Mikrotubuli sind Organellen, die in den meisten eukaryontischen Zellen vorkommen und dort eine Reihe von Funktionen wie Mitose, intrazelluläre Bewegungen, Zellwanderung und die Ausprägung der Zellform übernehmen. Mikrotubuli sind Polymere aus Tubulin, das seinerseits ein Dimer aus einer a-und einer ß-Einheit darstellt. Diese Heterodimere binden zwei Moleküle Guanosintriphosphat (GTP), wobei eines der GTPs fest gebunden und das andere austauschbar ist. Die Heterodimere polymerisieren in einer Kopf-Schwanz-Anordnung zu fadenförmigen Makromolekülen, den sogenannten Protofilamenten, die sich ihrerseits zu röhrenförmigen Organellen, den Mikrotubuli, zusammenlagern.

Mikrotubuli unterliegen einem ständigen Auf-und Abbau. Das Gleichgewicht zwischen Wachstum und Abbau hängt von der Verfügbarkeit neuer GTP-Tubulin- Untereinheiten und der Hydrolysegeschwindigkeit des zweiten gebundenen GTPs ab.

Am Plus-Ende werden neue Untereinheiten angebaut, wogegen am Minus-Ende Untereinheiten abdiffundieren.

Es ist bekannt, dass zytotoxische Substanzen wie Colchicin, Vinblastin, Vincristin, Taxol, Epothilone, Podophyllotoxin, Steganicin, Combretastatin und 2- Methoxyestradiol den Auf-bzw. Abbau der Mikrotubuli (Tubulinpolymerisation und Tubulindepolymerisation) beeinflussen und somit in der Lage sind, die Zellteilung phasenspezifisch zu beeinflussen. Dies betrifft vor allem schnell wachsende, neoplastische Zellen, deren Wachstum durch intrazelluläre Regelmechanismen weitgehend unbeeinflusst ist. Wirkstoffe dieser Art sind prinzipiell geeignet zur Behandlung maligner Tumoren.

Fotsis et. al. Nature 1994 368,237-239 berichten darüber, dass 2-Methoxyestradiol das Tumorwachstum und die Angiogenese hemmt.

Cushman et. a/. J. Med. Chem. 1995 38,2041-2049 untersuchen die zytotoxische sowie die tubulinpolymerisationshemmende Wirkung von 2-Methoxyestradiol, und berichten in J. Med. Chem. 1997, 40,2323-2334 darüber, dass 2-Alkoxy-6- oximinoestradiol-Derivate die Tubulinpolymerisation sowie die Bindung von [3H]- Cholchicin an Tubulin hemmen. Die hier genannten 2-Alkoxy-6-oximinoestradiol- Derivate zeigen bzgl. der Hemmung der Tubulinpolymerisation vergleichbare Aktivität wie 2-Ethoxyestradiol, das eine höhere Aktivität als 2-Methoxyestradiol aufweist.

Steroid-3-sulfamate werden andererseits in der Literatur als Hemmstoffe der Steroid- sulfatase beschrieben : W093/05064 betrifft u. a. Verbindungen der Formel R1 Ri R wobei R1 und R2 jeweils unabhängig Wasserstoff oder Methylgruppe bedeuten, mit der Maßgabe, dass mindestens einer der Reste R1 und R2 ein H-Atom ist, und der Rest-O-Polycyclus ein 3-Sterol ist, dessen Sulfatester durch ein Enzym mit Steroid- sulfatase-Aktivität hydrolisierbar ist. In der 2-Stellung des Steroidgerüstes spezifisch substituierte Verbindungen sind nicht explizit offenbart.

US 6,011, 024 beruht auf der WO 93/05064 und deckt z. B. alle Verbindungen ab, in denen die primäre Sulfamatfunktion an einem Sechsring gebunden ist. In der 2- Stellung des Steroidgerüstes spezifisch substituierte Verbindungen sind wiederum nicht explizit offenbart.

WO 96/05216 betrifft an C2-unsubstituierte Estra-1,3, 5 (10)-trien-Sulfamat-Derivate. WO 96/05217 betrifft pharmazeutische Zusammensetzungen enthaltend Wirkstoffe der allgemeinen Formel

worin R = NH2 ; R3 = C1-5-Alkoxygruppe, OH ; R8, R9 und R10 voneinander unabhängig = H, OH ; R9 und R° zusammen = O die Bedeutung haben können. Die darin offenbarten pharmazeutischen Zusammensetzungen können zur weiblichen Fertilitätskontrolle ; klimakterischen HRT und zur Behandlung gynäkologischer und andrologischer Krankheitsbilder, wie Mamma-bzw. Pröstatakarzinom verwendet werden.

WO 97/14712 betrifft Steroidsulfamat-Derivate der allgemeinen Formel worin R1 eine Acyl-, Alkoxywarbonyl-, Aminocarbonyl-, Sulfonyl-oder Sulfonamidyl- gruppe ; R2 ein Wasserstoff-oder ein Metallatom ; R7 und R3 unabhängig voneinander H, OH und C1-5-Alkoxy; R13, R12, R11 unabhängig voneinander H oder OH darstellen können.

WO 98/42729 betrifft 16-Halogensubstituierte-1, 3, 5-estratriene-3-monosulfamate sowie 3, 17ß-Bissulfamate, die an C2 alkoxysubstituiert sein können. Die 16-Halogen- substitution erhöht sowohl die Sulfatase-Hemmwirkung als auch die Estrogenität der entsprechenden Sulfamat-Derivate.

Die Einführung einer zu der 3-Sulfamat-zusätzlichen 17-Sulfamatfunktion setzt die Estrogenität drastisch herab.

WO 98/24802 betrifft Sulfamate, die die Estronsulfatase hemmen. 2-Methoxyestron- sulfamat wird explizit genannt. Als potentielles Therapiegebiet findet Mammakarzinom, nicht jedoch Prostatakarzinom in der Beschreibung Erwähnung.

Auch WO 99/33858 beschreibt Estronsulfatase-Inhibitoren der Formel worin R'und R'unabhängig voneinander H, Alkyl, oder zusammen Piperidin-, Morpholin, Piperazin ; R3 = H, CN, NO2, Co2R4 ; Rs = H, NO2, NR6R7 darstellen. In der Beschreibung ist als mögliches Therapiegebiet Mammakarzinom erwähnt.

