La présente invention est relative à un nouveau composé utilisable à titre de principe actif pharmaceutique, notamment dans le traitement du cancer. Ce composé peut se présenter sous forme d'un extrait de plante concentré ou sous forme de composé de synthèse.

Guiera senegalensis est une plante très commune en Afrique tropicale. Espèce soudano sahélienne, ses zones d'abondance sont principalement en Afrique occidentale. Cette plante est très commune dans le sahel où elle forme des peuplements mono spécifiques. Elle abonde dans les jachères sur sols argileux ou sableux, est localement grégaire, et existe aussi dans les limons des vallées passagèrement inondées. Elle est présente dans presque tout le Mali, sur une zone s'étendant de Kayes à Gossi (région de Tombouctou). Espèce envahissante des friches sablonneuses, première colonisatrice des terrains brûlés par les feux de brousse dans les savanes soudaniennes et soudano-guinéennes, élément des savanes dégradées, elle est également une plante pionnière disséminée par le bétail dans les jachères, et est aussi indicateur de surpâturage. L'aire géographique du Guiera et ses zones d'abondance ont été principalement établies en Afrique de l'Ouest. Son aire s'étale parallèlement à l'équateur du Sénégal aux frontières de l'Ethiopie.

Taxonomie, tableau 1

On reconnaît principalement à Guiera senegalensis les propriétés anti-inflammatoires, antiseptiques, béchiques, diurétiques, eupnéiques et fébrifuges. D'où sa prescription pour la toux, les états dyspnéiques, le paludisme, les pneumopathies, les bronchopathies. Ce sont les feuilles qui sont généralement utilisées sous forme de décocté ou macéré en bain et comme boisson. En usage externe, Guiera senegalensis est considéré comme vulnéraire antiseptique, cicatrisant pour le traitement des blessures, des stomatites, gingivites, des chancres syphilitiques (Kerharo J. et Adams (1974), La Pharmacopée sénégalaise Traditionnelle. Plantes Médicinales et Toxiques. Imprimerie JOUVE, 17 rue du LOUVRE, 75001 PARIS. 354).

Un méthoxylate naphtyl butènone, appelé Guieranone A, a été isolé des feuilles du Guiera senegalensis. (Olga Silva and Eisa T. Gomes. (2003), Guieranone A, a Naphtyl Butenone from the Leaves of Guiera senegalensis with Antifungal Activity. J. Nat. Prod., 66, 447).

Guieranone A

Les inventeurs ont pu isoler un nouveau composé à partir de Guiera senegalensis. Ce nouveau composé appelé Guieranone B a la formule (I) suivante.

Les inventeurs ont en outre découvert que ce composé présente une activité antiproliférative élevée, comme cela a été démontré sur la lignée de cellules cancéreuses mammaires MCF- 7. Le tableau 2 ci-dessous décrit l'activité antiproliférative comparée de 3 principes actifs (tamoxifène, 5-FU et Guieranone B) sur la lignée cancéreuse mammaire MCF-7 testée dans les mêmes conditions au laboratoire. La CI50 observée pour la Guieranone B (7,09 μΜ) est comprise entre les valeurs observées pour le tamoxifène et le 5-FU. La Guieranone B est donc un principe actif intéressant pour le traitement des cancers du sein, notamment. CI50 moyenne en μοΛηί. CI50 moyenne en μΜ

Tamoxifène 4,42 ± 0,34 1 1 ,91 ± 0,93

5-FU 0,53 ± 0,05 4,04 ± 0,39

Guieranone B 2,24 ± 0,13 7,09 ± 0,41

Tableau 2

Un objet de l'invention est donc de proposer la Guieranone B comme nouveau composé ou principe actif pharmaceutique, notamment comme nouvel agent anti-cancéreux.

Un autre objet de l'invention est d'isoler ce nouveau composé sous une forme substantiellement pure à partir de Guiera senegalensis. Un autre objet de l'invention est d'administrer ce nouveau composé à l'homme ou à l'animal pour traiter le cancer.

