 此模型可以作为 IgG的拟蛋白 A亲和配基理性 设计的起始点。

实施例 2 多肽库的构建

1. 确定多肽序列的长度

已知：

肽键的长度 1.33A;

氨基酸主链长度 2.78A

插入一个氨基酸残基需 2个肽键长度和一个氨基酸的主链长度 2x 1.33+2.78=5.44 A;

插入两个氨基酸残基需 3个肽键长度和两个氨基酸主链长度 3 χ 1.33+2χ2.78=9.55Α;

图 3为插入一个氨基酸的示例 （虚线框内线条代表增添的键）。 若两个热点残基之间的 C和 Ν端 之间的距离 （insertion distance) <5.44 A时， 就可以插入一个氨基酸残基； 若 5.44 A< insertion distance <9.55 A， 则考虑插入两个氨基酸残基； 若 insertion distance >9.55 A， 则需要插入三个或以上的氨基酸 残基。

根据 SpA两个热点残基相应的 N和 C端之间的距离（利用 Visual Molecular Dynamics, VMD软件 计算得到） ， 确定需插入的氨基酸个数。 最终确定的多肽构建模式如表 1 所示。 表 2

表 1

序号 多肽构建模式

序号 多肽构建模式

1 FYCHXXXE

1 FYXHXXXE

2 FYXHCXXE

2 FYXHXXR

3 FYCHXXR

3 FYXXRXE

4 FYXHCXR

4 YFXXRXE

5 FYXCRXE

5 HXYFXXR

6 YFXCRXE

6 HXYFXXK

7 HXYFCXR

8 HXYFCXK

其中， 一种模式是八肽， 其余都是七肽。 考虑到多肽配基的 N和 C两末端都由热点残基组成， 它 们和 IgG均具有较高的亲和作用。 为使配基在固定化后仍然保持其与抗体之间的 高亲和性， 考虑在配 基的中间位置插入 Cys， 这样就可将多肽通过二硫键偶联在 Thiopropyl Sepharose 6B介质上。 因此， 在 多肽序列的中间位置插入一个 Cys 以便于多肽的固定化。 这样就可保证多肽固定于介质上后， 其两端 的关键残基具有充分的自由度， 能够充分发挥两端关键残基的亲和作用， 从而保持其与 IgG Fc片段之 间的亲和作用力。 据此， 根据 SpA热点残基以及残基之间需插入的残基个数， 我们最终得到八种多肽 的构建模式 （见表 2)。

2. 确定热点残基空隙处插入的氨基酸残基种类

利用片段定位法（fragment location method),片段定位法是利用分子模拟方法来确定� ��定原子或片 段在结合腔中的最佳位置的一种模拟方法。 首先确定结合腔中不同的作用区域， 如： 静电区域、 疏水区 域、氢键供体区和氢键受体区。再根据化学环 境匹配的原则， 在结合腔内放置与之化学特征匹配的配体 分子。 例如， 受体疏水区附近放置的配体分子片段也是疏水 性基团， 如苯环、 脂肪疏水链等； 受体上的 正 /负电区域应该与配体的负 /正电区域匹配。首先选择与蛋白 A的六个热点残基之间的空缺位置所对应 的 Fc片段区域， 利用分子对接软件 vina将 19种氨基酸 （除去 Cys， 便于之后的多肽配基固定化） 与 Fc 片段区域依次进行对接， 得到与该空缺位置具有较高亲和性的氨基酸种 类， 再将这些氨基酸残基与 热点残基按顺序连接起来得到候选多肽配基。

利用氨基酸定位法确定热点残基之间应插入氨 基酸的种类， 以此为基础构建多肽库。

选取氨基酸的基本原则如下： 1) 构象合适， 即氨基酸残基对接构象的 C和 N末端必须与其它氨基 酸残基的相应 N、 C端首尾相接； 2) 亲和结合自由能< -2.0 k _C al/mol。 表 3所示为确定的多肽中未知氨 基酸残基 （X) 的种类。

表 3

多肽构建模式& X代表的氨基酸种类

条数

FYCHXXXE X— 1 A, R, N, D, Q, E, H, I, L, K, M, T, W, Υ, V (15)

990 X— 2 A, Q, E, I, L, K (6)

X— _3 A, R, D, Q, E, L, K, M, P, S, T (11)

FYXHCXXE X— 1 A, R,N, D, I, P,T,W,Y(9)

594 X— —2 A, Q, E, I, L, K(6)

X— _3 A, R, D, Q, E, L, K, M, P, S, T (11)

FYCHXXR X— 1 N, D, Q, E, H, I, K, M, F, P, T, W, Y, V (14)

112 X— —2 Q, E, H, I, K, M, F,W(8)

FYXHCXR X— 1 A, R,N, D, I, P,T,W,Y(9)

72 X— —2 Q, E, H, I, K, M, F,W(8)

FYXCRXE X— 1 A, R, N, D, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, W, Y, V (17)

153 X— —2 N, D, Q, E, L, M, S,T,W(9)

YFXCRXE X— 1 N, D, E, H, I, L, K, M,P, S, T, Y, V (13)

117 X— —2 N, D, Q, E, L, M, S,T,W(9)

HXYFCXR X— 1 A, R,N, D, I, P,T,W,Y(9)

54 X— —2 Q, H, K, S,W,Y(6)

HXYFCXK X— 1 A, R,N, D, I, P,T,W,Y(9)

