Sector Técnico La presente invención se relaciona de forma general con anticuerpos monoclonales anti-idiotipos y su uso como inmunomoduladores. Más particularmente, la presente invención se refiere a un anticuerpo monoclonal murino, el cual fue desarrollado contra un anticuerpo monoclonal murino reactivo con gangliósidos portadores de ácido siálico N-glicolilados y con antígenos expresados en células tumorales, y su efecto inhibitorio sobre el crecimiento tumoral.

Técnica Anterior Una de las estrategias para el tratamiento de cáncer ha sido el uso de la inmunoterapia activa, una modalidad de tratamiento que tiene como objetivo la activación del potencial natural del sistema inmune del hospedero contra el tumor.

Desde que Niels Jerne en 1974 (Jerne, N. K. 1974. Ann Immunol 125C, 373-389) propuso su teoría de la red idiotípica, nuevas posibilidades se abrieron en el estudio de terapias efectivas contra el cáncer. La teoría de Jerne presentaba por primera vez, al sistema inmune como una red de anticuerpos que pueden interactuar entre si y con un gran número de epitopos naturales, a través de sus regiones variables o idiotipos (Id). Este conjunto complejo de interacciones Id-anti-Id opera para regular las respuestas inmunes a los antígenos. Dichos anticuerpos desarrollados en respuesta al antígeno original, nombrados Abl, se convierten ellos mismos en antígenos y provocan la producción de un segundo conjunto de anticuerpos, llamados anticuerpos anti- idiotipos (anti-Id o Ab2), que también pueden ser regulados por otros anticuerpos referidos como anti-anti-Id (Ab3).

La teoría original de Jerne continúa siendo revisada, y ha sido reportado que el resultado de la interacción de Ab2 con linfocitos portadores de Abl no tiene por qué ser necesariamente la supresión de la respuesta inmune, sino que puede ser la estimulación de dicha respuesta. Además, Jerne limitó su teoría a los linfocitos B y a los anticuerpos, pero ahora resulta claro que las células T juegan un papel importante en la regulación a través de los idiotipos de los receptores de las células T (Teitelbaum, D. et al, 1984 J.

Immunol 132,1282-1285; Zanetti, M. et al (1986) J. Immunol 137,3140-3146; Powell, J. et al (1988) 140,3266-3272; Baskin, J. G. et al (1990) J Immunol 145,202-208; Furuyama, A. et al (1992) Anticancer Res 12,27-32; Raychaudhuri, S. et al. J. Immunol 131,271-278; Raychaudhuri et al (1987) J.

Immunol 139,3902-3910; Durrant et al (1994) Cancer Res. 54, 4837-4840).

Un idiotipo es inmunológicamente definido por su reactividad con más de un anti-Id que reconoce un determinante idiotipo o idiotopo dentro de un determinado idiotipo. Por lo tanto, como un Abl particular expresa múltiples idiotopos, cuando este Abl es administrado a animales singénicos, se obtiene una población heterogénea de anticuerpos anti-Id.

La clasificación de los anticuerpos anti-Id se basa en sus uniones dentro del sitio de unión al antígeno o a alguna otra región del Id. Si la unión del Ab2 con el Abl es inhibida por el antígeno relevante y si el Ab2 es también capaz de inducir una respuesta de anticuerpos de la misma especificidad que la del Abl, este mimifica el antígeno natural y se clasifica como Ab2p ; este tipo de Ab2 se refiere como anti-Id imagen interna y ellos pueden actuar como sustitutos de los antígenos. Los anti-Id que no son inhibidos por el antígeno se designan Ab2a, estos Ab2 reaccionan con idiotopos del Abl que no están estructuralmente relacionados con el sitio de unión al antígeno. En 1984 Bona y Köhler propusieron un

tercer tipo de anticuerpos anti-Id (Ab2y), los cuales son inhibidos por el antígeno a causa de una interferencia estérica, este tipo de anti-Id reacciona con idiotopos estructuralmente asociados con el sitio de unión al antígeno, pero ellos no mimifican el epitopo antigénico reconocido por el Abl (Bona and Köhler 1984, In Monoclonal and anti- idiotypic antibodies : Probes for receptor structure and function, Venter JC, Frasser CM, Lindstrom J (eds), NY, Alan R. Liss, pp 141-149,1984).