In WO 99/33859 sowie in US°2002/0032180 werden anti-estrogene Verbindungen beschrieben, die zur Behandlung verschiedener, vor allem estrogen-abhängiger Erkrankungen geeignet sind. Bevorzugte Verbindungen weisen einen Estra-1,3, 5 (10)- trien-Grundkörper auf und sind an Position 11 und 17 substituiert. Besonders bevorzugt sind 17-Desoxy-estra-1,3, 5 (10) -triene. Unter die allgemeinen Formeln fallen auch 2-substituierte D-Homo-estra-1,3, 5 (10)-trien-3yl-sulfamate, jedoch werden entsprechende Verbindungen nicht explizit genannt.

WO 99/64013 betrifft eine pharmazeutische Zusammensetzung eines Sulfamat- Derivates mit einem Zellsignalmodifier (wie z. B. TNFa). 2-Methoxyestronsulfamat wird in dieser Kombination als bevorzugtes Sulfamat explizit beansprucht ; es fallen aber zahlreiche weitere Steroid-3-sulfamate unter den Umfang der allgemeinen Formel. Als Wirkmechanismus für die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammen- setzungen bzw. für die darin enthaltenen Steroid-3-sulfamate (bevorzugt mit mindestens einem 2-Alkoxysubstituenten) werden 1) Hemmung der Glucoseaufnahme in Tumorzellen, 2) Hemmung der Tumorangiogenese, 3) Abbau der Mikrotubuli ; 4) Induzierung von Apoptose beschrieben. WO 00/76487 betrifft Stoffe, die die TNFa-induzierte Aromatase-Aktivität hemmen. Als solche werden 2- Alkoxyestron-3-sulfamate, bevorzugt 2-Methoxyestronsulfamat beansprucht.

WO 01/18028 beschreibt nicht-estrogene Estronsulfatase-inhibierende N-Acyl-18a- substituierte Steroid-3-sulfamate, wie z. B. 16a-Fluor-2-methoxy-18a-homoestradiol- (N-acetylsulfamat) bzw. 16cc-Fluor-2-methoxy-18a-homoestron-(N-acetylsulfamat).

In Cancer 2000,85, 983-994 werden die 2-Methoxyestradiol-, Docetaxel-und Paclitaxel-induzierte Apoptose in Hepatomazellen und deren Korrelation mit reaktiven Sauerstoffspezien verglichen.

Potter et al. Int. J. Cancer 2000,85, 584-589 untersuchen die Wirkung von 2- Methoxyestronsulfamat im Vergleich zu 2-Methoxyestron auf das Wachstum von Brustkrebszellen und induzierte Mammatumoren und finden, dass 2- Methoxyestronsulfamat ein beachtliches therapeutisches Potential zur Behandlung von Brustkrebs aufweist.

Potter et. al. Molecular Cellular Endocrinology 2000, 160, 61-66 untersuchen die Hemmung der Deoxyglucoseaufnahme in MCF-7-Brustkrebszellen durch 2-Methoxy- estron und 2-Methoxyestron-3-sulfamat, die die Glucoseaufnahme um 25 bis 49% bei 10, uM (ebenso 2-Methoxyestradiol und 2-Methoxyestron) hemmen, und folger, dass die Verbindungen durch ihr Vermögen die Glucoseaufnahme zu hemmen, therapeutisches Potential zur Hemmung von Brustkrebs haben könnten.

Potter et. al. Cancer Research 2000, 60, 5441-5450 beschreibt 2-Methoxyestron- sulfamat und 2-Ethoxyestronsulfamat als neue antimikrotubullenaktive Verbindungen, die in vitro Antikrebsaktivität in Mammakarzinomzellen aufwiesen, und daher auch eventuell in vivo aktiv sein könnten. In J. Steroid Biochem. Mol Biol. 1999,69, 227- 238 wird berichtet, dass die Hemmung der Steroidsulfatase-Aktivität ein wichtiger Ansatzpunkt bei der Behandlung von hormonabhängigen Mammakarzinomen ist.

Explizit werden 2-Methoxyestronsulfamat, 17-Deoxyestronsulfamat und Estronsulfamat aufgeführt. Mono-bzw. bicyclische, nicht steroidale Sulfamate hemmen zwar die Steroidsulfatase, jedoch nicht so effektiv wie die entsprechenden Steroidderivate.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, weitere Verbindungen zur Verfügung zu stellen, die die Tubulinpolymerisation wirksam hemmen.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung wird erfindungsgemäß durch die Bereitstellung von 2-substituierten D-Homoestra-1,3, 5 (10)-trien-3-yl-sulfamaten der allgemeinen Formel I gelöst : worin R1 und R2 unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, eine Methyl-, Ci-C4- Acyl-oder eine Benzoylgruppe, R3 eine C1-C5-Alkyl, eine C1-C5-Alkyloxygruppe oder einen Rest -O-CnFmHo, wobei n=1,2, 3,4, 5 oder 6, m>1 und m+o=2n+1 ist, R6 und R7 unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, eine Hydroxy-, Amino- oder NHR3-Gruppe, wobei R8 eine Acetylgruppe ist, oder R6 und R7 zusammen ein Oxim NOH, R13 ein Wasserstoffatom oder eine Methylgruppe, Rlg ein Wasserstoff-oder Fluoratom, R20 ein Wasserstoff-oder Fluoratom öder eine Hydroxy-bzw. Ci-C5- Alkyloxybzw. C-C5-Alkylgruppe oder einen Rest-CnFmHo wobei n=1,2, 3,4, 5 oder 6, m>1 und m+o=2n+1 oder eine Gruppe 2 R'9 und R20 zusammen ein Sauerstoffatom, eine Methylen-, Difluormethylen-oder Monofluormethylengruppe oder ein Oxim NOR21, wobei R21 ein Wasserstoffatom oder eine C1-C5-Alkylgruppe ist, bedeuten,

sowie ihre pharmazeutisch annehmbaren Salze.