81 X— —2 A, R, Q, H, K, F, W,Y,V(9)

利用 peri脚本调用 Charmm软件得到多肽库， 总共包含 2173条序列， 每条序列都包含 4个热点残 基。

实施例 3 多肽分子与 Fc片段的对接

1. 多肽与 Fc片段的 vina对接

由于单个残基与 Fc有较强的亲和作用不一定代表由残基组成的� ��肽与 Fc有较强的相互作用，因此 继续用 vina将多肽库中的全部多肽与 Fc片段的 CBC依次对接。对接结果显示所有多肽都能与 Fc片段 结合，且所有多肽的预测结合自由能在 -4.5~-8.2k _C al/mol 之间，此范围符合亲和配基的适中亲和力要求 (结合常数在 10 ⁴ ~10 ⁸ M— ¹ 之间）。 其中结合自由能在 -6.5 kcal/mol左右的多肽分布最多。 筛选时为避免 漏选， 选取结合自由能低于 -6.5 kcal/mol 的多肽分子， 共计 754个多肽。 对接打分数值的分布见图 4。

为了能够充分发挥热点残基与 IgG之间的亲和作用， 要尽量寻找多肽中的热点残基的对接构象与 SpA中相应的热点残基构象一致的多肽序列，这 样的多肽序列能够仿效 SpA与 Fc片段形成高效的亲和 结合作用。 为了分析短肽配基中热点残基与 SpA中相应残基之间构象的差别， 本研究利用 GROMACS 分子模拟软件自带的 g_rms程序计算 vina对接得到的 754条多肽序列与 SpA中相应的热点残基之间的 rmsd。 选择 Encad全原子力场， 对除去氢原子之外的关键氨基酸残基计算 rmsd值。 rmsd值越小， 表示 多肽包含的热点残基的对接构象与 SpA中相应热点残基的构象越接近。结果表明， rmsd值分布在 0.2 0.6 nm之间 （图 5 )。 选择 rmsd<0.4 nm的 150个多肽序列进行下一步的研究。

2. FlexPepDock复筛多肽分子

一般的分子对接软件如 Autodock, DOCK, PatchDock, ParDock, MEDdock等只适用于含有一定 数目的可旋转键的小分子的对接， 由于多肽侧链较多， 比小分子含有更多的自由度， 因此以上对接软件 在用于多肽与蛋白质之间的分子对接筛选时有 一定的限制。 Flexpepdock是一种针对研究多肽与目标蛋 白对接的新型软件， 该软件采用蒙特卡洛最小化方法， 充分考虑多肽的主、侧链柔性以及受体蛋白的 侧 链柔性。 只需知道结合位点以及多肽-蛋白的大致结合� �型， 就能够利用该软件高精度地预测多肽 -受体 蛋白质之间的结合构象。 FlexPepDock的打分函数是一种全原子能量函数， 包括 Lennard- Jones全原子 吸引和排斥项， Lazaridis-Jarplus溶剂项以及氢键等。 大量研究证实评价多肽 -蛋白结合的强弱主要是看 结合界面能量分数 （I_sc)。

利用 Flexpepdock对上一轮筛选得到 150个多肽与 Fc进行逐个对接。 结果发现只有少数几个多肽 不能与 Fc结合， 大部分多肽序列都能结合到 Fc上。 这些待选多肽的 I_sc在 -5~-22之间， 分数越负， 表示结合作用越强。 挑选 I_sc<-16的待选多肽序列， 共进行了两次平行对接， 第一次对接结果中有 34 个多肽序列的 I_sc的绝对值大于 16 (图 6)。 第二次对接结果中， 有 38个多肽序列的 I_sc的绝对值大 于 16。在这两次 Flexpepdock对接结果中， I_sc绝对值均大于 16的多肽序列有 15条。表 4中 vina_score 表示 vina对接的打分， I_sc-1表示第一次 Flexpepdock对接的打分， I_sc-2表示第二次平行 Flexpepdock 对接的打分分数。

表 4

Peptide vina score I—sc-l I_sc-2

FYWHCLDE -7.3 -21.3 -22.0

FYFCRWE -7.0 -16.9 -19.3

FYIHCLPE -6.9 -18.2 -18.8

FYYHCKKE -6.5 -16.7 -18.8

FYCHWALE -7.6 -17.1 -18.1

FYCHWQDE -7.7 -20.1 -17.8

FYCHTIDE -6.8 -17.8 -17.4

FYRHCQRE -6.5 -19.7 -16.9

FYCHHKTE -6.6 -17.0 -16.9

FYCHLQKE -6.7 -17.2 -16.8

FYCHRKAE -6.9 -17.6 -16.8

FYCHNQDE -6.6 -19.9 -16.7

FYCHRQEE -6.7 -17.6 -16.6

FYNHCASE -7.1 -16.8 -16.1 FYTHCAKE -7.0 -17.1 -16.1 因此， 我们挑选这 15条多肽分子做进一步的分子动力学模拟分析� ��与 IgG之间的亲和性。

实施例 4分子动力学 (MD)模拟

MD模拟是研究蛋白动力学行为的非常有效的工� ��， 蛋白快速的内部运动、 较慢的构象变化以及 折叠过程都可以应用 MD模拟进行研究。为了进一步验证 IgG—多肽配基复合物之间的亲和作用力， 不 仅要考虑其静态结构 （利用分子对接）， 也要研究其动态行为。 接下来就利用 MD模拟来研究上述 15 条候选多肽分子与 IgG的 Fc片段结合的动态信息。

