Une activation anormale des cellules T intervient dans la pathogenèse de nombreuses maladies autoimmunes, ainsi que dans les phénomènes de rejet de greffes où elle provoque le développement d'une réponse immune dirigée contre le greffon.

L'activation des lymphocytes T nécessite un signal activateur, induit par la reconnaissance par les récepteurs T (TCR) de l'antigène associé avec le complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) de classe II et présenté par les cellules présentatrices de l'antigène (CPAg). Cette activation n'entraîne cependant la prolifération des cellules T et la sécrétion de cytokines immunomodulatrices spécifiques (telles que l'interleukine 2, l'interféron gamma ou l'interleukine 4), que si d'autres systèmes de co-stimulation T sont également activés.

L'un des systèmes les plus importants de régulation de l'activation des lymphocytes T est le système moléculaire B7/CD28/CTLA4. Ce système joue par exemple un rôle essentiel dans les mécanismes du rejet de greffe [WOODWARD et al., Transplantation, 66,14-20, (1998)]. Les molécules B7.1 (CD80) et B7.2 (CD86) portées par les CPAgs peuvent activer le récepteur CD28 ainsi que le récepteur CTLA4 des lymphocytes T. L'activation du CD28 délivre au lymphocyte T un signal positif stimulant la cellule ; en revanche, l'activation du CTLA4 délivre un signal négatif conduisant à une non-réponse (anergie) [FALLARINO et al., J. Exp. Med., 188,205-210, (1998)].

Les lymphocytes T au repos expriment une quantité importante de CD28, et très peu de CTLA4. Lors d'un premier contact cognitif entre une CPAg et un lymphocyte T, l'interaction CD28/B7 est privilégiée, ce qui active la cellule. Ce n'est que plusieurs heures après l'initiation de l'activation, du fait de l'augmentation de l'expression

membranaire de CTLA4 dont l'affinité pour B7 est 5 à 10 fois supérieure à celle du CD28, que l'interaction B7/CD28 se déplace au profit d'une interaction B7/CTLA4.

Actuellement, pour bloquer l'activation des lymphocytes T, notamment dans le cadre des transplantations d'organes, on utilise principalement la cyclosporine. Malgré l'efficacité de ce médicament, la protection qu'il confère n'est cependant pas absolue. En outre, il agit en bloquant toutes les voies d'activation cellulaires dépendantes du calcium, et possède donc une activité biologique qui n'est pas strictement spécifique de lymphocytes T et entraîne un nombre important d'effets secondaires. Il est donc souhaitable de développer de nouveaux immunosuppresseurs au mode d'action défini et de spécificité plus grande.

Il a été postulé que l'inhibition sélective du signal agoniste délivré à la cellule T par le CD28 en laissant intact le système antagoniste constitué par le couple CTLA4/B7, par l'intermédiaire d'un blocage spécifique de l'interaction CD28/B7 permettrait de prévenir l'activation des lymphocytes T. Un tel blocage spécifique de l'interaction CD28/B7 peut tre obtenu à l'aide d'un anticorps dirigé contre CD28.

Des anticorps anti-CD28 capables d'empcher la liaison de CD28 avec B7 sont connus. Ils présentent toutefois l'inconvénient, lorsqu'ils sont utilisés sous leur forme native divalente, d'entraîner la dimérisation et l'activation de CD28 par leur liaison avec ce récepteur. Cependant, des fragments monovalents issus de ces anticorps sont capables de bloquer sans l'activer le récepteur CD28 [DAMLE et al., J.

Immunol., 140,1753-1761, (1988) ; NUNES et al., Int.

Immunol., 5,311-315, (1993) ; PAGES et al., J. Biol. Chem., 271,9403, (1996)].

Il a ainsi été rapporté [PERRIN et al., J.

Immunol. 163,1704-1710, (1999)] que des fragments Fab issus d'un anticorps anti-CD28 pouvaient enrayer les symptômes cliniques de l'encéphalite expérimentale auto-immune induite chez la souris par l'administration de myéline ou le transfert de cellules T d'un animal atteint.

Des fragments monovalents, Fab ou scFv, dérivés d'un anticorps anti-CD28 sont potentiellement utilisables pour prévenir l'activation des lymphocytes T par l'intermédiaire d'un blocage spécifique de l'interaction CD28/B7.

Les fragments Fab résultent de l'action de la papaïne sur une molécule d'immunoglobuline, et contiennent chacun une chaîne légère et la première moitié d'une chaîne lourde ; les fragments scFv sont constitués des portions variables des chaînes lourdes et légères d'un anticorps, reliées entre elles par l'intermédiaire d'un lieur flexible [CLACKSON et al., Nature, 352,624-628, (1991)], formant ainsi une protéine simple-chaîne.

Ces fragments monovalents présentent fréquemment une affinité pour l'antigène moins importante que celle des anticorps natifs, ce qui peut limiter leurs possibilités d'utilisation dans des applications diagnostiques ou thérapeutiques.