Weiterhin umfasst die vorliegende Erfindung die neuen Verbindungen als pharmazeutische Wirkstoffe, deren Herstellung, ihre therapeutische Anwendung und die pharmazeutischen Darreichungsformen, die die neuen Substanzen enthalten.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen der allgemeinen Formel (1)'oder deren pharmazeutisch annehmbare Salze können für die Herstellung eines Arzneimittels, insbesondere zur Behandlung von Tumorerkrankungen, die sich durch die Hemmung der Tubulinpolymerisation positiv beeinflussen lassen, eingesetzt werden.

Es wurde festgestellt, dass die erfindungsgemäßen 2-substituierten D-Homoestra- 1,3, 5 (10)-trien-3-yl sulfamate in vitro die Tubulinpolymerisation überraschend stärker hemmen als 2-Methoxyestradiol. Die erfindungsgemäßen Verbindungen hemmen die Proliferation von Tumorzellen und zeigen auch in vivo Antitumorwirkung.

Weiterhin verfügen die erfindungsgemäßen Verbindungen über eine bessere orale Bioverfügbarkeit als 2-Methoxyestradiol.

Bei den C-C5-Alkylgruppen für R3 oder R20 kann es sich durchweg um eine Methyl-, Ethyl-, n-Propyl-, iso-Propyl-, n-, iso-, oder tert.-Butyl, n-, iso-oder neo-Pentylgruppe handeln.

Für einen Acylrest R1 und R2 kann ein Formyl-, Acetyl-, Propionyl-, Butyryl-oder iso- Butyrylrest stehen.

Für den C1-C5-Alkoxyrest R3 oder R20 kann eine Methoxy-, Ethoxy-, n-Propoxy-, iso- Propoxy-, n-, iso-, oder tert.-Butoxy, n-, iso-oder neo-Pentoxygruppe stehen.

Bevorzugt gemäß vorliegender Erfindung sind Verbindungen der allgemeinen Formel I, in denen : R1 H, Methyl, Acetyl, Propionyl, Butyryl, insbesondere H R2 H, Acyl R3 Methyl, Ethyl, Methoxy, Ethoxy, 2,2, 2-Trifluorethoxy R6 und R7 beide Wasserstoff oder zusammen Oxim

R13 H oder Methyl R'9 H R20 H, OH, C1-C5-Alkyloxy darstellen, insbesondere H, OH ist.

Die nachstehend genannten Verbindungen sowie deren Verwendung sind erfindungsgemäß besonders bevorzugt : 1) 2-Methoxy-17a-oxo-17a-homoestra-1, 3,5 (10)-trien-3-yl sulfamat (1) 2) 2-Methoxy-17a-oxo-17a-homoestra-1, 3,5 (10)-trien-3-yl (N-acetyl)-sulfamat 3) 2-Methoxy-17a-homoestra-1, 3,5 (10)-trien-3-yl sulfamat (2) 4) 2-Methoxy-17a-homoestra-1, 3,5 (10)-trien-3-yl (N-acetyl)-sulfamat 5) 2-Methoxy-6-oximino-17a-homoestra-1, 3,5 (10)-trien-3-yl sulfamat 6) 2-Methoxy-6-(O-methyloximino)-17a-homoestra-1, 3,5 (10)-trien-3-yl sulfamat 7) 6a-Hydroxy-2-methoxy-17a-homoestra-1, 3,5 (10)-trien-3-yl sulfamat 8) 6a-Acetylamino-2-methoxy-17a-homoestra-1, 3,5 (10)-trien-3-yl sulfamat 9) 2-Methoxy-6-oxo-17a-homoestra-1,3, 5 (10)-trien-3-yl sulfamat 10) 17aa-Hydroxy-2-methoxy-17a-homoestra-1, 3,5 (10)-trien-3-yl sulfamat (3a) 11) 17aß-Hydroxy-2-methoxy-17a-homoestra-1, 3,5 (10)-trien-3-yl sulfamat (3b) 12) 2-Methoxy-17a-homoestra-1, 3,5 (10)-trien-3, 17aß-diyl bissulfamat (4) 13) 2-Methoxy-17a-homoestra-1, 3,5 (10) -trien-3, 17aß-diyl bis- (N-acetyl)-sulfamat 14) 17a-Difluor-2-methoxy-17a-homoestra-1, 3,5 (10)-trien-3-yl sulfamat 15) 17aa-Fluor-2-methoxy-17a-homoestra-1, 3,5 (10)-trien-3-yl sulfamat 16) 17aß-Fluor-2-methoxy-17a-homoestra-1, 3,5 (10)-trien-3-yl sulfamat 17) 2-Methoxy-17a-oximino-17a-homoestra-1, 3,5 (10)-trien-3-yl sulfamat 18) 2-Methoxy-17a- (methyloximino)-17a-homoestra-1, 3,5 (10)-trien-3-yl sulfamat 19) 2, 17aß-Dimethoxy-17a-homoestra-1, 3,5 (10)-trien-3-yl sulfamat 20) 2, 17aß-Dimethoxy-17a-homoestra-1, 3,5 (10)-trien-3-yl (N-acetyl)-sulfamat 21) 17aß-Ethoxy-2-methoxy-17a-homoestra-1,3, 5 (10)-trien-3-yl sulfamat 22) 17aß-Ethoxy-2-methoxy-17a-homoestra-1, 3,5 (10)-trien-3-yl (N-acetyl)- sulfamat 23) 2-Methoxy-17aß-(n-propoxy)-17a-homoestra-1, 3,5 (10)-trien-3-yl sulfamat 24) 2-Methoxy-17aß-methyl-17a-homoestra-1, 3,5 (10)-trien-3-yl sulfamat 25) 17aß-Difluormethyl-2-methoxy-17a-homoestra-1, 3,5 (10)-trien-3-yl sulfamat 26) 17aß-Fluormethyl-2-methoxy-17a-homoestra-1, 3,5 (10)-trien-3-yl sulfamat 27) 17aß-Ethyl-2-methoxy-17a-homoestra-1, 3,5 (10)-trien-3-yl sulfamat

