スイートピー(Lathyrus odoratus L.)は、マメ科� ��ンリソウ属の植物であり、別名、麝香蓮理� ��、麝香豌豆とも呼ばれる。主に観賞用に用� ��られる地中海を原産とする園芸品種である� ��花の色は白、ピンク、青、紫等があり、芳� ��がある。
 スイートピー抽出物については、その植物� ��全草又は花、茎、葉、根、種子のうちの一� ��以上を常温又は加温下にて溶剤に浸漬して� ��出するか又はソックスレー抽出器等の抽出� ��具を用いて抽出することにより得られる。� ��らにクロマトグラフィー等を用いて成分を� ��製しても良い。老化の予防、改善効果によ� ��優れる抽出物を得るためには、抽出部位は� ��が特に好ましい。花びら、がく片、雄しべ� ��雌しべを含む花全体から抽出しても良く、� ��びらのみ選択的に採取し、花びらから抽出� ��ても良い。スイートピー抽出物は各種溶剤� ��出液、その希釈液、その濃縮液又は抽出液� ��乾燥や凍結乾燥して得られる乾燥末あるい� ��ペーストの形態で使用することができる。

 スイートピー抽出物を得るために用いられ� ��抽出溶剤としては、極性溶剤、非極性溶剤� ��いずれをも使用することができる。例えば� ��水、アルコール類のメタノール、エタノー� ��、プロパノール、ブタノール等、多価アル� ��ール類のプロピレングリコール、ブチレン� ��リコール等、ケトン類のアセトン、メチル� ��チルケトン等、エステル類の酢酸メチル、� ��酸エチル等、鎖状及び環状エーテル類のテ� ��ラヒドロフラン、ジエチルエーテル等、ポ� ��エーテル類のポリエチレングリコール等、� ��ロゲン化炭化水素類のジクロロメタン、ク� ��ロホルム、四塩化炭素等、炭化水素類のヘ� ��サン、シクロヘキサン、石油エーテル等、� ��香族炭化水素類のベンゼン、トルエン等、� ��リジン類等が挙げられ、これらは2種以上を 混合して用いることもできる。
 上記の抽出溶剤の中でも、アポトーシス抑� ��効果又はDNA障害抑制効果又はDNA損傷修復促� ��効果又は突然変異抑制効果あるいは紫外線� ��害抑制効果に優れる抽出物を得るためには� ��または水溶性有機溶剤が好ましい。水溶性� ��機溶剤としてはメタノール、エタノール、� ��ロパノール、2-プロパノール、プロピレン� �リコール、ブチレングリコール、アセトン� �が挙げられる。

 スイートピー抽出物からなるアポトーシス� ��制剤、DNA損傷抑制剤、DNA損傷修復剤、突然� ��異抑制剤あるいは紫外線障害抑制剤とする� ��とができる。あるいは、スイートピー抽出� ��を含有するアポトーシス抑制剤、DNA損傷抑� ��剤、DNA損傷修復剤あるいは紫外線障害抑制� ��とすることができる。
 本発明のアポトーシス抑制剤、DNA損傷抑制� ��、DNA損傷修復剤、突然変異抑制剤あるいは� ��外線障害抑制剤は医薬、食品、医薬部外品� ��配合して使用することができる。また、経� ��投与、皮膚外用等の非経口投与のいずれも� ��能である。
 以下に本発明を実施例に基づき、さらに具� ��的に説明するが、本発明はこれにより限定� ��れるものではない。

〔抽出液1〕
 スイートピーの花びら(紫色)45.9gと蒸留水459 gを瓶に入れ、90~100℃の湯煎中で30分加熱した 。冷却後、ガーゼで搾り取り、さらに3000rpm× 10分間、遠心分離した。上清を湯煎温度約65� �のロータリーエバポレータで濃縮し、水を� �えて45.9gに定容した。抽出液中の可溶性固形 分は4.87%であった。

〔抽出液2〕
 抽出液1をロータリーエバポレータで濃縮し 、5倍の濃度の濃縮液を得た。可溶性固形分� �濃度は24.4%である。

〔抽出液3〕
 スイートピーの茎148.2gと蒸留水741gを瓶に入 れ、90~100℃の湯煎中で60分加熱した。冷却後� ��ガーゼで搾り取り、さらに3000rpm×10分間、� �心分離した。上清を湯煎温度約65℃のロータ リーエバポレータで濃縮し、水を加えて29.6g� ��定容した。抽出液中の可溶性固形分は13.6%� �あった。