Les Inventeurs sont parvenus à sélectionner, parmi différents anticorps reconnaissant l'antigène CD28, un anticorps capable de bloquer l'interaction CD28/B7, et dont les fragments monovalents présentent une affinité pour l'antigène suffisante pour tre utilisables, in vitro ou in vivo, pour bloquer le récepteur CD28 sans activation de ce récepteur.

Cet anticorps, dénommé CD28.3, est produit par l'hybridome déposé, selon les termes du traité de Budapest, le 28 novembre 2000 auprès de la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 PARIS CEDEX 15) sous le numéro 1-2582.

La présente invention a pour objet une protéine capable de se lier spécifiquement au récepteur lymphocytaire CD28 et de bloquer l'interaction CD28/B7, caractérisé en ce qu'elle comprend au moins les CDRs de la chaîne lourde et de la chaîne légère de l'immunoglobuline CD28.3.

Les CDRs (régions déterminant la complémentarité) sont les portions des régions variables d'une immunoglobuline

impliquées dans la spécificité de reconnaissance de l'antigène.

Des protéines conformes à l'invention englobent ainsi notamment : a) l'anticorps CD28.3 produit par l'hybridome CNCM I-2582 ; b) les fragments Fv, Fab, Fab'2 ou scFv de l'anticorps CD28.3 ; c) les anticorps chimériques ou humanisés obtenus à partir des régions variables de CD28.3 ; d) les fragments des anticorps b) ci-dessus comprenant les CDRs de l'anticorps CD28.3, qu'il s'agisse de fragments monovalents, Fv, Fab, ou scFv, ou de fragments divalents Fab'2 ; e) les protéines recombinantes comprenant un fragment b) ou d) et un polypeptide hétérologue.

Il peut s'agir par exemple : - de dérivés di-ou plurivalents de fragments scFv, tels que les « diabodies » ou « triabodies », résultant de l'association de 2 ou 3 fragments scFv ; - de protéines associant au moins un fragment d'anticorps comprenant les CDRs de l'anticorps CD28.3, avec au moins un fragment d'anticorps comprenant les CDRs d'un anticorps de spécificité différente ; on citera à titre d'exemples, des immunoglobulines bi-spécifiques, des conjugués d'un fragment Fv ou Fab contenant les CDRs de CD28.3 avec un fragment Fv ou Fab d'un anticorps de spécificité différente, des « diabodies bi-spécifiques » résultant de l'association d'un fragment scFv contenant les CDRs de CD28.3 avec un fragment Fv ou Fab d'un anticorps de spécificité différente.

- de protéines associant au moins un fragment d'anticorps comprenant les CDRs de l'anticorps CD28.3, avec une molécule dotée d'activité pharmacologique (par exemple une toxine), ou de propriétés effectrices (par exemple un fragment Fc).

- de protéines associant au moins un fragment d'anticorps comprenant les CDRs de l'anticorps CD28.3, avec

une molécule permettant de prolonger sa demi-vie plasmatique lors de son administration in vivo ; on peut par exemple associer ledit fragment d'anticorps avec un polypeptide hydrosoluble de masse moléculaire suffisante pour que la masse moléculaire du polypeptide de fusion ainsi obtenu soit supérieure au seuil de filtration rénale. Dans ce cas, on choisira un polypeptide qui contrairement aux fragments Fc, ne puisse pas s'associer en dimères, et qui ne possède pas d'activité effectrice propre susceptible d'entraîner des effets secondaires inopportuns. Des polypeptides possédant ces propriétés peuvent avantageusement tre obtenus à partir de protéines sériques hydrosolubles, à savoir notamment l'albumine sérique, l'haptoglobuline, l'ITIH2 (inhibiteur inter-alpha (globuline), polypeptide H2), la transferrine, le CBG (protéine liant les corticostéroïdes), l'al antitrypsine, l'ITIH4 (inhibiteur inter-alpha (globuline), polypeptide H4), l'AACT (alpha-1-antichymotrypsine), le TBG (globuline liant la thyroxine), le fibrinogène et la prothrombine, pour préparer des protéines de fusion avec des fragments scFv dérivés d'anticorps anti-CD28. On peut également conjuguer une protéine conforme à l'invention avec un polyol, par exemple le polyéthylène glycol, comme décrit par exemple dans le Brevet US 4,179,337.

Un exemple d'une protéine conforme à l'invention est illustré par la Figure 1, qui représente un fragment scFv dérivé de l'anticorps CD28.3. Les séquences des CDRs de l'anticorps CD28.3 sont encadrées dans la séquence représentée sur la Figure 1.

La séquence nucléotidique codant pour ce fragment scFv est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO : 1 et la séquence peptidique correspondante est représentée sous le numéro SEQ ID NO : 2.

Des fragments Fv, Fab, ou Fab'2 conformes à l'invention peuvent tre obtenus par les techniques classiques de digestion enzymatique, à partir de l'anticorps CD28. 3.

Un plasmide contenant un polynucléotide codant pour un fragment scFv de CD 28.3, fusionné à un

polynucléotide codant pour les acides aminés 53 à 425 de l'al antitrypsine a été déposé, selon les termes du traité de Budapest, le 11 décembre 2001 auprès de la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 PARIS CEDEX 15), sous le numéro I- 2762.