Basado en la teoría de Jerne se han desarrollado dos enfoques principales en la búsqueda de vacunas para un gran número de antígenos, incluidos los antígenos tumor- asociados. El primer enfoque se basa en la presentación de epitopos en un ambiente molecular diferente, usando Ab2p. Las vacunas que contienen este tipo de anticuerpos anti-Id han sido capaces de inducir respuestas protectoras contra virus, bacterias y parásitos (Kennedy et al (1986) 232,220-223; McNamara et al (1985) Ciencia 226,1325-1326). También, los Ab2p se han usado para inducir respuestas inmunes a antígenos tumor-asociados y resultados positivos han sido obtenidos en modelos animales y en ensayos clínicos (Raychauhuri et al (1986) J. Immunol37,1743-1749; Raychauhuri et al (1987) J. Immunol 139,3902-3910; Bhattacharya-Chatterjee et al (1987) J. Immunol 139,1354-1360; Bhattacharya-Chatterjee et al (1988) J. Immunol 141,1398-1403; Herlyn, D. et al (1989) Intern. Rev. Immunol 4,347-357; Chen, Z-J et al. Cell Imm. Immunother. Cancer (1990) 351-359; Herlyn, D. et al (1991) In Vivo 5,615-624; Furuya et al (1992) Anticancer Res 12,27-32; Mittelman, A. et al (1992) Proc. Natl. Acad. Sci.

USA 89,466-470; Durrant, LG. et al (1994) Cancer Res. 54, 4837-4840; Mittelman, A. et al (1994) Cancer Res. 54,415- 421; Schmitt, H. et al (1994) Hibridoma 13,389-396; Chakrobarty, M. et al (1995) J. Immunother. 18,95-103; Chakrobarty, M. et al (1995) Cancer Res. 55,1525-1530;- Foon, K. A. et al (1995) Clin. Cancer Res. 1,1285-1294;

Herlyn, D. et al (1995) Hybridoma 14,159-166; Sclebusch, H. et al (1995) Hybridoma 14,167-174; Herlyn, D. et al (1996) Cancer Immunol. Immunother. 43,65-76). No obstante, se ha demostrado que el carácter (3 de un Ab2 no es suficiente para producir el efecto biológico que podría inducir dicho Ab2 (Raychauhuri y cols, 1986, J. Immunol 137,1743-1749; Raychauhuri y cols, 1987, J. Immunol 139,231-278; Maruyama y cols, 1996, Int J Cancer 65,547-553).

El segundo enfoque se basa en la manipulación de la red mediante idiotopos regulatorios los cuales no están vinculados a la unión al antígeno, pero involucran idiotopos compartidos con otros anticuerpos o células T. Se han acumulado evidencias de que estos anticuerpos anti-Id son también capaces de producir respuestas inmunes y efectos protectores (Paul, W. E. and Bona, C. (1982) Immunology Today 3,230-234; McNamara M. K. et al (1985) Science 226,1325- 1326; Köhler y cols (1992) Proc. 8th Inter. Cong Immunol.

Budapest, pp. 619).

Los gangliósidos son glicoesfingolípidos que contienen ácido siálico y se expresan en la mayoría de las membranas de las células de los maníferos. Aunque estos antígenos están presente en tejidos normales, ellos pueden encontrarse en cantidades mucho mayores y expresados en una conformación y organización diferente en la superficie de células malignas (Hakomori, S. (1985), Cancer Res. 45,2405-2415; Miraldi, F.

(1989) Seminars in Nuclear Medicine XIX, 282-294; Hamilton et al (1993) Int J Cancer 53,1-81).

Aunque los gangliósidos pudieran ser blancos útiles contra los cuales dirigir las respuestas inmunes, su inmunogenicidad es extremadamente pobre, debido a su naturaleza sacarídica y a su condición de antígeno propio (Livingston, P. et al, (1995) Seminars in Cancer Biology 6,357-366).

