La présente invention se rapporte à une compo¬ sition antidiabétique apte à stimuler la sécrétion d'insuline et spécialement destinée au traitement du dia¬ bète de type II ou diabète non insulino dépendant.

Il est connu que le diabète touche, aujour¬ d'hui, plus de trente millions d'individus dans le monde, prenant la dimension d'un phénomène majeur sur le plan de la santé publique ; à titre d'exemple, on considère que, dans les pays européens, le diabète atteint entre 2 et 5 % de la population, et qu'en France, environ 3 à 4 % des ha¬ bitants souffrent de diabète non insulino dépendant qui est de loin le plus fréquent et en particulier entre 5 et 10 % des sujets âgés de 60 à 70 ans souffrent de cette maladie.

De plus, et pour diverses raisons liées notam¬ ment à la richesse alimentaire, l'obésité, le tabagisme ou encore la diminution de l'activité physique, le nombre de diabétiques aurait doublé en France en une vingtaine d'an- nées, essentiellement du fait d'une augmentation du diabète non insulino dépendant.

Cette affection est caractérisée par une alté¬ ration de la sécrétion d'insuline associée ou non à une in¬ sulino résistance des tissus périphériques. L'altération du fonctionnement des cellules B pancréatiques qui synthéti¬ sent l'insuline, survient dès la phase initiale du diabète

non insulino dépendant. Elle se traduit par une très nette diminution de la sécrétion d'insuline en réponse à une sti¬ mulation glucosée.

Pour traiter cette maladie, les spécialistes ont en conséquence été tout naturellement amenés à recher¬ cher des produits susceptibles de stimuler la sécrétion d'insuline ; parmi ceux-ci, seuls les sulfamides (sulfonylurées) ont, dans un premier temps, révélé une ef¬ ficacité. Cependant, malgré leurs avantages, les sulfony¬ lurées présentent un certain nombre d'inconvénients avant tout liés aux difficultés rencontrées pour déterminer la posologie adéquate ; il en résulte des risques de surdosage pouvant provoquer fréquemment des hypoglycémies, avec ris- que de coma hypoglycemique, notamment chez les personnes âgées.

Pour remédier à ces inconvénients, on a en con¬ séquence cherché à proposer un médicament de nature à se substituer aux sulfonylurées pour stimuler la sécrétion d'insuline.

C'est ainsi que, conformément au document EP- 0 587 476, on a pu mettre en lumière les propriétés anti¬ diabétiques de certains acides aminés mono ou polyhydroxy- lés parmi lesquels le plus actif s'est révélé être la 4- hydroxyisoleucine de formule :

5 4 3 2 1

OH CH ₃ NH ₂

et/ou sa forme lactonique.

Conformément à cette publication, on a en par- ticulier proposé un procédé d'extraction de la 4-

hydroxyisoleucine à partir de graines d'une espèce particu¬ lière de trigonelles (Trigonella sp : le fenugrec Tricronel- la foenum-graecum L) qui est une légumineuse facilement cultivable dans les régions méditerranéennes. Ce procédé consiste à mettre en oeuvre les éta¬ pes suivantes :

- on soumet des graines de fenugrec a un broyage et à une extraction préalable à l'hexane, à température ambiante de façon à obtenir un tourteau délipidé, - on soumet ce tourteau à plusieurs extractions hydro¬ alcooliques successives avec de l'éthanol à 70 % à tempé¬ rature ambiante,

- on concentre l'extrait obtenu sous pression réduite,

- on fait passer le concentrât sur une colonne contenant une résine échangeuse de cations sous forme H de façon à retenir la 4-hydroxyisoleucine recherchée sur cette co¬ lonne,

- on élue celle-ci en utilisant une solution d'ammoniaque N ou 2N, - après concentration et reprise par de l'éthanol à 70 %, on soumet le mélange obtenu à une chromatographie d'adsorption sur gel de silice, et

- on élue celui-ci avec de l'éthanol à 70 % avant de le concentrer sous vide et de le purifier par cristallisa- tion avec addition d'éther diéthylique de façon à obtenir une 4-hydroxyisoleucine titrant 99 % de pureté.

Pour permettre aux malades de pouvoir bénéfi¬ cier des propriétés antidiabétiques toutes particulières de la 4-hydroxyisoleucine, il a été décidé de poursuivre les recherches sur ce produit : en effet, la mise sur le marché d'un médicament nouveau exige une connaissance et une des¬ cription précise du principe actif ; or, le squelette de la 4-hydroxyisoleucine renferme trois carbones asymétriques successifs et comporte, par suite, huit stéréo-isomères pouvant être définis par les notations standardisées {2S,

3R, 4S) ; (2S, 3R, 4R) ; (2R, 3S, 4R) ; (2R, 3S, 4S) ; (2S, 3S, 4S) ; (2S, 3S, 4R) ; (2R, 3R, 4R) ; (2R, 3R, 4S) .