La caractérisation de ce nouveau composé et la description d'un procédé d'extraction- purification permet de disposer d'extraits concentrés en ce composé. Notamment, le procédé décrit aux exemples permet d'obtenir composé pur à plus de 89 % molaire. Cette mesure a été effectuée par HPLC. Le produit obtenu peut ensuite servir à purifier davantage le composé identifié et caractérisé, pour obtenir un composé ayant un degré de pureté supérieur. La présente invention a donc pour objet le composé de formule (I) ci-dessus, un de ses isomères de position ou de structure, ou un de ses sels d'addition avec des bases ou des acides pharmaceutiquement acceptables, sous une forme isolée ou substantiellement pure. Par substantiellement pur, on entend que le composé (I) est pur à plus de 80, 85 ou 89% molaire.

L'invention a aussi pour objet un extrait issu de Guiera senegalensis ou une composition concentrée comprenant au moins 50 % molaire du composé de formule (I), notamment au moins 60, 70, 80, 85 ou 89% molaire de ce composé. L'invention a notamment pour objet une composition concentrée comprenant au moins 80% molaire, de préférence au moins 85% molaire, de composé de formule (I).

Conformément à l'invention, ce composé ou cet extrait ou composition concentrée est utilisable en tant que médicament, notamment en tant que médicament anticancéreux. L'invention a donc aussi pour objet une composition pharmaceutique ou anticancéreuse comprenant un composé de formule (I), notamment substantiellement pur, ou une composition concentrée selon l'invention, et un véhicule ou excipient pharmaceutiquement acceptable.

Elle a aussi pour objet une composition, notamment pharmaceutique, comprenant à titre de principe actif un extrait selon l'invention et un véhicule ou excipient pharmaceutiquement acceptable.

Le composé selon l'invention peut être utilisé en combinaison avec au moins un autre agent pharmaceutique, notamment agent anticancéreux. Il peut ainsi être utilisé en combinaison avec d'autres agents pharmaceutiques ou anticancéreux autorisés par les autorités réglementaires.

L'invention a donc aussi pour objet une composition comprenant le composé de formule (I), notamment substantiellement pur, ou une composition concentrée selon l'invention, et (au moins) un autre agent pharmaceutique ou agent anticancéreux, dans un véhicule ou excipient pharmaceutiquement acceptable.

L'invention a aussi pour objet une composition comprenant le composé de formule (I), notamment substantiellement pur, ou une composition concentrée selon l'invention, et (au moins) un autre agent pharmaceutique ou anticancéreux à l'exception d'un agent présent dans Guiera senegalensis, dans un véhicule ou excipient pharmaceutiquement acceptable.

L'invention a aussi pour objet une composition comprenant le composé de formule (I), notamment substantiellement pur, ou une composition concentrée selon l'invention, et (au moins) un autre agent pharmaceutique ou agent anticancéreux, notamment à l'exception d'un agent présent dans Guiera senegalensis, pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps du composé de formule (I) ou de la composition concentrée et de l'autre agent pharmaceutique ou anticancéreux. Ces autres agents se présentent sous forme de médicament pouvant être administré simultanément (dans une formulation commune, éventuellement extemporanée, avec le composé de formule (I)), séparément (selon un protocole de traitement prévoyant une administration concomitante des formulations séparées) ou encore étalée dans le temps (selon un protocole de traitement prévoyant une administration étalée dans le temps des formulations séparées). Par exemple, l'autre agent est choisi parmi le tamoxifène, le 5-FU, la vinorelbine, le docetaxel ou leurs mélanges. Dans un mode de réalisation, l'autre agent anticancéreux est le tamoxifène. Dans un autre mode de réalisation, il s'agit du 5-FU. Dans un autre mode de réalisation, il s'agit de la vinorelbine. Dans un autre mode de réalisation, il s'agit du docetaxel.

