Asparagin-10-substituierte Nonadepsipeptlde

Die Erfindung betrifft Nonadepsipeptide und Verfahren zu ihrer Herstellung sowie ihre Verwendung zur Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Krankheiten, insbesondere bakteriellen Infektionskrankheiten.

Die bakterielle Zellwand wird durch eine Reihe von Enzymen synthetisiert (Zellwandbiosynthese) und ist essentiell für das überleben bzw. die Vermehrung von Mikroorganismen. Die Struktur dieses Makromoleküls ebenso wie die an ihrer Synthese beteiligten Proteine sind innerhalb der Bakterien stark konserviert. Aufgrund ihrer essentiellen Natur und Einheitlichkeit ist die Zellwandbiosynthese ein idealer Angriffspunkt für neue Antibiotika (D.W. Green, The bacterial cell wall as a source of antibacterial targets, Expert Opin. Ther. Targets, 2002, 6, 1-19).

Vancomycin und Penicilline sind Inhibitoren der bakteriellen Zellwandbiosynthese und stellen erfolgreiche Beispiele für die antibiotische Potenz dieses Wirkprinzips dar. Sie werden seit mehreren Jahrzehnten in der Klinik zur Behandlung von bakteriellen Infektionen, vor allem mit Gram-positiven Erregern eingesetzt. Durch das wachsende Auftreten von resistenten Keimen, z.B. Methicillin-resistenten Staphylokokken, Penicillin-resistenten Pneumokokken und Vancomycin-resistenten Enterokokken (F. Baquero, Gram-positive resistance: challenge for the development of new antibiotics, /. Antimicrob. Chemother., 1997, 39, Suppl A: 1-6; A. P. Johnson, D.M. Livermore, G. S. Tillotson, Antimicrobial susceptibility of Gram-positive bacteria: what's current, what's anticipated ?, /. Hosp. Infect, 2001, (49), Suppl A: 3-11) sowie jüngst auch erstmals Vancomycin-resistenten Staphylokokken (B. Goldrick, First reported case of VRSA in the United States, Am. J. Nurs., 2002, 102, 17) verlieren diese Substanzen zunehmend ihre therapeutische Wirksamkeit.

Die vorliegende Erfindung beschreibt eine neue Klasse von Zellwandbiosynthese- Inhibitoren ohne Kreuzresistenzen zu bekannten Antibiotika-Klassen, sowie Verfahren zu deren Herstellung.

Die semisynthetische Derivatisierung komplexer Naturstoffe setzt oft komplexe Schutzgruppenoperationen voraus (Haebich et ah, Angew. Chem. Int. Ed., 2006, 45, 5072). Nur so gelingt die regio- und chemoselektive Adressierung der Derivatisie- rungsposition. In der vorliegenden Erfindung wurde überraschenderweise ein Verfahren gefunden, das ohne Schutzgruppenoperationen eine hoch regio- und chemoselektive Derivatisierung des komplexen Depsipeptids Lysobactin erlaubt.

Der Naturstoff Lysobactin und einige Derivate sind als antibakteriell wirksam beschrieben in US 4,754,018. Die Isolierung und antibakterielle Wirksamkeit von Lysobactin ist auch in EP-A-196 042 und JP 01132600 beschrieben. WO04/099239 beschreibt Derivate des Lysobactins mit antibakterieller Wirksamkeit.

Die antibakterielle Wirkung von Lysobactin und Katanosin A wird weiterhin beschrieben in O'Sullivan, J. et al., J. Antibiot. 1988, 41, 1740 - 1744, Bonner, D. P. et al., J. Antibiot. 1988, 41, 1745 - 1751, Shoji, J. et al, J. Antibiot. 1988, 41, 713 - 718 und Tymiak, A. A. et al, J. Org. Chem. 1989, 54, 1149 - 1157.

Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, alternative Verbindungen mit vergleichbarer oder verbesserter antibakterieller Wirkung, besserer Löslichkeit, höherer freier Fraktion im Blutplasma und besserer Verträglichkeit, z.B. geringerer Nephro- toxizität, zur Behandlung von bakteriellen Erkrankungen bei Menschen und Tieren zur Verfügung zu stellen.

Gegenstand der Erfindung sind Verbindungen der Formel

in welcher

R ¹ 2-Methylprop-l-yl, 2,2-Dimethylprop-l-yl, 1-Trimethylsilylmethyl oder 3- Pyridylmethyl bedeutet,

wobei 3-Pyridylmethyl substituiert sein kann mit einem Substituenten Tri- fluormethyl,

R ² 2-Methylprop-l-yl, 2,2-Dimethylprop-l-yl, 2,2-Dimethylbut-l-yl, 2-Ethyl-2- methylbut-1-yl, 2,2-Diethylbut-l-yl, 2,2-Dimethylpent-l-yl oder 1-Trimethyl- silylmethyl bedeutet,

R ³ Ci-Cö-Alkyl bedeutet,

wobei Alkyl substituiert sein kann mit 1 bis 3 Substituenten, wobei die Substituenten unabhängig voneinander ausgewählt werden aus der Gruppe, bestehend aus Hydroxy, Amino, Hydroxycarbonyl, Aminocarbonyl, {[Bis(dimethyl- amino)methylen]amino}ethoxy, Phenyl, 5- oder 6-gliedriges Heterocyclyl, 5- oder 6-gliedriges Heteroaryl, Benzyloxycarbonyl und Benzyloxycarbonyl- amino,

R ⁴ Wasserstoff, Ci-Cj-Alkyl, Cyclopropyl oder Cyclopropylmethyl bedeutet,

R ⁵ Wasserstoff oder Methyl bedeutet,

und ihre Salze, ihre Solvate und die Solvate ihrer Salze.

Erfindungsgemäße Verbindungen sind die Verbindungen der Formeln (Ia), (I), (IIa) und (II) und deren Salze, Solvate, Solvate der Salze und Prodrugs, die von den Formeln (Ia), (I), (IIa) und (II) umfassten Verbindungen der nachfolgend genannten Formeln und deren Salze, Solvate, Solvate der Salze und Prodrugs sowie die von den Formeln (Ia), (I), (IIa) und (II) umfassten, nachfolgend als Ausführungsbeispiele genannten Verbindungen und deren Salze, Solvate, Solvate der Salze und Prodrugs, soweit es sich bei den von den Formeln (Ia), (I), (IIa) und (II) umfassten, nachfolgend genannten Verbindungen nicht bereits um Salze, Solvate, Solvate der Salze und Prodrugs handelt.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in Abhängigkeit von ihrer Struktur in stereoisomeren Formen (Enantiomere, Diastereomere) existieren. Die Erfindung betrifft deshalb die Enantiomeren oder Diastereomeren und ihre jeweiligen Mischungen. Aus solchen Mischungen von Enantiomeren und/oder Diastereomeren lassen sich die stereoisomer einheitlichen Bestandteile in bekannter Weise isolieren.

Sofern die erfindungsgemäßen Verbindungen in tautomeren Formen vorkommen können, umfasst die vorliegenden Erfindung sämtliche tautomere Formen.

Als Salze sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung physiologisch unbedenkliche Salze der erfindungsgemäßen Verbindungen bevorzugt. Umfasst sind aber auch Salze, die für pharmazeutische Anwendungen selbst nicht geeignet sind aber beispielsweise für die Isolierung oder Reinigung der erfindungsgemäßen Verbindungen verwendet werden können. Der Begriff Salze schließt auch Mischsalze der erfindungsgemäßen Verbindungen wie beispielsweise Mesylat-Trifluoracetat Salze ein.

Physiologisch unbedenkliche Salze der erfindungsgemäßen Verbindungen umfassen Säureadditionssalze von Mineralsäuren, Carbonsäuren und Sulfonsäuren, z.B. Salze der Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Methan- sulfonsäure, Ethansulfonsäure, Toluolsulfonsäure, Benzolsulfonsäure, Naphthalindisul- fonsäure, Essigsäure, Trifluoressigsäure, Propionsäure, Milchsäure, Weinsäure, äpfelsäure, Zitronensäure, Fumarsäure, Maleinsäure und Benzoesäure.

Physiologisch unbedenkliche Salze der erfindungsgemäßen Verbindungen umfassen auch Salze üblicher Basen, wie beispielhaft und vorzugsweise Alkalimetallsalze (z.B. Natrium- und Kaliumsalze), Erdalkalisalze (z.B. Calcium- und Magnesiumsalze) und Ammoniumsalze, abgeleitet von Ammoniak oder organischen Aminen mit 1 bis 16 C-Atomen, wie beispielhaft und vorzugsweise Ethylamin, Diethylamin, Triethylamin, Ethyldiisopropylamin, Monoethanolamin, Diethanolamin, Triethanolamin, Dicyclohe- xylamin, Dimethylaminoethanol, Prokain, Dibenzylamin, N-Methylmorpholin, Argi- nin, Lysin, Ethylendiamin und N-Methylpiperidin.

Als Solvate werden im Rahmen der Erfindung solche Formen der erfindungsgemäßen Verbindungen bezeichnet, welche in festem oder flüssigem Zustand durch Koordination mit Lösungsmittelmolekülen einen Komplex bilden. Hydrate sind eine spezielle Form der Solvate, bei denen die Koordination mit Wasser erfolgt.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung haben die Substituenten, soweit nicht anders spezifiziert, die folgende Bedeutung:

Alkyl steht für einen linearen oder verzweigten Alkylrest mit in der Regel 1 bis 6, vorzugsweise 1 bis 4, besonders bevorzugt 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, beispielhaft und vorzugsweise für Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, tert-Butyl, 2,2-Dimethylprop-l-yl, n-Pentyl und n-Hexyl.

Heterocyclyl steht für einen monocyclischen, heterocyclischen Rest mit 5 oder 6 Ringatomen und bis zu 3, vorzugsweise bis zu 2 Heteroatomen und/oder Hetero- gruppen aus der Reihe N, O, S, SO, SO2. Die Heterocyclyl-Reste können gesättigt oder teilweise ungesättigt sein. Beispielhaft und vorzugsweise seien genannt Tetrahydrofu- ran-2-yl, Tetrahydrofuran-3-yl, Pyrrolidin-2-yl, Pyrrolidin-3-yl, Pyrrolinyl, Piperidin- 1-yl, Piperidin-2-yl, Piperidin-3-yl, Piperidin-4-yl, Tetrahydropyran-2-yl, Tetrahydro- pyran-3-yl, Tetrahydropyran-4-yl, Piperazin-1-yl, Piperazin-2-yl, Morpholin-2-yl, Morpholin-3-yl, Morpholin-4-yl, Thiomorpholin-2-yl, Thiomorpholin-3-yl und Thiomorpholin-4-yl.

Heteroaryl steht für einen aromatischen, monocyclischen Rest mit 5 oder 6 Ringatomen und bis zu 4, vorzugsweise bis zu 2 Heteroatomen aus der Reihe S, O und N, beispielhaft und vorzugsweise für Thien-2-yl, Thien-3-yl, Fur-2-yl, Fur-3-yl, Pyrrol-1-yl, Pyrrol-2-yl, Pyrrol-3-yl, Thiazol-2-yl, Thiazol-4-yl, Thiazol-5-yl, Oxazol-2-yl, Oxazol-4-yl, Oxazol-5-yl, Imidazol-1-yl, Imidazol-2-yl, Imidazol-4-yl, Imidazol-5-yl, Pyrid-2-yl, Pyrid- 3-yl, Pyrid-4-yl, Pyrimid-2-yl, Pyrimid-4-yl, Pyrimid-5-yl, Pyrazin-2-yl, Pyrazin-3-yl, Pyridazin-3-yl und Pyridazin-4-yl.

Halogen steht für Fluor, Chlor, Brom und Jod, bevorzugt Fluor und Chlor.