La variante N-glicolilada del ácido siálico se expresa en tejidos normales de la mayoría de los mamíferos, pero es muy

difícil detectarla en tejidos normales de humanos (Watarai, S. et al (1995) J. Biochem 117,1062-1069). Por otra parte, la presencia de estos antígenos ha sido reportada en cáncer de colon, melanoma, retinoblastoma y cáncer de mama, entre otros (Higachi, H et al (1984) Jpn J Cancer Res (Gann) 75, 1025-1029; Higachi, H et al (1985) Cancer Res. 45,3796-3802; Hirabayashi, I. Et al (1987) Jpn J Cancer Res (Gann) 78, 1614-1620; Higachi, H. et al (1988) Jpn J Cancer Res (Gann) 79,952-956; Miyake, M. et al (1990) Cancer 65,499-505; Devine, P. L. et al (1991) Cancer Res. 51,5826-5386; Vázquez, A. M. et al (1995) Hybridoma 14,551-556; Marquina, G. et al (1996) Cancer Res. 56,5165-5171).

La inmunización con vacunas que contienen gangliósidos ha resultado en la prolongación de la sobrevida de pacientes con melanoma quienes desarrollaron anticuerpos anti- gangliósidos (Livingston, P. et al (1987) Proc Natl Acad Sci USA 84,2911-2915; Livingston, P. et al (1989) Cancer Res 49,7045-7050; Livingston, P. (1995) Immunological Reviews 145,147-166). No obstante, los problemas de la obtención de grandes cantidades del antígeno junto con su pobre inmunogenicidad han hecho el uso de los anticuerpos anti-Id una alternativa atractiva para la inmunoterapia activa en este modelo antigénico.

Un anticuerpo monoclonal (AcM) murino anti-Id (4C10) fue generado contra un AcM IgM humano (L612) que reconoce GM3 sobre melanoma humano. Sueros de ratones inmunizados con este AcM anti-Id acoplado con KLH, reaccionaron fuertemente con una línea celular de melanoma antígeno-positiva y con GM3 purificado lo cual sugirió que este AcM anti-Id portador de la imagen interna de GM3 (Ab2ß) puede ser una herramienta efectiva para la inmunoterapia activa específica en pacientes con melanoma (Yamamoto, S. et al (1990) J. Natl.

Cancer. Inst. 82,1757-1760; Irie, R. F. Patent Number US 5,208,146). Las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras (VL y VH) de este AcM anti-Id fueron clonadas,

secuenciadas y expresadas como un anticuerpo quimérico ratón/IgGl humano (Hastings, A. et al (1992) Cancer Res 52, 1681-1686).

Además, un AcM anti-Id tipo-alfa se generó contra el AcM humano L612 útil para procedimientos de inmunodiagnóstico (Irie, R. F. Patente Número US 5,208,146).

El AcM BEC-2, es un AcM anti-Id murino levantado contra un AcM de ratón que reconoce al gangliósido GD3 (AcMR24), el cual puede mimificar al GD3 y consecuentemente puede inducir anticuerpos contra este gangliósido a pesar de la expresión de GD3 en el tejido normal de conejo (Chapman, P. B. And Houghton, A. N. (1991) 88,186-192). Los resultados de un estudio piloto mostró que dicho AcM BEC-2 más BCG como adyuvante incrementó significativamente la sobrevida de pacientes con cáncer de pulmón de células pequeñas (Scrip Magazine (1996) pp 56-59; 33rd American Society of Clinical Oncology annual meeting (1997).

En la inmunización de ratas con un AcM murino específico contra GD2 (3F8), se generaron AcMs anti-Id que cuando se probaron como inmunógenos en ratones, pudieron estimular anticuerpos que reaccionaron con el gangliósido GD3. Esto sugirió que estos AcMs anti-Id pueden ser útiles en la construcción de vacunas (Cheung, N-K. V. et al (1993) Int. J.

Cancer 54,499-505).