Le composé, l'extrait ou les compositions concentrées selon l'invention, associés ou non à un autre agent, peuvent notamment être utilisés dans le traitement du cancer. Dans un mode de réalisation, il s'agit du cancer du sein. Dans un autre mode de réalisation, il s'agit du cancer de la prostate. Dans un autre mode de réalisation, il s'agit du cancer du colon.

L'invention a donc aussi pour objet l'utilisation du composé de formule (I), notamment substantiellement pur, ou une composition concentrée selon l'invention, pour la fabrication d'un médicament, notamment d'un médicament pour traiter le cancer. Dans un mode de réalisation, il s'agit du cancer du sein. Dans un autre mode de réalisation, il s'agit du cancer de la prostate. Dans un autre mode de réalisation, il s'agit du cancer du colon.

Les compositions selon l'invention peuvent être présentées sous toute forme appropriée à la voie d'administration prévue. La voie parentérale est la voie d'administration préférentielle et notamment la voie intraveineuse.

Les compositions selon l'invention pour administration parentérale peuvent être des solutions stériles aqueuses ou non aqueuses, des suspensions ou des émulsions. Comme solvant ou véhicule, on peut employer le propylène glycol, les huiles végétales, en particulier l'huile d'olive, et les esters organiques injectables, par exemple l'oléate d'éthyle. Ces compositions peuvent également comprendre des adjuvants en particulier des agents mouillants, émulsifiants ou dispersants. La stérilisation peut se faire de plusieurs façons, par exemple à l'aide d'un filtre bactériologique, en incorporant à la composition des agents stérilisants, par irradiation ou par chauffage. Elles peuvent être également sous forme de compositions solides stériles qui peuvent être dissoutes ou dispersées dans de l'eau stérile ou tout autre milieu stérile injectable.

L'invention concerne également une méthode de traitement d'une pathologie sensible au composé de formule (I), en particulier de cancer, comprenant l'administration, au patient qui en a besoin, d'une quantité efficace du composé selon l'invention, notamment substantiellement pur, ou sous forme d'extrait ou d'une composition concentrée, avec un véhicule ou excipient pharmaceutiquement acceptable. Dans un mode de réalisation, il s'agit du cancer du sein. Dans un autre mode de réalisation, il s'agit du cancer de la prostate. Dans un autre mode de réalisation, il s'agit du cancer du colon.

On entend par quantité suffisante, une quantité de composé selon la présente invention efficace pour limiter l'évolution de la maladie, la faire régresser ou la faire disparaître. La quantité suffisante peut être déterminée par l'homme du métier, par l'intermédiaire de technique conventionnelle et par l'observation des résultats obtenus dans des circonstances analogues. Pour déterminer la quantité suffisante différents facteurs doivent être pris en compte par l'homme du métier, notamment et sans y être limité : le sujet, sa taille, son âge, son état de santé général, la maladie impliquée et son degré de sévérité ; la réponse du sujet, le type de composé, le mode d'administration, la biodisponibilité de la composition administrée, le dosage, l'utilisation concomitante d'autres concomitante d'autres médicaments, etc. L'invention a aussi pour objet la fraction appelée KP-18 ^E dont le mode de préparation est décrit dans les exemples. L'invention a ainsi pour objet une composition pharmaceutique ou anticancéreuse comprenant cette fraction, et ses utilisations conformes à l'invention.

L'invention va être maintenant décrite plus en détail à l'aide d'exemples pris à titre non limitatif.

Exemple 1 : Protocole d'extraction du composé de formule (I)

L'extraction a été effectuée à partir de 1 100 g de feuilles de Guiera senegalensis (récoltées à proximité de la ville de Ségué, région de Mopti, Mali).. Le matériel végétal renferme souvent des quantités appréciables de graisses, il a été procédé à une délipidation par agitation mécanique des feuilles broyées avec 7,5 litres de cyclohexane durant 48 heures. Le matériel végétal a ensuite été filtré sous vide et séché.