〔アポトーシス阻害試験及びDNA損傷抑制試験 〕
 3次元皮膚モデルTOYOBO LSE-high (LSE-003)(東洋� �績社製)を精製水で0.2%、1.0%、5.0%に希釈した� ��記抽出液2及びブランクとして精製水各100μl に曝露した。24時間後に培地を回収、検体を� ��去し、PBS(-)で洗浄後、PBS(-)100μlに置き換え� ��UVB200mJ/cm ² を照射した。PBS(-)を検体に置き換え、新しい 培地中で24時間培養し、TUNNEL染色、Thymine Dime rの染色を行った。
 ホルマリン固定、パラフィン包埋した組織� ��用い、5μmの切片を作成し、染色に用いた。 TUNEL染色はIn situ Apoptosis Detection Kit  (Takara )を用いて行った。Thymine DimerはProteinase K処� �、マイクロウェーブ処理後、1次抗体として1 00倍希釈したMonoclonal anti-Thymine dimmer clone H3   (Sigma)を、2次抗体として100倍希釈したRabbit  anti-mouse Immunoglobulin-FITC (DAKO)を用いた。TUNN EL染色、Thymine Dimer染色ともに核が染色され� �ため、陽性像は緑色蛍光の点状に見える。� �、角層が全体的に緑色蛍光を発する場合が� �るが、これはアポトーシスやDNA損傷を反映� �るものではなく、陽性像とはみなさない。

(TUNEL染色(アポトーシス)の結果)
 TUNEL染色(アポトーシス)の結果、ブランクと して精製水に曝露した3次元皮膚モデルではUV B照射により基底層からその上部にかけて陽� �像が確認され、今回用いた線量でアポトー� �スが起こっていることが画像解析の結果確� �できた。陽性像の計数値(平均値)を表1、図1� ��示す。

 抽出液2を0.2%の抽出液2に曝露しても影響� ��みられなかったが、1.0%、5.0%の抽出液2に曝� ��するとTUNEL陽性細胞が明らかにに減少し、� �出液2がUVBによるアポトーシスを抑制するこ� ��が確認された。

(Thymine Dimer染色(DNA損傷)の結果)
 Thymine Dimer染色(DNA損傷)の結果、ブランクで はUVB照射により基底層からその上部にかけて 陽性像が確認され、今回用いた線量でDNA損傷 が起こっていることが画像解析の結果確認で きた。陽性像の計数値(平均値)を表2、図2に� �す。

 0.2%、1.0%の抽出液2に曝露した結果、陽性� ��が明らかに減少し、5.0%の抽出液2に曝露す� �と陽性像が殆ど認められず、抽出液2がUVBに� ��るDNA損傷を抑制することが確認された。

〔紫外線照射による細胞死の抑制効果〕
 HaCaT細胞を35mmディッシュにて2日間培養後、 培地をPBS(-)に置換し、10 mJ/cm ² のUVBを照射した。照射後、直ちに前記「抽出 液1」を0.1%含む培地及び「抽出液1」を含まな い培地に交換し、さらに3日間培養した後、PB S(-)で洗浄し、ニュートラルレッド含有培地� �交換し、3時間培養した。PBS(-)で洗浄後、1%� �酸含有50%エタノール溶液でニュートラルレ� �ドの抽出を行い、細胞量の指標として570nmに おける吸光度を測定した。
 HaCaT細胞を35mmディッシュにて2日間培養後、 培地をPBS(-)に置換し、UVBを照射せずに、直ち に前記「抽出液1」を含まない培地に交換し� �さらに3日間培養した後、PBS(-)で洗浄し、ニ� ��ートラルレッド含有培地に交換し、3時間培 養した。PBS(-)で洗浄後、1%酢酸含有50%エタノ� ��ル溶液でニュートラルレッドの抽出を行い� ��細胞量の指標として570nmにおける吸光度を� �定した。この紫外線を照射していない細胞� �生存率を100%とした。
 紫外線を照射した細胞の生存率(x)を次式に� ��り算出した。結果を表3、図3に示す。
(x)=570nm吸光度(紫外線照射)/570nm吸光度(紫外線 非照射)×100(%)

 この結果、抽出液1無添加では生存率が56% であるところ、0.1%添加では79%であり、無添� �を100%とすると141%になり、40%以上向上するこ とが認められる。スイートピー抽出液の紫外 線障害抑制効果を確認できた。

 〔紫外線照射によるDNA損傷修復の促進確認� ��
 10%FBSを含むDMEM(ダルベッコ変法イーグル培� �)にて表皮角化細胞(HaCaT)を35mmのディッシュ� �播種し、48時間培養後に、抽出液1を0%、0.3%� �1%含む培地に交換した。
 さらに24時間培養後、培地を除去、PBS(-)で� �浄し、PBS(-)1mlを加えUVB10mJ/cm ² を照射した。
 その後、PBS(-)を吸引し、DMEMに交換しさらに 培養した。
 培養0、2、24時間後にQIAamp DNA Blood Mini Kit� �を用いDNAを抽出し、分光光度計でDNA量を正� �に定量した後(260nmの吸光度1.0が50μg/mlに相当 )、DNA溶液を密閉して100℃で10分加熱、氷水中 で15分間冷却し、DNAを1本鎖とし、96穴硫酸プ� ��タミン付着マイクロタイタープレートに分� ��入し、37℃の恒温器に16時間以上放置し、DNA 10 ng /well乾燥固着させた。96穴硫酸プロタミ ン付着マイクロタイタープレートは硫酸プロ タミン水溶液をプレートのウェルに分注し、 37℃で一晩インキュベートして乾燥付着させ� ��ものである。