También, un AcM anti-Id humano se generó usando células mononucleares de sangre periférica obtenida a partir de un paciente tratado con el AcM murino 14G2, el cual es específico contra GD2. La inmunización de conejos con este AcM anti-Id humano indujo la producción de anticuerpos anti- GD2 y una respuesta DTH para células de tumor antígeno- positivas. Esto sugirió que este anticuerpo podría potencialmente usarse como una vacuna anti-Id en pacientes con melanomas malignos (Saleh, M. N. et al (1993) J. Immunol 151,3390-3398).

Como es evidente a partir de los antecedentes arriba mencionados, hasta el momento ningún AcM anti-Id se ha

generado contra AcMs que reconocen gangliósidos que contienen ácido siálico N-glicolilado. Tampoco han sido descritos AcMs anti-Id no beta en modelos gangliósido con un efecto anti-tumoral. En todos los trabajos previos se reclaman AcMs anti-Id como sustitutos del antígeno.

Divulgación de la Invención.

La presente invención se relaciona de forma general con anticuerpos monoclonales (AcM) anti-idiotipos (anti-Id) y su uso como inmunomoduladores para el tratamiento del cancer.

Más particularmente, la presente invención se refiere a un AcM anti-Id murino que se desarrolló contra un AcM murino que reacciona con gangliósidos portadores de ácido siálico N-glicolilado y con antígenos expresados en células tumorales. El hibridoma productor de dicho anticuerpo ha sido depositado, en correspondencia con el Tratado de Budapest, el 29 de Noviembre de 1997 bajo el número de acceso 97112901, en el Centro para la Microbiología Aplicada (CAMR) & Colección Europea de Cultivos Celulares (ECACC), en el Reino Unido.

Según la presente invención, uno de sus objetivos es proporcionar un nuevo AcM anti-Id capaz de inducir una predominante respuesta anti-idiotípica en modelos xenogénicos y de producir un efecto protector en ratones u otras especies animales portadoras de tumores malignos.

Descripción detallada de la Invención Procedimiento de inmunización para obtener respuesta de anticuerpos anti-idiotipos (Ab2) a AcMs antigangliósidos.

Los ratones y otras especies de mamíferos son inmunizados con dosis de 25-200 Ag de AcMs anti-gangliósidos purificados, con o sin adyuvante, y opcionalmente se acoplaron a una proteína transportadora.

Los animales recibieron de 2-6 dosis de AcMs anti- gangliósidos, a intervalos de 14 a 30 días entre dosis. Las rutas posibles de inmunización son intraperitoneal, subcutánea, endovenosa o una combinación de éstas.

Antes de y durante el período de inmunización, muestras del suero de la sangre del animal son tomadas y los niveles de respuesta de anticuerpos Ab2 son determinados mediante cualquier método de inmunoensayo conocido. Diluciones del suero del animal son incubadas con el AcM anti-gangliósido usado como inmunógeno, o con otros AcMs anti-gangliósidos no usados en el protocolo de inmunización.

También fueron llevados a cabo experimentos para definir la capacidad que los sueros de los animales inmunizados tenían para bloquear la unión a su antígeno, del AcM anti- gangliósido usado como inmunogeno. <BR> <BR> <BR> <BR> <P> Producción de AcMs anti-idiotipos contra AcMs anti-<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> gangliósidos.

Ratones con altos títulos de anticuerpos Ab2 recibieron una re-inmunización con los AcM usados como inmunógeno, tres de días antes de la obtención de las células productoras de anticuerpos. Deben emplearse preferentemente las células del bazo, aunque otras células productoras de anticuerpos pueden ser seleccionadas también.

Estas células son fusionadas con células de mieloma para dar a las células híbridas o hibridomas la propiedad de reproducción o proliferación tanto"in vitro"como"in vivo". La fusión celular puede ser llevada a cabo por cualquiera de los métodos conocidos para este fin.

Los anticuerpos producidos por los hibridomas son probados por métodos de inmunoensayo, preferentemente mediante un ensayo inmuno-enzimático en el que sobrenadantes de los hibridomas se incuban con el AcM usado como inmunógeno y con otros AcMs anti-gangliósidos no usados en las inmunizaciones.