Après séchage l'extraction a été réalisée en 3 étapes :

1 ^ere Etape : Les feuilles pulvérisées, délipidées et séchées ont été placées dans un erlenmeyer contenant 3,75 litres de méthanol. 1 ,25 litre d'une solution aqueuse d'ammoniaque à 33% a été ajoutée. La solution possède un pH compris entre 9 et 10. L'ensemble a été mis sous agitation mécanique pendant 48 heures. Au terme des 48 heures il a été procédé à une filtration sous vide, puis le filtrat a été concentré et au filtrat a été ajouté 0,65 litre de dichlorométhane. 2 ^eme Etape : La phase organique (dichlorométhane) a été séparée du marc à l'aide d'une ampoule à décanter. Après séchage sur Na ₂ S0 ₄ , elle a ensuite été concentrée partiellement à l'évaporateur rotatif jusqu'à un volume d'environ 0,4 litre. 0,3 litre d'une solution aqueuse d'acide chlorhydrique dilué à 5% a été ajouté. Ce mélange a été mis sous agitation 24 heures et la phase aqueuse a été séparée à l'aide d'une ampoule à décanter.

3 ^eme Etape : La phase aqueuse précédente a été alcalinisée par ajout d'une solution aqueuse de soude 1 M jusqu'à pH=8, en présence de 0,5 litre de dichlorométhane. La phase organique (dichlorométhane) a été séparée à l'aide d'une ampoule à décanter et la phase aqueuse a été ré-extraite deux fois avec 0,2 litre de dichlorométhane. Les phases organiques (dichlorométhane) rassemblées ont été séchées sur Na ₂ S0 ₄ , filtrées et évaporées sous pression réduite.

On a ainsi obtenu 3,3 g d'un extrait brut.

Exemple 2 : Protocole de séparation de l'extrait brut :

Une séparation par chromatographie sur gel de silice a ensuite été effectuée. Cette étape permet une séparation des molécules selon leur polarité. Le résultat des tests chromatographiques a conduit à utiliser comme système d'élution un mélange Cyclohexane/ Acétate d'éthyle/Méthanol en gradient de polarité.

Une masse d'environ 1 g d'extrait brut a été déposée sur une colonne de gel de silice (type 60, 230-400 mesh, Merck) préparée dans un mélange cyclohexane/acétate d'éthyle 95/5. L'élution a été réalisée par un gradient de polarité du système Cyclohexane/Acétate d'éthyle/Méthanol en commençant par un mélange cyclohexane/acétate d'éthyle 95/5 et en terminant par du méthanol pur avec un fractionnement en fonction des composants. Le suivi de ces fractions a été effectué par chromatographie sur couche mince de gel de silice sur support de verre. Les plaques ont été visualisées sous lumière UV (à 254 nm), puis révélées avec de l'acide phosphomolybdique. La progression de ces colonnes est rassemblée dans le tableau 3.

Système d'élution

o //o

Lot de fraction N ° de la fraction cyclohexane % acétate d'éthyle % Méthanol

01 -10 Sf1 95 5 -

1 1 -21 Sf2 95 5 -

22-26 Sf3 90 10 -

27-38 Sf4 90 10 - 39-52 Sf5 90 10 -

53-70 Sf6 90 10 -

71 -81 Sf7 90 10 -

82-135 Sf8 85 15 -

139-179 Sf9 85 15 -

180-186 Sf10 80 20 -

187-191 Sf1 1 80 20 -

192-207 Sf12 80 20 -

208-21 1 Sf13 80 20 -

212-308 Sf14 75 25 -

309-410 Sf15 75 25 -

41 1 -495 Sf16 65 35 -

496-623 Sf16 55 45 -

624-689 Sf17 40; 30 ; - 60; 70 ; 100 -

690-696 Sf18 - 90 10

697-734 Sf19 - 80 20

735-755 Sf20 - 50 50

- Sf21 - - 100

Tableau 3: Résultats de la séparation par chromatographie sur colonne de l'extrait des alcaloïdes totaux des feuilles du site de Ségué. Après rassemblement selon les résultats du suivi analytique, les fractions ont été éluées dans un système cyclohexane/acétate d'éthyle/méthanol avec différentes proportions. Ainsi il a été possible de regrouper certaines fractions et d'obtenir au final 1 1 fractions pour les feuilles de Ségué (tableau 4).