28) 2-Methoxy-17a (20)-methylen-17a-homoestra-1, 3,5 (10)-trien-3-yl sulfamat 29) 17a (20)-Difluormethylen-2-methoxy-17a-homoestra-1, 3,5 (10)-trien-3-yl sulfamat 30) 17a (20)-Fluormethylen-2-methoxy-17a-homoestra-1, 3,5 (10)-trien-3-yl sulfamat 31) 2-Methoxy-17a-oxo-17a,18a-dihomoestra-1, 3,5 (10)-trien-3-yl sulfamat 32) 2-Methoxy-17a-oxo-17a,18a-dihomoestra-1, 3,5 (10)-trien-3-yl- (N-acetyl) sulfamat 33) 2-Methoxy-17a, 18a-dihomoestra-1, 3,5 (10)-trien-3-yl sulfamat 34) 2-Methoxy-17a, 18a-dihomoestra-1,3, 5 (10)-trien-3-yl (N-acetyl)-sulfamat 35) 2-Methoxy-6-oximino-17a, 18a-dihomoestra-1,3, 5 (10)-trien-3-yl sulfamat 36) 2-Methoxy-6- (O-methyloximino)-17a, 18a-dihomoestra-1,3, 5 (10)-trien-3-yl sulfamat 37) 6a-Hydroxy-2-methoxy-17a, 18a-dihomoestra-1, 3,5 (10)-trien-3-yl sulfamat 38) 6α-Acetylamino-2-methoxy-17a,18a-dihomoestra-1, 3,5 (10)-trien-3-yl sulfamat 39) 17aß-Hydroxy-2-methoxy-17a, 18a-dihomoestra-1,3, 5 (10)-trien-3-yl sulfamat 40) 2-Methoxy-17a, 18a-dihomoestra-1,3, 5 (10)-trien-3, 17aß-diyl bissulfamat 41) 2-Methoxy-17a,18a-dihomoestra-1, 3,5 (10)-trien-3,17aß-diyl bis-(N-acetyl) sulfamat 42) 17a-Difluor-2-methoxy-17a,18a-dihomoestra-1, 3,5 (10)-trien-3-yl sulfamat 43) 17aa-Fluor-2-methoxy-17a, 18a-dihomoestra-1,3, 5 (10)-trien-3-yl sulfamat 44) 17aß-Fluor-2-methoxy-17a,18a-dihomoestra-1, 3,5 (10)-trien-3-yl sulfamat 45) 2-Methoxy-17a-oximino-17a,18a-dihomoestra-1, 3,5 (10)-trien-3-yl sulfamat 46) 2-Methoxy-17a-(methyloximino)-17a,18a-dihomoestra-1, 3,5 (10)-trien-3-yl sulfamat 47) 2,17aß-Dimethoxy-17a, 18a-dihomoestra-1,3, 5 (10)-trien-3-yl sulfamat 48) 17aß-Ethoxy-2-methoxy-17a, 18a-dihomoestra-1,3, 5 (10)-trien-3-yl sulfamat 49) 2-Methoxy-17aß-(n-propoxy)-17a,18a-dihomoestra-1, 3,5 (10)-trien-3-yl sulfamat 50) 2-Methoxy-17aß-methyl-17a,18a-dihomoestra-1, 3,5 (10)-trien-3-yl sulfamat 51) 17aß-Difluormethyl-2-methoxy-17a,18a-dihomoestra-1, 3,5 (10)-trien-3-yl sulfamat 52) 17aß-Fluormethyl-2-methoxy-17a,18a-dihomoestra-1, 3,5 (10)-trien-3-yl sulfamat

53) 17aß-Ethyl-2-methoxy-17a, 18a-dihomoestra-1, 3, 5 (10)-trien-3-yl sulfamat 54) 2-1 18a-dihomoestra-1, 3, 5 (10)-trien-3-yl sulfamat 55) 17a (20)-Difluormethylen-2-methoxy-17a, 18a-dihomoestra-1, 3, 5 (10)-trien-3-yl sulfamat 56) 17a (20)-Fluormethylen-2-methoxy-17a, 18a-dihomoestra-1, 3, 5 (10)-trien-3-yl sulfamat 57) 2-Ethyl-17a-oxo-17a-homoestra-1, 3, 5 (10)-trien-3-yl sulfamat 58) 2-Ethyl-17a-oxo-17a-homoestra-1, 3, 5 (10)-trien-3-yl (N-acetyl)-sulfamat 59) 2-Ethyl-17a-homoestra-1, 3, 5 (10)-trien-3-yi sulfamat 60) 2-Ethyl-17a-homoestra-1, 3, 5 (10)-trien-3-y 61) 2-Ethyl-17aß-hydroxy-17a-homoestra-1, 3, 5 (10)-trien-3-yl sulfamat 62) 2-Ethyl-17a-homoestra-1, 3, 5 (10)-trien-3, 17aß-diy 63) 2-Ethy)-17a-homoestra-1, 3, 5 (10)-trien-3, 17aß-diy 64) 2-Ethy 3, 5 (10)-trien-3-yl sulfamat 65) 2-Ethyl-17aß-ethoxy-17a-homoestra-1, 3, 5 (10)-trien-3-yl sulfamat Pharmakologische Daten 1. Hemmung der Tubulinpolymerisation Die erfindungsgemäßen Verbindungen wurden in verschiedenen Modellen getestet.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen der allgemeinen Formel # zeichnen sich dadurch aus, dass sie die Tubu stärker hemmen als 2- Methoxyestradiol. Die in vitro Testung der Tubulinpo wurde folgendermaßen durchgeführt : Mikrotubuläres Protein wurde nach Shelanski et. al. (Shelanski et. al. Proc. Nati.

Acad. Sci. USA 1973, 70, 765-8) über zyklische Assembl aus Schweinehirn gereinigt. Das verwendete Puffersystem hatte folgende Zusammensetzung : 20 mM PIPES (1, 4-Piperazine-diethane-sulfonsäure, pKa 6, 8), 80 m 0, 5 mM MgC 1 mM EGTA [Ethylengl tetraessigsäure].

Für die Wirkstofftestung wurden Proteinkonzentrationen von 1 mg/ml (ca. 10 mM Tubulin) eingesetzt. Die Proteinbestimmung erfolgte nach der Lowry-Methode (Lowry et al. J. Biol. Chem. 1951,193, 265-75) mit Rinderserumalbumin als Standard. Die Assemblierung von Mikrotubuli erfolgte in Gegenwart von 0.25 mM GTP und Erwärmen der Proben auf 37°C.