所有的 MD模拟都是用 GROMACS 4.5.3软件包进行的， 选择 GROMOS96 53a6力场， 将多肽-蛋 白复合物置于矩形水盒子中心， 距离盒子边缘至少 0.9 nm， 库仑力和 Lennard-Jones作用的截断值均为 0.9 nm， PME方法用于计算长程静电相互作用，其网格间 距和内插级数分别为 0.12 nm和 4，应用 v-rescale 恒温器和 Parrinello-Rahman恒压器分别控制体系温度（300 K)和压力 （l bar)。 积分步长为 2 fs， 应用 LINCS算法限制所有的共价键。先进行 50,000步最陡下降法将体系进行能量最小化，然 后依次进行 100 ps的 NVT和 NPT系综下的限制动力学平衡， 最后进行 20 ns的无限制动力学模拟。每 500 ps保存一帧 构象，共进行 20 ns的 MD模拟，最后得到 40个不同模拟时间的构象。所有的 MD模拟都是在 Dawning A620r-F服务器上进行。

首先利用 VMD 软件计算多肽与 Fc片段之间的相互作用和相对位置的变化， 发现 15个多肽分子 当中只有 FYTHCAKE从 Fc片段上解离下来， 并在 MD模拟过程中逐渐远离对方。 分析 FYTHCAKE 和 Fc作用时发现 C _a 原子的 rmsd值随模拟时间的变化， 发现在整个 20 ns的模拟过程中， 多肽和 Fc的 C _a 的 rmsd值剧烈波动， 一直没有达到稳定状态。 将其最终构象与初始构象 （Flexpepdock对接构象） 相比， 其 C _a 原子的 rmsd值达到 0.45 nm。 并分析 FYTHCAKE与 Fc原子之间的接触数和最小距离随模 拟时间的变化， 发现在 15 ns左右， 多肽与 Fc开始发生脱离， 接触数从 600开始急剧下降， 相应地最 小距离迅速增大， 在 18 ns左右两者已经完全脱离。 说明 FYTHCAKE和 IgG之间的亲和作用不高。 相 反， 在整个分子动力学模拟过程中其他多肽分子均 能与 Fc保持结合状态， 说明这 14个多肽分子可能是 IgG 的有效亲和配基， 分别是 FYWHCLDE、 FYFCRWE、 FYIHCLPE、 FYYHCKKE、 FYCHWALE、 FYCHWQDE、 FYCHTIDE、 FYRHCQRE, FYCHHKTE、 FYCHLQKE、 FYCHRKAE、 FYCHNQDE、 FYCHRQEE和 FYNHCASE。 实施例 5 亲和色谱实验验证

1. 肽配基的固定和亲和柱的制备

多肽分子委托吉尔生化有限公司（上海)进行� �成， 产品经高效液相色谱 (HPLC)纯化， 纯度为 96.36%。 称取 1 g干介质 （Thiopropyl Sepharose 6B购自 GE Healthcare), 用大约 200 mL过膜水在布氏 漏斗中清洗 15 min, 滤除水分后从中分别称取 lg湿介质加入到两个 25 mL锥形瓶中， 然后分别加入 6 mL和 10.7 mL交联缓冲液 （0.1 M Tris-HCl, pH 7.5, 0.5 M NaCl, 1 mM EDTA) 使介质充分预平衡。 从 分子动力学模拟得到的 14条多肽中随机挑选多肽分子（FYWHCLE和 FYCHWALE), 分别称取上述肽 粉， 溶于 500 50%乙二醇溶液中。 将肽溶液和对应的锥形瓶中的介质充分混合， 使得肽溶液初始浓 度为 1.0 mg/mL, 25 °C 170 rpm水浴摇床反应 2小时。 每隔 lh离心取 500 μ∑反应上清液， 用于反相高 压液相色谱 （RP-HPLC ) 检测反应液中剩余的肽含量。 待反应上清液中肽含量不再变化后， 加入 8 mg Cys继续反应 0.5 h， 封闭介质上的未反应基团以免干扰蛋白与配基 的亲和作用。 反应完毕后， 离心， 移去上清液， 然后将介质用清洗缓冲液 （10 mM磷酸盐缓冲液， pH 7.2， 150 mM NaCl) 在布氏漏斗中 反复清洗多次， 洗去未固定的多肽。 最后将介质用平衡缓冲液 (20 mM柠檬酸钠盐缓冲液， pH 5.0 5.5 ; 或 20 mM磷酸钠盐缓冲液， pH 5.5 6.0)悬浮为 1 mL，脱气后缓慢灌入玻璃柱内（Tricom型色谱柱� �� Tricom 5x5， GE公司），先用平衡缓冲液以流速 O. l mL/min冲洗柱子，待柱压稳定后将流速升高至 0.2 mL/min, 按此操作直至流速升高至 1.0 mL/min, 观察凝胶柱高度不再下降时， 将高度调节器旋至凝胶柱上表面， 即可。