Bevorzugt sind Verbindungen der Formel (Ia), welche der Formel

entsprechen,

in welcher

R ¹ 2-Methylprop-l-yl, 2,2-Dimethylprop-l-yl, 1-Trimethylsilylmethyl oder 3- Pyridylmethyl bedeutet,

wobei 3-Pyridylmethyl substituiert sein kann mit einem Substituenten Tri- fluormethyl,

R ² 2-Methylprop-l-yl, 2,2-Dimethylprop-l-yl, 2,2-Dimethylbut-l-yl, 2-Ethyl-2- methylbut-1-yl, 2,2-Diethylbut-l-yl, 2,2-Dimethylpent-l-yl oder 1-Trimethyl- silylmethyl bedeutet,

R ³ Ci-Cö-Alkyl bedeutet,

wobei Alkyl substituiert sein kann mit 1 bis 3 Substituenten, wobei die Substi- tuenten unabhängig voneinander ausgewählt werden aus der Gruppe, bestehend aus Hydroxy, Amino, Hydroxycarbonyl, Aminocarbonyl, {[Bis(dimethyl- amino)methylen]amino}ethoxy, Phenyl, S- oder 6-gliedriges Heterocyclyl, 5- oder 6-gliedriges Heteroaryl, Benzyloxycarbonyl und Benzyloxycarbonyl- amino,

R ⁴ Wasserstoff, Ci-C ₄ -AIkVl, Cyclopropyl oder Cyclopropylmethyl bedeutet,

und ihre Salze, ihre Solvate und die Solvate ihrer Salze.

Bevorzugt sind auch Verbindungen der Formeln (Ia) und (I), in welchen

R ¹ 2-Methylprop-l-yl, 2,2-Dimethylprop-l-yl, 1-Trimethylsilylmethyl oder 3- Pyridylmethyl bedeutet,

wobei 3-Pyridylmethyl substituiert sein kann mit einem Substituenten Tri- fluormethyl,

R ² 2-Methylprop-l-yl, 2,2-Dimethylprop-l-yl, 2,2-Dimethylbut-l-yl, 2-Ethyl-2- methylbut-1-yl, 2,2-Diethylbut-l-yl, 2,2-Dimethylpent-l-yl oder 1-Trimethyl- silylmethyl bedeutet,

R ³ Ci-C-Alkyl bedeutet,

wobei Alkyl substituiert sein kann mit 1 bis 2 Substituenten, wobei die Substi- tuenten unabhängig voneinander ausgewählt werden aus der Gruppe, bestehend aus Hydroxy, Amino, Hydroxycarbonyl, Aminocarbonyl, {[Bis(dimethyl- amino)methylen]amino}ethoxy, Phenyl, Morpholin-4-yl, Pyrid-2-yl, Pyrid-3-yl, Pyrid-4-yl, Benzyloxycarbonyl und Benzyloxycarbonylamino,

R ⁴ Wasserstoff oder Methyl bedeutet,

und ihre Salze, ihre Solvate und die Solvate ihrer Salze.

Bevorzugt sind auch Verbindungen der Formeln (Ia) und (I), in welchen

R ¹ 2-Methylprop-l-yl bedeutet,

R ² 2-Methylprop-l-yl bedeutet,

R ³ Ci-Cs-Alkyl bedeutet,

wobei Alkyl substituiert sein kann mit einem Substituenten, wobei der Substi- tuent ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus Hydroxy, Amino, Hydroxycarbonyl, Aminocarbonyl, {[Bis(dimethylamino)methylen]amino}eth- oxy, Phenyl, Morpholin-4-yl, Pyrid-3-yl, Benzyloxycarbonyl und Benzyloxycarbonylamino,

R ⁴ Wasserstoff oder Methyl bedeutet,

und ihre Salze, ihre Solvate und die Solvate ihrer Salze.

Bevorzugt sind auch Verbindungen der Formeln (Ia) und (I), in welchen

R ¹ 2,2-Dimethylprop-l-yl bedeutet,

R ² 2,2-Dimethylprop-l-yl bedeutet,

R ³ Ci-Cs-Alkyl bedeutet,

wobei Alkyl substituiert sein kann mit einem Substituenten, wobei der Substi- tuent ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus Hydroxy, Amino, Hydroxycarbonyl, Aminocarbonyl, {[Bis(dimethylamino)methylen]amino}eth- oxy, Phenyl, Morpholin-4-yl, Pyrid-3-yl, Benzyloxycarbonyl und Benzyloxy- carbonylamino,

R ⁴ Wasserstoff oder Methyl bedeutet,

und ihre Salze, ihre Solvate und die Solvate ihrer Salze.

Gegenstand der Erfindung sind ferner Verbindungen, welche der Formel

entsprechen,

in welcher

R ¹ 2-Methylprop-l-yI, 2,2-Dimethylprop-l-yl, l-Trimethylsilylmethyl oder 3- Pyridylmethyl bedeutet,

wobei 3-Pyridylmethyl substituiert sein kann mit einem Substituenten Tri- fluormethyl,

R ² 2-Methylprop-l-yl, 2,2-Dimethylprop-l-yl, 2,2-Dimethylbut-l-yl, 2-Ethyl-2- methylbut-1-yl, 2,2-Diethylbut-l-yl, 2,2-Dimethylpent-l-yl oder 1-Trimethyl- silylmethyl bedeutet,

R ⁵ Wasserstoff oder Methyl bedeutet,

und ihre Salze, ihre Solvate und die Solvate ihrer Salze.

Bevorzugt sind Verbindungen der Formel (IIa), welche der Formel

entsprechen,

in welcher

R ¹ 2-Methylprop-l-yl, 2,2-Dimethylprop-l-yl, 1-Trimethylsilylmethyl oder 3- Pyridylmethyl bedeutet

wobei 3-Pyridylmethyl substituiert sein kann mit einem Substituenten Tri- fluormethyl,

R ² 2-Methylprop-l-yl, 2,2-Dimethylprop-l-yl, 2,2-Dimethylbut-l-yl, 2-Ethyl-2- methylbut-1-yl, 2,2-Diethylbut-l-yl, 2,2-Dimethylpent-l-yl oder 1-Trimethyl- silylmethyl bedeutet,

und ihre Salze, ihre Solvate und die Solvate ihrer Salze.

Bevorzugt sind auch Verbindungen der Formeln (IIa) und (II), in welchen

R ¹ 2-Methylprop-l-yl bedeutet,

R ² 2-Methylprop-l-yl bedeutet,

und ihre Salze, ihre Solvate und die Solvate ihrer Salze.

Bevorzugt sind auch Verbindungen der Formeln (IIa) und (II), in welchen

R ¹ 2,2-Dimethylprop-l-yl bedeutet,

R ² 2,2-Dimethylprop-l-yl bedeutet,

und ihre Salze, ihre Solvate und die Solvate ihrer Salze.

Bevorzugt sind auch Verbindungen der Formeln (Ia), (I), (IIa) und (II), in welchen R ¹ 2-Methylprop-l-yl bedeutet.

Bevorzugt sind auch Verbindungen der Formeln (Ia), (I), (IIa) und (II), in welchen R ² 2-Methylprop-l-yl bedeutet.

Bevorzugt sind auch Verbindungen der Formeln (Ia), (I), (IIa) und (II), in welchen R ¹ und R ² 2,2-Dimethylprop-l-yl bedeuten.

Bevorzugt sind auch Verbindungen der Formeln (Ia), (I), (IIa) und (II), in welchen R ¹ 1-Trimethylsilylmethyl und R ² 3-Pyridylmethyl bedeutet.

Bevorzugt sind auch Verbindungen der Formeln (Ia) und (I), in welchen R ⁴ Wasserstoff bedeutet.

Bevorzugt sind auch Verbindungen der Formeln (Ia) und (IIa), in welchen R ⁵ Methyl bedeutet.

Die in den jeweiligen Kombinationen bzw. bevorzugten Kombinationen von Resten im einzelnen angegebenen Restedefinitionen werden unabhängig von den jeweiligen angegebenen Kombinationen der Reste beliebig auch durch Restedefinitionen anderer Kombination ersetzt.

Ganz besonders bevorzugt sind auch Kombinationen von zwei oder mehreren der oben genannten Vorzugsbereiche.

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der Formel (Ia), wobei Verbindungen der Formel

in welcher

R ¹ , R ² und R ⁵ die oben angegebene Bedeutung haben,

mit Verbindungen der Formel

in welcher

R ³ und R ⁴ die oben angegebene Bedeutung haben,

umgesetzt werden.

Die freie Amino-Gruppe in dem Rest HaN(CHR ² )- wird vor der Umsetzung nach dem Fachmann bekannten Methoden zum Beispiel mit einer Boc-Schutzgruppe oder einer Benzyloxycarbonyl-Schutzgruppe geschützt, die nach der Umsetzung wieder abgespalten wird.

Die Umsetzung erfolgt im Allgemeinen in inerten Lösungsmitteln, in Gegenwart eines Dehydratisierungsreagenzes, gegebenenfalls in Gegenwart einer Base, bevorzugt in einem Temperaturbereich von -30°C bis 50 ⁰ C bei Normaldruck.

Inerte Lösungsmittel sind beispielsweise Halogenkohlenwasserstoffe wie Dichlor- methan oder Trichlormethan, Kohlenwasserstoff wie Benzol, Nitromethan, Dioxan, Dimethylformamid oder Acetonitril. Ebenso ist es möglich, Gemische der Lösemittel einzusetzen. Besonders bevorzugt ist Dichlormethan oder Dimethylformamid.

Basen sind beispielsweise Alkalicarbonate, wie z.B. Natrium- oder Kaliumcarbonat, oder -hydrogencarbonat, oder organische Basen wie Trialkylamine z.B. Triethylamin, N-Methylmorpholin, N-Methylpiperidin, 4-Dimethylaminopyridin oder Diisopropyl- ethylamin.

Als Dehydratisierungsreagenzien eignen sich hierbei beispielsweise Carbodiimide wie z.B. fyλT-Diethyl-, N,N, '-Dipropyl-, λ/,W-Diisopropyl-, tyiV'-Dicyclohexylcarbodiimid, N-ß-DimethylaminoisopropyO-N'-ethylcarbodiimid-hydrochlorid (EDC), N-Cyclo- hexylcarbodiimid-JV'-propyloxymethyl-Polystyrol (PS-Carbodiimid) oder Carbonyl- verbindungen wie Carbonyldiimidazol, oder 1,2-Oxazoliumverbindungen wie 2- Ethyl-5-phenyl-l,2-oxazolium-3-sulfat oder 2-rerr-Butyl-5-methyl-isoxazolium-per- chlorat, oder Acylaminoverbindungen wie 2-Ethoxy-l-ethoxycarbonyl-l,2-dihydro- chinolin, oder Propanphosphonsäureanhydrid, oder Isobutylchloroformat, oder Bis- (2-oxo-3-oxazolidinyl)-phosphorylchlorid, oder O-(Benzotriazol-l-yl)-N _/ N _/ N' _/ N'-tetra- methyluroniumhexafluorophosphat (HBTU), 2-(2-Oxo-l-(2H)-pyridyl)-l, 1,3,3-tetra-

methyluroniumtetrafluoroborat (TPTU) oder O-Cy-Azabenzotriazol-l-yO-tyfyA^N'- tetramethyluroniumhexafluorophosphat (HATU), oder 1-Hydroxybenztriazol (HOBt), oder Benzotriazol-l-yloxytris(dimethylamino)phosphoniumhexafluoro phosphat (BOP), oder Benzotriazol- 1 -yloxytris(pyrrolidino)phosphoniumhexafluorophosphat (PyBOP), oder N-Hydroxysuccinimid, oder Mischungen aus diesen, mit Basen.

Vorzugsweise wird die Kondensation mit HATU und JV-Methylmorpholin durchgeführt.

Bevorzugt sind die Verfahren, in welchen R ⁵ Methyl bedeutet.

