Mikrotubuli sind Organellen, die in den meisten eukaryontischen Zellen vorkommen und dort eine Reihe von Funktionen wie Mitose, intrazelluläre Bewegungen, Zellwanderung und die Ausprägung der Zellform übernehmen. Mikrotubuli sind Polymere aus Tubulin, das seinerseits ein Dimer aus einer a-und einer ß-Einheit darstellt. Diese Heterodimere binden zwei Moleküle Guanosintriphosphat (GTP), wobei eines der GTP. s fest gebunden und das andere austauschbar ist. Die Heterodimere polymerisieren in einer Kopf-Schwanz-Anordnung zu fadenförmigen Makromolekülen, den sogenannten Protofilamenten, die sich ihrerseits zu röhrenförmigen Organellen, den Mikrotubuli, zusammenlagern. Mikrotubuli unterliegen einem ständigen Auf-und Abbau. Das Gleichgewicht zwischen Wachstum und Abbau hängt von der Verfügbarkeit neuer GTP-Tubulin-Untereinheiten und der Hydrolysegeschwindigkeit des zweiten gebundenen GTPs ab. Am Plus-Ende werden neue Untereinheiten angebaut, wogegen am Minus-Ende Untereinheiten abdiffundieren. Es ist bekannt, dass zytotoxische Substanzen wie Colchicin, Vinblastin, Vincristin, Taxol, Epothilone, Podophyllotoxin, Steganicin, Combretastatin und Methoxyestradiol den Auf-bzw. Abbau der Mikrotubuli (Tubulinpolymerisation und Tubulindepolymerisation) beeinflussen und somit in der Lage sind, die Zellteilung phasenspezifisch zu beeinflussen. Dies betrifft vor allem schnell wachsende, neoplastische Zellen, deren Wachstum durch intrazelluläre Regelmechanismen weitgehend unbeeinflusst ist. Wirkstoffe dieser Art sind prinzipiell geeignet zur Behandlung maligner Tumoren.

Fotsis et. al. Nature 1994 368,237-239 berichten darüber, dass 2-Methoxyestradiol das Tumorwachstum und die Angiogenese hemmt.

Cushman et a/J. Med Chem 1995 38,2041-2049 untersuchen die zytotoxische r' sowie die Tubulin-Polymerisationshemmende Wirkung von 2-Methoxyestradiol, und

berichten in J. Med. Chem. 1997,40, 2323-2334 darüber, dass 2-Alkoxy-6- oximinoestradiol-Derivate die Tubulinpolymerisation sowie die Bindung von [3H]- Cholchicin an Tubulin hemmen. Die hier genannten 2-Alkoxy-6-oximinoestradiol- Derivate zeigen bzgl. der Hemmung der Tubulinpolymerisation vergleichbare Aktivität wie 2-Ethoxyestradiol, das eine höhere Aktivität als 2-Methoxyestradiol aufweist.

W093/05064 betrifft u. a. Verbindungen der Formel R1 \ ii Ri p-Polycyclus

wobei R1 und R2 jeweils unabhängig Wasserstoff oder Methylgruppe bedeuten, mit der Maßgabe, dass mindestens einer der Reste R1 und R2 ein H-Atom ist, und der Rest-O-Polycyclus ein 3-Sterol ist, dessen Sulfatester durch ein Enzym mit Steroid- sulfatase-Aktivität hydrolisierbar ist. In der 2-Stellung des Steroidgerüstes spezifisch substituierte Verbindungen sind nicht explizit offenbart.

US 6,011, 024 beruht auf der W093/05064 und deckt z. B. alle Verbindungen ab, in denen die primäre Sulfamatfunktion an einem Sechsring gebunden ist. In der 2- Stellung des Steroidgerüstes spezifisch substituierte Verbindungen sind wiederum nicht explizit offenbart.

WO 96/05216 betrifft an C2-unsubstituierte Estra-1,3, 5 (10)-trien-Sulfamat-Derivate.

WO 96/05217 betrifft pharmazeutische Zusammensetzungen enthaltend Wirkstoffe der allgemeinen Formel

worin R = NH2; R@ = C1-5-Alkoxygruppe, OH ; R, R und R'voneinander unabhängig = H, OH ; R9 und R10 zusammen = O die Bedeutung haben können. Die darin

offenbarten pharmazeutischen Zusammensetzungen können zur weiblichen Fertilitätskontrolle ; klimakterischen HRT und zur Behandlung gynäkologischer und andrologischer Krankheitsbilder, wie Mamma-, bzw. Prostatakarzinom verwendet werden.

WO 97/14712 betrifft Steroidsulfamat-Derivate der allgemeinen Formel worin R1 eine Acyl-, Alkoxycarbonyl-, Aminocarbonyl-, Sulfonyl- oder Sulfonamidyl- gruppe ; R2 ein Wasserstoff-oder ein Metallatom ; R7 und R8 unabhängig voneinander H, OH und C1 s-AlkoxY ; R13, R12, R11 unabhängig voneinander H oder OH darstellen können.

WO 98/42729 betrifft 16-Halogensubstituierte-1, 3, 5-estratriene-3-monosulfamate sowie 3, 17ß-Bissulfamate, die an C2 alkoxysubstituiert sein können. Die 16-Halogen- substitution erhöht sowohl die Sulfatase-Hemmwirkung als auch die Estrogenität der entsprechenden Sulfamat-Derivate.

Die Einführung einer zu der 3-Sulfamat-zusätzlichen 17-Sulfamatfunktion setzt die Estrogenität drastisch herab.

WO 98/24802 betrifft Sulfamate, die die Estronsulfatase hemmen. 2-Methoxyestron- sulfamat wird explizit genannt. Als potentielles Therapiegebiet findet Mammakarzinom, nicht jedoch Prostatakarzinom in der Beschreibung Erwähnung.