Nom de la

N ° des fraction et

fractions quantité (mg) Observations

Sf1 -Sf3 SF1 (38) 1 composé révélé à l'aide de l'acide phosphomolybdique

Sf4 SF2 (3) apparemment pas de composé

Sf5-Sf6 SF3 (28) mélange de deux composés visible à l'UV

Sf7 SF4 (4) 1 composé visible à l'UV

Sf8-Sf 13 SF5 (218) 3 composés visibles à l'UV

Sf14-Sf16 SF6 (133) 2 composés visibles à l'UV 2 composés : un visible à l'UV et l'autre révélé à l'acide

Sf17 SF7 (149) phosphomolybdique

Sf18 SF8 (68) 3 composés visibles à l'UV

Sf19 SF9 (122) sous forme de traînée (impuretés)

Sf20 SF10 (56) 3 composés visibles à l'UV

Sf21 SF1 1 (500) 2 Composés visibles à l'UV

Tableau 4: Regroupement des fractions issues de la colonne chromatographique de l'extrait d'alcaloïdes totaux des feuilles du site de Ségué.

Exemple 3 : Isolement et purification de la fraction KP-18E (Guieranone B ou composé de formule (I))

Une séparation chromatographique sur colonne a été ensuite effectuée sur la fraction SF5 qui présente une activité anticancéreuse intéressante. Cette étape permet une séparation plus précise des molécules selon leur polarité. Le résultat des tests chromatographiques a conduit à utiliser comme système d'élution un mélange Cyclohexane/Acétate d'éthyle/Dichlorométhane/Méthanol en gradient de polarité.

Une masse de 210 mg de SF5 a été déposée sur une colonne de gel de silice (type 60, 230- 400 mesh, Merck) préparée dans du cyclohexane/acétate d'éthyle 90/10. Les dimensions de colonne de silice est 22cm hauteur et 3 cm diamètre. L'élution a été réalisée par un gradient de polarité du système Cyclohexane/Acétate d'éthyle/Méthanol en commençant par un mélange cyclohexane/acétate d'éthyle 90/10 et en terminant par du dichlorométhane/méthanol (0,2% triéthylamine) avec un fractionnement en fonction des composants. Le suivi de ces fractions a été effectué par chromatographie sur couche mince de gel de silice sur support de verre. Les plaques ont été visualisées sous lumière UV (à 254 nm), puis révélées avec de l'acide phosphomolybdique. La progression de ces colonnes a été rassemblée dans le tableau 3. Après rassemblement selon les résultats du suivi analytique, 9 fractions différentes ont été obtenues.

Parmi celles-ci, la fraction KP-18E, représentant 17 mg, est constituée du composé de l'invention, qui a été dénommé Guieranone B. Système d'élution Lot de Nom de la Observations

fraction fraction et

(numéro de tubes)

quantité (mg)

Cyclohex 9 /EtOAc 1 1 -29 KP-18A 2 taches visibles en UV

(1 -35) (20) jaune dans silice

30-35 KP-18B 1 tache visible en UV et 2 taches révélées à l'acide

(100)

phosphomolybdique jaune dans silice

Cyclohex 8 /EtOAc 2 36-56 KP-18C 3 tache visibles en UV

(36-52) (21 ) rose dans silice

Cyclohex 7 /EtOAc 3 57-69 KP-18D 1 tache visible en UV

(53-83) (10) rose dans silice

Cyclohex 6 /EtOAc 4 70- 86 KP-18E 1 tache visible en UV

(84-104) (17) rose dans silice

Cyclohex 5 /EtOAc 5 87-140 KP-18F Trace visible en UV

(105-122) (9) rose dans silice

Cyclohex 4 /EtOAc 6

(123-140)