Bevorzugt sind auch die Verfahren, in welchen

R ¹ 2-Methylprop-l-yl, 2,2-Dimethylprop-l-yl, 1-Trimethylsilylmethyl oder 3- Pyridylmethyl bedeutet,

wobei 3-Pyridylmethyl substituiert sein kann mit einem Substituenten Tri- fluormethyl,

R ² 2-Methylprop-l-yl, 2,2-Dimethylprop-l-yl, 2,2-Dimethylbut-l-yl, 2-Ethyl-2- methylbut-1-yl, 2,2-Diethylbut-l-yl, 2,2-Dimethylpent-l-yl oder 1-Trimethyl- silylmethyl bedeutet,

R ³ Ci-C ₄ -AIkVl bedeutet,

wobei Alkyl substituiert sein kann mit 1 bis 2 Substituenten, wobei die Substituenten unabhängig voneinander ausgewählt werden aus der Gruppe, bestehend aus Hydroxy, Amino, Hydroxycarbonyl, Aminocarbonyl, {[Bis(dimethyl- amino)methylen]amino}ethoxy, Phenyl, Morpholin-4-yl, Pyrid-2-yl, Pyrid-3-yl, Pyrid-4-yl, Benzyloxycarbonyl und Benzyloxycarbonylamino,

R ⁴ Wasserstoff oder Methyl bedeutet,

Bevorzugt sind auch die Verfahren, in welchen

R ¹ 2-Methylprop-l-yl bedeutet,

R ² 2-Methylprop-l-yl bedeutet,

R ³ Ci-Ca-Alkyl bedeutet,

wobei Alkyl substituiert sein kann mit einem Substituenten, wobei der Substi- tuent ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus Hydroxy, Amino, Hydroxycarbonyl, Aminocarbonyl, {[Bis(dimethylamino)rnethylen]amino}eth- oxy, Phenyl, Morpholin-4-yl, Pyrid-3-yl, Benzyloxycarbonyl und Benzyloxy- carbonylamino,

R ⁴ Wasserstoff oder Methyl bedeutet,

Bevorzugt sind auch die Verfahren, in welchen

R ¹ 2,2-Dimethylprop-l-yl bedeutet,

R ² 2,2-Dimethylprop-l-yl bedeutet,

R ³ Ci-Cs-Alkyl bedeutet,

wobei Alkyl substituiert sein kann mit einem Substituenten, wobei der Substi- tuent ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus Hydroxy, Amino, Hydroxycarbonyl, Aminocarbonyl, {[Bis(dimethylamino)rnethylen]amino}eth- oxy, Phenyl, Morpholin-4-yl, Pyrid-3-yl, Benzyloxycarbonyl und Benzyloxy- carbonylamino,

R ⁴ Wasserstoff oder Methyl bedeutet,

Die Verbindungen der Formeln (Ia), (I), (IIa) und (II), die als Salze vorliegen, können zum Beispiel durch Umsetzung mit Salzsäure oder Methansulfonsäure in ein Salz mit einem anderen Gegenion überfuhrt werden.

Die Verbindungen der Formeln (Ia), (I), (IIa) und (II), die als Salze vorliegen, können durch Umsetzung mit einer Base in die freie Base überführt werden.

Die Verbindungen der Formel (III) sind bekannt oder lassen sich nach bekannten Verfahren aus den entsprechenden Edukten synthetisieren.

überraschend wurde gefunden, dass Verbindungen der Formel (IIa) hergestellt werden können durch selektive Hydrolyse von Verbindungen der Formel

in welcher

R ¹ , R ² und R ^s die oben angegebene Bedeutung haben,

mit einer Säure in einem geeigneten Lösungsmittel.

Die Umsetzung erfolgt im Allgemeinen in einem Lösungsmittel, bevorzugt in einem Temperaturbereich von Raumtemperatur bis 50 ⁰ C bei Normaldruck.

Lösungsmittel sind beispielsweise Gemische von Dioxan mit Wasser oder Tetrahydro- furan mit Wasser.

Säuren sind beispielsweise Mineralsäuren wie Salzsäure oder andere starke Säuren wie Methansulfonsäure, bevorzugt ist Salzsäure.

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der Formel (IIa) durch Hydrolyse einer Verbindung der Formel (IVa) mit einer Säure in einem geeigneten Lösungsmittel.

Bevorzugt wird das Verfahren in einem Temperaturbereich von Raumtemperatur bis 5O ⁰ C bei Normaldruck durchgeführt.

Besonders bevorzugt wird das Verfahren bei Raumtemperatur unter Normaldruck durchgeführt.

Bevorzugt ist das Lösungsmittel ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus, Dioxan, Tetrahydrofuran, Wasser und Mischungen davon.

Besonders bevorzugt ist das Lösungsmittel ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Gemisch von Dioxan mit Wasser und einem Gemisch von Tetrahydrofuran mit Wasser.

Bevorzugt ist die Säure ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Mineralsäuren und anderen starken Säure, insbesondere ist die Säure eine Mineralsäure.

Bevorzugt ist die Säure ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Salzsäure und Methansulfonsäure.

Besonders bevorzugt ist die Säure Salzsäure.

Bevorzugt sind die Verfahren, in denen R ⁵ Methyl bedeutet.

Bevorzugt sind auch die Verfahren, in denen R ¹ und R ² 2-Methylprop-l-yl bedeuten.

Bevorzugt sind auch die Verfahren, in denen R ¹ und R ² 2,2-Dimethylprop-l-yl bedeuten.

Die Verbindungen der Formel (IVa) sind bekannt oder können hergestellt werden, indem Verbindungen der Formel

in welcher R ^s die oben angegebene Bedeutung hat,

mit Verbindungen der Formel

in welcher

R ¹ und R ² die oben angegebene Bedeutung haben, und

X ¹ Halogen, bevorzugt Brom, Chlor oder Fluor, oder Hydroxy bedeutet,

umgesetzt werden.

Falls X ¹ für Halogen steht, erfolgt die Umsetzung im Allgemeinen in inerten Lösungsmitteln, gegebenenfalls in Gegenwart einer Base, bevorzugt in einem Temperaturbereich von -3O ⁰ C bis 50 ⁰ C bei Normaldruck.

Inerte Lösungsmittel sind beispielsweise Tetrahydrofuran, Methylenchlorid, Pyridin, Dioxan oder Dimethylformamid. Als inerte Lösungsmittel sind Tetrahydrofuran oder Methylenchlorid bevorzugt.

Basen sind beispielsweise Triethylamin, Diisopropylethylamin oder N-Methyl- morpholin, bevorzugt ist Diisopropylethylamin.

Falls X ¹ für Hydroxy steht, erfolgt die Umsetzung im Allgemeinen in inerten Lösungsmitteln, in Gegenwart eines Dehydratisierungsreagenzes, gegebenenfalls in Gegenwart einer Base, bevorzugt in einem Temperaturbereich von -30 ⁰ C bis 5O ⁰ C bei Normaldruck.

Inerte Lösungsmittel sind beispielsweise Halogenkohlenwasserstoffe wie Dichlor- methan oder Trichlormethan, Kohlenwasserstoff wie Benzol, Nitromethan, Dioxan, Dimethylformamid oder Acetonitril. Ebenso ist es möglich, Gemische der Lösemittel einzusetzen. Besonders bevorzugt ist Dichlormethan oder Dimethylformamid.

Als Dehydratisierungsreagenzien eignen sich hierbei beispielsweise Carbodiimide wie z.B. N,N '-Diethyl-, N,N, '-Dipropyl-, N,N'-Diisopropyl-, fyN'-Dicyclohexylcarbodiimid,

N-Q-DimethylaminoisopropyO-N'-ethylcarbodiimid-hydrochlorid (EDC), N-Cyclo- hexylcarbodiimid-N'-propyloxymethyl-Polystyrol (PS-Carbodiimid) oder Carbonyl- verbindungen wie Carbonyldiimidazol, oder 1,2-Oxazoliumverbindungen wie 2- Ethyl-5-phenyl-l,2-oxazolium-3-sulfat oder 2-terr-Butyl-5-methyl-isoxazolium-per- chlorat, oder Acylaminoverbindungen wie 2-Ethoxy-l-ethoxycarbonyl-l,2-dihydro- chinolin, oder Propanphosphonsäureanhydrid, oder Isobutylchloroformat, oder Bis- (2-oxo-3-oxazolidinyl)-phosphorylchlorid oder Benzotriazolyloxy-tri(dimethylami- no)phosphoniumhexafluorophosphat, oder O-(Benzotriazol-l-yl)-N _/ λ/ ^' _/ λr' _/ ./V'-tetra- methyluroniumhexafluorophosphat (HBTU), 2-(2-Oxo-l-(2H)-pyridyl)-l,l,3,3-tetra- methyluroniumtetrafluoroborat (TPTU) oder O-(7-Azabenzotriazol-l-yl)-N _/ N _/ N' _/ N'- tetramethyluroniumhexafluorophosphat (HATU), oder 1-Hydroxybenztriazol (HOBt), oder Benzotriazol- 1 -yloxytris(dimethylamino)phosphoniumhexafluorophosphat (BOP), oder N-Hydroxysuccinimid, oder Mischungen aus diesen, mit Basen.

Basen sind beispielsweise Alkalicarbonate, wie z.B. Natrium- oder Kaliumcarbonat, oder -hydrogencarbonat, oder organische Basen wie Trialkylamine z.B. Triethylamin, N-Methylmorpholin, N-Methylpiperidin, 4-Dimethylaminopyridin oder Diisopropyl- ethylamin.

Vorzugsweise wird die Kondensation mit HATU oder mit EDC in Gegenwart von HOBt durchgeführt.

Die Verbindungen der Formel (VI) tragen gegebenenfalls Schutzgruppen, so dass sich in diesen Fällen der Umsetzung der Verbindung der Formel (Va) mit Verbindungen der Formel (VI) eine Abspaltung der Schutzgruppen mit zum Beispiel Trifluor- essigsäure nach dem Fachmann bekannten Methoden anschließt.

Die Verbindungen der Formel (Va) lassen sich durch doppelten Edmann-Abbau aus Lysobactin (Beispiel IA) oder Katanosin A synthetisieren.

Die Verbindungen der Formel (VI) sind bekannt oder lassen sich nach bekannten Verfahren aus den entsprechenden Edukten synthetisieren.

Die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen kann durch folgendes Syntheseschema verdeutlicht werden.

Syntheseschema:

/ WWaasssseerr

Die erfindungsgemäßen Verbindungen der Formeln (Ia) und (I) zeigen ein nicht vorhersehbares, wertvolles pharmakologisches Wirkspektrum. Sie zeigen eine antibakterielle Wirkung.

Sie eignen sich daher zur Verwendung als Arzneimittel zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Krankheiten bei Menschen und Tieren.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen der Formeln (Ia) und (I) zeichnen sich durch eine höhere freie Fraktion (f _u ) in Ratten- und Humanplasma gegenüber Lysobactin aus.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen der Formeln (Ia) und (I) zeichnen sich durch eine geringere Nephrotoxizität gegenüber Lysobactin aus.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen der Formeln (Ia) und (I) zeichnen sich durch eine bessere Löslichkeit gegenüber Lysobactin aus.

Die beschriebenen Nonadepsipeptide wirken als Inhibitoren der bakteriellen Zellwandbiosynthese.

Besonders wirksam sind die erfindungsgemäßen Zubereitungen gegen Bakterien und bakterienähnliche Mikroorganismen. Sie sind daher besonders gut zur Prophylaxe und Chemotherapie von lokalen und systemischen Infektionen in der Human- und Tiermedizin geeignet, die durch diese Erreger hervorgerufen werden.