Des protéines conformes à l'invention telles que des anticorps chimériques ou recombinants, des fragments scFv et leurs dérivés, etc. peuvent tre obtenues, par les techniques classiques du génie génétique, telles que celles décrites par SAMBROOK et al., [MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., (1989)].

Des polynucléotides codant les régions variables de l'anticorps anti-CD28.3 peuvent par exemple tre obtenus par clonage desdites régions variables à partir d'une banque d'ADNc de l'hybridome CD28.3, ou à partir du plasmide CNCM I- 2762. Ils peuvent également tre préparés totalement ou partiellement, par synthèse d'acides nucléiques, à partir des séquences nucléotidiques desdites régions variables. On peut par exemple synthétiser des polynucléotides codant les CDRs de CD28.3, et les incorporer dans les régions de charpente (FR pour « framework régions ») d'un autre anticorps, notamment d'un anticorps d'origine humaine, par les techniques, connues en elles-mmes, de greffe de CDRs, telles que celles décrites par ROUTLEDGE et al., ["Reshaping antibodies for therapy", in PROTEIN ENGINEERING OF ANTIBODY MOLECULES FOR PROPHYLATIC AND THERAPEUTIC APPLICATIONS IN MAN, 13-44, Academic Titles, Nottingham, England (1993)] ou par ROGUSKA et al., Protein Engineering, 9 (10), 895-904, (1996)].

La présente invention a également pour objet toute molécule d'acide nucléique codant une protéine conforme à l'invention comprenant les CDRs de l'anticorps CD28.3, ainsi que tout vecteur recombinant, notamment tout vecteur d'expression, comprenant ladite molécule d'acide nucléique.

La présente invention a également pour objet toute cellule exprimant une protéine conforme à l'invention

comprenant les CDRs de l'anticorps CD28.3. Ceci englobe notamment l'hybridome CNCM 1-2582, ainsi que les cellules- hôtes transformées par une molécule d'acide nucléique conforme à l'invention.

Des molécules d'acide nucléique conformes à l'invention peuvent avantageusement comprendre, outre une séquence codant une protéine conforme à l'invention, une séquence codant un peptide signal permettant la sécrétion de ladite protéine ; elles peuvent aussi comprendre une ou plusieurs séquence (s) codant un ou plusieurs peptide (s) marqueur (s) permettant la détection et/ou facilitant la purification de ladite protéine.

Des vecteurs d'expression conformes à l'invention comprennent au moins une séquence d'acide nucléique codant une protéine conforme à l'invention, associée à des éléments de contrôle de la transcription et de la traduction actifs dans la cellule-hôte choisie. Des vecteurs utilisables pour la construction de vecteurs d'expression conformes à l'invention sont connus en eux-mmes, et seront choisis notamment en fonction de la cellule-hôte que l'on souhaite utiliser.

Des cellules-hôtes utilisables dans le cadre de la présente invention peuvent tre des cellules procaryotes ou eucaryotes. Parmi les cellules eucaryotes utilisables, on citera en particulier des cellules végétales, des cellules de levure, telles que Saccharomyces, des cellules d'insecte, telles que les cellules de Drosophila, ou de Spodoptera et des cellules de mammifères telles que les cellules HeLa, CHO, 3T3, C127, BHK, COS, etc...

La construction de vecteurs d'expression conformes à l'invention, et la transformation des cellules- hôtes peut tre effectuée par les techniques classiques de biologie moléculaire.

L'invention a également pour objet un procédé de production d'une protéine conforme à l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend la mise en culture d'au moins une cellule conforme à l'invention, et la récupération de ladite protéine à partir de ladite culture.

Si la protéine est sécrétée, elle peut tre récupérée directement à partir du milieu de culture ; sinon on procédera préalablement à la lyse des cellules.

La protéine peut ensuite tre purifiée à partir du milieu de culture ou du lysat cellulaire, par des procédures classiques, connues en elles-mmes de l'homme de l'art, par exemple par précipitation fractionnée, notamment précipitation au sulfate d'ammonium, électrophorèse, filtration sur gel, chromatographie d'affinité, etc.

Les protéines conformes à l'invention peuvent tre utilisées in vitro pour étudier la réponse proliférative ou la différentiation de lymphocytes T répondant à une stimulation antigénique, virale, allogénique ou xénogénique.

Elle peut tre également utilisée in vitro pour induire la différenciation de lymphocytes T prélevés chez un patient, par exemple l'induction d'une tolérance vis-à-vis d'un antigène ou d'un alloantigène, destinés à tre par la suite ré-administrés in vivo.

Elles peuvent également tre utilisées pour l'obtention de médicaments, ou de réactifs de diagnostics.

Des protéines conformes à l'invention, divalentes, c'est à dire possédant 2 sites de liaison au récepteur CD28, et donc capables d'induire la dimérisation de ce récepteur, sont utilisables dans tous les cas où l'on souhaite activer ce récepteur CD28, c'est-à-dire augmenter la réponse d'un lymphocyte T vis à vis d'un antigène.