Die Mikrotubulusbildung wurde mit Hilfe der Turbidimetrie bei einer Wellenlänge von 340 nm geprüft. Der Gleichgewichtszustand, bei dem das mikrotubuläre Protein keinen Zuwachs der Assemblatkonzentration (entsprechend der Mikrotubuluskonzentration) und der Trübungswert keinen Anstieg mehr aufweist, wird typischerweise nach 20 Minuten erreicht.

Die Testung der Wirkstoffe erfolgte durch deren Zugabe am Anfang der Assemblierung oder im Gleichgewichtszustand. Abweichungen der Trübungskurven von der Kontrolle charakterisieren ihre Wirksamkeit. Zur Wirkungskontrolle und Bewertung der Trübungsmesswerte wurde stets eine transmissionselektronenmikroskopische Untersuchung (CEM 902 A, Zeiss/ Oberkochen) der Assemblate nach Negativfärbung mit 1 % igem wässrigen Uranylazetat durchgeführt.

Tab. 1. Verbindung Hemmung der Tubulin- polymerisation 1c50 [pM] 2-Methoxyestradiol 2,7 (2) 0,95

2. Hemmung der Zellproliferation Die erfindungsgemäßen Verbindungen zeichnen sich durch eine potente Hemmung der Zellproliferation aus.

Zellkulturen der folgenden Zelllinien wurden in 96well Mikrotiterplatten angelegt : 1. MaTu/ADR Multidrug-resistente humanen Brusttumorzellen (Epo GmbH Berlin), 5000 Zellen/Well.

2. HCT116 humane Kolontumorzellen (ATCC CCL-247), 3000 Zellen/Well.

3. NCI-H460 humane nicht-kleinzelliges Lungenkarzinomzellen (ATCC HTB-177), 3000 Zellen/Well.

4. DU145 humane Prostatatumorzellen (ATCC HTB-81), 5000 Zellen/Well.

5. HMVEC humane primäre dermale mikrovaskuläre Endotheizellen, 7500 Zellen/Well.

Nach 24 Stunden Inkubationszeit in einem Zellkulturbrutschrank bei 37°C wurden die Zellen einer Mikrotiterplatte mit Kristallviolett gefärbt (Referenzplatte), während die Zellen in den Testplatten für 4 Tage mit den Testsubstanzen in den Konzentrationen 0. 1-10 uM, sowie mit dem Lösungsmittel DMSO allein (Lösungsmittelkontrolle), inkubiert wurden. Die Zellproliferation wurde durch Färbung der Zellen mit Kristallviolett bestimmt. Die Extinktion des Kristallvioletts wurde photometrisch bei 595 nm bestimmt. Die Prozentzahl der Änderung der Zellzahl in den Testplatten wurde nach Normalisation der Extinktionswerte auf die Referenzplatte (0%) und auf die Lösungsmittelkontrollen (100%) bestimmt. Die halbmaximale Inhibition des Zellwachstums (IC50) wurde als die Substanzkonzentration bestimmt, bei der 50% der Zellzahl der Lösungsmittelkontrollen vorhanden waren. Verbindung Hemmung der Zellproliferation IC50 [pM] NCI-H460 HCT116 DU145 MaTu/ADR HMVEC Taxol 0,004 0,004 0,004 0,4 0,004 2-Methoxy- estradiol 1.8 1.1 1.9 0.2 2.2 (1) 0.18 0.18 0.5 <0.1 0.22 (2) 0.6 0.6 0.6 0.2 0.5 (4) 1.8 1.8 2.8 0.8 0.6

Dosierung Im allgemeinen sind zufriedenstellende Resultate zu erwarten, wenn die täglichen Dosen einen Bereich von 5 pg bis 50 mg der erfindungsgemäßen Verbindung pro kg Körpergewicht umfassen. Bei größeren Säugetieren, beispielsweise dem Menschen, liegt eine empfohlene tägliche Dosis im Bereich von 10 pg bis 30 mg pro kg Körper- gewicht.

Geeignete Dosierungen für die erfindungsgemäßen Verbindungen betragen von 0,005 bis 50 mg pro Tag pro kg Körpergewicht, je nach Alter und Konstitution des Patienten, wobei die notwendige Tagesdosis durch Einmal-oder Mehrfachabgabe appliziert werden kann.

Aufgrund der besonderen Depotwirkung der Estrogen-Sulfamate können die erfin- dungsgemäßen Verbindungen aber auch in größeren Abständen als einmal am Tag verabreicht werden.

Die Formulierung der pharmazeutischen Präparate auf Basis der neuen Verbindungen erfolgt in an sich bekannter Weise, indem man den Wirkstoff mit den in der Galenik gebräuchlichen Trägersubstanzen, Füllstoffen, Zerfallsbeeinflussern, Bindemitteln, Feuchthaltemitteln, Gleitmitteln, Absorptionsmitteln, Verdünnungsmitteln, Geschmackskorrigentien, Färbemitteln usw. verarbeitet und in

die gewünschte Applikationsform überführt. Dabei ist auf Remington's Pharmaceutical Science, 15th ed. Mack Publishing Company, East Pennsylvania (1980) hinzuweisen.

Für die orale Applikation kommen insbesondere Tabletten, Dragees, Kapseln, Pillen, Pulver, Granulate, Pastillen, Suspensionen, Emulsionen oder Lösungen in Frage.

Für die parenterale Applikation sind Injektion-und Infusionszubereitungen möglich.

Für die intraartikulären Injektion können entsprechend zubereitete Kristallsuspen- sionen verwendet werden.

Für die intramuskuläre Injektion können wässrige und ölige Injektionslösungen oder Suspensionen und entsprechende Depotpräparationen Verwendung finden.

Für die rektale Applikation können die neuen Verbindungen in Form von Suppositorien, Kapseln, Lösungen (z. B. in Form von Klysmen) und Salben sowohl zur systemischen als auch zur lokalen Therapie verwendet werden.

Zur pulmonalen Applikation der neuen Verbindungen können diese in Form von Aerosolen und Inhalten verwendet werden.