Auch WO 99/33858 beschreibt Estronsulfatase-Inhibitoren der Formel

worin Rl und R2 unabhängig voneinander H, Alkyl, oder zusammen Piperidin-, Morpholin, Piperazin ; R3 = H, CN, NOz, C02R4 ; R8 = H, N02, NR6R darstellen. In der Beschreibung ist als mögliches Therapiegebiet Mammakarzinom erwähnt.

WO 99/64013 betrifft eine pharmazeutische Zusammensetzung eines Sulfamat- Derivates mit einem Zellsignalmodifier (wie z. B. TNFa). 2-Methoxyestronsulfamat wird in dieser Kombination als bevorzugtes Sulfamat explizit beansprucht ; es fallen aber zählreiche weitere Steroid-3-sulfamate unter den Umfang der allgemeinen Formel. Als Wirkmechanismus für die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammen- setzungen bzw. für die darin enthaltenen Steroid-3-sulfamate (bevorzugt mit mindestens einem 2-Alkoxysubstituenten) werden 1) Hemmung der Glucoseaufnahme in Tumorzellen, 2) Hemmung der Tumorangiogenese, 3) Abbau der Mikrotubuli ; 4) Induzierung von Apoptose beschrieben. WO 00/76487 betrifft Stoffe, die die TNFa-induzierte Aromatase-Aktivität hemmen. Als solche werden 2- Alkoxyestron-3-sulfamate, bevorzugt 2-Methoxyestronsulfamat beansprucht.

WO 01/18028 beschreibt nicht-estrogene Estronsulfatase-inhibierende N-Acyl-18a- substituierte Steroid-3-sulfamate, wie z. B. 16a-Fluor-2-methoxy-18a-homoestradiol- (N-acetylsulfamat) bzw. 16a-Fluor-2-methoxy-18a-homoestron- (N-acetylsulfamat).

,.

In Cancer 2000, 85, 983-994 werden die 2-Methoxyestradiol-, Docetaxel-und Paclitaxel-induzierte Apoptose in Hepatomazellen und deren Korrelation mit reaktiven Sauerstoffspezien verglichen.

Potter et. al. Int. J. Cancer 2000, 85,584-589 untersuchen die Wirkung von 2- Methoxyestronsulfamat im Vergleich zu 2-Methoxyestron auf das Wachstum von Brustkrebszellen und induzierte Mammatumoren und finden, dass 2- Methoxyestronsulfamat ein beachtliches therapeutisches Potential zur Behandlung von Brustkrebs aufweist.

Potter et al. Molecular and Cellular Endocrinology 2000, 160, 61-66 untersuchen die Hemmung der Deoxyglucoseaufnahme in MCF-7-Brustkrebszellen durch 2-Methoxy- estron und 2-Methoxyestron-3-sulfamat, die die Glucoseaufnahme um 25 bis 49% bei 10, uM (ebenso 2-Methoxyestradiol und 2-Methoxyestron) hemmen, und folgern, dass die Verbindungen durch ihr Vermögen die Glucoseaufnahme zu hemmen, therapeutisches Potential zur Hemmung von Brustkrebs haben könnten.

Potter et. al. Cancer Research 2000, 60,5441-5450 beschreibt 2-Methoxyestron- sulfamat und 2-Ethoxyestronsulfamat als neue antimikrotubullenaktive Verbindungen, die in vitro Antikrebsaktivität in Mammakarzinomzellen aufwiesen, und daher auch eventuell in vivo aktiv sein könnten. In J. Steroid Biochem. and Mol. Biol. 1999,69, 227-238 wird berichtet, dass die Hemmung der Steroidsulfatase-Aktivität ein wichtiger Ansatzpunkt bei der Behandlung von hormönabhängigen Mammakarzinomen ist.

Explizit werden 2-Methoxyestronsulfamat, 17-Deoxyestronsulfamat und Estronsulfamat aufgeführt. Mono-bzw. bicyclische, nicht steroidale Sulfamate hemmen zwar die Steroidsulfatase, jedoch nicht so effektiv wie die entsprechenden Steroidderivate.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, weitere Verbindungen zur Verfügung zu stellen, die die Tubulinpolymerisation wirksam hemmen.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung wird erfindungsgemäß durch die Verwendung von 2-substituierten 18a-homoestra-1,3, 5 (10)-trien-3-yl sulfamate der allgemeinen Formel I zur Herstellung eines Arzneimittels, insbesondere zur Behandlung von Tumorerkrankungen, die sich durch die Hemmung der Tubulinpolymerisation positiv beeinflussen lassen, gelöst :

worin R2 C1-C5-Alkyl, C1-C5-Alkoxy oder einen Rest -O-CnFmHo, wobei n=1,2, 3,4, 5 oder 6, m>1 und m+o=2n+1 ist, R14 und R15 jeweils Wasserstoff oder zusammen eine Methylengruppe oder eine zusätzliche Bindung, R16 Wasserstoff, R17 Wasserstoff, Hydroxy, C1-C5-Ålkyl oder Ci-C5-Alkoxy oder einen Rest -CnFmHo, wobei n=1,2, 3,4, 5 oder 6, m>1 und m+o=2n+1 oder eine Gruppe SO3NHX, X Wasserstoff, C1-C5-Alkyl oder C1-C5-Acyl bedeuten, wobei im B-und D-Ring des Steroidgerüstes die gestrichelten Linien zusätzlich bis zu zwei Doppelbindungen sein können, sowie ihre pharmazeutisch annehmbaren Salze.