Des protéines conformes à l'invention, monovalentes, c'est à dire possédant un seul site de liaison au récepteur CD28, sont utilisables dans tous les cas où l'on souhaite bloquer sélectivement ce récepteur sans l'activer, afin d'induire une immunosuppression.

Une protéine conforme à l'invention, comprenant un fragment monovalent dérivé d'un anticorps anti-CD28 peut notamment tre utilisée pour l'obtention d'un médicament immunosuppresseur, bloquant sélectivement les phénomènes d'activation des cellules T impliquant-le récepteur CD28, et ne présentant pas les inconvénients des immunosuppresseurs connus, tels que la cyclosporine.

L'immunosuppression T par blocage sélectif du CD28 par une protéine conforme à l'invention possède des applications dans toutes les pathologies dépendantes des lymphocytes T.

Il s'agit essentiellement du rejet de greffe, de la maladie du greffon contre l'hôte, des maladies auto- immunes à médiation lymphocytaire T, telles que le diabète de type I, ou la sclérose en plaques, et de l'hypersensibilité de type IV, qui intervient dans les phénomènes allergiques ainsi que dans la pathogenèse de maladies inflammatoires chroniques suivant une infection par un agent pathogène (notamment lèpre, tuberculose, leishmaniose, listérose, etc.).

La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples non-limitatifs de préparation et d'utilisation d'anticorps conformes à l'invention.

EXEMPLE 1 : CHOIX D'UN ANTICORPS PRODUISANT DES FRAGMENTS MONOVALENTS PROPRIETES DE FRAGMENTS MONOVALENTS Fab ISSUS DE CD28.3.

Certaines des propriétés de plusieurs anticorps anti-CD28 (CD28.1, CD28.2, CD28.3, CD28.4, CD28.5 et CD28.6) sont décrites dans la publication de NUNES et al. [Int.

Immunol., 5,311, (1993)]. Ces différents anticorps, qui ne sont pas accessibles au public, ont été fournis par le laboratoire de Daniel OLIVE (INSERM). Les propriétés de liaison à l'antigène des fragments monovalents Fab de ces différents anticorps ont été comparées.

5 mg de fragments Fab de chacun de ces anticorps ont été préparés par digestion à la papaïne (rapport molaire papaine/anticorps = 1/100) pendant 24 heures à 37°C, suivie d'inactivation de l'enzyme au iodoacétamide 0,03 M et de dialyse contre du PBS pour éliminer l'iodoacétamide.

1) Liaison des fragments Fab à des cellules T Jurkat CD28+ : 100 000 cellules Jurkat CD28+ en 100 pl sont incubées en PBS-BSA 1%-NaN3 0,1% à 4°C pendant 30 minutes avec des concentrations croissantes d'anticorps anti-CD28 ou

de leurs fragments Fab. Après lavage, les cellules sont incubées de manière similaire avec un anticorps de chèvre anti-IgG de souris conjugué à la FITC, lavées, et analysées en cytofluorométrie.

Les résultats sont illustrés par la Figure 2 : Légende de la Figure 2 : Axe des abscisses : concentration en anticorps ou fragments Fab Axe des ordonnées : Intensité moyenne de fluorescence (IMF) -#- : f1 = Fragments Fab de l'anticorps CD28.1 F2 = Fragments Fab de l'anticorps CD28.2 -A- : F3= Fragments Fab de l'anticorps CD28.3 - : F5 = Fragments Fab de l'anticorps CD28.5 - : F6 = Fragments Fab de l'anticorps CD28.6 ..#.. : W1 = anticorps entier CD28.1 .. _... W2 = anticorps entiers CD28.2 -o- : W3 = anticorps entiers CD28.3 -- : W5 = anticorps entiers CD28.5 - : W6 = anticorps entiers CD28.6 Mara-1 = contrôle négatif (IgGl de souris).

Ces résultats montrent que parmi les fragments Fab, seuls ceux issus de CD28.3 sont capables de se lier de manière significative aux cellules Jurkat CD28+ à des concentrations inférieures à 10 pg/ml 2) Effet des fragments Fab sur l'adhésion des cellules T Jurkat CD28+ à des cellules L murines transfectées exprimant la molécule B7-1. : 4 x 105 cellules humaines T (Jurkatt, CD28- positives) marquées au 51Cr sont incubées pendant 2 heures dans une plaque de microtitration dans laquelle 105 cellules adhérentes LTK-ou LB7+ (fibroblastes murins transfectés avec B7.1 humain [PAGES et al., J. Biol. Chem., 271,9403, (1996)] ont été ensemencées 24 heures auparavant. Ces incubations sont réalisées en présence des fragments Fab issus des anticorps CD28.1 à CD28.6, ou de l'anticorps CD28. 3, dilués à différentes dilutions dans du tampon PBS sans Ca2+ ni Mg Les cellules adhérentes après lavages sont quantifiées par

lecture de la radioactivité résiduelle au compteur beta (PACKARD TOPCOUNT).