Für die topische Auftragung sind Formulierungen in Gele, Salben, Fettsalben, Cremes, Pasten, Puder, Milch und Tinkturen möglich. Die Dosierung der Verbindungen der allgemeinen Formel I sollte in diesen Zubereitungen 0, 01%-20% betragen, um eine ausreichende pharmakologische Wirkung zu erzielen.

Die vorliegende Erfindung umfasst die Verbindungen der allgemeinen Formel I und deren Verwendung zur Herstellung eines Arzneimittels, insbesondere zur Behandlung von Tumorerkrankungen, die sich durch die Hemmung der Tubulinpolymerisation positiv beeinflussen lassen.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen der allgemeinen Formel I werden bevorzugt zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Tumorerkrankungen der männlichen und weiblichen Keimdrüsen, männlichen und weiblichen Sexualorgane einschließlich der Brustdrüsen, insbesondere von Prostatakarzinomen oder Mammakarzinom verwendet.

Ferner betrifft die vorliegende Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen, die mindestens eine erfindungsgemäß besonders bevorzugte Verbindung, gegebenenfalls in Form eines pharmazeutisch/pharmakologisch verträglichen Salzes, ohne oder zusammen mit pharmazeutisch verträglichen Hilfs-und/oder Trägerstoffen enthalten.

Diese pharmazeutischen Zusammensetzungen und Arzneimittel können zur oralen, rektalen, vaginalen, subkutanen, perkutanen, intravenösen oder intramuskulären Applikation vorgesehen sein. Sie enthalten neben üblichen Träger-und/oder Verdün- nungsmitteln mindestens eine erfindungsgemäß besonders bevorzugte Verbindung.

Die Arzneimittel der Erfindung werden mit den üblichen festen oder flüssigen Träger- stoffen oder Verdünnungsmitteln und den üblicherweise verwendeten pharma- zeutisch-technischen Hilfsstoffen entsprechend der gewünschten Applikationsart mit einer geeigneten Dosierung in bekannter Weise hergestellt. Die bevorzugten Zubereitungen bestehen in einer Darreichungsform, die zur oralen Applikation geeignet ist. Solche Darreichungsformen sind beispielsweise Tabletten, Filmtabletten, Dragees, Kapseln, Pillen, Pulver, Lösungen oder Suspensionen oder auch Depotformen.

Die pharmazeutischen Zusammensetzungen, die mindestens eine der erfindungsgemäßen Verbindungen enthalten, werden bevorzugt oral appliziert.

Es kommen auch parenterale Zubereitungen wie Injektionslösungen in Betracht.

Weiterhin seien als Zubereitungen beispielsweise auch Suppositorien und Mittel zur vaginalen Anwendung genannt.

Entsprechende Tabletten können beispielsweise durch Mischen des Wirkstoffs mit bekannten Hilfsstoffen, beispielsweise inerten Verdünnungsmitteln wie Dextrose, Zucker, Sorbit, Mannit, Polyvinylpyrrolidon, Sprengmitteln wie Maisstärke oder Algin- säure, Bindemitteln wie Stärke oder Gelatine, Gleitmitteln wie Magnesiumstearat oder Talk und/oder Mitteln zur Erzielung eines Depoteffektes wie Carboxylpolymethylen, Carboxylmethylcellulose, Celluloseacetatphthalat oder Polyvinylactat, erhalten werden. Die Tabletten können auch aus mehreren Schichten bestehen.

Entsprechend können Dragees durch Überziehen von analog den Tabletten herge- stellten Kernen mit üblicherweise in Drageeüberzügen verwendeten Mitteln, beispielsweise Polyvinylpyrrolidon oder Schellack, Gummiarabicum, Talk, Titanoxid- oder Zucker, hergestellt werden. Dabei kann auch die Drageehülle aus mehreren Schichten bestehen, wobei die oben bei den Tabletten erwähnten Hilfsstoffe verwendet werden können.

Lösungen oder Suspensionen mit den erfindungsgemäßen Verbindungen der allgemeinen Formel I können zusätzlich geschmacksverbessernde Mittel wie Saccharin, Cyclamat oder Zucker sowie z. B. Aromastoffe wie Vanillin oder Orangenextrakt enthalten. Sie können außerdem Suspendierhilfsstoffe wie Natriumcarboxymethylcellulose oder Konservierungsstoffe wie p-Hydroxybenzoate enthalten.

Die Verbindungen der allgemeinen Formel I enthaltende Kapseln können beispielsweise hergestellt werden, indem man die Verbindung (en) der allgemeinen Formel I mit einem inerten Träger wie Milchzucker oder Sorbit mischt und in Gelatinekapseln einkapselt.

Geeignete Suppositorien lassen sich beispielsweise durch Vermischen mit dafür vorgesehenen Trägermitteln wie Neutralfetten oder Polyethylenglykol bzw. deren Derivaten herstellen.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können zur Therapie von Prostatakarzinomen mit einem oder mehreren der folgenden Wirkstoffe kombiniert verabreicht werden : 1) Antiandrogene wie CPA, Flutamid, Casodex etc.

2) Gonadrotrophormon (GnRH) Agonisten 3) 5a-Reduktase Hemmer wie Finasterid 4) Zytostatika 5) VEGF-Kinase-Inhibitoren 6) Antigestagene 7) Antiestrogene 8) Antisense Oligonukleotide 9) EGF-Antikörper 10) Estrogene

Darüber hinaus können die erfindungsgemäßen Verbindungen der allgemeinen Formel I zur Therapie und Prophylaxe weiterer oben nicht genannter Krankheitszustände eingesetzt werden.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen der allgemeinen Formel 1 lassen sich wie nachstehend beschrieben herstellen : Die Funktionalisierung des C-Atoms 2 eines Estra-1,3, 5 (10)-trien-17-on-derivates erfolgt vorzugsweise durch Friedel-Crafts-Acylierung wie in der Literatur beschrieben (T. Nambara et al. Chem. Pharm. Bull. 1979, 18, 474-480).