Es wurde festgestellt, dass die erfindungsgemäßen 2-substituierten 18a homoestra- 1, 3,5 (10)-trien-3-yl sulfamate in vitro die Tubulinpolymerisation überraschend stärker hemmen als 2-Methoxyestradiol selbst. Die erfindungsgemäßen Verbindungen hemmen die Proliferation von Tumorzellen und zeigen auch in vivo Antitumorwirkung.

Zudem weisen die genannten Verbindungen eine gute orale Bioverfügbarkeit auf.

Unter Alkylresten sind gerad-oder verzweigtkettige, gesättigte oder ungesättigte Alkylreste zu verstehen. Als Vertreter für gerad-oder verzweigtkettige Alkylgruppen mit 1-5 Kohlenstoffatomen sind beispielsweise Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl,

Isobutyl, tert.-Butyl, Pentyl, 1-Ethylpropyl, 1-Methylbutyl, 1, 1-Dimethylpropyl, 2-Methyl- butyl, 1,2-Dimethylpropyl, 3-Methylbutyl, 2,2-Dimethylpropyl zu nennen.

Für ungesättigte Alkylreste stehen beisielsweise Allyl, Vinyl, Propenyl, Butenyl, aber auch Ethinyl, Propinyl oder Butinyl.

Acylreste bedeuten beispielsweise Formyl, Acetyl, Propionyl, Butyryl, iso-Butyryl oder Valeryl.

Für einen C1-C5-Alkoxyrest kann eine Methoxy-, Ethoxy-, n-Propoxy-, iso-Propoxy-, n- , iso-, tert. -Butoxy-, oder Pentoxygruppe stehen, wobei diese fluoriert sein können.

Bevorzugt gemäß vorliegender Erfindung ist die Verwendung solcher Verbindungen der allgemeinen Formel. 1, in denen : R2 Methyl, Ethyl, Methoxy, Ethoxy, 2,2, 2-Trifluorethoxy, R14 und R15 jeweils H oder zusammen eine Methylengruppe R16 Wasserstoff, R17 Wasserstoff, Hydroxy, OC1-C5-Alkyl oder einen Rest - CnFmHo, wobei n=1,2, 3,4, 5 oder 6, m>1 und m+o=2n+1 oder eine Gruppe SO3NHX, X Wasserstoff, Methyl, Acetyl, Propionyl, Butyryl darstellen, wobei im B-und C-Ring des Steroidgerüstes die gestrichelten Linien eine 8,9-oder eine 16, 17-Doppelbindung bedeuten können.

Die Verwendung nachstehend genannter Verbindungen ist besonders bevorzugt : 1.17ß-Hydroxy-2-methoxy-18a-homoestra-1, 3,5 (10), 14-tetraen-3-yl sulfamat 2.17a-Hydroxy-2-methoxy-18a-homoestra-1, 3,5 (10), 14-tetraen-3-yl sulfamat 3.2, 17ß-Dimethoxy-18a-homoestra-1, 3,5 (10), 14-tetraen-3-yl sulfamat 4.2, 17a-Dimethoxy-18a-homoestra-1, 3,5 (10), 14-tetraen-3-yl sulfamat

5. 2-Methoxy-18a-homoestra-1, 3,5 (10), 14-tetraen-3-yl sulfamat 6.17ß-Hydroxy-2-methoxy-18a-homoestra-1, 3, 5 (10)-trien-3-yl sulfamat (1) 7.17ß-Hydroxy-2-methoxy-18a-homoestra-1, 3,5 (10)-trien-3-yl (N-acetyl)- sulfamat 8. 17a-Hydroxy-2-methoxy-18a-homoestra-1, 3,5 (10)-trien-3-yl sulfamat 9. 2-Ethoxy-17ß-hydroxy-18a-homoestra-1, 3,5 (10)-trien-3-yl sulfamat (2) 10.2-Ethoxy-17ß-hydroxy-18a-homoestra-1, 3,5 (10)-trien-3-yl (N-acetyl)-sulfamat 11.2-Ethoxy-17a-hydroxy-18a-homoestra-1, 3,5 (10)-trien-3-yl sulfamat, 12.2, 17ß-Dimethoxy-18a-homoestra-1,3, 5 (10)-trien-3-yl sulfamat (5) 13.17ß-Ethoxy-2-methoxy-18a-homoestra-1, 3,5 (10)-trien-3-yl sulfamat 14. 2-Methoxy-17ß- (1-propyloxy)-18a-homoestra-1, 3,5 (10)-trien-3-yl sulfamat 15. 2-Methoxy-18a-homoestra-1, 3,5 (10)-trien-3-yl sulfamat (4) 16. 2-Methoxy-18a-homoestra-1, 3,5 (10)-trien-3-yl (N-acetyl)-sulfamat 17. 2-Methoxy-18a-homoestra-1, 3,5 (10), 16-tetraen-3-yl sulfamat 18. 2-Methoxy-18a-homoestra-1, 3,5 (10), 16-tetraen-3-yl (N-acetyl)-sulfamat 19. 2-Ethyl-17ß-methoxy-18a-homoestra-1, 3,5 (10)-trien-3-yl sulfamat 20. 17ß-Ethoxy-2-ethyl-18a-homoestra-1, 3,5 (10)-trien-3-yl sulfamat 21. 2-Methoxy-18a-homoestra-1, 3,5 (10) -trien-3, 17ß-diyl bissulfamat 22. 2-Methoxy-18a-homoestra-1, 3, 5 (10)-trien-3, 17ß-diyl bis- (N-acetyl)-sulfamat 23. 2-Ethoxy-18a-homoestra-1, 3,5 (10)-trien-3, 1 i, 8-diy bissulfamat (3) 24.2-Ethoxy-18a-homoestra-1, 3,5 (10) -trien-3, 17ß-diyl bis- (N-acetyl)-sulfamat 25. 2-Ethyl-18a-homoestra-1, 3,5 (10)-trien-3, 17ß-diyl bissulfamat (6) 26. 2-Ethyl-18a-homoestra-1, 3,5 (10) -trien-3, 17ß-diyl bis- (N-acetyl)-sulfamat Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind zudem Verbindungen der allgemeinen Formel 1.