Les résultats sont illustrés par la Figure 3 : Légende de la Figure 3 : Axe des abscisses : pourcentage de cellules adhérentes Axe des ordonnées : concentration en anticorps Fl Fragments Fab de l'anticorps CD28.1 --- : F2 = Fragments Fab de l'anticorps CD28.2 - A- : F3 = Fragments Fab de l'anticorps CD28.3 -x-F5 = Fragments Fab de l'anticorps CD28.5 -*- : F6 = Fragments Fab de l'anticorps CD28.6 ..#.. : Anticorps entier CD28.3 0 : Pas d'anticorps.

Ces résultats montrent que les fragments Fab issus de CD28.3 sont les plus efficaces pour inhiber les interactions CD28/B7. Ils inhibent l'adhésion à 90% à une concentration de 3 pg/ml, et avec une efficacité comparable à celle de l'anticorps CD28.3 entier, alors qu'à cette concentration, les fragments Fab issus des autres anticorps n'inhibent pas l'adhésion à plus de 50%.

3) Effet des fragments Fab sur la prolifération en réaction lymphocytaire mixte : 105 cellules mononucléées du sang périphérique sont mélangées avec 105 cellules mononucléées allogéniques irradiées à 35 Gy, en présence de concentrations variables des anticorps CD28.1 à CD28.6 ou des fragments Fab issus de ces anticorps. La réponse proliférative dans ces cultures est évaluée après 3 jours, par incorporation de (3H) thymidine pendant une durée de 16 heures.

Les résultats sont illustrés par la Figure 4 : Légende de la Figure 4 : Axe des abscisses : concentration en anticorps Axe des ordonnées : réponse proliférative (cpm) Niveau basal de prolifération = 6500 cpm.

--- : 28. 1 = anticorps CD28.1 -p- : 28. 2 = anticorps CD28.2 -#- : 28.3 = anticorps CD28. 3

- #- : 28.5 = anticorps CD28.5 .. : 28. 6 = anticorps CD28.6 -#- : Fab.1 = fragments Fab de l'anticorps CD28.1 ..+.. : Fab. 2 = fragments Fab de l'anticorps CD28.2 -- : Fab. 3 = fragments Fab de l'anticorps CD28.3 -+- : Fab. 5 = fragment Fab de l'anticorps CD28.5 -#- : Fab.6 = fragment Fab de l'anticorps CD28.6.

Ces résultats montrent que les fragments Fab issus de CD28.3 ou de CD28.6 sont les plus efficaces pour inhiber la prolifération des cellules mononucléées. Les anticorps entiers CD28.1 à CD28.6, testés en parallèle, n'ont aucun effet inhibiteur ou bien stimulent la prolifération de par leur action stimulatrice sur le CD28.

Effet des fragments Fab issus de CD28.3 sur la prolifération induite par un super-antigène.

Pour cette expérimentation des cellules T CD4+ répondeuses ont été mélangées avec des PBMC isogéniques irradiées, en présence de 50 ng/ml de toxine-1 du syndrome de choc toxique (TSST-1) qui stimule spécifiquement les cellules T Vus2+, soit en l'absence d'anticorps, soit en présence d'anti-B7-1 (1 µg/ml), d'anti-B7-2 (0,5 pg/ml), de CTLA4Ig (10 µg/ml), ou de fragments Fab issus de CD28. 3 (10 µg/ml).

La réponse proliférative dans ces cultures est évaluée après 1,3,6, et 8 jours, par incorporation de (3H) thymidine pendant une durée de 16 heures.

Les résultats sont illustrés par la Figure 5 : Légende de la Figure 5 : Axe des abscisses : temps de culture Axe des ordonnées : indice de prolifération = IP cpm réaction mixte lymphocytaire-cpm cellules stimulatrices irradiées seules cpm cellules répondeuses non stimulées --- : Fab anti-CD28.3 - #- : anti B7-2 -#- : CTLA-4 Ig <BR> <BR> <BR> : anti-B7-1+2<BR> <BR> <BR> <BR> anti-B7-1 -O- : pas d'anticorps

TSST-1 induit une prolifération importante des cellules T CD4+. En présence d'anti-B7, de CTLA4Ig, ou des fragments Fab de CD28.3, on observe une inhibition de cette prolifération de 70% après 6 jours.

Effet des fragments Fab issus de CD28.3 sur la production de cytokines.

Afin de déterminer si les fragments Fab issus de CD28.3 pouvaient induire une déviation immune in vitro, une réaction lymphocytaire mixte (PBMC issues d'un donneur A/ PBMC irradiées issues d'un donneur B) a été effectuée, en présence de fragments Fab issus de CD28.3.105 cellules mononucléées du sang périphérique d'un donneur sont mélangées avec 105 cellules mononucléées allogéniques irradiées à 35 Gy, et cultivées pendant 5 jours en présence ou en l'absence de 10 pg/ml de Fab issus de l'anticorps CD28.3.