Grundsätzlich können die erfindungsgemäßen Zubereitungen gegen alle Bakterien und bakterienähnlichen Mikroorganismen verwendet werden, die im Besitz einer bakteriellen Zellwand (Murein sacculus) bzw. den dazugehörigen Enzymsystemen sind, beispielsweise gegen die folgenden Erreger oder gegen Mischungen der folgenden Erreger:

Gram-negative Kokken (Neisseria gonoπhoeae) sowie Gram-negative Stäbchen wie Enterobakteriaceen, z.B. Escherichia coli, Hämophilus influenzae, Pseudomonas, Klebsiella, Citrobacter (C. freundii, C. divernis), Salmonella und Shigella; ferner Enterobacter (E. aerogenes, E. agglomerans) , Hafnia, Serratia (5. marcescens), Providencia, Yersinia, sowie die Gattung Acinetobacter, Branhamella und Chlamydia. Darüber hinaus umfasst das antibakterielle Spektrum strikt anaerobe Bakterien wie z.B. Bacteroides fragilis, Vertreter der Gattung Peptococcus, Peptostreptococcus sowie die Gattung Clostridium; ferner Mykobakterien, z.B. M. tuberculosus. Besonders ausgeprägte Wirkung zeigen die erfindungsgemäßen Verbindungen gegen Gram-positive Kokken, z.B. Staphylokokken (S. aureus, S. epidermidis, S. haemolγticus, S. carnosus), Enterokok- ken (E. faecalis, E. faecium) und Streptokokken (S. agalactiae, S. pneumoniae, S. pγoge- nes).

Die obige Aufzählung von Erregern ist lediglich beispielhaft und keineswegs beschränkend aufzufassen. Als Krankheiten, die durch die genannten Erreger oder Mischinfektionen verursacht und durch die erfindungsgemäßen Zubereitungen verhindert, gebessert oder geheilt werden können, seien beispielsweise genannt:

Infektionskrankheiten beim Menschen wie z.B. unkomplizierte und komplizierte Harnwegsinfekte, unkomplizierte Haut- und Oberflächeninfektionen, komplizierte Haut- und Weichteilinfektionen, im Hospital und ambulant erworbene Lungenentzündung, nosokomiale Pneumonien, akute Exazerbationen und sekundäre bakterielle Infektionen der chronischen Bronchitis, akute Otitis media, akute Sinusitis, streptokokkale Pharyngitis, bakterielle Meningitis, unkomplizierte gonokokkale und nicht-gonokokkale Urethritis/Cervizitis, akute Prostatitis, Endocarditis, unkomplizierte und komplizierte intra-abdominale Infektionen, gynäkologische Infektionen, pelvische Entzündungskrankheit, bakterielle Vaginose, akute und chronische Osteomyelitis, akute bakterielle Arthritis, empirische Therapie in febrilen neutropenischen Patienten, des Weiteren Bakterämien, MRSA Infektionen, akute infektiöse Diarrhoe, Helicobacter pylori Infektionen, postoperative Infektionen, odontogene Infektionen, ophthalmologische Infektionen, postoperative Infektionen (inkl. periproktaler Abszess, Wundinfektionen, Galleninfektionen, Mastitis und akute Appendizitis), zystische Fibrose und Bronchiectasis.

Außer beim Menschen können bakterielle Infektionen auch bei anderen Spezies behandelt werden. Beispielhaft seien genannt:

Schwein: Diarrhoe, Enterotoxamie, Sepsis, Dysenterie, Salmonellose, Metritis- Mastitis-Agalaktiae-Syndrom, Mastitis;

Wiederkäuer (Rind, Schaf, Ziege): Diarrhoe, Sepsis, Bronchopneumonie, Salmonellose, Pasteurellose, Genitalinfektionen;

Pferd: Bronchopneumonien, Fohlenlähme, puerperale und postpuerperale Infektionen, Salmonellose;

Hund und Katze: Bronchopneumonie, Diarrhoe, Dermatitis, Otitis, Harnwegsinfekte, Prostatitis;

Geflügel (Huhn, Pute, Wachtel, Taube, Ziervögel und andere): E. co/Mnfektionen, chronische Luftwegserkrankungen, Salmonellose, Pasteurellose, Psittakose.

Ebenso können bakterielle Erkrankungen bei der Aufzucht und Haltung von Nutz- und Zierfischen behandelt werden, wobei sich das antibakterielle Spektrum über die vorher genannten Erreger hinaus auf weitere Erreger wie z.B. Pasteurella, Brucella, Campylobacter, Listeria, Erysipelothris, Corynebakterien, Borellia, Treponema, Nocardia, Rikettsia, Yersinia, erweitert.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen der Formeln (IIa) und (II) bilden wichtige Zwischenstufen in der Synthese der Verbindungen der Formeln (Ia) und (I).

Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist der Einsatz der erfindungsgemäßen Verbindungen der Formeln (Ia) und (I) zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Erkrankungen, insbesondere von bakteriellen Infektionskrankheiten.

Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen der Formeln (Ia) und (I) zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Erkrankungen, insbesondere der zuvor genannten Erkrankungen.

Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen der Formeln (Ia) und (I) zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Erkrankungen, insbesondere der zuvor genannten Erkrankungen.

Bevorzugt werden die erfindungsgemäßen Verbindungen der Formeln (Ia) und (I) zur Herstellung von Arzneimitteln verwendet, die zur Prophylaxe und/oder Behandlung von bakteriellen Erkrankungen geeignet sind.

Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Erkrankungen, insbesondere der zuvor genannten Erkran-

kungen, unter Verwendung einer antibakteriell wirksamen Menge der erfindungsgemäßen Verbindungen der Formeln (Ia) und (I).

Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Arzneimittel, enthaltend mindestens eine erfindungsgemäße Verbindung der Formeln (Ia) und (I) und mindestens einen oder mehrere weitere Wirkstoffe, insbesondere zur Behandlung und/oder Prophylaxe der zuvor genannten Erkrankungen. Bevorzugte Kombinationswirkstoffe sind antibakteriell wirkende Verbindungen, die ein anderes Wirkspektrum, insbesondere ergänzendes Wirkspektrum, haben und/oder synergistisch zu den erfindungsgemäßen Verbindungen sind.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen der Formeln (Ia) und (I) können systemisch und/oder lokal wirken. Zu diesem Zweck können sie auf geeignete Weise appliziert werden, wie z.B. oral, parenteral, pulmonal, nasal, sublingual, lingual, buccal, rectal, dermal, transdermal, conjunctivae otisch oder als Implantat bzw. Stent.

Für diese Applikationswege können die erfindungsgemäßen Verbindungen in geeigneten Applikationsformen verabreicht werden.

Für die orale Applikation eignen sich nach dem Stand der Technik funktionierende schnell und/oder modifiziert die erfindungsgemäßen Verbindungen abgebende Applikationsformen, die die erfindungsgemäßen Verbindungen in kristalliner und/oder amorphisierter und/oder gelöster Form enthalten, wie z.B. Tabletten (nicht überzogene oder überzogene Tabletten, beispielsweise mit magensaftresistenten oder sich verzögert auflösenden oder unlöslichen überzügen, die die Freisetzung der erfindungsgemäßen Verbindung kontrollieren), in der Mundhöhle schnell zerfallende Tabletten oder Filme/Oblaten, Filme/Lyophilisate, Kapseln (beispielsweise Hartoder Weichgelatinekapseln), Dragees, Granulate, Pellets, Pulver, Emulsionen, Suspensionen, Aerosole oder Lösungen.

Die parenterale Applikation kann unter Umgehung eines Resorptionsschrittes geschehen (z.B. intravenös, intraarteriell, intrakardial, intraspinal oder intralumbal) oder unter Einschaltung einer Resorption (z.B. intramuskulär, subcutan, intracutan, percutan oder intraperitoneal). Für die parenterale Applikation eignen sich als Applikationsformen u.a. Injektions- und Infusionszubereitungen in Form von Lösungen, Suspensionen, Emulsionen, Lyophilisaten oder sterilen Pulvern.

Für die sonstigen Applikationswege eignen sich z.B. Inhalationsarzneiformen (u.a. Pulverinhalatoren, Nebulizer), Nasentropfen, -lösungen, -sprays; lingual, sublingual oder buccal zu applizierende Tabletten, Filme/Oblaten oder Kapseln, Suppositorien, Ohren- oder Augenpräparationen, Vaginalkapseln, wässrige Suspensionen (Lotionen, Schüttelmixturen), lipophile Suspensionen, Salben, Cremes, transdermale therapeutische Systeme (wie beispielsweise Pflaster), Milch, Pasten, Schäume, Streupuder, Implantate oder Stents.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen der Formeln (Ia) und (I) können in die angeführten Applikationsformen überführt werden. Dies kann in an sich bekannter Weise durch Mischen mit inerten, nichttoxischen, pharmazeutisch geeigneten Hilfsstoffen geschehen. Zu diesen Hilfsstoffen zählen u.a. Trägerstoffe (beispielsweise mikrokristalline Cellulose, Laktose, Mannitol), Lösungsmittel (z.B. flüssige Polyethy- lenglykole), Emulgatoren und Dispergier- oder Netzmittel (beispielsweise Natriumdo- decylsulfat, Polyoxysorbitanoleat), Bindemittel (beispielsweise Polyvinylpyrrolidon), synthetische und natürliche Polymere (beispielsweise Albumin), Stabilisatoren (z.B. Antioxidantien wie beispielsweise Ascorbinsäure), Farbstoffe (z.B. anorganische Pigmente wie beispielsweise Eisenoxide) und Geschmacks- und/oder Geruchskorri- gentien.

Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Arzneimittel, die mindestens eine erfindungsgemäße Verbindung der Formeln (Ia) und (I), üblicherweise zusammen mit einem oder mehreren inerten, nichttoxischen, pharmazeutisch geeigneten Hilfsstoffen enthalten, sowie deren Verwendung zu den zuvor genannten Zwecken.

Im Allgemeinen hat es sich als vorteilhaft erwiesen, bei intravenöser Applikation Mengen von etwa 0.001 bis 100 mg/kg, vorzugsweise etwa 0.1 bis 10 mg/kg Körpergewicht zur Erzielung wirksamer Ergebnisse zu verabreichen, und bei oraler Applikation beträgt die Dosierung etwa 0.01 bis 50 mg/kg, vorzugsweise 0.5 bis 10 mg/kg Körpergewicht.

Trotzdem kann es gegebenenfalls erforderlich sein, von den genannten Mengen abzuweichen, und zwar in Abhängigkeit von Körpergewicht, Applikationsweg, individuellem Verhalten gegenüber dem Wirkstoff, Art der Zubereitung und Zeitpunkt bzw. Intervall, zu welchem die Applikation erfolgt. So kann es in einigen Fällen ausreichend sein, mit weniger als der vorgenannten Mindestmenge auszukommen, während in anderen Fällen die genannte obere Grenze überschritten werden muss. Im Falle der Applikation größerer Mengen kann es empfehlenswert sein, diese in mehreren Einzelgaben über den Tag zu verteilen.

Die Prozentangaben in den folgenden Tests und Beispielen sind, sofern nicht anders angegeben, Gewichtsprozente; Teile sind Gewichtsteile. Lösungsmittelverhältnisse, Verdünnungsverhältnisse und Konzentrationsangaben von flüssig/flüssig-Lösungen beziehen sich jeweils auf das Volumen.