Nach Wechsel der Schutzgruppe in Position 3 wird durch Baeyer-Villiger-Oxidation ein 2-Carboxy-estra-1,3, 5 (10)-trien-17-on generiert (M. B. Smith, J. March, March's Advanced Organic Chemistry, 5. Edition, Wiley Sons 2001, 1417-1418 und dort zit : Lit. ). Der Ester wird verseift und mit dem entsprechenden Alkylhalogenid unter basischen Bedingungen in einen 2-Alkylether überführt. Alternativ kann nun das 17- Keton wie bekannt reduziert und verethert werden. Die Spaltung der Schutzgruppe in Position 3 erfolgt wie in der Literatur beschrieben (T. W. Greene, P. G. M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, Wiley & Sons, 1999,249-275). Dieses Verfahren oder andere aus der Literatur bekannte (P. N. Rao, J. W. Cessac, Steroids 2002,67, 1065-1070 und dort zit. Lit. ) sind entsprechend auf die 17a-Homo-bzw.

17a, 18a-Dihomoderivate anwendbar.

Die vorzugsweise durch Friedel-Crafts-Acylierung erhaltenen 2-Acylderivate können durch Reduktion mit Natriumborhydrid und anschließender Hydrierung in die entsprechenden 2-Alkylderivate übergeführt werden.

Ebenso können aus den 2-funktionalisierten Derivaten die entsprechenden 17a- Oxim-, 17a-Alkylen- (sog. Wittig-Reaktion, siehe z. B S. Schwarz et al. Pharmazie 2001,56, 843-849), 17a-Difluormethylen- (Wadsworth-Emmons-Reaktion, S. R. Piettre, L. Cabanas, Tetrahedron Lett. 1996,37, 5881-4884), 17a, ß-Alkylderivate hergestellt (z. B. R. H. Peters et al., J. Med. Chem. 1989,32, 1642 ; G. E. Agoston et al.

W002/42319) und anschließend in 3-Position sulfamoyliert werden.

Nach Cushman et al. (J. Med. Chem. 1997,40, 2323) erfolgt die Synthese 6- funktionalisierter Estrogenderivate durch Oxidation des Acetyl-geschützen Estrogenderivates mit Chromtrioxid.

Ausgehend von den 2-funktionalisierten 17-Keto-Derivaten können 17-Oxirane (M.

Hübner, I. Noack, J. prakt. Chem. 1972, 314, 667), und daraus die entsprechenden 17a-Homo-Derivate (M. Hübner, K. Ponsold, Z. Chem. 1982,22, 186) hergestellt werden.

17a-Fluorierte Derivate können aus den etnsprechenden 17a-Oxo bzw. 17a-Hydroxy- Derivaten mit Diethylamino-schwefeltrifluorid hergestellt (M. Hudlicky, Org. Reactions 1988,35, 513 ; J. T. Welch, Fluorine in Bioorganic Chemistry 1991, John Wiley, New York ; S. Rozen et al. Tetrahedron Lett. 1979,20, 1823-1826) und anschließend sulfamoyliert werden.

Die vorliegende Erfindung wird anhand der nachfolgenden Beispiele näher erläutert, ohne sie darauf einzuschränken : Herstellungsverfahren Allgemeine Vorschrift 1 zur Herstellung von 17a-Homoestra-1, 3,5 (10) -trien-3- ylsulfamaten Es werden ein Äquivalent eines 17a-Homoestra-1,3, 5 (10) -trien-Derivates in Methylenchlorid unter Rühren gelöst bzw. suspendiert und mit 5 Äquivalenten 2,6-Di- tert.-butylpyridin versetzt. Anschließend werden unter Argon 10 Äquivalente Sulfamoylchlorid zugegeben und bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösung wird bis zum vollständigen Umsatz gerührt (DC-Kontrolle, 1-5h) und dann mit Wasser versetzt.

Bei säureempfindlichen Verbindungen wird vorher mit rund 10 Äquivalenten Triethylamin gepuffert. Die wässrige Phase wird mehrmals mit Dichlormethan oder Essigester extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden über Natriumsulfat getrocknet und am Vakuum eingeengt und anschließend flashchromatographisch gereinigt.

Allgemeine Vorschrift 2 zur Acylierung von Sulfamate Ein Äquivalent des 17a-Homoestra-1,3, 5 (10)-trien-Sulfamates bzw. Bisulfamates werden im Pyridin gelöst und unter Eiskühlung (0 bis 5°C) mit 5 Äquivalenten Anhydrid versetzt. Es wird 1h bei Raumtemperatur weitergerührt und dann mit Wasser versetzt. Die wässrige Phase wird mehrmals mit Dichlormethan oder Essigester extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden mit 6N Salzsäure und anschließend mit Wasser und Natriumchloridlösung gewaschen. Danach wird über Natriumsulfat getrocknet und am Vakuum eingeengt und anschließend flashchromatographisch gereinigt.

Folgende erfindungsgemäßen Verbindungen wurden nach den genannten Vorschriften hergestellt : Beispiel 1 2-Methoxy-17a-oxo-17a-homoestra-1, 3,5 (10)-trien-3-yl sulfamat (1) : 3.61 g 17a-Azidomethyl-3, 17ß-dihydroxy-2-methoxy-estra-1, 3,5 (10) -trien und 7.5 g Natriumiodid wurden in 250 mL Acetonitril suspendiert und bei Raumtemperatur langsam mit 15 mL Trimethylsilylchlorid versetzt. Nach 4h wurden weitere 4 mL Trimethylsilylchlorid zugegeben und nach weiteren 2.5h wurde mit ges.

Natriumthiosulfatlsg. und Wasser versetzt und mit Dichlormethan extrahiert (3x). Die vereinigten organischen Phasen wurden mit wässr. Natriumbicarbonatlsg. gewaschen, getrocknet und am Rotationsverdampfer eingeengt.

Flashchromatographie (Cyclohexan/Essigester = 10 : 1-> 7 : 1- 5 : 1) lieferte 2.12 g (67%) 3-Hydroxy-2-methoxy-17a-oxo-17a-homoestra-1, 3,5 (10) -trien als farblose Kristalle.

'H-NMR (CDCI3) : 8 = 1.13 (s, 3H ; 18-CH3), 2.62-2. 71 (m, 1H ; 17-H), 2.77 (dd, 2H ; 6- CH2), 3.86 (s, 3H ; 2-OCH3), 5.48 (s, 1H ; 3-OH), 6.63, 6.78 (2 s, 2H ; 1-H, 4-H).