L'ARN des cellules répondeuses a été extrait, et la quantité d'ARNm de cytokines a été évaluée par mesure quantitative du nombre de transcrits, rapportée à la quantité d'HPRT, à l'aide d'un TaqMan (Perkin Helmer).

On observe en présence de fragments Fab issus de CD28.3., une réduction de la production d'IFNy et d'IL2, et une augmentation de la production d'IL10. Cette déviation de la réponse immune suggère une orientation cers une réponse de type Th2. Ce résultat est inattendu dans la mesure où il a été rapporté que l'engagement de CTLA4 (qui est supposé intervenir lors du blocage de CD28 seul) conduit à une réponse de type Thl.

Traitement in vitro de l'anticorps CD28. 3 et des fragments Fab issus de celui-ci par les cellules T humaines.

Une éventuelle internalisation des fragments Fab de l'anticorps CD28.3 dans les cellules T humaines a été recherchée, en comparaison avec l'anticorps entier CD28.3.

Des cellules T Jurkatt ont été incubées en milieu de culture avec 100 zg/ml d'anticorps CD28.3, à 37°C ou à 0°C. A différents temps, les cellules ont été lavées avec du tampon PBS froid contenant 0,1% de sérum-albumine bovine, et du NaN3, afin de bloquer la motilité membranaire. Les

anticorps liés ont été révélés avec un anticorps secondaire de chèvre anti-souris, marqué à la fluorescéine. Les cellules ont été montées dans du MOVIOL et analysées par microscopie confocale.

On observe ainsi que les anticorps CD28.3 entiers se liant aux cellules T Jurkatt sont capturés et disparaissent de la surface cellulaire à 37°C, mais pas à 0°C. Au contraire, les fragments Fab restent fixés en surface de la cellule. Ceci indique que la fixation des anticorps divalents CD28.3 entraîne la dimérisation de CD28, ce qui conduit à leur entrée dans la cellule, alors que les fragments monovalents Fab, qui n'induisent pas cette dimérisation, demeurent en surface.

EXEMPLE 2 : PROPRIETES D'UN FRAGMENT scFv DERIVE DE L'ANTICORPS CD28.3.

La Figure 1 représente la séquence nucléotidique et la séquence polypeptidique déduite d'un fragment scFv dérivé de l'anticorps CD28.3. Les portions de cette séquence correspondant au fragment variable de la chaîne lourde et de la chaîne légère sont représentés en lettres capitales. La séquence correspondant au fragment variable de la chaîne légère est en outre souligné. La séquence du lieur est représentée en lettres minuscules. Les séquences des CDRs de la chaîne lourde et de la chaîne légère sont encadrées.

La séquence nucléotidique codant ce fragment scFv est également représentée dans la liste de séquences en annexe, sous le numéro SEQ ID NO : °1.

L'ADNc codant ce fragment scFv a été inséré dans le vecteur pIG6 (Biochemisches Institut, Universität Zurich).

Ce vecteur comprend notamment un marqueur de résistance à l'ampicilline, et une cassette d'expression qui comprend un promoteur lac inductible, sous contrôle duquel sont placés : une séquence codant un peptide signal ompA, une séquence codant un peptide marqueur de séquence (code 1 lettre) DYKD, une séquence codant un peptide marqueur c-myc, et une séquence codant un marqueur polyhistidine-5.

L'ADNc codant le fragment scFv décrit ci-dessus a été introduit entre les sites EcoRI et EcoRV de pIG6, en aval de la séquence codant le peptide DYKD et en amont de la séquence codant le marqueur c-myc.

La construction obtenue est dénommée pIg6-28. 3.

Production en cellules procaryotes Le vecteur pIg6-28. 3 a été utilisé pour transformer des cellules E. coli JM83. Les cellules sont cultivées à 25°C, jusqu'à une DOsso de 0,5. Après induction par l'IPTG, le fragment scFv est produit sous forme soluble dans le périplasme. Il apparaît après électrophorèse et transfert de Western, sous forme d'une bande à environ 30 kDa.

Il est purifié à partir des extraits périplasmiques des bactéries, obtenus après choc osmotique en 50 mM Tris-Cl, et ultracentrifugation du matériel insoluble, par chromarographie sur matrice de NI-NTA et échange d'ions sur DEAE-sépharose.

La liaison des fragments scFv présents dans l'éluat de la colonne de NiNTA à des cellules Jurkat CD28+ est comparable à celle obtenue avec des fragments Fab obtenus à partir de l'anticorps CD28.3 par digestion à la papaïne.

Production en cellules eucaryotes Le vecteur pSec-28.3 a été utilisé pour transfecter des cellules Cos. Les cellules sont cultivées à 37°C pendant 3 jours. Le fragment scFv est produit sous forme soluble dans le surnageant. Ce surnageant inhibite la réaction mixte lymphocytaire : 105 cellules mononucléées du sang périphérique d'un donneur sain sont mélangées avec 105 cellules mononucléées du sang périphérique d'un autre donneur sain allogénique. La réponse proliférative dans ces cultures est évaluée après 5 jours par incorporation de (3H) Thymidine pendant une durée de 16 heures. On observe une inhibition importante de l'incorporation dépendant de la dilution du surnageant utilisée. Un surnageant contrôle ne présente pas d'activité inhibitrice de la prolifération.