La capacidad del sobrenadante del hibridoma de bloquear la unión del AcM anti-gangliósido usado como inmunógeno a su antígeno es determinada mediante la incubación de dicho sobrenadante con diluciones adecuadas del AcM anti- gangliósido, seguido por la incubación de dicho anticuerpo con su antígeno.

Los hibridomas seleccionados son clonados por lo menos dos <BR> <BR> <BR> veces y los AcMs resultantes se producen"in vitro"e"in vivo"como se describe anteriormente.

Los AcMs anti-idiotipos obtenidos reconocen los AcMs anti- gangliósidos y poseen la capacidad de bloquear la unión del AcM anti-gangliósido a su antígeno.

Procedimiento de inmunización para obtener respuesta de anticuerpos anti-anti-idiotipos (Ab3) a AcMs Ab2 en modelos xenogénicos.

Monos u otra especie xenogénica son inmunizados con AcMs anti-idiotipos. Estos AcMs pueden ser administrados con o sin adyuvante y opcionalmente ser acoplados a una proteína transportadora, antes de ser usados como inmunógenos.

Cada animal recibió de 2 a 8 dosis de 250 Ag a 2 mg de los AcMs anti-idiotipos a intervalos de tiempo de 7 a 30 días entre dosis.

Las vías de inmunización pueden ser intradérmica, subcutánea, endovenosa, intraperitoneal o una combinación de éstas.

Los muestreos de la sangre de los animales se realizan antes y durante el protocolo de inmunización y la presencia de respuesta de anticuerpos Ab3 es monitoreada usando cualquiera de los métodos de inmunoensayo conocidos.

La administración a los animales de los AcMs anti-idiotipos producidos por la inmunización con AcMs anti-gangliósidos, pueden inducir una respuesta de anticuerpo predominante contra el idiotipo del AcM anti-idiotipo usado como inmunógeno, sin la inducción de respuesta de anticuerpos antígeno-específica.

Efecto anti-tumoral del tratamiento con AcMs anti- idiotipos.

AcMs anti-idiotipos se administran en una cantidad efectiva con o sin adyuvantes y opcionalmente acoplados a una proteína transportadora. El término de cantidad efectiva debe entenderse como la cantidad del AcM anti-idiotipo requerida

para lograr un efecto anti-tumoral. El tratamiento con los AcMs anti-idiotipos se realiza antes o después de la administración experimental de las células malignas en los animales.

Los animales recibieron de 1-5 dosis de 10-200 Rg de los AcMs anti-idiotipos, a intervalos de tiempo de 7-30 días entre csis.

Las rutas de inmunización pueden ser intradérmica, intraperitoneal, subcutánea, endovenosa o una combinación de éstas.

Después del tratamiento con los AcMs anti-idiotipos, la incidencia del tumor y la sobrevida en el grupo tratado con los AcMs anti-idiotipos fue comparada con la de los grupos contrôles.

Este ensayo reveló que el tratamiento con el AcM anti- idiotipo incrementó significativamente la sobrevida de los animales portadores de tumores y disminuyó las metástasis pulmonares en los mismos.

EJEMPLOS DE REALIZACIÓN : Ejemplo 1 : Generación de un anticuerpo anti-idiotipo contra el AcM P3 en un modelo singénico.

Ratores hembras Balb/c de 6-8 semanas, fueron inmunizadas ccn dos dosis de 50 u. g del AcM P3 purificado (anticuerpo desarrollado contra gangliósidos portadores de ácido siálico N-glicolilado, No. de Acceso ECACC 94113026, Solicitud de pater. te europea EP 657471 Al; Hibridoma (1995) 14,551-556) acoplado a KLH, a intervalos de 14 días entre dosis.

Tres días después de la última inmunización, se extrajeron los bazos de los ratones que mostraron altos niveles en suero de anticuerpos Ab2 contra el AcM P3 y se preparó una suspensión celular mediante el prensado del tejido a través <BR> <BR> <BR> <BR> de un tamiz de acero inoxidable o perfusión del bazo.<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <P> La fusión fue llevada a cabo mediante el método descrito por Köhler y Milstein (1975, Nature (Lond) 256, 495-497), con ligeras modificaciones.