worin R2 9-Alkyl, Ci-C5-Alkoxy oder ein Rest wobei n=1,2, 3,4, 5 oder 6, m>1 und m+o=2n+1 ist, R14 und R15 jeweils Wasserstoff oder zusammen eine Methylengruppe R16 Wasserstoff, R17 Wasserstoff, Hydroxy, C1-C5-Alkyl oder C1-C5-Alkoxy, oder einen Rest -CnF. H., wobei n=1,2, 3,4, 5 oder 6, m>1 und m+o=2n+1 X Wasserstoff, C1-C5-Alkyl bedeuten, wobei im B-und D-Ring des Steroidgerüstes die gestrichelten Linien zusätzlich bis zu zwei Doppelbindungen sein können. sowie ihre pharmazeutisch annehmbaren Salze.

Unter Alkylresten, ungesättigten Alkylresten und C1-C5-Alkoxyresten, die fluoriert sein können, sind die gleichen Reste wie bereits zur erfindungsgemäßen Verwendung ausgeführt zu verstehen.

Bevorzugt sind 2-substituierte 18a-Homoestra-1,3, 5 (10)-trien-3-yl sulfamate der allgemeinen Formel 1, in denen :

R2 Methyl, Ethyl, Methoxy, Ethoxy oder 2,2, 2-Trifluorethoxy, R14 und R15 jeweils H oder zusammen eine Methylengruppe R16 Wasserstoff, R17 Wasserstoff, Hydroxy oder OC1-C5-Alkyl, X Wasserstoff, Methyl, darstellen, wobei im B-und C-Ring des Steroidgerüstes die gestrichelten Linien eine 8,9-oder eine 16, 17-Doppelbindung bedeuten können.

Die nachstehend genannten Verbindungen sind erfindungsgemäß besonders bevorzugt : 1. 17ß-Hydroxy-2-methoxy-18a-homoestra-1, 3,5 (10)-trien-3-yl sulfamat 2. 17a-Hydroxy-2-methoxy-18a-homoestra-1, 3,5 (10)-trien-3-yl sulfamat 3.2-Ethoxy-17ß-hydroxy-18a-homoestra-1, 3,5 (10)-trien-3-yl sulfamat 4.2-Ethoxy-17a-hydroxy-18a-homoestra-1, 3,5 (10)-trien-3-yl sulfamat 5.2, 17ß-Dimethoxy-18a-homoestra-1,3, 5 (10)-trien-3-yl sulfamat 6.17ß-Ethoxy-2-methoxy-18a-homoestra-1, 3,5 (10)-trien-3-yl sulfamat 7. 2-Methoxy-17ß- (1-propyloxy)-18a-homoestra-1, 3,5 (10)-trien-3-yl sulfamat 8. 2-Methoxy-18a-homoestra-1, 3,5 (10)-trien-3-yl sulfamat 9. 2-Methoxy-18a-homoestra-1, 3,5 (10), 16-tetraen-3-yl sulfamat 10. 2-Ethyl-17ß-methoxy-18a-homoestra-1, 3,5 (10)-trien-3-yl sulfamat 11. 17ß-Ethoxy-2-ethyl-18a-homoestra-1, 3,5 (10)-trien-3-yl sulfamat Pharmakologische Daten 1. Hemmung der Tubulinpolymerisation Die erfindungsgemäßen Verbindungen wurden in verschiedenen Modellen getestet.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen der allgemeinen Formel I zeichnen sich dadurch aus, dass sie die Tubulinpolymerisation stärker hemmen als 2- Methoxyestradiol. Die in vitro Testung der Tubulinpolymerisationsbeeinflussung wurde folgendermaßen durchgeführt : Mikrotubuläres Protein wurde nach Shelanski et. al. (Shelanski et. al. Proc. Natl.

Acad. Sci. USA 1973,70, 765-8) über zyklische Assemblierung/Deassemblierung aus Schweinehirn gereinigt. Das verwendete Buffersystem hatte folgende Zusammen- setzung : 20 mM PIPES (1, 4-Piperazine-diethane-sulfonsäure, pKa 6,8), 80 mM NaCI, 0,5 mM MgCh, 1 mM EGTA (Ethylenglykol-bis- (2-aminoethyle)-tetraessigsäure).

Für die Wirkstofftestung wurden Proteinkonzentrationen von 1 mg/ml (ca. 10-5 mM Tubulin) eingesetzt. Die Proteinbestimmung erfolgte nach der Lowry-Methode (Lowry <BR> <BR> <BR> et al. J. Biol. Chem. 1951,193, 265-75) mit Rinderserumalbumin als Standard. Die Assemblierung von Mikrotubuli erfolgte in Gegenwart von 0. 25 mM GTP und Erwärmen der Proben auf 37 °C.

Die Mikrotubulusbildung wurde mit Hilfe der Turbidimetrie bei einer Wellenlänge von 340 nm geprüft. Der Gleichgewichtszustand, bei dem das mikrotubuläre Protein keinen Zuwachs der Assemblatkonzentration (entsprechend der Mikrotubuluskonzentration) und der Trübungswert keinen Anstieg mehr aufweist, wird typischerweise nach 20 Minuten erreicht.