EXEMPLE 3 : OBTENTION D'UNE PROTEINE DE FUSION COMPRENANT UN FRAGMENT scFv DE CD28.3.

La séquence nucléotidique codant le fragment scFv décrit à l'Exemple 2 a été liée à l'extrémité 5'd'une portion de l'ADNc de l'al-antitrypsine humaine (numéro d'accès GENBANK K01396) correspondant aux acides aminés 53 à 425, par l'intermédiaire d'un peptide charnière, de séquence VAAPS. La séquence résultante est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO : 3, et le polypeptide correspondant sous le numéro SEQ ID NO : 4.

EXEMPLE 4 : CONSTRUCTION DE VECTEURS D'EXPRESSION COMPRENANT LA SEQUENCE CODANT POUR L'a-1 ANTITRYPSINE ET PERMETTANT L'INTRODUCTION D'UNE SEQUENCE CODANT UN FRAGMENT scFv Vecteur d'expression procaryote : Le vecteur pIG6 a été utilisé (Biochemisches Institut, Universitât Zurich). Ce vecteur comprend notamment un marqueur de résistance à luote ampicilline, et une cassette d'expression qui comprend un promoteur lac inductible, sous contrôle duquel sont placés : une séquence codant un peptide signal ompA, une séquence codant un peptide marqueur de séquence (code 1 lettre) DYKD, une séquence codant un peptide marqueur c-myc, et une séquence codant un marqueur polyhistidine-5.

L'ADNc codant un fragment d'al-antitrypsine humaine correspondant aux acides aminés 53 à 425, a été introduit entre les sites EcoRI et EcoRV de pIG6, en aval de la séquence codant le peptide DYKD et en amont de la séquence codant le marqueur c-myc.

La Figure 1 schématise la construction obtenue, dénommée pIg6-Haat.

Vecteur d'expression eucaryote : Le vecteur pSECTagB (Invitrogen, De Schelp, Pays Bas) a été utilisé. Ce vecteur comprend notamment un marqueur de résistance à l'ampicilline, un marqueur de résistance à la zéocine, et une cassette d'expression qui comprend un promoteur CMV, sous contrôle duquel sont placés : une

séquence codant un peptide signal de la chaîne légère IgG Kappa, une séquence codant un peptide marqueur c-myc, et une séquence codant un marqueur polyhistidine-6.

L'ADNc codant un fragment d'al-antitrypsine humaine correspondant aux acides aminés 53 à 425, a été introduit entre les sites BamHI et EcoRI du vecteur PSEC B Tag, en amont de la séquence codant le marqueur c-myc.

La Figure 2 schématise la construction obtenue, dénommée pSecHaat.

EXEMPLE 5 : CONSTRUCTION DE VECTEURS D'EXPRESSION INTEGRANT LA SEQUENCE CODANT LA PROTEINE DE FUSION scFv CD28.3/al- ANTITRYPSINE Vecteur d'expression procaryote : L'ADNc codant la protéine de fusion ScFv CD28.3/al-antitrypsine décrite à l'exemple 3 ci-dessus a été introduit entre les sites EcoRI et XhoI de pIG6, en aval de la séquence codant le peptide DYKD et en amont de la séquence codant le marqueur c-myc.

La Figure 3 schématise la construction obtenue, dénommée pIg6-28. 3Haat.

Vecteur d'expression eucaryote L'ADNc codant la protéine de fusion ScFv CD28.3/al-antitrypsine décrite à l'exemple 3 ci-dessus a été introduit entre les sites BamHI et XhoI du vecteur PSEC B Tag, en amont de la séquence codant le marqueur c-myc.

La Figure 4 schématise la construction obtenue, dénommée pSec-28.3Haat.

Ce vecteur, hébergé dans E. coli DH5a, a été déposé le 11 décembre 2001 auprès de la CNCM, sous le numéro 1-2762.

EXEMPLE 6 : EXPRESSION ET PURIFICATION DES PROTEINES DE FUSION En cellules procaryotes Le vecteur pIg6-28. 3Haat a été utilisé pour transformer des cellules E. coli JM83. Les cellules sont cultivées à 25°C, jusqu'à une D055o de 0,5. Après induction

par l'IPTG, la protéine est produite sous forme soluble dans le périplasme. Elle apparaît après électrophorèse et transfert de Western, sous forme d'une bande à environ 74 kDa.

Elle peut tre purifiée à partir des extraits périplasmiques en utilisant une matrice de chromatographie d'affinité NI-NTA, et/ou une matrice de chromatographie d'affinité anti-c-myc. Elle peut également tre purifiée à partir d'une colonne d'affinité anti-al-antitrypsine.

En cellules eucaryotes Le vecteur pSec-28.3Haat a été utilisé pour transfecter des cellules CHO par lipofection. Les cellules sont cultivées en présence de 200 g/ml de zéocine en milieu MEM contenant 10% de sérum de veau foetal.