Las células de los bazos de ratones fueron fusionadas con las células del mieloma murino no-secretor P3/X63 Ag8 6.5.3., No. de acceso ECACC. 85011420, en una relación 10 : 1, en 0.5 ml del medio de fusión que contiene 42% de polietilenglicol (PEG) en medio RPMI-1640.

Posterior a la fusión, las células son cultivadas en el medio selectivo HAT (hipoxantina-aminopterina y timidina) a 37°C en una atmósfera CO2.5% Dentro de los diez a quince días posteriores a la fusión, la evaluación de la presencia de los anticuerpos en los sobrenadantes de los hibridomas fue determinada mediante un ELISA. Las placas del ELISA (COSTAR) se incubaron durante la noche a 4°C con 10 Ag/ml del AcM P3 y con otro AcM IgM anti- gangliósido, en tampón carbonato-bicarbonato pH 9.8.

Los placas, después de lavadas con PBS conteniendo 0.05% de Tween 20, fueron bloqueadas con el mismo tampón conteniendo 1% BSA durante una hora a 37°C.

El paso del lavado es repetido y 50 µl/pozo de los sobrenadantes fueron añadidos. Después de su incubación durante 2 horas, las placas son lavadas nuevamente y se agrega un antisuero de carnero contra la región Fc de IgG murina, conjugado a fosfatasa alcalina. Después del lavado, se añadieron 100 Zl/pozo de la solución substrato (1 mg/ml de p-nitrofenilfosfato diluido en tampón dietanolamina, pH 9.8). La absorbancia se midió a 405 nm en un lector de ELISA.

Además, la capacidad de los sobrenadantes de bloquear la unión del AcM P3 al NeuGcGM3 fue determinada mediante un ELISA indirecto llevado a cabo sobre placas activadas de cloruro de polivinilo (ICN-FLOw) con NeuGcGM3 inmovilizado, segun el método siguiente : Cincuenta microlitros del gangliósido en metanol (4 ßg/ml) se añadieron a cada pozo. El metanol se evapora incubando las placas a 370C durante una hora. Luego se agregaron 150 µl/pozo de tampón TRIS-HCL 0.05 M pH 7.8 conteniendo 1% BSA y las placas se incubaron a 37°C durante 30 minutos.

Los sobrenadantes de los hibridomas se incubaron con 4 ßg/ml del AcM P3 durante 3 horas a 37°C y entonces, 50 ßl/pozo de las mezclas se agregaron y las placas se incubaron a 37°C durante 90 minutos.

Los pozos fueron lavados 4 veces con 200 l de PBS y se añadieron 50 u. l de un antisuero anti-inmunoglobulinas de ratón conjugado a fosfatase alcalina, adecuadamente diluidos. Después de lavar con PBS los pozos se incubaron con la solución substrato como se describió anteriormente.

Un AcM anti-idiotipo, nombrado 1E10, de la subclase IgGl fue obtenido. Este AcM 1E10 anti-IdP3 resultó ser muy específico para el AcM P3 usado como inmunógeno.

El hibridoma productor de dicho anticuerpo ha sido depositado, en correspondencia con el Tratado de Budapest, el 29 de Noviembre de 1997 bajo el número de acceso 97112901, en el Centro para la Microbiología Aplicada (CAMR) & Colección Europea de Cultivos Celulares (ECACC), en el Reino Unido.

Este AcM 1E10 anti-IdP3 seleccionado no reacciona con otros anticuerpos anti-gangliósidos tales como E1, A3 y F6 (Figura 1) y si es capaz de inhibir la unión del AcM P3 al NeuGcGM3 (Figura 2) y a la línea celular de tumor de mama P3 positiva.

Ejemplo 2 : Generación de respuesta de anticuerpos anti- anti-idiotipos (Ab3) al AcM anti-Id 1E10 en un modelo <BR> <BR> <BR> xenogénico.<BR> <BR> <BR> <BR> <P> El AcM anti-IdP3 1E10 precipitado en hidróxido de aluminio fue empleado para inmunizar intradérmicamente monos Cynomolgus, a 14 días de intervalo con una dosis de 2 mg de AcM por inyección. Los animales recibieron varias dosis del AcM.