Cyclohex 3 /EtOAc 7 KP-18G 1 tache visible en UV

(100 ml) (8) rose dans silice

Cyclohex 2 /EtOAc 8 KP-18H Trace visible en UV

(150 ml) (5) rose dans silice Cyclohex 1 /EtOAc 9 KP-181 Trace visible en UV

EtOAc 100 % (8) rose dans silice

EtOAc 9 /MeOH 1

DCM 8 /MeOH (0,2

% TEA) 2

(100ml pour chaque)

Tableau 5: Regroupement des fractions issues de la colonne chromatographique de la fraction SF5 La pureté en Guieranone B dans les fractions SF5 et KP-18E a été mesurée par HPLC sur colonne Symmetry C18 4.6 x 150 mm, diam : 5mm

phase mobile : gradient [H20 + acide trifluoroacétique (0.1 %)] et MeOH

Tableau 6 :

débit : 1 mL / min

détecteur : UV 254 nm

volume injecté : 20mL

Résultats :

- SF5 : pic caractéristique à 24,062 : aire sous la courbe 4,3681 % molaire

- KP-18E : pic caractéristique à 24,335 : aire sous la courbe 89,1262% molaire

On démontre l'obtention d'un composé de formule (I) substantiellement pur, avec une pureté molaire de plus de 89%.

Exemple 4 : Caractérisation complète de KP-SF5-18 ^E (KP-18E)

Guieranone B (C ₁₇ H ₁₆ 0 ₆ - 316 g.mol ^~1 ). TOF (pos.) m/z 339 [M+Na] ⁺ , HRMS-TOF (pos) m/z 317,10181 , ([M+H] ⁺ , calcd. pour C ₁₇ H ₁₇ 0 _6, 317,10150).

13C RMN (CDCI ₃ -c/7, 100 MHz) δ 18,0 (C4'); 56,0 (OCH ₃ -4, OCH ₃ -8); 63,2 (OCH ₃ -6); 105,5 (C3); 111,9 (C7); 117,3 (C8a); 130,7 (C2); 134,2 (C2'); 134,9 (C4a); 148,9 (C3'); 158,5 (C6); 158,7 (C8); 159,3 (C4); 179,2 (C1); 182,8 (C5); 193,1 (C1'). H RMN (CDCI ₃ -c/7, 400 MHz) δ 7,56 (s, 1H, H3); 6,59 (m, 1H, H3'); 6,30 (d, J= 15,5, 1H, H2'); 6,08 (s, 1H, H7); 3,95 (s, 3H, 0-CH ₃ -4); 3,90 (s, 3H, 0-CH ₃ -4); 3,82 (s, 3H, 0-CH ₃ -6); 1,94 (d, J=6,60 Hz, 3H, H4')

Tableau 7:

Position H C HMBC

1 179,2

2 130,7

3 7,56, s, 1H 105,5 1,2,4, 4a, 8a, l',

2'

4 159,3

OCH ₃ -4 3,95, s, 3H 56,0 4

4a 134,9

5 182,8

6 158,5

OCH ₃ -6 3,82, s, 3H 63,2 6

7 6,08, s, 1H 111,9 1 , 5, 6, 8, 8a

8 158,7

OCH ₃ -8 3,90, s, 3H 56,0 7,8

8a 117,3

v 193,1

2' 6,30, d, 1H (J= 15,5 Hz) 134,2 l', 3', 4'

3' 6,59, m, 1H 148,9 l', 2' 4'

4' 1,94, d, 3H (J=6,60 Hz) 18,0 l', 2', 3' Les spectres RMN H, COSY (Corrélation Spectroscopy), ³ C et HMBC ( H/ ³ C) mettent en évidence la présence de deux groupements aromatiques et d'une cétone éthylénique. Les analyses des spectres de RMN H, COSY, ³ C, HSQC et HMBC ( H/ ³ C) permettent de confirmer la structure finale de KP18E (naphtylméthoxylate de buténone).