Die Testung der Wirkstoffe erfolgte durch deren Zugabe am Anfang der Assemblierung oder im Gleichgewichtszustand. Abweichungen der Trübungskurven von der Kontrolle charakterisieren ihre Wirksamkeit. Zur Wirkungskontrolle und Bewertung der Trübungsmesswerte wurde stets eine Transmissionselektronenmikroskopische Untersuchung (CEM 902 A, Zeiss/ Oberkochen) der Assemblate nach Negativfärbung mit 1 % igem wässrigen Uranylazetat ausgeführt.

Tab. 1. Verbindung Hemmung der Tubulin polymerisation IC50 [µM] 2-Methoxyestradiol 2,70 (1) 0, 50 (4) 1,80

2. Hemmung der Zellproliferation Die erfindungsgemäßen Verbindungen zeichnen sich durch eine potente Hemmung der Zellproliferation aus.

Zellkulturen der folgenden Zellinie wurden in 96well Mikrotiterplatten angelegt : 1. MaTu/ÄDR Multidrug-resistente humanen Brusttumorzellen (Epo GmbH Berlin), 5000 Zellen/Well.

2. HCT116 humane Kolontumorzelleri (ATCC CCL-247), 3000 Zellen/Well.

3. NCI-H460 humane nicht-kleinzelliges Lungenkarzinomzellen (ATCC HTB-177), 3000 Zellen/Well.

4. DU145 humane Prostatatumorzellen (ATCC HTB-81), 5000 Zellen/Well.

5. HMVEC humane primäre dermate mikrovaskuiäre Endotheizeiien, 7500 Zellen/Well.

Nach 24 stündiger Inkubation in einem Zellkulturbrutschrank bei 37°C wurden die Zellen einer Mikrotiterplatte mit Kristallviolett gefärbt (Referenzplatte), während die Zellen in den Testplatten für 4 Tage mit den Testsubstanzen in den Konzentrationen 0. 1-10 uM, sowie mit dem Lösungsmittel DMSO alleine (Lösungsmittelkontrolle), inkubiert wurden. Die Zellproliferation wurde durch Färbung der Zellen mit Kristallviolett bestimmt. Die Extinktion des Kristallvioletts wurde photometrisch bei 595 nm bestimmt. Die Prozentzahl der Änderung der Zellzahl in den Testplatten wurde nach Normalisation der Extinktionswerte auf die Referenzplatte (0%) und auf die Lösungsmittelkontrollen (100%) bestimmt. Die halbmaximale Inhibition des Zellwachstums (IC50) wurde als die Substanzkonzentration bestimmt, bei der 50% der Zellzahl der Lösungsmittelkontrollen vorhanden waren.

Tab. 2 Verbindung Hemmung der Zellproliferation IC50 [µM] NCI-H460 HCT116 DU145 MaTu/AD HMVEC R 0,004 0,004 0,004 0,4 0,004 Taxol 1.8 1.1 1.9 0.2 2. 2 1. 8 1.1 1.9 0.2 2.2 2-Methoxyestradiol 0. 5 0.6 0.6 0.45 0.6 (4) <0.1 <0.1 0.15 <0.1 <0.1 1) 0. 3 0.4 0.9 0.1 0.5 (1) 0. 3 0.4 0.9 0.1 0.5 (2) 0.13 <0.1 0.19 <0.1 <0.1 5) 0.18 0.18 0.18 0.1 <0.1 (6)

Dosierung Im allgemeinen sind zufriedenstellende Resultate zu erwarten, wenn die täglichen Dosen einen Bereich von 5 pg bis 50 mg der erfindungsgemäßen Verbindung pro kg Körpergewicht umfassen. Bei größeren Säugetieren, beispielsweise dem Menschen, liegt eine empfohlene tägliche Dosis im Bereich von 10 pg bis 30 mg pro kg Körper- gewicht.

Geeignete Dosierungen für die erfindungsgemäßen Verbindungen betragen von 0,005 bis 50 mg pro Tag pro kg Körpergewicht, je nach Alter und Konstitution des Patienten, wobei die notwendige Tagesdosis durch Einmal-oder Mehrfachabgabe appliziert werden kann.

Aufgrund der besonderen Depotwirkung der Estrogen-Sulfamate können die erfin- dungsgemäßen Verbindungen aber auch in größeren Abständen als einmal am Tag verabreicht werden.

Die Formulierung der pharmazeutischen Präparate auf Basis der neuen Verbindungen erfolgt in an sich bekannter Weise, indem man den Wirkstoff mit den in der Galenik gebräuchlichen Trägersubstanzen, Füllstoffen, Zerfallsbeeinflussern, Bindemitteln, Feuchthaitemitteln, Gleitmitteln, Absorptionsmitteln, Verdünnungsmitteln, Geschmackskorrigentien, Färbemitteln usw. verarbeitet und in die gewünschte Applikationsform überführt. Dabei ist auf Remington's Pharmaceutical Science, 15th ed. Mack Publishing Company, East Pennsylvania (1980) hinzuweisen.

Für die orale Apvplikation kommen insbesondere Tabletten, Dragees, Kapseln, Pillen, Pulver, Granulate, Pastillen, Suspensionen, Emulsionen oder Lösungen in Frage.

Für die parenterale Applikation sind Injektion-und Infusionszubereitungen möglich.

Für die intraartikulären Injektion können entsprechend zubereitete Kristallsuspen- sionen verwendet werden.

Für die intramuskuläre Injektion können wässrige und ölige Injektionslösungen oder Suspensionen und entsprechende Depotpräparationen Verwendung finden.

Für die rektale Applikation können die neuen Verbindungen in Form von Suppositorien, Kapseln, Lösungen (z. B. in Form von Klysmen) und Salben sowohl zur systemischen als auch zur lokalen Therapie verwendet werden.

Zur pulmonalen Applikation der neuen Verbindungen können diese in Form von Aerosolen und Inhalten verwendet werden.