Las muestras de los sueros se tomaron antes y después de las inmunizaciones. La presencia de respuesta de anticuerpos Ab3 en los sueros de los monos fue determinada por ELISA.

Placas de ELISA (COSTAR) se incubaron durante la noche a 4°C

con 10 AcM1E10osusfragmentosF(ab')2entampóndel carbonate-bicarbonato, pH 9.8.

Las placas, después de ser lavadas con PBS conteniendo 0.05% de Tween 20, fueron bloqueadas con el mismo tampón conteniendo 1% BSA durante una de hora a 37°C.

El paso de lavado se repitió y 50 ul/pozo de las diluciones de los diferentes sueros fueron añadidas. Después de la incubación durante 2 horas a 37°C, las placas se lavaron nuevamente y fueron añadidos antisueros anti- inmunoglubulinas humanas, anti-IgM o anti-IgG, conjugados a fosfatasa alcalina. Después del lavado, la solución del substrato se agregó según lo anteriormente descrito.

Los experimentos de bloqueo se llevaron a cabo para distinguir entre las respuestas de anticuerpos anti- isotípica y anti-idiotípica. Los sueros de monos fueron incubados durante la noche a 4°C con 500 µg/ml de un AcM con el mismo isotipo que el del AcM 1E10, pero con diferente especificidad. Entonces, la reactividad remanente del suero contra el AcM 1E10 fue medida mediante ELISA, como se describió arriba.

Los sueros de los monos fueron chequeados en cuanto a su capacidad para inhibir la unión de AcM P3 biotinilado a los fragmentos F (ab') 2 del AcM 1E10 en placas de ELISA, usando el método de ELISA descrito anteriormente, pero donde después de incubar las placas con las diluciones de los sueros, se agregaron 50 Al/pozo del AcM P3 biotinilado.

Después de una incubación durante una hora a 37°C, las placas se lavaron y 50 µl/pozo del complejo avidina-biotina- peroxidasa se agregaron y se procedió a la incubación de dichas placas durante una hora a 37°C. Después de lavar, el tampón substrato (8 mg de o-fenilendiamina en 12 ml de buffer fosfato-citrato, pH 5.0) se agregó. Se midió la absorbancia a 492 nm en un lector de ELISA.

Los sueros obtenidos a partir de monos inmunizados con AcM anti-IdP3 1E10 reaccionaron fuertemente con los

fragmentos F (ab') 2 1E10 (Fig. 3). Los sueros obtenidos a partir monos inmunizados se unieron específicamente con el AcM 1E10 y con menos reactividad que con el AcM no relacionado (ior C5). La presencia de anticuerpos contra el idiotipo 1E10 se confirmó después de la incubación de los sueros de los animales con el AcM no relacionado, debido a una reactividad fuerte de los sueros adsorbidos con el AcM anti-IdP3 1E10 ; sorprendentemente la respuesta de anticuerpos anti-idiotípica inducida fue superior en comparación con la respuesta de anticuerpo anti-isotípica generada (Fig. 4). Los sueros de los monos también inhibieron la unión del AcM P3 biotinilado al AcM anti-Id 1E10, lo que indica que anticuerpos Ab3 en el suero de los monos comparten los idiotopos con el AcM P3 (Fig. 5). Una respuesta predominante de anticuerpo IgG se generó contra el AcM anti-IdP3 1E10 (Fig. 6). Los sueros obtenidos a partir de los monos reaccionaron con los fragmentos F (ab) 2 1E10 aún 4 meses después que los animales recibieron la última inmunización (Fig. 7), así como anticuerpos Ab3 con capacidad inhibitoria de la unión del AcM P3 a 1E10 fueron detectados también en ese momento. No se detectaron anticuerpos contra NeuGcGM3 en el suero de los animales.

Todo esto demuestra que el AcM anti-idiotipo 1E10 es del tipo gamma, ya que el anti-idiotipo 1E10 es capaz de inhibir la unión del AcM P3 con su antígeno y no es capaz de inducir la producción de anticuerpos similares al P3 en los animales.