2. 溶液中肽含量的检测 反应液中肽含量的检测采用反相高压液相色谱 法， 具体检测参数如下： 流动相 A， 含 0.1 %三氟乙 酸的水溶液； 流动相 B， 含 0.1 %三氟乙酸的乙腈； 上样量： 10 L; 流速： 0.5 mL/min _; 检测波长： 220 nm。 其中多肽 FYWHCLDE几乎能全部固定到介质上， FYCHWALE的固定化率为 93.7%。

3. 亲和色谱实验

(1)平衡： 用平衡缓冲液冲洗直至基线走平， 流速 0.5 mL/min， 继续冲洗 5倍柱体积开始上样。

(2)上样： 除非特别声明， 蛋白样品均以平衡缓冲液配制， 每次上样后用 5-10倍柱体积的平衡缓冲 液（20 mM柠檬酸钠盐 buffer ， pH<5.5 _; 20 mM磷酸钠盐 buffer, pH>5.5 )进行平衡。 上样体积为 100 μL, 蛋白样品浓度为 1.0 mg/mL， 流速： 0.5 mL/min。

(3) 洗脱： 用洗脱缓冲液冲洗 5-10个柱体积， 流速： 0.8 mL/min。

(4) 保存： 先用 10倍柱体积的纯水冲洗柱子， 然后再用 10倍柱体积的 20%乙醇溶液冲洗柱子， 并 将其保存于该溶液中。 所有缓冲液均要过膜脱气。

在 pH 5.0-6.0时， FYWHCLDE肽配基对 hlgG有较强吸吸附作用。 相反， 对 BSA只有在 pH 5.5 时才有较大吸附。 FYWHCLDE肽配基与 hlgG之间的亲和作用主要涉及特异性静电相互� �用。 在 pH 5.5 7.0时， 配基 FYCHWALE对 hlgG都有较大吸附， 但在 pH 6.0时几乎能吸附全部的 hIgG。 因此磷 酸钠盐缓冲液（20 mM， pH 6.0)为 FYCHWALE吸附 hlgG的最佳吸附条件。 肽配基与 hlgG之间的亲 和作用主要涉及静电相互作用， 因此吸附体系的离子强度要适宜， 不能太高， 以免引起肽配基对抗体蛋 白的吸附力减弱。 FYCHWALE在 pH 5.5时能吸附大约一半的 BSA， pH 6.0时吸附 1/3的 BSA， pH 6.5 时只吸附很少量的 BSA。 以上结果说明两条多肽在 pH 6.0时对 hlgG都有特异性吸附。

4. 蛋白含量测定

混合蛋白溶液中蛋白总量的测定均采用 Bradford法， 操作如下： 配制一系列浓度为 15、 30、 45、 60、 75和 90 g/mL的 BSA溶液各 1 mL， 空白对照为 lmL蒸熘水。 测定每个数据点时， 向蛋白溶液和 对照溶液中各加入考马斯亮蓝 G-250溶液 3 mL， 充分混和， 1-2分钟内于 595 nm下测定吸光值， 蛋白 浓度对吸光值作图即可得到蛋白含量标准曲线 。为了制作 IgG浓度的标准曲线，分别配制 0 ~ 2.0 mg/mL 浓度的 hlgG溶液， 用紫外分光光度法测 280 nm下的吸收值， 然后绘制标准曲线。 IgG标准曲线用于测 定只含有 IgG的纯蛋白溶液。 测定色谱各组分中蛋白在 280 nm和 595 nm下的吸光值， 然后根据标准 曲线计算其中的蛋白含量。

5. 对血清样品中 IgG的色谱分离纯化

亲和介质经平衡缓冲液（20 mM磷酸钠盐缓冲液， pH 6.0或 6.5 )充分平衡后， 即各项指标基线都 达到平衡， 将人血清与吸附缓冲液按 1:9混合得到血清样品， 进样 500 L。 继续用平衡缓冲液冲洗 5 个柱体积， 然后用含有 0.5或 0.2 M NaCl的平衡缓冲液进行洗脱； 或是 50 mM柠檬酸钠盐缓冲液 （pH 3.0) 进行洗脱。 待洗脱峰完全分离后， 用 0.1 M Gly-HCl缓冲液 （pH 2.4) 进行亲和介质再生。 分离结 果如图 7所示。

6. 十二垸基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)

主要溶液：

1) . 10%的分离胶， 4 mL: 1330 的 30%的凝胶 （丙烯酰胺： 甲叉双丙 =29:1 ); 1670 的去离子 水； 1000 的 1.5M的 Low Tris缓冲液； 40 的 10%过硫酸胺 （APS ) ； 10 的 TEMED。

2) . Low Tris缓冲液： 称取 Tris 18.17 g， 2.5 mL浓 HC1, SDS 0.4 g， 加水溶解， 定容至 lOO mL, 调 pH至 8.8。

3). 10%过硫酸胺： 称取 APS O.l g, 加水溶解， 定容至 l mL。

4) . Upp Tris缓冲液： 称取 Tris 3.03 g， 2 mL浓 HC1， SDS 0.2 g, 加水溶解， 定容至 50 mL， 调 pH 至 6.8。

5) . 5%的浓缩胶， 4 mL: 665 的 30%的凝胶； 2335 的去离子水； 1000 的 1.0 M的 Upp Tris; 40 的 10% APS; 16 的 TEMED。