A. Beispiele

Abkürzungen

AHg. Allgemein(e)

Area (Peak)fläche ber. berechnet

BHI Brain Heart Infusion

Boc tert-Butyloxycarbonyl br. breites Signal (bei NMR-Spektren)

Bsp. Beispiel d Dublett (bei NMR-Spektren)

DC Dünnschichtchromatographie

DCI direkte chemische Ionisation (bei MS)

DCM Dichlormethan

DIEA N _/ N-Diisopropylethylamin

DMSO Dimethylsulfoxid

DMF λ7,2V-Dimethylformamid d. Th. der Theorie

EDC l-Ethyl-3-(3-dimethylarninopropyl)carbodiimide (auch EDCI)

EDCxHCl l-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiirnide-hydrochlorid

EE Ethylacetat (Essigsäureethylester)

EI Elektronenstoß-Ionisation (bei MS)

ESI Elektrospray-Ionisation (bei MS)

Fp. Schmelzpunkt gef. gefunden ges. gesättigt h Stunde

HATU O-(7-Azabenzotriazol-l-yl)-N _/ W _/ N ^/ _/ N ^/ -tetramethyluronium- hexafluorphosphat

HOBt 1 -Hydroxybenzotriazol

HPLC Hochdruck-, Hochleistungsflüssigchromatographie

HR High Resolution (Hochauflösung) i. V. im Vakuum konz. konzentriert

LC-MS Flüssigchromatographie-gekoppelte Massenspektroskopie

LDA Lithium-Diisopropylamid m middle (mittel) (bei UV- und IR-Spektren) m Multiple« (bei NMR-Spektren)

MALDI Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization

MHK Minimale Hemmkonzentration min Minute/Minuten

MRSA Methicillin-resistenter Staphγlococcus aureus

MS Massenspektroskopie

NCCLS National Committee for Clinical Laboratory Standards neg. negativ

NMM N-Methylmorpholin

NMR Kernresonanzspektroskopie (nuclear magnetic resonance) p.a. pro analysi

Pd-C Palladium auf Kohle pos. positiv proz. prozentig quant. quantitativ

RP-HPLC Reverse Phase HPLC

RT Raumtemperatur

R, Retentionszeit (bei HPLC) s strong (stark) (bei UV- und IR-Spektren) s Singulett (bei NMR-Spektren)

TBTU 0-(Benzotriazol-l-yl)-N _/ N _/ N' _/ N'-tetramethyluronium- tetrafluoroborat

TCTU 0-(lH-6-Chlorbenzotriazol-l-yl)-l,l,3,3-tetramethyluronium- tetrafluoroborat

TFA Trifluoressigsäure

TFE 2,2,2-Trifluorethanol

THF Tetrahydrofuran

TOF Flugzeit (time of flight)

UV Ultraviolett

Vis sichtbar (visible)

VRSA Vancomycin-resistenter Staphylococcus aureus w weak (schwach) (bei UV- und IR-Spektren)

Z, Cbz Benzyloxycarbonyl

Literatur

Zur Nomenklatur der Peptide und Cyclodepsipeptide vergleiche:

1. A Guide to IUPAC Nomenclature of Organic Compounds (Recommendations 1993), 1993, Blackwell Scientific publications.

2. Nomenclature and symbolism for amino acids and peptides. Recommendations 1983. IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature, UK. Biochemical Journal 1984, 219, 345-373. Sowie zitierte Literatur.

3. Zur Nomenklatur von Nonadepsipeptid-Derivaten, die in den Aminosäure- Seitenketten derivatisiert sind, wird das IUPAC-Prefix-System zur Adressierung der jeweiligen Derivatisierungsstelle verwendet (IUPAC, Nomenclature and Symbolism for Amino Acids and Peptides, Names and Symbols for Derivatives of Named Peptides, Section 3AA-22, Recommendations 1983-1992). So bezeichnet beispielsweise N ^ω - ⁶ -Acetyl-lysobactin ein an der Aminosäure 6 (vom N-Terminus des Depsipeptids gerechnet, d.h. hier D-Arg) speziell am terminalen Stickstoffatom acetyliertes Lysobactin. Analog bezeichnet O ^{3 11} -Methy\- lysobactin ein an der Aminosäure 11 (Ser) am Seitenkettensauerstoffatom (O ³ ) methyliertes Derivat.

Allgemeine Methoden LC-MS, HR-MS. HPLC und Gelchromatographie

Methode 1 (HPLC): Gerätetyp HPLC: HP 1100 Series; UV DAD Säule: Zorbax Eclipse XBD-C8 (Agilent), 150 mm x 4.6 mm, 5 μm; Eluent A: 5 ml HC1O ₄ /1 Wasser, Eluent B: Acetonitril; Gradient: 0-1 min 10%B, 1-4 min 10-90%B, 4-5 min 90%B; Fluss: 2.0 ml/min; Ofen: 3O ⁰ C; UV-Detektion: 210 und 254 nm.

Methode 2 (HPLC): Säule: Kromasil RP-18, 60 mm x 2 mm, 3.5 μm; Eluent A: 5 ml HCIO4/I Wasser, Eluent B: Acetonitril; Gradient: 0 min 2%B, 0.5 min 2%B, 4.5 min 90%B, 9 min 90%B; Fluss: 0.75 ml/min; Ofen: 30 ⁰ C; UV-Detektion: 210 nm.

Methode 3 (LC-MS): Gerätetyp MS: Micromass ZOj Gerätetyp HPLC: HP 1100 Series; UV DAD; Säule: Phenomenex Synergi 2μ Hydro-RP Mercury 20 mm x 4 mm; Eluent A: 1 1 Wasser + 0.5 ml 50%ige Ameisensäure, Eluent B: 1 1 Acetonitril + 0.5 ml 50%ige Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 90%A -» 2.5 min 30%A -» 3.0 min 5%A -> 4.5 min 5%A; Fluss: 0.0 min 1 ml/min, 2.5 min/3.0 min/4.5 min. 2 ml/min; Ofen: 50°C; UV- Detektion: 210 nm.

Methode 4 (HPLC): Säule: Kromasil RP-18, 250 mm x 4 mm, 5 μm; Eluent A: 5 ml HCIO4/I Wasser, Eluent B: Acetonitril; Gradient: 0 min 5%B, 10 min 95%B; Fluss: 1 ml/min; Ofen: 40 ⁰ C; UV-Detektion: 210 nm.

Methode 5 (HPLC): Säule: Kromasil RP- 18, 250 mm x 4 mm, 5 μm; Eluent A: 2 ml HCIO ₄ /I Wasser, Eluent B: Acetonitril; Isokratisch: 45%B, 55%A; Fluss: 1 ml/min; Ofen: 40°C; UV-Detektion: 210 nm.

Methode 6 (präparative HPLC): Gerät: Gilson Abimed HPLC; binäres Pumpensystem; Säule: Nucleodur Ci ₈ Gravity, Fa. Macherey-Nagel, 5 μm; 250 mm x 21 mm; Eluent A: Wasser/0.05-0.1% Trifluoressigsäure, Eluent B: Acetonitril/ 0.05-0.1% Trifluoressigsäure; Gradient: 0-8 min 5%B, 8-40 min 5-60%B, 40-60 min 60%B,

60-75 min 60-100%B, 75-80 min 100%B, anschließend Regeneration der Chromatographiesäule; Fluss: 7-15 ml/min; UV-Detektion: 210 nm.

Methode 7 (präparative HPLC): Gerät: Gilson Abimed HPLC; binäres Pumpensystem; Säule: Kromasil-IOOA Ci ₈ , 5 μm; 250 mm x 30 mm; Eluent A: Wasser/0.05-0.5% TFA, Eluent B: Acetonitril; Gradient: 0-5 min 5%B, 5.01-10 min 10%B, 10.01-20 min 40%B, 20.01-27 min 50%B, 27.01-40 min 60%B, 40.01-45 min 90%B, 45.01-60 min 100%B; Fluss: 15-60 ml/min; UV Detektor 210 nm.

Methode 8 (präparative HPLC): Gerät: Gilson Abimed HPLC; binäres Pumpensystem; Säule: Kromasil-100A Ci ₈ , 5 μm; 250 mm x 30 mm; Eluent A: Wasser/0.05-0.5% Trifluoressigsäure, Eluent B: Acetonitril; 0-10 min 10%B, Rampe, 10.01-55 min 100% B; Fluss: 30 ml/min; UV Detektor 210 nm.

Methode 9 (Gelchromatographie Sephadex LH-20): Gelchromatographie wird ohne Druck an Sephadex LH-20 (Firma Pharmacia) durchgeführt. Es wird nach UV- Aktivität (UV Detektor für 210 nm, Firma Knauer) fraktioniert (Fraktionssammler ISCO Foxy 200). Säulendimensionen: 60 x 21 cm (2500-5000 μmol Maßstab); 50 x 10 cm (500-2500 μmol Maßstab); 30 x 5 cm (250-500 μmol Maßstab); 25 x 4 cm (50-250 μmol Maßstab); 40 x 2 cm (5-50 μmol Maßstab).

Methode 10 (LC-MS): Gerätetyp MS: Micromass ZOj Gerätetyp HPLC: Waters Allian- ce 2795/HP 1100; Säule: Phenomenex Synergi 2 μ Hydro-RP Mercury 20 mm x 4 mm; Eluent A: 1 1 Wasser + 0.5 ml 50%ige Ameisensäure, Eluent B: 1 1 Acetonitril + 0.5 ml 50%ige Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 90%A -> 2.5 min 30%A -» 3.0 min 5%A -> 4.5 min 5%A; Fluss: 0.0 min 1 ml/min, 2.5 min/3.0 min/4.5 min 2 ml/min; Ofen: 50 ⁰ C; UV-Detektion: 210 nm.

Methode 11 (TOF-HR-MS): TOF-HR-MS-ESI+ Spektren werden mit einem Micromass LCT Gerät (Kapillarspannung: 3.2 KV, Cone-Spannung: 42 V, Quellentemperatur: 120 ⁰ C, Desolvations-Temperatur: 280 ⁰ C) aufgenommen. Hierzu wird eine Spritzen-

pumpe (Fa. Harvard Apparatus) für die Probenzuführung verwendet. Als Standard dient Leucin-Enkephalin (Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu).

Methode 12 (HPLC): Säule: Gilson Abimed HPLC; Varian binäres Pumpensystem; Phenomenex Luna Cl 8 5μ 250 mm x 20 mm; Fluss: 25 ml/min; Ofen: RT; UV- Detektion: 210 nm; Eluent A: Wasser/0.2% TFA, Eluent B: Acetonitril; Isokratisch 50%B.

Methode 13 (HPLC): Säule: Gilson Abimed HPLC; Varian binäres Pumpensystem; Kromasil 100 C18 5μ 250 mm x 20 mm; Fluss: 25 ml/min; Ofen: RT; UV-Detektion: 210 nm; Eluent A: Wasser/0.2% TFA, Eluent B: Acetonitril; Isokratisch 65%B.

Methode 14 (analytische HPLC): Gerätetyp HPLC: HP 1100 Series; UV DAD; Säule: Phenomenex Synergi 2 μ Hydro-RP Mercury 20 mm x 4 mm; Eluent A: 1 1 Wasser + 0.5 ml 50%ige Ameisensäure, Eluent B: 1 1 Acetonitril + 0.5 ml 50%ige Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 90%A -> 2.5 min 30%A -> 3.0 min 5%A -» 4.5 min 5%A; Fluss: 0.0 min 1 ml/min, 2.5 min/3.0 min/4.5 min. 2 ml/min; Ofen: 5O ⁰ C; UV-Detektion: 210 nm.

Methode 15 (analytische HPLC): Gerätetyp HPLC: HP 1050 Series; UV DAD; Säule: Zorbax 300 mSB-C18 3.5 μ, 4.6 mm x 150 mm; Eluent A: 1 1 Wasser + 0.1% Trifluo- ressigsäure, Eluent B: 400 ml Acetonitril/ 600 ml Wasser + 0.1% Trifluoressigsäure; Gradient: 0.0 min 100%A, 1.3 min 10%B, 18.0 min 80%B, 20.0 min 80%B, 21.0 min 100%B, 25.0 min 100%B, 26.0 min 0%B, 30.0 min 0%B. Fluss: 1 ml/min; Ofen: 4O ⁰ C; UV-Detektion: 210 nm.