492 mg 3-Hydroxy-2-methoxy-17a-oxo-17a-homoestra-1,3, 5 (10)-trien wurden nach der allgemeinen Synthesevorschrift zum Produkt umgesetzt und anschließend durch Flashchromatographie (Cyclohexan/Essigester = 3 : 1-> 2 : 1) gereinigt. Es wurden 545 mg (89%) 2-Methoxy-17a-oxo-17a-homoestra-1,3, 5 (10)-trien-3-yl sulfamat (1) als farblose Kristalle erhalten.

1H-NMR (CDCl3): # = 1. 13 (s, 3H ; 18-CH3), 2.63-2. 71 (m, 1 H ; 17-H), 2.74-2. 84 (m, 2H ; 6-CHz), 3. 88 (s, 3H ; 2-OCH3), 5.00 (s, 2H ; NH2), 6.93, 7.04 (2 s, 2H ; 1-H, 4-H).

Beispiel 2 2-Methoxy-17a-homoestra-1, 3,5 (10)-trien-3-yl sulfamat (2) : 600 mg 3-Hydroxy-2-methoxy-17a-oxo-17a-homoestra-1,3, 5 (10)-trien wurden in 20 mL Triethylenglycol gelöst und unter Argon mit 15 mL Hydrazin-monohydrat und 0.8 g Kaliumhydroxid versetzt. Anschließend wurde 2h auf 130°C und anschließend weitere 1.5h auf 200°C erhitzt. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wurde mit 6N Salzsäure angesäuert und mit Dichlormethan extrahiert (3x). Die vereinigten organischen Phasen wurden mit ges. Natriumbicarbonatlsg. gewaschen, getrocknet und am Rotationsverdampfer eingeengt. Flashchromatographie (Cyclohexan/Essigester = 100 : 1-<-50 : 1--> 20 : 1) lieferte 541 mg (94%) 3-Hydroxy-2-methoxy-17a-homoestra- 1,3, 5 (10)-trien als farblose Kristalle.

'H-NMR (CDCI3) : 6 = 0.85 (s, 3H ; 18-CH3), 2.71-2. 74 (m, 2H ; 6-CH2), 3.85 (s, 3H ; 2- OCH3), 5.41 (s, 1 H ; 3-OH), 6.62, 6.79 (2 s, 2H ; 1-H, 4-H).

253 mg 3-Hydroxy-2-methoxy-17a-homoestra-1,3, 5 (10) -trien wurden nach der allgemeinen Synthesevorschrift 1 zum Produkt umgesetzt und anschließend durch Flashchromatographie (Toluol/Essigester = 20 : 1 < 10 : 1) gereinigt. Es wurden 217 mg (68%) 2-Methoxy-17a-homoestra-1, 3,5 (10)-trien-3-yl sulfamat (2) in Form farbloser Kristalle erhalten.

'H-NMR (CDCI3) : 8 = 0.85 (s, 3H ; 18-CH3), 2.67-2. 82 (m, 2H ; 6-CH2), 3.86 (s, 3H ; 2- OCH3), 4.97 (s, 2H ; NH2), 6.93, 7.02 (2 s, 2H ; 1-H, 4-H).

Beispiel 3 17aa-Hydroxy-2-methoxy-17a-homoestra-1, 3,5 (10)-trien-3-yl sulfamat (3a) und 17aß-Hydroxy-2-methoxy-17a-homoestra-1,3, 5 (10)-trien-3-yl sulfamat (3b : 298 mg 2-Methoxy-17a-oxo-17a-homoestra-1, 3,5 (10)-trien-3-yl sulfamat (2) wurden in 20 mL Methanol und 10 mL Tetrahydrofuran gelöst und unter Eiskühlung mit 115 mg Natriumborhydrid versetzt. Nach 2h wurde mit Aceton versetzt und am Rotationsverdampfer eingeengt. Der Rückstand wurde mit 6N Salzsäure angesäuert

und mit Dichlormethan extrahiert (2x). Die vereinigten organischen Phasen wurden mit ges. Natriumbicarbonatlsg. gewaschen, getrocknet und am Rotationsverdampfer eingeengt. Flashchromatographie (n-Hexan/Essigester = 3 : 2 # 1 : 1) lieferte 35 mg (12%) des a-Epimers 3a sowie 276 mg (92%) des ß-Epimers 3b als amorphe, Feststoffe.

3a :'H-NMR (CDCI3) : 8 = 0.86 (s, 3H ; 18-CH3), 3.42 (dd, 3Jeq = 3Jax = 2.7 Hz, 1H ; 17aß-H), 3.86 (s, 3H ; 2-OCH3), 5.14 (s, 2H; NH2), 6.92, 7.02 (2 s, 2H ; 1-H, 4-H).

3b : 1H-NMR (CDCI3) : 8 = 0.84 (s, 3H ; 18-CH3), 3.25 (dd, 3J = 4.3 und 11.3 Hz, 1H ; 17aa-H), 3.87 (s, 3H; 2-OCH3), 5.07 (s, 2H ; NH2), 5.29 (s, 1H; OH), 6.93, 7.03 (2 s, 2H ; 1-H, 4-H).

Beispiel 4 2-Methoxy-17a-homoestra-1,3, 5 (10)-trien-3, 17aß-diyl bissulfamat (4) : 62 mg 17aß-Hydroxy-2-methoxy-17a-homoestra-1, 3,5 (10)-trien-3-yl sulfamat (3b) wurden nach der allgemeinen Synthesevorschrift 1 zum Produkt umgesetzt und anschließend durch Flashchromatographie (Toluol/Essigester = 3 : 1) gereinigt. Es wurden 55 mg (74%) 2-Methoxy-17a-homoestra-1, 3,5 (10)-trien-3, 17aß-diyl bissulfamat (4) als farbloses Öl erhalten, welches langsam kristallisierte.

1H-NMR (DMSO-d6) : 8 = 0.84 (s, 3H ; 18-CH3), 3.76 (s, 3H ; 2-OCH3), 4.06 (dd, 3J = 4.3 und 11.7 Hz, 1H ; 17aa-H), 6.97, 7.00 (2 s, 2H ; 1-H, 4-H), 7.37 (s, 2H ; NH2), 7.82 (s, 2H ; NH2).