 以下、ELIZA法によるシクロブタン型ダイマ� �の分析手順を示す。DNAを固着させたプレー� �をPBS(-)・0.05%  Tween 20で洗浄し、2%FBS(牛胎� �血清)/PBS(-)溶液を加えて37℃で60分間インキ� �ベートして抗体の非特異的吸着部位をブロ� �クした。PBS(-)・0.05% 
 Tween 20で洗浄し、一次抗体として0.05% TDM-2( シクロブタン型ダイマーを特異的に認識する マウス由来モノクローナル抗体) (D194-1, MBL)/ PBS(-)溶液を100μl加え、37℃で30分間反応させ� �。
 PBS(-)・0.05%  Tween 20で洗浄し、2次抗体とし て0.02% Biotin-F(ab') ₂  fragment of Goat anti-mouse IgG(H+L) (710-1632, Rock land, コスモ・バイオ)/PBS(-)溶液を100μl加え、 37℃で30分間反応させた。
 PBS(-)・0.05%  Tween 20で洗浄し、0.01% Peroxidas e-Streptavidin (43-4323, Zymed, コスモ・バイオ)/PB S(-)溶液を100μl加え37℃で30分間反応させた。
 PBS(-)・0.05%  Tween 20、次いでクエン酸・リ� ��酸バッファー(pH5.0)で洗浄し、基質溶液(o-Phe nylene diamine 0.4 mg/ml,  H ₂ O ₂   0.02 %,  クエン酸・リン酸バッファー(pH5. 0)に溶解)を100μl加え37℃で30分間反応させた� �2M硫酸を50μl添加し、反応を停止した。
 96穴マイクロプレート用光度計を用いて492nm における吸光度を測定し、これをシクロブタ ン型ダイマー量の指標とした。
 また、紫外線未照射の場合の吸光度をO.D.(C1 )、紫外線照射後0時間の吸光度をO.D.(C2)、一� �時間後の吸光度をO.D.(S)として以下の式によ� ��DNA修復率を算出した。
 
 修復率(%)=100-[(O.D.(S)-O.D.(C1))/(O.D.(C2)-O.D.(C1))]* 100

  結果を表4及び図4に示す。

結果
 抽出液1を1%添加することにより、シクロブ� ��ン型ダイマー(CPD)の修復率が増加したこと� �ら、スイートピーエキスにDNA修復促進能が� �ることがわかった。

 〔紫外線照射による突然変異に対する抑制� ��認〕
(突然変異試験)
 スイートピー花抽出物(抽出液 1 を凍結乾� ��して得た固形分)の紫外線誘発突然変異に対 する抑制効果を、サルモネラ・ティフィムリ ウム TA 102(以下 「TA102」 と略す)菌株を用� ��たエームズ法(エームズ等、ミューテーショ ン リサーチ.,Ames.B.N.et al.,Mutation Res .,31 巻 , 347 頁, 1975 年)によって測定した。

(1)測定試料の調製
 スイートピー花抽出物(抽出液 1 の凍結乾� ��物(抽出液固形分))をジメチルスルホオキサ� ��ド(以下 DMSO と略す)に任意の濃度となるよ うに溶解し、測定試料を調製した。
(2)突然変異原性試験法
 直径 35mm のシャーレに 100mM リン酸ナト� �ウム緩衝溶液( pH7.4) 2mlとT A102 株の前培養 液 0.4ml(あらかじめ 100mM リン酸ナトリウム� ��衝溶液( pH7.4) にて洗浄した。)を添加した� ��、中央値 254nmの紫外線として殺菌灯( SANKYO DENKI. GE RM 1 CIDAL  LAMP  GT15  T8 ) 15W を� ��い、 24J / m ² 照射した。(ただし、コントロールは未照射� �)照射後直ちに、(1)の項で調製した測定試料� �0.4mlを添加した。(ただし、コントロールは  DMSOのみ添加した。)この溶液を 0.7mlずつ3 本 の試験管に分取した後、それぞれに 2mlの軟� ��天を加えて、最小グルコース寒天平板培地� ��重層固化し、 37℃にて2日間培養した。培� �後、プレート上の復帰変異コロニー数をカ� �ントした。突然変異していない(突然変異が� ��制された) TA102 株は最小グルコース寒天平 板培地でコロニーを形成しない。