Methode 16 (analytische HPLC): Gerätetyp HPLC: HP 1050 Series; UV DAD; Säule: Zorbax 300 mSB-C18 3.5 μ, 4.6 mm x 150 mm; Eluent A: 1 1 Wasser + 0.1% Trifluoressigsäure, Eluent B: 400 ml Acetonitril/600 ml Wasser + 0.1% Trifluoressigsäure; Gradient: 0.0 min 100%A, 2.0 min 10%B, 50.0 min 80%B, 52.0 min 100%B,

55.0 min 100%A, 60.0 min 100%A. Fluss: 1 ml/min; Ofen: 40 ⁰ C; UV-Detektion: 210 nm.

Allgemeine Arbeitsvorschriften

Allgemeine Arbeitsvorschrift 1 (Abspaltung von Boc-Schutzgruppen mit TFA)

Die Boc-geschützte Verbindung (2-15 μmol) wird in Dichlormethan suspendiert (1 ml) und anschließend unter Argon-Schutzgasatmosphäre mit Trifluoressigsäure (3 ml) in Dichlormethan (10 ml) versetzt und so lange bei RT gerührt bis das HPLC- Chromatogramm vollständigen Umsatz zeigt (z. B. Methode 14). Dann wird das Lösungsmittel im Vakuum abdestilliert, wobei die Badtemperatur 3O ⁰ C nicht übersteigen soll. Das Rohprodukt wird in Toluol suspendiert, erneut am Rotationsverdampfer eingeengt und im Hochvakuum getrocknet. Diese Prozedur wird mehrfach wiederholt (2-5 x).

Allgemeine Arbeitsvorschrift 2 (Hydrogenolytische Esterspaltung/Carbamid- spaltung)

Der peptidische Benzylester (1-15 μmol) wird in Dioxan (2 ml) und 0.1%ige wässriger Trifluoressigsäure (3 ml) gelöst und unter Argonschutzgasatmosphäre mit 10%iger Palladium-Kohle (10 mol%) versetzt. Bei RT und Normaldruck wird so lange hydriert bis die analytische HPLC (z. B. Methode 14) vollständigen Umsatz (ca. 30 min) zeigt. Das Reaktionsgemisch wird filtriert (z.B. über Spritzenfilter, Kieselgur, Celite ^® ) und über die präparative RP-HPLC feingereinigt.

Allgemeine Arbeitsvorschrift 3 (Amidkupplung)

Zu einer Lösung des Carbonsäurecyclopeptids (1.0 äquivalente) und des Amins (5 - 15 äquivalente) in trockenem DMF (5-30 μmol/ml) wird bei 0 ⁰ C unter Argon- Schutzgasatmosphäre zunächst HATU (5-15 äquivalente) und anschließend NMM (5- 20 äquivalente) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird langsam auf RT erwärmt und wird bei dieser Temperatur nachgerührt, bis sich ein vollständiger Umsatz zeigt. Das Reaktionsgemisch wird im Hochvakuum eingedampft und chromatographisch aufgereinigt.

Ausgangsverbindungen

Beispiel IA

D-Leucyl-N ^J -{(35,65, 125 _/ 155, 18 _J R _/ 215,245,275 _/ 28ä)-6-[(15)-2-amino-l-hydroxy-2-oxo- ethyl]-18-(3-{[amino(imino)methyl]amino}propyl)-12-[(lS)-l-h ydroxyethyl]-3-(hy- droxymethyl)-24-[(ii?)-l-hydroxy-2-methylpropyl]-21-isobutyl -15-[(lS)-l-methyl- propyl]-2,5, 8, l l,14,17,20,23,26-nonaoxo-28-phenyl-l-oxa-4,7,10, 13,16,19,22,25- octaazacyclooctacosan-27-yl}-L-leucinamid-bis-trifluoracetat (Lysobactin)

Fermentation:

Kultur Medium:

YM: Hefe-Malz Agar: D-Glucose (4 g/l), Hefe Extrakt (4 g/l), Malz Extrakt (10 g/l), 1 Liter Lewatit Wasser. Vor dem Sterilisieren (20 Minuten bei 121 ⁰ C) wird der pH auf 7.2 eingestellt.

HPM: Mannit (5.4 g/l), Hefe Extrakt (5 g/l), Fleischpepton (3 g/l).

Arbeitskonserve: Der lyophilisierte Stamm (ATCC 53042) wird in 50 ml YM Medium angezogen.

Kolbenfermentation: 150 ml YM Medium oder 100 ml HPM Medium in einem 1 1 Erlenmeyerkolben werden mit 2 ml der Arbeitskonserve beimpft und für 30-48 Stunden bei 28°C auf einem Schüttler bei 240 Upm wachsen gelassen.

30 1 Fermentation: 300 ml der Kolbenfermentation (HPM Medium) werden zum Animpfen einer sterilen 30 1 Nährmedienlösung verwandt (1 ml Antifoam SAG 5693/1). Diese Kultur wird für 21 Stunden bei 28 ⁰ C ₇ 300 Upm und einer Belüftung mit steriler Luft von 0.3 wm wachsen gelassen. Der pH wird mit 1 M Salzsäure auf pH = 7.2 konstant gehalten. Insgesamt werden während der Kultivierungszeit 880 ml 1 M Salzsäure zugeführt.

Hauptkultur (200 D: 15 x 150 ml YM Medium in 1 1 Erlenmeyerkolben werden mit 2 ml der Arbeitskonserve beimpft und bei 28°C für 48 Stunden und 240 Upm auf dem Schüttler wachsen gelassen. 2250 ml dieser Kultur werden zum Beimpfen einer sterilen 200 1 Nährmedienlösung (YM) verwandt (1 ml Antifoam SAG 5693/1) und für 18.5 Stunden bei 28°C, 150 Upm und einer Belüftung mit steriler Luft von 0.3 wm wachsen gelassen.

Zur Kontrolle des Fermentationsverlaufs werden stündlich Proben (50 ml) entnommen. 2 ml dieser Kulturbrühe werden mit 1 ml Methanol (0.5% Trifluoressigsäure) versetzt und über einen 0.45 μm Filter filtriert. 30 μl dieser Suspension werden mittels HPLC analysiert (Methode 1 und Methode 2).

Nach 18.5 Stunden wird die Kulturbrühe der Hauptkultur bei 17000 Upm in überstand und Sediment getrennt.

Isolierung:

Der überstand (183 1) wird mit konzentrierter Trifluoressigsäure bzw. Natronlauge auf pH 6.5-7 eingestellt und auf eine Lewapolsäule (OC 1064, 60 1 Inhalt) aufgetragen. Anschließend wird mit reinem Wasser, Wasser/Methanol 1:1 und anschließend mit reinem Methanol (mit 0.1% Trifluoressigsäure) eluiert. Diese organische Phase wird im Vakuum bis zu einem verbleibenden wässrigen Rest von 11.5 1 eingeengt.

Die verbleibende wässrige Phase wird an Kieselgel Ciβ gebunden und aufgetrennt (MPLC, Biotage Flash 75, 75 x 30 cm, KP-C18-WP, 15-20 μm, Fluss: 30 ml; Eluent: Acetonitril/ Wasser mit 0.1% Trifluoressigsäure; Gradient: 10%, 15% and 40% Aceto- nitril). Die 40% Acetonitril Phase, die die Hauptmenge von Beispiel IA enthält, wird im Vakuum eingeengt und anschließend lyophilisiert (ca. 13 g). Dieses Feststoffgemisch wird in 1.2 g Portionen zunächst an einer präparativen HPLC (Methode 3), anschließend durch Gelfiltration an Sephadex LH-20 (5 x 70 cm, Acetonitril/Wasser 1:1, jeweils mit 0.05% Trifluoressigsäure) und einer weiteren präparativen HPLC (Methode 4) getrennt.

Dieser Prozess liefert 2250 mg Beispiel IA.

Das Sediment wird in 4 1 Aceton/Wasser 4:1 aufgenommen, mit 2 kg Celite versetzt, mit Trifluoressigsäure auf pH = 6 eingestellt, ausgerührt und zentrifugiert. Das Lösungsmittel wird im Vakuum eingeengt und der Rückstand gefriergetrocknet. Das

erhaltene Lyophilisat (89.9 g) wird in Methanol aufgenommen, abfiltriert, eingeengt und an Kieselgel (Methode 5) getrennt. Beispiel IA wird danach per Gelfiltration (Sephadex LH-20, 5 x 68 cm, Wasser/ Acetonitril 9:1 (mit 0.05% Trifluoressigsäure), Fluss: 2.7 ml/min, Fraktionsgröße 13.5 ml) zur Reinsubstanz aufgereinigt.

Dieser Prozess liefert 447 mg Beispiel IA.

HPLC (Methode 1): R _t = 6.19 min

MS (ESIpos): m/z = 1277 (M+H) ⁺

¹ H NMR (500.13 MHz, rf _ö -DMSO): δ = 0.75 (d, 3H), 0.78 (d, 6H), 0.80 (t, 3H), 0.82 (d, 3H), 0.90 (d, 3H), 0.91 (d, 3H), 0.92 (d, 3H), 0.95 (d, 3H), 0.96 (d, 3H), 1.05 (m, IH), 1.19 (d, 3H), 1.25 (m, 2H), 1.50 (m, 4H), 1.51 (m, 2H), 1.55 (m, IH), 1.61 (m, IH), 1.65 (m, IH), 1.84 (m, IH), 1.85 (m, IH), 1.86 (m, IH) , 1.89 (m, IH), 1.95 (m, IH), 2.75 (m, 2H), 3.40 (m, IH), 3.52 (m, 2H), 3.53 (dd, IH), 3.64 (m, 2H), 3.66 (m, IH), 3.68 (dd, IH), 3.73 (m, 2H), 4.00 (dd, IH), 4.02 (br., IH), 4.13 (br., IH), 4.32 (dd, IH), 4.39 (t, IH), 4.55 (m, IH), 4.75 (dd, IH), 5.19 (t, IH), 5.29 (d, IH), 5.30 (br., IH), 5.58 (m, 2H), 6.68 (m, 3H), 6.89 (d, IH), 6.93 (m, 3H), 6.94 (br., IH), 6.98 (d, IH), 7.12 (br., IH), 7.20 (br., 2H), 7.23 (m, 2H), 7.42 (m, 2H), 7.54 (d, IH), 7.58 (d, IH), 8.32 (br., IH), 9.18 (br., IH), 9.20 (m, 2H), 9.50 (br., IH).

¹³ C-NMR (125.77 MHz, ^ ₆ -DMSO): δ = 10.3, 15.3, 19.0, 19.2, 19.6, 20.0, 20.9, 22.0, 22.4, 23.0, 23.2, 24.3, 24.4, 25.0, 25.4, 26.0, 27.8, 30.9, 35.4, 39.5, 40.8, 40.9, 41.6, 44.1, 51.5, 52.7, 55.9, 56.2, 56.4, 57.9, 58.8, 60.2, 61.1, 62.6, 70.1, 71.6, 71.7, 75.5, 128.1, 128.6, 136.7, 156.8, 168.2, 170.1, 170.4, 171.2, 171.5, 171.9, 172.2, 172.4, 173.7.

Die Zuordnung der Signale erfolgte nach der in der Literatur beschriebenen Zuordnung (T. Kato, H. Hinoo, Y. Terui, /. Anübiot, 1988, 61, 719-725).

Beispiel 2A

D-Leucyl-L-leucyl-[(3i?)-3-hydroxy-L-phenylalanyl]-[(3i?)-3- hydroxy-L-leucyl]-L- leucyl-D-arginyl-L-isoleucyl-L-allothreonyl-glycyl-[(3S)-3-h ydroxy-L-aspartyl]-L-serin- C ^{; π} -O ^3J -lacton-bis-trifluoracetat _/ [10-{(3S)-3-Hydroxy-L-aspartat}J lysobactin-bis-tri- fluoracetat

(Lysobactinsäure-bis-trifluoracetat)

Eine Suspension von Lysobactin-bis-trifluoracetat (Beispiel IA, 30.0 mg, 19.94 μmol) in Dioxan/10% Wasser (1.5 ml) wird mit 6 N Salzsäure (6 ml) versetzt und in 2 Tagen unter Rühren bei RT zum vollständigen Umsatz gebracht. Die Reaktion wird ständiger HPLC-Kontrolle unterworfen. Zur Aufarbeitung wird das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer bei 3O ⁰ C Badtemperatur entfernt und der Rückstand mittels

präparativer RP-HPLC (Methode 6) bei RT gereinigt. Man erhält 21 mg (76% d. Th.) vom Produkt.