6) . 非还原型电泳样品缓冲液（Non-reducing Sample buffer): ¾ Upp Tris 5.5 mL, 甘油 8.8 mL， 再 称取 SDS 2 g， 溴酚蓝 5-10 mg， 加水溶解， 定容至 50 mL。 7). PAGE电泳染色液： 称取考马斯亮蓝 （R-250 ) 0.625 g， 甲醇 250 mL和乙酸 50 mL混合， 定容 至 500 mL。

8). PAGE电泳脱色液： 取甲醇 150 mL和乙酸 50 mL混合， 定容至 500 mL。

9).电泳缓冲液 （PAGE buffer) : 称取 Tris 7.5 g， 十二垸基硫酸钠 （SDS ) 1.0 g和甘氨酸 36 g， 溶 于水中， 定容 500 mL， 调节 pH 8.3。 使用方法： 每次取 lOO mL, 用水稀释 5倍； 电泳缓冲液要没过平 台， 并在电泳结束后回收。

样品准备： 取 25 的原样品溶液和 25 L的样品 buffer混合均匀。 Maker进样 5 L， 样品进样 10 。取 SDS-PAGE的分离胶加到 SE/250型垂直板电泳槽中，分离胶加入量要控制 在距玻璃板 1.5 cm处， 然后轻轻在分离胶上覆盖一层水， 待分离胶凝固后， 倒出水， 加入浓缩胶并插入梳子。 待浓缩胶凝固后 拔出梳子， 用微量进样器向梳子孔内加入待测样品。 样品中蛋白质含量以 10 μ _§ 为宜。 选择在 10 mA 的电流下运行，直到指示带迁移到浓缩胶底部 ，然后再将电流调至 25 mA，直到指示带迁移到凝胶底部， 结束电泳。 电泳结束后， 采用考马斯亮蓝（R-250 )染色法， 该方法灵敏度高， 最低检测极限为 0.3〜1.0 μ _{§ 0} 将凝胶浸入染色液中， 室温染色 4h， 这样可以同时达到固定和染色的目的。 再利用脱色液脱色， 直到凝胶背景接近无色为止。 所得凝胶经凝胶成像仪照相， 用 Gel-Pro分析软件对凝胶结果进行分析。

对分离人血清得到的流出峰和洗脱峰组分进行 电泳， 电泳图如图 8所示。用 Gel-Pro分析软件计算 得到 IgG纯度， 用 Bradford法计算回收率。 人血清中 IgG含量为 18.07%， FYWHCLDE纯化的洗脱峰 组分中 IgG含量 88.86%, 回收率 65.5%。 FYCHWALE纯化的洗脱峰组分中 IgG含量分别为 89.6% (pH 6.5吸附体系） 和 88.5% (pH 6.0吸附体系）， IgG得率达 71% (pH 6.0吸附体系）。 和报导中提到的其 他 hlgG亲和配基的分离纯化效果相比， 本发明利用的肽配基纯化得到的 hlgG的纯度以及得率都较高， 因此是 hlgG的有效亲和配基。

本发明所介绍的分子模拟设计人 IgG亲和肽配基的方法与其它的构建新型肽配基 的方法如组合化 学合成肽库筛选、 噬菌体展示肽库筛选以及核糖体展示肽库筛选 相比， 有如下优点： 第一， 不需要复杂 昂贵的原材料， 比实验手段操作简单， 成本低廉； 第二， 可以构建数量庞大的候选分子库， 实现真正意 义上的大规模高通量筛选。 筛选得到的多肽分子不仅是人 IgG的亲和配基， 也适用于其他物质， 如也 能对猪和羊 IgG等进行有效地分离纯化。 本发明所使用的分子对接筛选、 分子动力学模拟复筛和最后 的实验验证， 对多肽库中的所有多肽分子都是适用的， 由于各种限制因素， 不能将肽库中的全部多肽分 子都进行实验验证， 只能通过各种筛选方法进行有效候选多肽分子 的富集。但有一点值得肯定的是， 除 了最终得到的 14条多肽序列， 散布在多肽库中的其他多肽分子也可能是 IgG的亲和肽配基， 相关技术 人员如有需要可挑选并进行实验验证。 但根据已取得的实验数据， 表明肽库中的多肽分子是人 IgG的 有效候选亲和肽配基， 希望有效果较佳的肽配基能够得到商业化， 进而造福人类。