  突然変異抑制効果の評価は、変異原及び� �料を加えた系でカウントしたプレート当た� �のコロニー数( A )、変異原のみのコロニー� ��( B )、 DMSOのみの自然復帰コロニー数( C  )をもとに次式により突然変異率を算出する� �とによって行った。

 突然変異率( % )= [ ( A - C )/ ( B - C )]  × 100

 結果
 下記の表5に、スイートピー花抽出物の短波 長紫外線( 24J / m2 )に対する紫外線誘発突� �変異抑制効果をそれぞれ示した。

   表5に示すように変異原のみの場合の� �然変異率を 100 %とした場合、試料添加量の 増大と共に突然変異率の減少が認められた。 従って、これらのスイートピー花抽出物の紫 外線に対する突然変異抑制効果が認められた 。

 〔紫外線照射によるDNA損傷修復の促進確認( UVB照射後にスイートピー花抽出物を添加)〕
 10%FBSを含むDMEM(ダルベッコ変法イーグル培� �)にて表皮角化細胞(HaCaT)を35mmのディッシュ� �播種し、72時間培養後に、UVB10mJ/cm ² を照射した。次いで、スイートピー花抽出物 (抽出液 1 を凍結乾燥して得た固形分)を0mg/m L、0.02 mg/mL、0.1 mg/mL含む培地に交換した。
 培養0、2、24時間後にQIAamp DNA Blood Mini Kit� �を用いDNAを抽出し、分光光度計でDNA量を正� �に定量した後(260nmの吸光度1.0が50μg/mlに相当 )、DNA溶液を密閉して100℃で10分加熱、氷水中 で15分間冷却し、DNAを1本鎖とし、96穴硫酸プ� ��タミン付着マイクロタイタープレートに分� ��入し、37℃の恒温器に16時間以上放置し、DNA 200 ng /well乾燥固着させた。96穴硫酸プロタ� �ン付着マイクロタイタープレートは硫酸プ� �タミン水溶液をプレートのウェルに分注し� �37℃で一晩インキュベートして乾燥付着させ たものである。

 以下、ELIZA法による(6-4)型ダイマーの分析手 順を示す。DNAを固着させたプレートをPBS(-)・ 0.05%  Tween 20で洗浄し、2%FBS(牛胎児血清)/PBS( -)溶液を加えて37℃で60分間インキュベートし て抗体の非特異的吸着部位をブロックした。 PBS(-)・0.05%  Tween 20で洗浄し、一次抗体とし て0.05% 64M-2(6-4)型ダイマーを特異的に認識す� ��マウス由来モノクローナル抗体(D195-1, MBL社 製)/PBS(-)溶液を100μl加え、37℃で30分間反応さ せた。
 PBS(-)・0.05%  Tween 20で洗浄し、2次抗体とし て0.02% Biotin-F(ab') ₂  fragment of Goat anti-mouse IgG(H+L) (710-1632, Rock land, コスモ・バイオ)/PBS(-)溶液を100μl加え、 37℃で30分間反応させた。
 PBS(-)・0.05%  Tween 20で洗浄し、0.01% Peroxidas e-Streptavidin (43-4323, Zymed, コスモ・バイオ)/PB S(-)溶液を100μl加え37℃で30分間反応させた。
 PBS(-)・0.05%  Tween 20、次いでクエン酸・リ� ��酸バッファー(pH5.0)で洗浄し、基質溶液(o-Phe nylene diamine 0.4 mg/ml,  H ₂ O ₂   0.02 %,  クエン酸・リン酸バッファー(pH5. 0)に溶解)を100μl加え37℃で30分間反応させた� �2M硫酸を50μl添加し、反応を停止した。
 96穴マイクロプレート用光度計を用いて492nm における吸光度を測定し、これを(6-4)型ダイ� ��ー量の指標とした。
 また、紫外線未照射の場合の吸光度をO.D.(C1 )、紫外線照射後0時間の吸光度をO.D.(C2)、一� �時間後の吸光度をO.D.(S)として以下の式によ� ��DNA修復率を算出した。

 修復率(%)=100-[(O.D.(S)-O.D.(C1))/(O.D.(C2)-O.D.(C1))]* 100

  結果を表6及び図5に示す。

結果
 表皮角化細胞にUVBを照射して、DNAを損傷さ� ��た後で、スイートピー花抽出物を添加した� ��地を用いて培養することにより、(6-4)型ダ� �マーの修復率が有意に増加した。従って、� �イートピーエキスにDNA修復促進能があると� �える。

[処方例1]
<錠剤>
常法に従って、下記の組成の錠剤を製造した 。

[処方例2]
<外用剤>
[製法]Aに属する水相成分とBに属する油相成� �をそれぞれ加熱溶解し、油相成分を水相成� �に混合し、乳化機にて乳化する。冷却後、C� ��属する成分を混合して得た。