La protéine est sécrétée dans le milieu de culture.

Après séparation par électrophorèse, transfert de Western, et révélation par un anticorps anti-c-myc elle apparaît sous forme d'une bande à environ 80 kDa.

EXEMPLE 7 : TESTS D'ACTIVITE D'UNE PROTEINE DE FUSION scFv /al-ANTITRYPSINE L'activité anti-CD28 de la protéine de fusion scFv CD28.3/al-antitrypsine obtenue à l'exemple 6 ci-dessus est évaluée par sa liaison à la molécule CD28, ou à des cellules exprimant CD28 sur leur membrane, et son absence de liaison à des cellules qui n'expriment pas CD28.

L'activité immunosuppressive de la protéine de fusion scFv CD28.3/al-antitrypsine obtenue à l'exemple 6 ci- dessus est évaluée par l'inhibition de l'adhésion à B7, et l'inhibition de l'activation induite du lymphocyte T.

Ces activités anti-CD28 et immunosuppressive ont été mesurées par les tests suivants : Activité anti CD28 Mesure au biosenseur des paramètres de liaison à CD28 : Du CD28 humain recombinant a été immobilisé sur le détecteur du biosenseur (BIACORE). Une protéine de fusion

scFv CD28.3/al-antitrypsine obtenue comme décrit à l'exemple 6 ci-dessus a été mise en contact avec le détecteur. Les paramètres de liaison sont : KA (1/M) 2.86e9 ; KD (M) : 3.49e- 10. En comparaison, ces paramètres mesurés pour le fragment Fab de l'anticorps CD28.3 sont : KA (1/M) : 9.69e8 ; KD (M) : 1.03e-9. L'affinité pour CD28 du fragment Fab de l'anticorps CD28.3 et de la protéine de fusion sont donc comparables.

Test de reconnaissance spécifique de CD28 en cytofluorométrie : 105 cellules Jurkat (CD28+) et U937 (CD28-) sont incubées en PBS-BSA 1%-NaN3 0,1% à 4°C pendant 1 heure avec des concentrations croissantes de la protéine de fusion scFv CD28.3/al-antitrypsine. Après lavage, les cellules sont incubées avec un anticorps de lapin anti-alpha-1- antitrypsine, puis avec un anticorps de chèvre anti-lapin conjugué à la FITC, lavées, et analysées en cytofluorométrie.

On observe une liaison dépendante de la dose sur les cellules Jurkat (CD28+) et pas de liaison sur les cellules U937 (CD28-). Ceci montre la spécificité de la protéine de fusion pour la molécule CD28 et son absence de réactivité envers d'autres molécules exprimées par des cellules hématopoïétiques humaines.

Activité immunosuppressive Test d'adhésion CD28/B7-dépendant : 4 x 105 cellules humaines T (Jurkatt, CD28- positives) marquées au 51Cr sont incubées pendant 2 heures dans une plaque de microtitration dans laquelle 105 cellules adhérentes LTK-ou LB7+ (fibroblastes murins transfectés avec B7.1 humain [PAGES et al., J. Biol. Chem., 271,9403 (1996)] ont été ensemencées 24 heures auparavant. Ces incubations sont réalisées en absence ou en présence de la protéine de fusion scFv CD28.3/al-antitrypsine, diluée à différentes concentrations dans du tampon PBS sans Ca2+ ni Mg2+. Les cellules adhérentes après lavages sont quantifiées par lecture de la radioactivité résiduelle au compteur beta (PACKARD TOPCOUNT). On observe une inhibition de l'adhésion en présence de la protéine de fusion scFv CD28.3/al-

antitrypsine, inhibition directement dépendante de la dose de protéine de fusion utilisée.

Inhibition de l'activation 5 x 104 cellules T (polyclonales humaines, déplétées en cellules CDllb) sont stimulées avec 1 x 104 cellules d'hydridome OKT3 (anti-CD3) irradiées, ou avec des cellules B CD28-allogéniques (déplétées en cellules CD28+) en absence ou en présence de quantités variables de la protéine de fusion scFv CD28.3/al-antitrypsine. La réponse proliférative dans ces cultures est évaluée après 3 jours lorsque la stimulation est effectuée par des anti-CD3, ou après 7 jours lorsque la stimulation est effectuée par des cellules allogéniques, par incorporation de (3H) Thymidine pendant une durée de 16 heures. On observe une inhibition importante de l'incorporation en présence de la protéine de fusion scFv CD28.3/al-antitrypsine, inhibition directement dépendante de la dose de protéine de fusion utilisée.

Inhibition de la réaction mixte lymphocytaire : 105 cellules mononucléées du sang périphérique d'un donneur sain sont mélangées avec 105 cellules mononucléées du sang périphérique de un autre donneur sain allogénique. La réponse proliférative dans ces cultures est évaluée après 5 jours par incorporation de (3H) Thymidine pendant une durée de 16 heures. On observe une inhibition importante de l'incorporation en présence de la protéine de fusion scFv CD28.3/al-antitrypsine, inhibition directement dépendante de la dose de protéine de fusion utilisée.