表 5

FYCHAAAE FYCHAARE FYCHAADE FYCHAAQE FYCHAAEE FYCHAALE FYCHAAKE

FYCHAAME FYCHAAPE FYCHAASE FYCHAATE FYCHAQAE FYCHAQRE FYCHAQDE

FYCHAQQE FYCHAQEE FYCHAQLE FYCHAQKE FYCHAQME FYCHAQPE FYCHAQSE

FYCHAQTE FYCHAEAE FYCHAERE FYCHAEDE FYCHAEQE FYCHAEEE FYCHAELE

FYCHAEKE FYCHAEME FYCHAEPE FYCHAESE FYCHAETE FYCHAIAE FYCHAIRE

FYCHAIDE FYCHAIQE FYCHAIEE FYCHAILE FYCHAIKE FYCHAIME FYCHAIPE

FYCHAISE FYCHAITE FYCHALAE FYCHALRE FYCHALDE FYCHALQE FYCHALEE

FYCHALLE FYCHALKE FYCHALME FYCHALPE FYCHALSE FYCHALTE FYCHAKAE

FYCHAKRE FYCHAKDE FYCHAKQE FYCHAKEE FYCHAKLE FYCHAKKE FYCHAKME

FYCHAKPE FYCHAKSE FYCHAKTE FYCHRAAE FYCHRARE FYCHRADE FYCHRAQE

FYCHRAEE FYCHRALE FYCHRAKE FYCHRAME FYCHRAPE FYCHRASE FYCHRATE 3S¾ H3Ad 3T¾ H3Ad 33¾ H3Ad 3 ¾ H3Ad

3V¾ H3Ad 3n H3Ad 3S1 H3Ad 3dl H3Ad 3P\n H3Ad

331 H3Ad 3 1 H3Ad 3V1 H3Ad 3II H3Ad 3SI H3Ad

3dI H3Ad 3IMI H3Ad 3¾I H3Ad 31I H3Ad 33I H3Ad 3 I H3Ad 3ai H3Ad

3¾I H3Ad 3VI H3Ad 3I3 H3Ad 3S3 H3Ad 3d3 H3Ad 3M3 H3Ad 3¾3 H3Ad

313 H3Ad 333 H3Ad 3 3 H3Ad 3O3 H0Ad 3V3 H3Ad 3I H3Ad

3S H3Ad 3d H3Ad 3¾ H3Ad 31 H3Ad 33 H3Ad 3 H3Ad

3O H0Ad 3V H3Ad 3IV H3Ad 3SV H3Ad 3dV H3Ad 3MV H3Ad

3¾V H3Ad 31V H3Ad 33V H3Ad 3 V H3Ad 30V H3Ad 3¾V H3Ad 3W H3Ad

3d¾ H3Ad 33¾OH3Ad 3 ¾OH3Ad

3V¾OH3Ad HSlOHOAd

HVlOHOAd HIIOHOAd HSIOHOAd

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HVIOHOAd 3S3OH0Ad 3d3OH0Ad 3¾3OH0Ad

333OH0Ad 3 3OH0Ad 3V3OH0Ad 3I aH3Ad

3S OH0Ad 3d 0H3Ad 3¾ 0H3Ad 33 0H3Ad 3 0H3Ad

3V 0H3Ad HIVOHOAd HSVOHOAd HdVOHOAd

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HdlNHOAd 3¾INH3Ad HlINHOAd 33INH3Ad 3 INH3Ad

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313NH3Ad 333NH3Ad 3 3NH3Ad 3¾3NH3Ad 3V3NH3Ad 3I NH3Ad

3S NH3Ad 3d NH3Ad 3M NH3Ad 3¾ NH3Ad 31 NH3Ad 33 NH3Ad 3 NH3Ad

3a NH3Ad 3V NH3Ad HIVNHOAd HSVNHOAd HdVNHOAd

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HITHHOAd HSTHHOAd

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T9.i80/ciozN3/x3d tnt60/noz OAV 3V¾lH3Ad

HIIlHOAd HSIlHOAd

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3331H3Ad 3 31H3Ad 3V31H3Ad 3I 1H3Ad

3S 1H3Ad 3d 1H3Ad 33 1H3Ad 3 1H3Ad

3V 1H3Ad HIVlHOAd HSVlHOAd HdVlHOAd

3 VlH3Ad 3aVlH3Ad HVVlHOAd 3a¾IH3Ad 3d¾IH3Ad 3I¾IH3Ad

3S¾IH3Ad 3¾¾IH3Ad 31¾IH3Ad 33¾IH3Ad 3 ¾IH3Ad

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HdllHOAd HMIIHOAd 3¾IIH3Ad HlIIHOAd 33IIH3Ad 3 IIH3Ad aailHOAd

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313IH3Ad 333IH3Ad 3 3IH3Ad 3¾3IH3Ad 3V3IH3Ad 3I IH3Ad