Für die topische Auftragung sind Formulierungen in Gele, Salben, Fettsalben, Cremes, Pasten, Puder, Milch und Tinkturen möglich. Die Dosierung der Verbindungen der allgemeinen Formel I sollte in diesen Zubereitungen 0,01%-20% betragen um eine ausreichende pharmakologische Wirkung zu erzielen.

Die vorliegende Erfindung umfasst die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen der allgemeinen Formel i zur Herstellung eines Arzneimittels insbesondere zur Behandlung von Tumorerkrankungen, die sich durch die Hemmung der Tubulinpolymerisation positiv beeinflussen lassen.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen der allgemeinen Formel I werden bevorzugt verwendet zur Herstellung eines Arzneimittels, insbesondere zur Behandlung von Tumorerkrankungen der männlichen und weiblichen Keimdrüsen, männlichen und, weiblichen Sexualorgane einschließlich der Brustdrüsen, insbesondere von Prostatakarzinomen oder Mammakarzinom.

Ferner betrifft die vorliegende Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen, die mindestens eine erfindungsgemäß besonders bevorzugte Verbindung, gegebenenfalls in Form eines pharmazeutisch/pharmakologisch verträglichen Salzes, ohne oder zusammen mit pharmazeutisch verträglichen Hilfs-und/oder Trägerstoffen enthalten.

Diese pharmazeutischen Zusammensetzungen und Arzneimittel können zur oralen, rektalen, vaginale, subkutanen, perkutanen, intravenösen oder-intramuskulären Applikation vorgesehen sein. Sie enthalten neben üblichen Träger-und/oder Verdün- nungsmitteln mindestens eine erfindungsgemäß besonders bevorzugte Verbindung.

Die Arzneimittel der Erfindung werden mit den üblichen festen oder flüssigen Träger- stoffen oder Verdünnungsmitteln und den üblicherweise verwendeten pharma- zeutisch-technischen Hilfsstoffen entsprechend der gewünschten Applikationsart mit einer geeigneten Dosierung in bekannter Weise hergestellt. Die bevorzugten Zubereitungen bestehen in einer Darreichungsform, die zur oralen Applikation geeignet ist. Solche Darreichungsformen sind beispielsweise Tabletten, Filmtabletten, Dragees, Kapseln, Pillen, Pulver, Lösungen oder Suspensionen oder auch Depotformen.

Die pharmazeutischen Zusammensetzungen, die mindestens eine der erfindungsgemäßen Verbindungen enthalten, werden bevorzugt oral appliziert.

Es kommen auch parenterale Zubereitungen wie Injektionslösungen in Betracht.

Weiterhin seien als Zubereitungen beispielsweise auch Suppositorien und Mitte) zur vaginalen Anwendung genannt.

Entsprechende Tabletten können beispielsweise durch Mischen des Wirkstoffs mit bekannten Hilfsstoffen, beispielsweise inerten Verdünnungsmitteln wie Dextrose, Zucker, Sorbit, Mannit, Polyvinylpyrrolidon, Sprengmitteln wie Maisstärke oder Algin- säure, Bindemitteln wie Stärke oder Gelantine"Gleitmitteln wie Magnesiumstearat oder Talk und/oder Mitteln zur Erzielung eines Depoteffektes wie Carboxylpoly- methylen, Carboxylmethylcellulose, Celluloseacetatphthalat oder Polyvinylacetat, erhalten werden. Die Tabletten können auch aus mehreren Schichten bestehen.

Entsprechend können Dragees durch Überziehen von analog den Tabletten herge- stellten Kernen mit üblicherweise in Drageeüberzügen verwendeten Mitteln, beispielsweise Polyvinylpyrrolidon oder Schellack, Gummiarabicum, Talk, Titanoxid oder Zucker, hergestellt werden. Dabei kann auch die Drageehülle aus mehreren Schichten bestehen, wobei die oben bei den Tabletten erwähnten Hilfsstoffe verwendet werden können.

Lösungen oder Suspensionen mit den erfindungsgemäßen Verbindungen der allgemeinen Formel I können zusätzlich geschmacksverbessernde Mittel wie Saccharin, Cyclamat oder Zucker sowie z. B. Aromastoffe wie Vanillin oder Orangenextrakt enthalten. Sie können außerdem Suspendierhilfsstoffe wie

Natriumcarboxymethylcellulose oder Konservierungsstoffe wie p-Hydroxybenzoate enthalten.

Die Verbindungen der allgemeinen Formel I enthaltende Kapseln können beispielsweise hergestellt werden, indem man die Verbindung (en) der allgemeinen Formel I mit einem inerten Träger wie Milchzucker oder Sorbit mischt und in Gelatinekapseln einkapselt.

Geeignete Suppositorien lassen sich beispielsweise durch Vermischen mit dafür vorgesehenen Trägermitteln wie Neutralfetten oder Polyethylenglykol bzw. deren Derivaten herstellen.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können zur Therapie von Prostatakarzinomen mit einem oder mehreren der folgenden Wirkstoffen kombiniert verabreicht werden : 1) Antiandrogene wie CPA, Flutamid, Casodex etc.

2) Gonadrotrophormon (GnRH) Agonisten 3) 5a-Reduktase Hemmer wie Finasterid 4) Zytostatika 5) VEGF-Kinase-Inhibitoren 6) Antigestagene 7) Antiestrogene 8) Antisense Oligonukleotide 9) EGF-Antikörper 10) Estrogene Darüber hinaus können die erfindungsgemäßen Verbindungen der allgemeinen Formel I zur Therapie und Prophylaxe weiterer oben nicht genannter Krankheitszustände eingesetzt werden.