Compte tenu de cette situation, on a eu l'idée de rechercher, conformément à l'invention, au(x)quel(s) de ces isomères devaient être attribuées les caractéristiques antidiabétiques ou tout au moins l'essentiel de ces carac¬ téristiques.

On a, à cet effet, tenu compte des travaux de Fowden et al. (Phytochemistry, 1973, vol.13, pp. 1707 à 1711) et d'Alcock et al (Phytochemistry, 1989, vol.28, pp. 1835-1841) conformément auxquels on a pu établir qu'à l'état naturel, le Fenugrec ne renferme que deux isomères de la 4-hydroxyisoleucine (diastéréoisomères sur le carbone 2) à savoir les isomères suivants :

COOH COOH

H,N - C H H - C - NH-

H ₃ C - H H-.C - C - H

HO - C - H HO - C - H

CH, CH,

Isomère (2S, 3R, 4S) Isomère (2R, 3R, 4S)

Plus précisément, il a été prouvé que le Fenu¬ grec renferme environ 97 % d'isomère (2S, 3R, 4S) qui doit donc être considéré comme l'isomère majeur et environ 3 % d'isomère (2R, 3R, 4S) qui doit être considéré comme l'isomère mineur.

Conformément à l'invention, on a constaté expé¬ rimentalement que lorsque l'on extrait des graines de Fenu¬ grec par le procédé susmentionné, décrit dans le document

EP-A-0 587 476, à petite échelle, on obtient la 4- hydroxyisoleucine en conservant essentiellement les propor¬ tions susmentionnées d'isomère majeur et d'isomère mineur ; les caractéristiques . physico-chimiques de l'isomère majeur ont été déterminées et correspondent à la structure (2S, 3R, 4S) .

'CH.

OH

Cette configuration a pu être attribuée grâce aux mesures suivantes et par analogie avec les travaux an¬ térieurs :

- Pouvoir rotatoire (Perkin-Elmer) [α] ² ₎ ⁰ 31.3 (c=1.2, H ₂ 0) .

-- SSppeeccttrroommééttrriiee iinnffrraarroouuggee ((PPeerrkkiinn--EEllmmeerr,, FT-IR, Paragon

-i 1000) dont les résonances sont les suivantes en cm :

V _maχ 3500-2000, 1634, 1490, 1415, 1356, 1312, 1270, 1180,

1104, 1053, 1017, 962, 931, 899, 858, 817, 794.

- Spectrométrie de masse (JEOL, JMS-SX 102A) selon la tech- nique « fast atom bombardement » en modes positif et né¬ gatif avec une matrice de glycérol-thioglycérol :

FAB+ : 148 (M+H) ⁺ 100 ; FAB- : 146 (M-H) ⁺ 100

- Spectrométrie RMN H et C (Bruker AC 250 MHz) dont les déplacements chimiques sont les suivants (en ppm : δ) ^λ E NMR δ : 1 (d, 3H, J=7, CH ₃ C-3) ; 1,29 (d, 3H, J=6,3, CH ₃ C-4) : 1,97 (qdd, 1H, J=7/4/8, CH-3) ; 3,88 ( (qd, 1H, J)=8/6,3, CH-4) ; 3,94 (d, 1H, J=4, CH-2) .

¹³ C NMR δ : 38,6(C ₆ ) , 47,2(C ₅ ) , 67,8(C ₃ ) , 83,5(C ₂ ) , 96,4(C ₄ ) , 200(C _! ) .

Les figures la à lf ont permis d'établir les caractéristiques physico-chimiques de l'isomère (2S, 3R, 4S) de la 4-hydroxyisoleucine.

Plus précisément, la figure la correspond à la chromatographie HPLC tandis que les figures lb à lf repré¬ sentent respectivement le spectre IR, le spectre de masse « FAB » mode positif, le spectre de masse « FAB » mode né-

1 13 gatif, le spectre RMN H et le spectre RMN C.

On s'est, en revanche, rendu compte que si l'on transpose le procédé susmentionné à une échelle supérieure pour laquelle les différentes étapes exigent des temps plus importants, on obtient un produit comportant environ 85 à 90 % d'isomère majeur et environ 10 à 15 % d'isomère mi¬ neur.

Partant de ces constatations, on a cherché à séparer les deux diastéréoisomères par chromatographie en utilisant une colonne semi-préparâtive ultrabase C ₁₈ qui est caractérisée par une hydrophobicite élevée et un indice de silanol résiduel très faible, donc une capacité de ré¬ tention élevée ; il est connu que de telles colonnes sont adaptées pour effectuer la séparation de composés présen- tant des groupements, fonctionnels très polaires, comme les substances acides ou basiques.

On a ainsi purifié 2 grammes d'un mélange obte¬ nu suite à la mise en oeuvre du procédé susmentionné dans les conditions suivantes :

- Support : colonne semi-préparative ultrabase C ₁₈ ,

5μM (10 mm x 15 cm)

- Détecteur : UV (190 à 220 nm) ou réfractomètre,

- Eluant : eau pure, - Débit : 2 ml/min.