Ejemplo 3 : Tratamiento de ratones con el AcM anti-Id 1E10.

Ratones C57BL/6 se inmunizaron con cinco dosis de 50 µg de AcM anti-IdP3 1E10 precipitado en hidróxido de aluminio a intervalos de 14 días. Una semana después, los ratones se <BR> <BR> <BR> inyectaron subcutáneamente con 5 x 103 células del melanoma B16. Los animales que se trataron del mismo modo, pero que no recibieron el AcM lE10, se usaron como controles. Las curvas de sobrevida de Kaplan-Meyer se muestran en la

Figura 8, en la cual se muestra que la sobrevida es significativamente mejor en el grupo inmunizado con el AcM anti-IdP3 1E10 que en el grupo control.

Ratones C57BL/6 se inocularon por via intravenosa con 50 x 103 células del tumor de Lewis (cáncer de pulmón). Catorce días después, 10 g de 1E10 se administró por via intravenosa y 6 días después, los ratones se sacrificaron y el número de metástasis pulmonares fue contado. Animales tratados con un AcM IgG irrelevante o que recibieron únicamente PBS, fueron empleados como controles. Siete de los 10 animales tratados con AcM anti-P3 1E10 no desarrollaron metástasis de pulmón, en los otros 3 animales el número total máximo de metástasis fue 3. En contraste, todos los animales tratados con el IgGl irrelevante o los que únicamente recibieron PBS desarrollaron metástasis de pulmonares. Estos resultados indican que el tratamiento con este AcM anti-Id tipo gamma produjo un efecto protector contra tumores.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS : Figura 1 : Muestra la reactividad del AcM anti-IdP3 1E10 contra los AcMs anti-gangliósidos P3, E1, A3 y F6.

Figura 2 : Muestra los resultados de un ensayo de inhibición donde el AcM P3 se incubó con el AcM anti-IdP3.

1E10, y luego la reactividad del AcM P3 al NeuGcGM3 es medida por ELISA.

Figura 3 : Muestra la reactividad de sueros de un mono con los fragmentos F (ab') 2 del AcM 1E10 medida por ELISA, después que el animal recibiera dosis diferentes del AcM anti-Id 1E10 precipitado en hidróxido de aluminio.

Figura 4 : Muestra los resultados de un ensayo de inhibición, donde se determinó la reactividad mediante ELISA de un suero de mono no pre-adsorbido con el AcM 1E10 (-g-) y no pre-adsorbido con un AcM irrelevante del mismo isotipo ior C5 (-4b-), así como la reactividad de dicho suero pre- adsorbido al AcM lE10 (-Q-) y al AcM ior C5(-#-), empleando una dilución del suero de 1/20,000. Las flechas

tiempo de inmunización y las líneas continuas el momento en que se obtienen muestras del suero del animal.

Figura 5 : Muestra la inhibición de la unión del AcM P3 al AcM anti-Id 1E10, por el suero de un mono inmunizado con el AcM 1E10, determinada por ELISA. Las flechas indican tiempo de inmunización y las líneas continuas el momento en que se obtienen muestras del suero del animal.

Figura 6 : Muestra la cinética de la respuesta de anticuerpos IgG e IgM contra el AcM 1E10 en el suero de un mono inmunizado con el AcM anti-idiotipo, determinado por ELISA. Las flechas indican tiempo de inmunización y las líneas continuas el momento en que se obtienen muestras del suero del animal.

Figura 7 : Muestra el reconocimiento de fragmentos F (ab') 2 del AcM 1E10 por el suero de mono pre-inmune; por el suero obtenido después que el mono recibió la última dosis del AcM anti-idiotipo 1E10 precipitado en hidróxido de aluminio (indicado con la flecha), y por el suero obtenido 4 meses después que el animal recibió la última inmunización.

Figura 8 : Curvas de sobrevida de Kaplan-Meyer en ratones tratados con el AcM anti-IdP3 1E10 e inoculados con células de melanoma B16.