3S IH3Ad 3d IH3Ad 3M IH3Ad 3¾ IH3Ad 31 IH3Ad 33 IH3Ad 3 IH3Ad

3a IH3Ad 3¾ IH3Ad 3V IH3Ad HIVIHOAd HSVIHOAd HdVIHOAd HMVIHOAd

3¾VIH3Ad HlVIHOAd 33VIH3Ad 3 VIH3Ad 3aVIH3Ad 3¾VIH3Ad HVVIHOAd

3S¾HH3Ad 3¾¾HH3Ad H SHHOAd 33¾HH3Ad 3 ¾HH3Ad

3V¾HH3Ad HSlHHOAd HdlHHOAd 3P\nHH3Ad 3¾lHH3Ad 3nHH3Ad

331HH3Ad 3 1HH3Ad HVlHHOAd HIIHHOAd HSIHHOAd

HdlHHOAd HIMIHHOAd 3¾IHH3Ad HlIHHOAd 33IHH3Ad 3 IHH3Ad HaiHHOAd

3¾IHH3Ad HVIHHOAd 3I3HH3Ad 3S3HH3Ad 3d3HH3Ad 3M3HH3Ad 3¾3HH3Ad

313HH3Ad 333HH3Ad 3 3HH3Ad 3O3HH0Ad 3¾3HH3Ad 3V3HH3Ad 3I HH3Ad

3S HH3Ad 3d HH3Ad 3M HH3Ad 3¾ HH3Ad 31 HH3Ad 33 HH3Ad 3 HH3Ad

30 HH3Ad 3V HH3Ad HIVHHOAd HSVHHOAd HdVHHOAd

3¾VHH3Ad HlVHHOAd 33VHH3Ad 3 VHH3Ad HaVHHOAd 3¾VHH3Ad HWHHOAd

30¾HH3Ad 3d¾HH3Ad 3I¾HH3Ad 33¾3H3Ad 3 ¾3H3Ad

3V¾3H3Ad 3n3H3Ad 3S13H3Ad 3dl3H3Ad 3¾13H3Ad

3313H3Ad 3 13H3Ad 3V13H3Ad 3II3H3Ad 3SI3H3Ad

3dI3H3Ad 3P\[I3H3Ad 3¾I3H3Ad 31I3H3Ad 33I3H3Ad 3 I3H3Ad 3ai3H3Ad

3VI3H3Ad 3I33H3Ad 3S33H3Ad 3d33H3Ad 3M33H3Ad 3¾33H3Ad

3133H3Ad 3333H3Ad 3 33H3Ad 3O33H0Ad 3¾33H3Ad 3V33H3Ad 3I 3H3Ad

3S 3H3Ad 3d 3H3Ad 3M 3H3Ad 3¾ 3H3Ad 31 3H3Ad 33 3H3Ad 3 3H3Ad

30 3H3Ad 3V 3H3Ad 3IV3H3Ad 3SV3H3Ad 3dV3H3Ad 3MV3H3Ad

3¾V3H3Ad 31V3H3Ad 33V3H3Ad 3 V3H3Ad 3aV3H3Ad 3¾V3H3Ad 3W3H3Ad

3S¾3H3Ad 3Q¾3H3Ad 3d¾3H3Ad 3Q¾ H3Ad

T9.i80/ciozN3/x3d tnt60/noz OAV 3¾I H3Ad 33I H3Ad 3 I H3Ad HSI HOAd

3I3 H3Ad 3S3 H3Ad 3d3 H3Ad 3ai H3Ad

HVI HOAd 3 3 H3Ad 3V3 H3Ad 3¾3 H3Ad

313 H3Ad 333 H3Ad 33 H3Ad 3I H3Ad

3S H3Ad 3d H3Ad 3V H3Ad HIV HOAd HSV HOAd HdV HOAd 3 H3Ad

HVV HOAd 3I¾IH3Ad 3¾VIH3Ad HlVIHOAd HIMVAVHOAd

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331IH3Ad 3 1IH3Ad 3¾IIH3Ad HlIIHOAd 33IIH3Ad 3 IIH3Ad HSIIHOAd

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313IH3Ad 333IH3Ad 31 IH3Ad 33 IH3Ad 3I IH3Ad

3S IH3Ad 3d IH3Ad 3V IH3Ad HIVIHOAd HSVIHOAd HdVIHOAd 3 IH3Ad

3a IH3Ad 3¾VIH3Ad 3d¾IH3Ad HVVIHOAd

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33Ί腿 U 3丄 I腿; 3入 d HSIIMHOAd

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3V MH3Ad HIVMHOAd HdVMHOAd 3爾腿 U

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3¾V¾H3Ad 31V¾H3Ad 33V¾H3Ad 3 V¾H3Ad 30V¾H3Ad

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33T¾H3Ad 3 T¾H3Ad 3Vl¾H3Ad HI IHOAd 3SI¾H3Ad

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3S ¾H3Ad 3d ¾H3Ad 33 ¾H3Ad 3 ¾H3Ad