Exemple 5 : Protocole détaillé de la mesure de prolifération des cellules cancéreuses mammaires MCF-7 1 ^ere partie Jour 1 : ensemencement des cellules

1 . Préparation du milieu :

-Préparation du volume pour mettre dans les plaques :

Dans un Falcon de 50 mL préparer 30 mL de RPMI complet avec 10% de SVF et 1 % de Glutamine : 27 mL de RPMI ; 3 mL de SVF et 300 μί de Glutamine.

2. Préparation de la suspension de cellules :

-Aspirer le milieu contenu dans le flasque avec la trompe à vide

-Rincer avec 3 mL de PBS et aspirer avec la trompe à vide

-Ajouter 1 mL de trypsine et laisser agir 3 min à l'étuve à 37 ^< C en vue de décoller les cellules.

-Lorsque les cellules sont décollées, ajouter 2 ml de milieu complet préparé précédemment pour inactiver la trypsine.

-Bien mélanger la suspension par aspiration-refoulement et transférer dans un Falcon 15 bien identifié.

-Dénombrement des cellules en cellule de Malassez : effectuer une dilution au 20 ^eme pour les compter au bleu Trypan.

3. Ensemencement des plaques:

-Ensemencer les plaques avec 200 μί de suspension de cellules selon le schéma déterminé -Mettre 200 μί d'eau dans les puits périphériques

-Laisser incuber 24 h.

2 ^eme partie : Jour 2, mise en présence de l'extrait

4. Préparation du milieu:

45 mL au total de milieu à préparer dans un Falcon de 50 stérilisées

Soit 40,5 mL de RPMI + 4,5 mL de SVF + 450 μί de glutamine

5. Préparation des extraits :

-préparer une solution de 10 mg/mL : Dissoudre 8,1 mg d'extrait brut (noté SF) selon l'exemple 1 , de la fraction SF5 selon l'exemple 2 ou de la fraction KP-18 ^E (Guieranone B) dans 810 μΙ_ de DMSO

-Préparation de la solution mère d'extrait (Ex) à 100 μ9ΛηΙ_ soit 50μΙ_ de (10 mg/ml) dans 4950 μΙ- de RPMI

-Réalisation de la gamme d'extrait (pour 1 extrait et 1 seule gamme).

-Enlever le milieu dans les plaques et ajouter 200 μΙ_ par puits d'une gamme d'extrait (une colonne par concentration).

-Mettre à incubation à l'étuve les plaques sous 37 ^< C durant 72H.

6. Préparation de la résazurine (révélateur) et lecture de la plaque To

· Pour To ;

2 colonnes de cellules + une colonne de Résazurine seule= 3 colonnes

200 μί /puits X 3 colonnes X 6 lignes= 3600 μΙ_ (volume total à préparer : 5 ml_)

-Préparer 4,9 ml_ de milieu + 100 μΙ_ Résazurine

Enlever le milieu et ajouter 200 μΙ_ de (milieu + Résazurine) par puits.

-Incuber pendant 2 heures, et lecture au fluoroskan.

3 ^eme partie : Mesure de la prolifération à 24 h (pour U, 72 h (pour extrait)

• Pour les extraits à 72h :

200 μί /puits X 18 colonnes X 6 lignes (volume total à préparer : 25 ml_)

-Préparer 24,5 ml_ de RPMI + 500 μΙ_ de Résazurine

-Enlever le milieu et ajouter 200 μΙ_ de (milieu + Résazurine) par puits.

-Au bout de 2 heures, lecture au fluoroskan.