Die Erfindung umfasst auch die Herstellung der Verbindungen nach der allgemeinen Formel i.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen der allgemeinen Formel 1 lassen sich wie nachstehend beschrieben herstellen :

Allgemeiner Syntheseteil Die Funktionalisierung des C-Atoms 2 eines Estra-1,3, 5 (10)-trien-17-on-derivates erfolgt vorzugsweise durch Friedel-Crafts-Acylierung wie in der Literatur beschrieben (T. Nambarä et al. Chem. Pharm. Bull. 1979, 1S, 474-480).

Nach Wechsel der Schutzgruppe in Position 3 wird durch Baeyer-Villiger-Oxidation ein 2-Carboxy-estra-1,3, 5 (10)-trien-17-on generiert (M. B. Smith, J. March, March's Advanced Organic Chemistry, 5. Edition, Wiley Sons 2001,1417-1418 und dort zit.

Lit ;). Der Ester wird verseift und mit dem entsprechenden Alkylhalogenid unter basischen Bedingungen in einen 2-Alkylether überführt. Alternativ kann nun das 17- Keton wie bekannt reduziert und verethert werden. Die Spaltung der Schutzgruppe in Position 3 erfolgt wie in der Literatur beschrieben (T. W. Greene, P. G. M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, Wiley & Sons, 1999,249-275). Dieses Verfahren oder andere aus der Literatur bekannte (P. N. Rao, J. W. Cessac, Steroids 2002,67, 1065-1070 und dort zit. Lit. ) sind entsprechend auf die 18a-Homoderivate anwendbar.

Die vorzugsweise durch Friedel-Crafts-Acylierung erhaltenen 2-Acylderivate können durch Reduktion mit Natriumborhydrid und anschließender Hydrierung in die entsprechenden 2-Alkylderivate übergeführt werden.

Die 2-Hydroxylierung, ausgehend von Verbindungen der allgemeinen Formel II (R2 = H),

bei denen R14 und Ris zusammen eine Methylenbrücke bilden bzw. welche zusätzliche Doppelbindungen im Steroidgerüst besitzen, wird durch ortho-Metalierung realisiert, wobei für R3 als ortho-dirigierende Schutzgrüppe vorzugsweise eine Ether- (z. B. H. E. Paaren, S. R. Duff, US6448419 und dort zit. Lit. ) oder Carbamat- schutzgruppe (V. Snieckus, Chem. Rev. 1990,90, 879-933) verwendet wird. Die elektrophile Substitution erfolgt nach 2-Lithiierung mit Trialkylborat und anschließender basischer Oxidation mit Wasserstoffperoxid. Die selektiv erhaltene 2- Hydroxygruppe kann anschließend in bekannter Weise (Z. Wang, M. Cushman, Synth. Commun. 1998,28, 4431) zur 2-Alkoxyverbindung umgewandelt und entschützt werden. Anschließende Oppenauer-Oxidation (C. Djerassi, Org. React.

1951,6, 207, S. Schwarz et al. Pharmazie 2001, 56,843-849) liefert die 17- Ketoverbindungen, welche weiter funktionalisiert und wie bekannt zu den Sulfamate umgesetzt werden können.

Ausgehend von den 2-funktionalisierten 17-Keto-Derivaten kann die 17- Ketofunktion durch eine Wolff-Kishner-Reduktion entfernt (z. B. R. H. Peters et. al., J. Med. Chem. 1989,32, 1642 ; G. E. Agoston et al. WO 02/42319) und anschließend in 3-Position sulfamoyliert werden.

Die vorliegende Erfindung wird anhand der nachfolgenden Beispiele näher erläutert, ohne sie darauf einzuschränken :

Herstellungsverfahren Allgemeine Synthesevorschrift 1 zur Herstellung von Sulfamate Es werden ein Äquivalent eines Estra-1,3, 5 (10)-trien-Derivates in Methylenchlorid unter Rühren gelöst bzw. suspendiert und mit 5 Äquivalenten 2, 6-Di-tert.-butylpyridin versetzt. Anschließend werden unter Argon 10 Äquivalente Sulfamoylchlorid zugegeben und bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösung wird bis zum vollständigen Umsatz gerührt (DC-Kontrolle, 1-5h). und dann mit Wasser versetzt Bei säureempfindlichen Verbindungen wird vorher mit rund 10 Äquivalenten Triethylamin gepuffert. Die wässrige Phase wird mehrmals mit Dichlormethan oder Essigester extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden über Natriumsulfat getrocknet und am Vakuum eingeengt und anschließend flashchromatographisch gereinigt ; Allgemeine Synthesevorschrift 2. zur Acylierung von Sulfamate Ein Äquivalent des Estra-1,3, 5 (10)-trien-Sulfamates bzw. Bissulfamates werden in Pyridin gelöst und unter Eiskühlung (0 bis 5°C) mit 5 Äquivalenten Anhydrid versetzt.

Es wird 1h bei Raumtemperatur weitergerührt und dann mit Wasser versetzt. Die wässrige Phase wird mehrmals mit Dichlormethan oder Essigester extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden mit 6N Salzsäure und anschließend mit Wasser und Natriumchloridlösung gewaschen. Danach wird über Natriumsulfat getrocknet und am Vakuum eingeengt und anschließend flashchromatographisch gereinigt.

Beispiel 1 17ß-Hydroxy-2-methoxy-18a-homoestra-1, 3, 5 (10)-trien-3-yl sulfamat (1) : 400 mg 2-Methoxy-17-oxo-18a-homoestra-1, 3,5 (10)-trien-3-yl sulfamat wurden in 5 mL Methanol und 5 mL Tetrahydrofuran gelöst und bei Raumtemperatur mit zwei Spatelspitzen Natriumborhydrid versetzt. Nach 2h wurde mit 1N Salzsäure angesäuert und am Rotationsverdampfer eingeengt. Der Rückstand wurde mit Wasser versetzt und mit Essigester extrahiert (3x). Die vereinigten organischen Phasen wurden mit ges. Natriumchloridlsg. gewaschen, getrocknet und am

Rotationsverdampfer eingeengt. Man erhielt 425 mg (quant. ) 17ß-Hydroxy-2-methoxy- 18a-homoestra-1,3, 5 (10)-trien-3-yl sulfamat (1) als farblosen Schaum.