HPLC (Methode 16) R, = 37.46 min.

LC-MS (Methode 10): R, = 1.60 min; MS (ESIpos): m/z (%) = 1277 (5) [M+H] ⁺ , 639 (100) [M + 2H] ²⁺ ; MS (ESIneg): m/z (%) = 1275 (60) [M - H] ^" , 637 (100) [M - 2H] ² ".

HR-TOF-MS (Methode 11): C ₅₈ H ₉₇ Ni ₄ Oi ₈ [M + H] ⁺ gef. 1277.7104, ber. 1277.7100.

Beispiel 3A

N ^{2 J} -(Benzyloxycarbonyl)-D-leucyl-L-leucyl-[(3i?)-3-hydroxy-L-ph enylalanyl]-[(3i?)-3- hydroxy-L-leucyl]-L-leucyl-D-arginyl-L-isoleucyl-L-allothreo nyl-glycyl-[(3S)-3- hydroxy-L-aspartyl]-L-serin-C' ^{J J} -O ^{i 3} -lacton-trifluoracetat

(^ '-(BenzyloxycarbonylHysobactinsäure-trifluoracetat)

Lysobactinsäure-bis-trifluoracetat (Beispiel 2A, 200.0 mg, 0.13 μmol) wird in einer Mischung aus THF (30 ml) und DMF (5 ml) gelöst, dann werden N-(Benzoyloxy- carbonyloxy)succinimid (99.3 mg, 0.40 mmol) und NMM (39 μl, 36.3 mg, 0.36 mmol) bei O ⁰ C zugegeben. Man erwärmt die Reaktion auf RT. Man rührt über Nacht und beobachtet dabei vollständigen Umsatz. Das Lösungsmittel wird am Rotationsverdampfer bei 30 ⁰ C Badtemperatur entfernt und mittels präparativer RP-

HPLC (Methode 8) gereinigt. Nach Gefriertrocknung erhält man 99.0 mg (49% d. Th.) der Titelverbindung.

HPLC (Methode 15) R, = 18.75 min

LC-MS (Methode 10): R _t = 2.27 min; MS (ESIpos): m/z (%) = 1411 (37) [M + H] ⁺ , 706 (100) [M + 2H] ²⁺ ; MS (ESIneg): m/z (%) = 1410 (100) [M - H] ^" , 704 (40) [M-2H] ² ".

HR-TOF-MS (Methode 11): C ₆₆ H ₁₀₃ Ni ₄ O ₂₀ [M + H] ⁺ gef. 1411.7493, ber. 1411.7468.

Beispiel 4A

AP '-Ctert-ButoxycarbonyO-D-leucyl-L-leucyl-tCS^-B-hydroxy-L-ph enylalany^-fCa^-S- hydroxy-L-leucyl]-L-leucyl-D-arginyl-L-isoleucyl-L-allothreo nyl-glycyl-[(3S)-3- hydroxy-L-aspartyll-L-serin-C^'-O^-lacton-trifluoracetat

(^ '-(tert-Butoxycarbony^-lysobactinsäure-trifluoracetat)

Unter Argon-Schutzgasatmosphäre wird Lysobactinsäure-bis-trifluoracetat (Beispiel 2A, 200.0 mg, 0.13 mmol) in einem Gemisch aus Dioxan (22.4 ml), Puffer pH 6 (11.2 ml, Fa. Riedel de Haen, mit Fungizid) und Phosphat-Puffer pH 7 (11.2 ml, Fa. Dr. Lang, LCX021) gelöst. Anschließend werden nacheinander bei 0°C Di-rerr- butyldicarbonat (34.8 mg, 0.16 mmol, 1.2 äquivalente) und JV.N-Diisopropylethyl- amin (28 μl, 20.6 mg, 0.16 mmol, 1.2 äquivalente) zugegeben und man rührt über

Nacht bei RT nach. Nach weiterer Zugabe von Di-tert-butyldicarbonat (29.0 mg, 0.13 mmol, 1 äquivalent) und N,N-Diisopropylethylamin (14 μl, 10.3 mg, 0.08 mmol, 0.6 äquivalente) bei RT und dreistündigem Rühren bei RT wird ein vollständiger Umsatz erreicht. Zur Aufarbeitung wird die Reaktionslösung direkt auf die präparative RP-HPLC (Methode 7) gegeben. Man erhält 147.9 mg (75% d. Th.) von der Titelverbindung.

HPLC (Methode 15) R, = 23.10 min

LC-MS (Methode 10): R, = 2.28 min; MS (ESIpos): m/z (%) = 1378 (34) [M + H] ⁺ , 639 (100); MS (ESIneg): m/z (%) = 1376 (73) [M - H]", 688 (100) [M - 2H] ² \

Beispiel 5A

AP^-tBenzyloxycarbonyOJ-iV^^-CZ-morpholin-^ylethyO-D-leucyl- L-leucyl-P^-a- hydroxy-L-phenylalanyl]-[(3i?)-3-hydroxy-L-leucyl]-L-leucyl- D-arginyl-L-isoleucyl-L- allothreonyl-glycyl-[(35)-3-hydroxy-L-asparaginyl]-L-serin-C ^{J H} -O- ³³ -lacton-bis-tri- fluoracetat

(N ^{2 J} -[Benzyloxycarbonyl]-N ^{4 10} -(2-morpholin-4-ylethyl)-lysobactin-bis-trifluoracetat)

Nach der Arbeitsvorschrift 3 werden das Cyclopeptid (Beispiel 3A, 4.0 mg, 2.62 μmol), N-(2-Aminoethyl)morpholin (3 μl, 3.4 mg, 26.2 μmol, 10 äquivalente) und HATU (11.7 mg, 31.46 μmol, 12 äquivalente) in DMF (500 μl) über Nacht zum Amid bei RT umgesetzt. Nach präparativer HPLC (Methode 6) werden 3.0 mg (65% d. Th.) der Titelverbindung erhalten.

HPLC (Methode 15): R, = 22.06 min.

LC-MS (Methode 10): R _t = 1.88 min; MS (ESIpos.): m/z (%) = 763 (100) [M + 2H] ²⁺ ; ESIneg: m/z (%) = 1522 (50) [M - H]", 761 (100) [M - 2H] ² -.

HR-TOF-MS (Methode 11): C ₇₂ H ₁ IsNi ₆ O ₂ O ber. 1523.8469, gef. 1523.8517 [M + H] ⁺ .

Beispiel 6A

JV ^{2 I} -[Benzyloxycarbonyl]-N ^{4 I0} -(2-hydroxyethyl)-D-leucyl-L-leucyl-[(3i?)-3-hydroxy-L- phenylalanyl]-[(3λ)-3-hydroxy-L-leucyl]-L-leuq^l-D-arginyl- L-isoleucyl-L-allothreonyl- glycyl-[(3S)-3-hydroxy-L-asparaginyl]-L-serin-C ^{i π} -O"-lacton-trifluoracetat

(N ² '-[Benzyloxycarbonyl]-N ^{4 J0} -(2-hydroxyethyl)-lysobactin-trifluoracetat)

Nach der Arbeitsvorschrift 3 werden das Cyclopeptid (Beispiel 3A, 20.0 mg, 13.11 μmol), Ethanolamin (11 μl, 11.2 mg, 183.53 μmol, 14 äquivalente), HATU (39.9 mg, 104.88 μmol, 8 äquivalente) und NMM (12 μl, 10.8 mg, 104.88 μmol, 8 äquivalente) in DMF (500 μl) über Nacht zum Amid bei RT umgesetzt. Nach präparativer HPLC (Methode 6) erhält man 15.7 mg (76% d. Th.) der Titelverbindung.

HPLC (Methode 15): R, = 21.82 min.

LC-MS (Methode 10): R _t = 2.07 min; MS (ESIpos.): rn/z (%) = 1455 (35) [M + H] ⁺ ; 728 (100) [M + 2H] ²⁺ , ESIneg: m/z (%) = 1523 (60) [M - H]", 726 (12) [M - 2H] ² -, 672 (100).

HR-TOF-MS (Methode 11): C ₆₈ Hi ₀₈ N ₁₅ O ₂ O bCr. 1454.7890, gef. 1454.7860 [M + H] ⁺ .

Beispiel 7 A

iV ² '-[Benzyloxycarbonyl]-N ^{4 !0} -methyl-D-leuq'l-L-leucyl-[(3i?)-3-hydroxy-L-phenylala- nyl]-[(3#)-3-hydroxy-L-leucyl]-L-leucyl-D-arginyl-L-isoleucy l-L-allothreonyl-glycyl-

[(35)-3-hydroxy-L-asparaginyl]-L-serin-C' "-O ^iJ -lacton-trifluoracetat

(N ^{2 J} -[Benzyloxycarbonyl]-N ^{4 I0} -methyl-lysobactin-trifluoracetat)

Nach der Arbeitsvorschrift 3 werden das Cyclopeptid (Beispiel 3A, 20.0 mg, 13.11 μmol) und das Methylamin-Hydrochlorid (4.4 mg, 65.55 μmol, 5 äquivalente) unter Zuhilfenahme von HATU (15.0 mg, 39.33 μmol, 3 äquivalente) und NMM (20 μl, 18.56 mg, 183.54 μmol, 14 äquivalente) in DMF (500 μl) innerhalb von 3 Tagen bei 4°C zum Amid umgesetzt. Nach präparativer HPLC (Methode 6) werden 17.0 mg (84% d. Th.) der Titelverbindung erhalten.

HPLC (Methode 15): R, = 21.26 min.

LC-MS (Methode 10): R, = 2.07 min; MS (ESIpos.): m/z (%) = 1425 (35) [M + H] ⁺ , 713 (100) [M + 2H] ²⁺ ; ESIneg: m/z (%) = 1524 (100) [M - H] ^" , 711 (85) [M - 2H] ^2" .

HR-TOF-MS (Methode 11): C ₆₇ HiOsN ₁₅ Oi ₉ ber. 1424.7824, gef. 1424.7830 [M + H] ⁺ .

Beispiel 8A

^ '-[Benzyloxycarbonylj-^ ^-CS-morpholin-^yl-propyO-D-leucyl-L-leucyl-fCS^-S- hydroxy-L-phenylalanyl]-[(3i?)-3-hydroxy-L-leucyl]-L-leucyl- D-arginyl-L-isoleucyl-L- allothreonyl-glycyl-[(35)-3-hydroxy-L-asparaginyl]-L-serin-C ^I "-O ⁵ ^-IaCtOn-OiS-UrIfIuOr- acetat

(N ^{2 J} -[Benzyloxycarbonyl]-N ^{4 J0} -(3-morpholin-4-yl-propyl)-lysobactin-bis-trifluor- acetat)

Nach der Arbeitsvorschrift 3 werden das Cyclopeptid (Beispiel 3 A, 13.0 mg, 8.52 μmol), 3-(Morpholin-4-yl)propylamin (20 μl, 17.2 mg, 119.28 μmol, 14 äquivalente), HATU (25.9 mg, 68.16 μmol, 8 äquivalente) und NMM (7 μl, 6.9 mg, 68.16 μmol, 8 äquivalente) in DMF (500 μl) innerhalb von 3 Tagen bei 4°C zum

Amid umgesetzt. Nach präparativer HPLC (Methode 6) werden 12.0 mg (80% d. Th.) der Titelverbindung erhalten.

HPLC (Methode 15): R, = 22.15 min.