Résultats :

1 : Mesure de l'activité antiproliférative de SF en % d'inhibition (Criblage 0 à 100 g mL) Tableau 8

SF Pourcentage d'inhibition

Concentrations 0 g mL 12^g/ml_ 25 g mL 50 g mL 100 g mL

0,00 98,10 96,79 100,00 100,00

1 1 ,25 98,46 97,74 100,00 100,00

19,60 98,78 97,57 100,00 100,00

Valeurs

0,00 98,20 98,42 100,00 100,00

5,93 97,07 97,82 100,00 100,00

5,72 98,40 96,71 100,00 100,00

Moyennes 7,08 98,17 97,51 100,00 100,00

ESM 3,04 0,24 0,27 0,00 0,00 2 : Mesure de l'activité antiproliférative de SF en % d'inhibition (Criblage 0 à 10 μg mL) Tableau 9

3 : Mesure de l'activité antiproliférative de SF en % d'inhibition

(Moyennes obtenues pour les 6 essais) Tableau 10

CI50

N1 3,64

1 N2 4,81

N3 4,40

μg/mL

N1 3,66

2 N2 3,29

N3 4,91

CI50 moyenne ± ESM 4,12 ± 0,27 μg/mL 4: Pourcentage d'inhibition de la prolifération des cellules cancéreuses MCF-7 en fonction des concentrations de SF5 du criblage Tableau 1 1

5 : Mesure de l'activité antiproliférative des fractions de SF : SF5 en % d'inhibition (Moyennes obtenues pour les 6 essais) Tableau 12

CI50 SF5

N1 1 ,40 μg/mL

1 N2 1 ,47

N3 1 ,53 N1 0,90

2 N2 1 ,05

N3 0,99

CI50 moyenne ± ESM 1 ,22 ± 0,1 1 μg/mL

6 : Pourcentage d'inhibition de la prolifération des cellules cancéreuses MCF-7 en fonction des concentrations de KP-18E du criblage Tableau 13

7 : Mesure de l'activité antiproliférative de KP-18E en % d'inhibition (Moyennes obtenues pour les 6 essais) Tableau 14 μg/mL 0 0,25 0,5 1 1 ,5 2 2,5 3 4 5

N1 Moyennes 3,23 0,89 4,08 16,32 33,96 46,74 74,28 95,88 99,55 99,43

1 N2 Moyennes 1 ,95 0,00 0,30 6,50 8,86 23,88 40,33 61 ,22 98,27 99,91

N3 Moyennes 3,22 0,53 2,19 2,87 22,68 41 ,08 65,99 93,83 99,46 99,29

N1 Moyennes 1 ,79 1 ,75 3,42 15,89 20,44 38,75 49,01 57,82 91 ,14 99,02

2 N2 Moyennes 1 ,90 4,00 7,57 20,89 32,06 48,73 57,31 70,40 99,55 100,00

N3 Moyennes 3,78 7,53 10,24 28,50 40,50 51 ,63 61 ,79 75,79 99,83 100,00

Moyenne des

manipulations 2,65 2,45 4,63 15,16 26,41 41 ,80 58,12 75,83 97,96 99,61

ESM 0,35 1 ,17 1 ,49 3,83 4,64 4,08 4,96 6,57 1 ,38 0,17 CI50

N1 2,0535

1 N2 2,7202 μg/mL

N3 2,1664

N1 2,5518

2 N2 2,067 μg/mL

N3 1 ,9176

CI50 moyenne 2,246083333 μg/mL

ESM 0,1293 μg/mL

Exemple 6 : Comparaison de l'activité antiproliférative de la Guieranone B avec celle du tamoxifène et du 5-FU:

Le protocole décrit à l'exemple 5 a été utilisé, en remplaçant la Guieranone B par le tamoxifène ou le 5-FU (5-Fluorouracile). En suivant ce protocole, il a été possible de mesurer les CI50 de ces composés et de les comparer à celle de la Guieranone B.

Le tableau 15 (identique au tableau 2) décrit l'activité antiproliférative comparée de ces 3 principes actifs (tamoxifène, 5-FU et Guieranone B) sur la lignée cancéreuse mammaire MCF-7 testée dans les mêmes conditions.

La CI50 observée pour la Guieranone B (7,09 μΜ) est comprise entre les valeurs observées pour le tamoxifène et le 5-FU. La Guieranone B est donc un principe actif potentiellement intéressant pour le traitement des cancers du sein.