Il est à noter que l'utilisation d'eau pure comme solvant de dilμtion s'est avérée indispensable car l'alcool perturbe la séparation. Une étude analytique préalable effectuée sur

10 μg de mélange a permis de vérifier que le temps de ré¬ tention était de 9,6 min. pour l'isomère mineur et de 10,2 min. pour l'isomère majeur et qu'il était donc ainsi possible de séparer les deux isomères présents. Cette possibilité a été confirmée par l'expérience et, la mise en oeuvre du procédé de séparation a effectivement permis d'obtenir, à partir des deux grammes initiaux, et après purification, d'une part, plus de 400 mg d'isomère mineur pratiquement pur et d'autre part, environ 1,5 g d'isomère majeur avec une pureté de 97 à 98 % identi¬ que au composé isolé à partir du document EP-A-0 587 476.

Conformément à l'invention, on a ensuite mis en oeuvre des tests pharmacologiques pour vérifier l'activité antidiabétique de chacun des isomères ainsi purifiés et on a constaté que le plus puissant (eutomer) renfermant la ma¬ jeure partie de l'activité antidiabétique est l'isomère ma¬ jeur tandis que l'isomère mineur s'avère nettement moins puissant (distomer) .

La présente invention a pour objet de tirer profit de ces constatations expérimentales en proposant une composition antidiabétique nouvelle apte à stimuler la sé¬ crétion d'insuline et spécialement destinée au traitement du diabète non insulino dépendant.

Conformément à l'invention, cette composition antidiabétique est caractérisée en ce qu'elle renferme, en

tant que substance active, l'isomère (2S, 3R, 4S) de la 4- hydroxyisoleucine de formule :

5 4 3 2 1 CH ₃ - CH - CH - CH - COOH i ! I

OH CH ₃ NH ₂ 6

et/ou sa forme lactonique, et en ce qu'elle est pratique¬ ment exempte de tout autre stéréoisomère de ce composé.

Selon une caractéristique préférentielle de l'invention, cette substance active est d'origine végétale, et est notamment obtenue à partir de trigonelles (Triαonella sp.) et plus particulièrement extraite de grai¬ nes de fenugrec (Triαonella fœnum-αraecum L) .

L'activité antidiabétique toute particulière de l'isomère (2S, 3R, 4S) de la 4-hydroxyisoleucine sera mise en lumière grâce à l'exemple suivant, portant sur une in- vestigation au niveau des îlots de Langherans isolés de pancréas de rat.

Après digestion du pancréas par la collagénase, les îlots de Langerhans qui possèdent des cellules B sécré¬ tant l'insuline ont été séparés des autres éléments du di- gestat, prélevés sous la loupe binoculaire, puis déposés dans des tubes d'incubation. Cette méthode, qui présente l'avantage de ne nécessiter qu'une faible quantité de subs¬ tance, permet une étude directe des effets de la composi¬ tion sur des cellules endocrines pancréatiques, en particulier des cellules B insulino sécrétrices, à l'exclu¬ sion de toute interférence avec les tissus exocrines et an¬ nexes.

Sur des îlots isolés de rats Wistar, incubés en présence de 8,3 mM de glucose (1,5 g/1) pendant une heure, on a recherché l'effet de 200 μM d'isomère majeur de la 4-

hydroxyisoleucine, d'une part, et de 500 μM et 1 mM d'isomère mineur d'autre part, sur la sécrétion d'insuline. Les résultats obtenus sont reportés sur la figure 2, sur lequel les histogrammes représentent pour chaque dose d'isomère de 4-hydroxyisoleucine la sécrétion d'insuline mesurée sur 60 minutes. Les valeurs données correspondent à chaque fois à la moyenne de 16 à 20 déterminations.

Sur ce schéma, on peut noter que pour l'isomère majeur, un effet stimulant significatif sur la sécrétion apparaît pour une concentration de 200 μM, alors que dans le cas de l'isomère mineur, cet effet n'est observé que pour une concentration de 1 mM.

Cette étude pharmacologique permet donc bien de mettre en lumière l'activité supérieure de l'isomère ma¬ jeur.

Ces résultats ont été confirmés par des expé¬ riences réalisées sur le pancréas isolé et perfusé en pré¬ sence de 8,3 mM de glucose.

Conformément à ces expériences, dont les résul- tats sont reportés sur la figure 3, l'isomère majeur et l'isomère mineur de la 4-hydroxyisoleucine ont été intro¬ duits à une concentration de 200 μM dans le milieu de per¬ fusion pendant 10 minutes.

Les valeurs données correspondent à chaque fois à la moyenne de 4 à 6 expériences.

Ce schéma montre clairement que, dans le cas de l'isomère majeur, la stimulation est immédiate et biphasi¬ que et persiste pendant toute la durée de la perfusion alors qu'au contraire, aucun effet notable n'est observé dans le cas de l'isomère mineur.