30 ¾H3Ad 3V ¾H3Ad 3IV¾H3Ad 3SV¾H3Ad 3dV¾H3Ad

3VV¾H3Ad 3¾VlH3Ad 33VlH3Ad

T9.i80/ciozN3/x3d tnt60/noz OAV

SI- FYCHWLLE FYCHWITE FYCHWLAE FYCHWLRE FYCHWLDE FYCHWLTE FYCHWKAE

FYCHWKQE FYCHWLKE FYCHWLME FYCHWLPE FYCHWLSE FYCHWKSE FYCHWKRE

FYCHWARE FYCHWKEE FYCHWKLE FYCHWKKE FYCHWKME FYCHWAKE FYCHWKTE

FYCHYAME FYCHWADE FYCHWAQE FYCHWAEE FYCHWALE FYCHYQRE FYCHYQDE

FYCHYQQE FYCHYAPE FYCHYASE FYCHYATE FYCHYQAE FYCHYQPE FYCHYQSE

FYCHWQTE FYCHYQEE FYCHYQLE FYCHYQKE FYCHYQME FYCHWEEE FYCHWELE

FYCHWEKE FYCHWEAE FYCHWERE FYCHWEDE FYCHWEQE FYCHWIAE FYCHWIRE

FYCHYIDE FYCHWEME FYCHWEPE FYCHWESE FYCHWETE FYCHYIME FYCHYIPE

FYCHYISE FYCHYIQE FYCHYIEE FYCHYILE FYCHYIKE FYCHYLQE FYCHYLEE

FYCHYLLE FYCHYITE FYCHYLAE FYCHYLRE FYCHYLDE FYCHYLTE FYCHYKAE

FYCHYKQE FYCHYLKE FYCHYLME FYCHYLPE FYCHYLSE FYCHYKSE FYCHYKRE

FYCHYARE FYCHYKEE FYCHYKLE FYCHYKKE FYCHYKME FYCHYAKE FYCHYKTE

FYCHYAAE FYCHYADE FYCHYAQE FYCHYAEE FYCHYALE FYCHVKDE FYCHVQSE

FYCHWQTE FYCHYKPE FYCHYKDE FYCHVAAE FYCHVKPE FYCHWEEE FYCHWELE

FYCHWEKE FYCHWEAE FYCHWERE FYCHWEDE FYCHWEQE FYCHWIAE FYCHWIRE

FYCHVIDE FYCHWEME FYCHWEPE FYCHWESE FYCHWETE FYCHVIME FYCHVIPE

FYCHVISE FYCHVIQE FYCHVIEE FYCHVILE FYCHVIKE FYCHVLQE FYCHVLEE

FYCHVLLE FYCHVITE FYCHVLAE FYCHVLRE FYCHVLDE FYCHVLTE FYCHVKAE

FYCHVKQE FYCHVLKE FYCHVLME FYCHVLPE FYCHVLSE FYCHVKSE FYCHVKRE

FYCHVARE FYCHVKEE FYCHVKLE FYCHVKKE FYCHVKME FYCHVAKE FYCHVKTE

FYCHVAME FYCHVADE FYCHVAQE FYCHVAEE FYCHVALE FYCHVQRE FYCHVQDE

FYCHVQQE FYCHVAPE FYCHVASE FYCHVATE FYCHVQAE FYCHVQPE FYCHVQEE

FYCHVQLE FYCHVQKE FYCHVQME FYAHCAAE FYAHCARE FYAHCADE FYAHCAQE

FYAHCAEE FYAHCALE FYAHCAKE FYAHCAME FYAHCAPE FYAHCASE FYAHCATE

FYAHCQEE FYAHCQLE FYAHCQKE FYAHCQME FYAHCQPE FYAHCQSE FYAHCQTE

FYAHCQAE FYAHCQRE FYAHCQDE FYAHCQQE FYAHCEAE FYAHCERE FYAHCEDE

FYAHCEEE FYAHCELE FYAHCEKE FYAHCEME FYAHCEPE FYAHCESE FYAHCETE

FYAHCEQE FYAHCIAE FYAHCIRE FYAHCIDE FYAHCIQE FYAHCIEE FYAHCILE

FYAHCIKE FYAHCIME FYAHCIPE FYAHCISE FYAHCITE FYAHCLAE FYAHCLRE

FYAHCLDE FYAHCLQE FYAHCLEE FYAHCLLE FYAHCLKE FYAHCLME FYAHCLPE

FYAHCLSE FYAHCLTE FYAHCKAE FYAHCKRE FYAHCKSE FYAHCKTE FYAHCKPE

FYAHCKDE FYAHCKQE FYAHCKEE FYAHCKLE FYAHCKKE FYAHCKME FYRHCAAE

FYRHCAEE FYRHCALE FYRHCAKE FYRHCAME FYRHCAPE FYRHCASE FYRHCATE

FYRHCQEE FYRHCQLE FYRHCQKE FYRHCQME FYRHCQPE FYRHCQSE FYRHCQTE

FYRHCQAE FYRHCQRE FYRHCQDE FYRHCQQE FYRHCEAE FYRHCERE FYRHCEDE

FYRHCEEE FYRHCELE FYRHCEKE FYRHCEME FYRHCEPE FYRHCESE FYRHCETE 3I 3HdAd 3S 3HdAd 3d 3HdAd 3¾ 0HdAd 31 3HdAd 33 3HdAd

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3I33HIAd 3S33HIAd 3d33HIAd 3M33HIAd 3¾33HIAd 3133HIAd 3333HIAd

3¾33HIAd 3V33HIAd 3 3HIAd 30 3HIAd 3¾ 3HIAd 3V 3HIAd

3I 0HIAd 3S 3HIAd 3d 3HIAd 3M 3HIAd 3¾ 3HIAd 31 3HIAd 33 3HIAd

HIVOHIAd HSVOHIAd HdVOHIAd HMVOHIAd 3¾V3HIAd HlVOHIAd 33V3HIAd

3 V3HIAd HaVOHIAd 3¾V3HIAd 3¾¾3HIAd HVVOHIAd

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3 I3HaAd 3¾I3HaAd HVIOHOAd 3 33HOAd

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3V33HOAd 3 3HOAd 3V 3HOAd

3S 3HOAd 3d 3HOAd 33 3HOAd

HIVOHOAd HSVOHOAd HdVOHOAd 3¾V3HaAd HlVOHOAd 33V3HOAd

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HIVOHMAd HSVOHMAd HdVOHNAd 3¾V3HNAd HlVOHNAd 33V3HNAd aaVOHMAd HWOHNAd HWOHNAd

T9.i80/ciozN3/x3d tnt60/noz OAV

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33I3HAAd 3 I3HAAd 3¾I3HAAd HVIOHAAd 3 33HAAd

3I33HAAd 3S33HAAd 3d33HAAd 3M33HAAd 3¾33HAAd 3133HAAd 3333HAAd

3¾33HAAd 3V33HAAd 3 3HAAd 30 3HAAd 3V 3HAAd

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3V33H Ad 3 3H Ad 3V 3H Ad

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3¾33HIAd 3V33HIAd 3i)toH工入 d 3a 3HIAd 3V 3HIAd

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T9.i80/ciozN3/x3d tnt60/noz OAV

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T9 .i80/ciozN3/x3d tnt60/noz OAV

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02

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