'H-NMR (DMSO-d6) : 6 = 0.93 (t, J = 7. 4 Hz, 3H ; 18-CH3), 2.70-2. 74 (m, 2H ; 6-CH2), 3.60 (m, 1 H ; 17a-H), 3.76 (s, 3H ; 2-OCH3), 4.54 (d, J = 4.3 Hz, 1 H ; OH), 6.96 (s, 2H ; 1-H, 4-H), 7.79 (br s, 2H; NH2).

Beispiel 2 2-Ethoxy-17ß-hydroxy-18a-homoestra-1, 3,5 (10)-trien-3-yl sulfamat (2) : 400 mg 2-Ethoxy-17-oxo-18a-homoestra-1, 3,5 (10)-trien-3-yl sulfamat wurden in 5 mL Methanol und 5 mL Tetrahydrofuran gelöst und bei Raumtemperatur mit zwei Spatelspitzen Natriumborhydrid versetzt. Nach 2h wurde mit 1N Salzsäure angesäuert und am Rotationsverdampfer eingeengt. Der Rückstand wurde mit Wasser versetzt und mit Essigester extrahiert (3x). Die vereinigten organischen Phasen wurden mit ges. Natriumchloridlsg. gewaschen, getrocknet und am Rotationsverdampfer eingeengt. Man erhält 387 mg (96%) 2-Ethoxy-17ß-hydroxy- 18a-homoestra-1,3, 5 (10)-trien-3-yl sulfamat (2) als farblosen Schaum.

1H-NMR (DMSO-d6) : 8 = 0.93 (t, J = 7.2 Hz, 3H ; 18-CH3), 1. 30 (t, J = 7.0 Hz, 3H ; 2- CH3), 2.71-2. 73 (m, 2H ; 6-CH2), 3.59-3. 62 (m, 1H ; 17a-H), 4.01-4. 06 (m, 2H ; 2- OCH2), 4.53 (d, J = 4. 3 Hz, 1H ; OH), 6.95, 6.96 (2s, 2H ; 1-H, 4-H), 7.76 (br s, 2H ; NH2).

Beispiel 3 2-Ethoxy-18a-homoestra-1, 3,5 (10) -trien-3, 17ß-diyl bissulfamat (3) : 144 mg 2, 17ß-Dihydroxy-2-ethoxy-18a-homoestra-1, 3,5 (10) -trien wurden nach der allgemeinen Synthese-vorschrift 1 zum Produkt umgesetzt und anschließend durch Flashchromatographie (Toluol/Essigester = 3 : 1) gereinigt. Es wurden 125 mg (59%) 2-Ethoxy-18a-homoestra-1,3, 5 (10)-trien-3, 17ß-diyl bissulfamat (3) als amorpher Feststoff erhalten.

1H-NMR (DMSO-d6) : 8 = 0.92 (t, J = 7.0 Hz, 3H ; 18-CH3), 2.71-2. 76 (m, 2H ; 6-CH2), 4.04 (q, 2H ; 2-OCH2), 4.36 (t, 3J= 8.0 Hz, 1H ; 17aa-H), 6.96, 6.97 (2 s, 2H ; 1-H, 4-H), 7.39 (s, 2H ; NH2), 7.79 (s, 2H ; NH2),.

Beispiel 4 2-Methoxy-18a-homoestra-1, 3,5 (10)-trien-3-yl sulfamat (4) : 3-Hydroxy-2-methoxy-18a-homoestra-1, 3,5 (10)-trien wurde und nach der allgemeinen Syhthesevorschrift 1 zum Produkt umgesetzt und anschließend durch Flashchromatographie (Toluol/Essigester = 20 : 1 # 10 : 1) gereinigt. Man erhielt 2- Methoxy-18a-homoestra-1,3, 5 (10)-trien-3-yl sulfamat (4) in 91% Ausbeute als farblose Kristalle.

1H-NMR (CDCI3) : 5 = 0. 81 (t, 3J = 7.4 Hz, 3H ; 18-CH3), 2.78-2. 81 (m, 2H ; 6-CH2), 3.86 (s, 3H ; 2-OCH3), 5.02 (s, 2H ; NH2), 6.92, 7.02 (2 s, 2H ; 1-H, 4-H).

Beispiel 5 2, 17ß-Dimethoxy-18a-homoestra-1, 3,5 (10)-trien-3-yl sulfamat 17. 00 (s, 1H), 6.90 (s, 1H), 5.14 (s, 2H), 3.86 (s, 3H), 3.36 (m, 4H), 2.78 (m, 2H), 2.44 (m, 1H), 2.20 (m, 2H), '2. 08 (m, 1H), 1.87 (m, 1H), 1.62 (m, 2H), 1.5-1. 1 (m, 8H), 0.98 (m, 3H) Beispiel 6 2-Ethyl-18a-homoestra-1, 3,5 (10)-trien-3, 17ß-diyl sulfamat 17. 92 (s, 2H), 7.38 (s, 2H), 7.20 (s, 1H), 7.00 (s, 1H), 4.36 (s, 1H), 2.80 (m, 2H), 2.62 (m, 2H), 2.32 (m, 2H), 2.18 (m, 2H), 1.80 (m, 1H), 1.64 (m, 1H), 1.52-1. 10 (m, 12H), 0,92 (m, 3H)