LC-MS (Methode 10): R, = 2.07 min; MS (ESIpos.): m/z (%) = 770 (100) [M + 2H] ²⁺ ; ESIneg: m/z (%) = 1537 (100) [M - H] ^" , 768 (75) [M - 2H] ² ".

HR-TOF-MS (Methode 11): C ₇₃ Hn ₇ N ₁₆ O ₂ O bCr. 1537.8625, gef. 1537.8623 [M + H] ⁺ .

Beispiel 9A

AF '-fBenzyloxycarbonyll-N^ ^-Cpyridin-S-yl-methyO-D-leucyl-L-leucyl-KS^-S-hy- droxy-L-phenylalanyl]-[(3i?)-3-hydroxy-L-leucyl]-L-leucyl-D- arginyl-L-isoleucyl-L- allothreonyl-glycyl-[(35)-3-hydroxy-L-asparaginyl]-L-serin-C ^{J 7i} -O ³³ -lacton-bis- trifluoracetat

(N ^{2 )} -[Benzyloxycarbonyl]-N ^{4 ;0} -(pyridin-3-yl-methyl)-lysobactin-bis-trifluoracetat)

Nach der Arbeitsvorschrift 3 werden das Cyclopeptid (Beispiel 3A, 20.0 mg, 13.11 μmol), 3-Picolylamin (19.5 mg, 183.5 μmol, 14 äquivalente), HATU (39.9 mg, 104.88 μmol, 8 äquivalente) und NMM (12 μl, 10.6 mg, 104.88 μmol, 8 äquivalente) in DMF (500 μl) bei RT über Nacht zum Amid umgesetzt. Nach präparativer HPLC (Methode 6) werden 17.0 mg (84% d. Th.) der Titelverbindung erhalten.

HPLC (Methode 14): R, = 2.11 min.

LC-MS (Methode 10): R, = 1.95 min; MS (ESIpos.): m/z (%) = 1503 (5) [M + H] ⁺ , 751 (100) [M + 2H] ²⁺ ; ESIneg: m/z (%) = 1500 (84) [M - H] ^" , 750 (30) [M - 2H] ² ", 695 (100).

HR-TOF-MS (Methode 11): C ₇₂ Hi ₀₇ N ₁₅ O ₂₀ ber. 1501.7812, gef. 1501.7819 [M + H] ⁺ .

Beispiel IQA

N ^{2 i} -[BenzyloxycarbonyI]-N ^{4 /0} -benzyI-D-leucyl-L-leucyl-[(3i?)-3-hydroxy-L-phenyl- alanyl] - [(3ß)-3-hydroxy-L-leucyl] -L-leucyl-D-arginyl-L-isoleucyl-L-allothreonyl- glycyl-[(35)-3-hydroxy-L-asparaginyl]-L-serin-C ^{J π} -0 ^3J -lacton-trifluoracetat

(λP ^Benzyloxycarbonyl]-N' ^U0 -benzyl-lysobactin-trifluoracetat)

Nach der Arbeitsvorschrift 3 werden das Cyclopeptid (Beispiel 3A, 20.0 mg, 13.11 μmol), Benzylamin (20μl, 19.7 mg, 183.54 PmOl, 14 äquivalente), HATU (39.9 mg, 104.88 μmol, 8 äquivalente) und NMM (12 μl, 10.6 mg, 104.88 μmol, 8 äquivalente) in DMF (500 μl) bei RT über Nacht zum Amid umgesetzt. Nach präparativer HPLC (Methode 6) werden 17.6 mg (83% d. Th.) der Titelverbindung erhalten.

HPLC (Methode 15): R, = 23.21 min.

LC-MS (Methode 10): R _t = 2.14 min; MS (ESIpos.): m/z (%) = 1502 (32) [M + H] ⁺ , 751 (100) [M + 2H] ²⁺ ; ESIneg: m/z (%) = 1500 (75) [M - H] ^" , 749 (20) [M - 2H] ² ", 695 (100).

HR-TOF-MS (Methode 11): C73H110N15O19 ber. 1500.8097, gef. 1500.8131 [M + H] ⁺ .

Beispiel IIA

N ² '-(tert.-Butoxycarbonyl)-N ^{4 10} ,N ⁴ '°-dimethyl-D-leucyl-L-leucyl-[(3fl)-3-hydroxy-L- phenylalanyl]-[(3i?)-3-hydroxy-L-leucyl]-L-leucyl-D-arginyl- L-isoleucyl-L-allothreonyl- glycyl-[(3S)-3-hydroxy-L-asparaginyl]-L-serin-C ^{i J;} -0 ^J -Macton-trifluoracetat

(N ^{2 J} -(tert.-Butoxycarbonyl)-N ^{4 W} ,N ⁴ '"-dimethyl-lysobactin-tπfluoracetat)

Nach der Arbeitsvorschrift 3 werden das Cyclopeptid (Beispiel 4A, 20.0 mg, 13.41 μmol) und eine 2M Lösung von Dimethylamin (67 μl, 6.0 mg, 134.10 μmol, 10 äquivalente) in THF unter Zuhilfenahme von HATU (25.5 mg, 67.05 μmol, 5 äquivalente) und NMM (12 μl, 10.6 mg, 107.28 μmol, 8 äquivalente) in DMF (500 μl) bei O ⁰ C über Nacht zum Amid umgesetzt. Nach einer Trennung über präpa- rative HPLC (Methode 6) werden 8.5 mg (42% d. Th.) der Titelverbindung erhalten.

HPLC (Methode 15): R, = 23.89 min.

LC-MS (Methode 10): R, = 2.26 min; MS (ESIpos.): m/z (%) = 1405 (9) [M + H] ⁺ , 753 (100) [M + 2H] ²⁺ ; ESIneg: m/z (%) = 1403 (100) [M - H] ^" .

HR-TOF-MS (Methode 11): CωHnoNisOw ber. 1404.8097, gef. 1404.8094 [M + H] ⁺ .

Beispiel 12A

iV ² '-(tert-Butoxycarbonyl)-N ^{4 J0} -[2-(benzyloxy)-2-oxoethyl]-D-leucyl-L-leucyl-[(3i?)-3- hydroxy-L-phenylalanyl]-[(3λ)-3-hydroxy-L-leucyl]-L-leucyl- D-arginyl-L-isoleucyl-L- allothreonyl-glycyl-[(35)-3-hydroxy-L-/?-asparaginyl]-L-seri n-C ^{J H} -O ^J " ³ -lacton-trifluor- acetat

(N ^{2 J} -(tert-Butoxycarbonyl)-N ^{4 J0} -[2-(benzyloxy)-2-oxoethyl]-lysobactin-trifluoracetat)

Nach der Arbeitsvorschrift 3 werden das Cyclopeptid (Beispiel 4A, 20.0 mg, 13.41 μmol), Glycinbenzylester-hydrochlorid (21.6 mg, 107.28 μmol, 8 äquivalente), HATU (25.5 mg, 67.05 μmol, 5 äquivalente) und NMM (29 μl, 27.1 mg, 268.2 μmol, 20 äquivalente) in DMF (500 μl) bei RT über Nacht zum Amid umgesetzt. Nach

chromatographischer Reinigung (Methode 6) werden 21.5 mg (98% d. Th.) der Titelverbindung erhalten.

HPLC (Methode 15): R ₁ = 23.60 min.

LC-MS (Methode 10): R ₁ = 2.32 min; MS (ESIpos.): m/z (%) = 1525 (40) [M + H] ⁺ , 763 (38) [M + 2H] ²⁺ , 713 (100); ESIneg: m/z = 1523 (60) [M - H] ^" , 761 (100) [M - 2H] ^2" .

HR-TOF-MS (Methode 11): C ₇₂ HiI ₄ Ni ₅ O ₂ I ber. 1524.8309, gef. 1524.8311 [M + H] ⁺ .

Beispiel 13A

^ '-(tert-ButoxycarbonylJ-N^^-CZ-ftbenzyloxycarbonylJaminoJeth y^-D-leucyl-L- leucyl-[(3i?)-3-hydroxy-L-phenylalanyl]-[(3i?)-3-hydroxy-L-l eucyl]-L-leucyl-D-arginyl- L-isoleucyl-L-allothreonyl-glycyl-[(35)-3-hydroxy-L-asparagi nyl]-L-serin-C ^{1 71} -O ³³ - lacton-trifluoracetat

(N ^{2 I} -(tert-Butoxycarbonyl)-N ^{4 I0} -(2-{[benzyloxycarbonyl]amino}ethyl)-lysobactin- trifluoracetat)

Nach der Arbeitsvorschrift 3 werden das Cyclopeptid (Beispiel 4A, 40.0 mg, 26.82 μmol), Benzyl(2-aminoethyl)carbamat-hydrochlorid (49.5 mg, 214.53 μmol, 8 äquivalente) unter Zuhilfenahme von HATU (50.982 mg, 134.08 μmol, 5 äquivalente) und NMM (59 μl, 54.2 mg, 536.31 μmol, 20 äquivalente) in DMF

(500 μl) bei RT über Nacht zum Amid umgesetzt. Nach einer chromatographischen Reinigung (Methode 6) werden 40.2 mg (90% d. Th.) der Titelverbindung erhalten.

HPLC (Methode 15): R, = 23.64 min.

LC-MS (Methode 10): R ₁ = 2.30 min; MS (ESIpos.): m/z (%) = 1554 (100) [M + H] ⁺ , 777 (53) [M + 2H] ²⁺ ; ESIneg: m/z (%) = 1552 (19) [M - H]-, 775 (100) [M - 2H] ^2" .

HR-TOF-MS (Methode 11): C ₇₃ Hn ₇ N ₁₆ O ₂ I ber. 1553.8574, gef. 1553.8595 [M + H] ⁺ .

Beispiel 14A

N ^{4 J0} -(2-Amino-2-oxoethyl)-N ^{2 J} -(tert-butoxycarbonyl)-D-leucyl-L-leucyl-[(3i?)-3-hy- droxy-L-phenylalanyl]-[(3i?)-3-hydroxy-L-leucyl]-L-leucyl-D- arginyl-L-isoleucyl-L- allothreonyl-glycyl-[(35)-3-hydroxy-L-asparaginyl]-L-serin-C ^{J JJ} -0 ^? " ³ -lacton-trifluor- acetat

(N ⁴ '°-(2-Amino-2-oxoethyl)-N ^{2 J} -(tert-butoxycarbonyl)-lysobactin-trifluoracetat)

Nach der Arbeitsvorschrift 3 werden das Cyclopeptid (Beispiel 4A, 20.0 mg, 13.41 μmol) und Glycinamin-hydrochlorid (11.9 mg, 107.28 μmol, 8 äquivalente) unter Zuhilfenahme von HATU (25.5 mg, 67.05 μmol, 5 äquivalente) und NMM (29 μl, 10.6 mg, 268.20 μmol, 20 äquivalente) in DMF (500 μl) bei RT über Nacht zum Amid umgesetzt. Nach einer chromatographischen Reinigung (Methode 6) werden 12.8 mg (60% d. Th.) der Titelverbindung erhalten.

HPLC (Methode 15): R, = 21.97 min.

LC-MS (Methode 10): R, = 2.19 min; MS (ESIpos.): m/z (%) = 1435 (23) [M + H] ⁺ , 718 (18) [M + 2H] ²⁺ , 667 (100); ESIneg: m/z (%) = 1433 (13) [M - H] ^" , 716 (100) [M - 2H] ² ".

HR-TOF-MS (Methode 11): C ₆₅ Hi ₀₉ N ₁₆ O ₂₀ ber. 1433.7999, gef. 1433.8000 [M + H] ⁺ .

Beispiel 15 A

N ² '-(tert-Butoxycarbonyl)-N ⁴ '°-[2-(2-{[bis(dimethylamino)methylen]amino}ethoxy)- ethyl]-D-leucyl-L-leucyl-[(3i?)-3-hydroxy-L-phenylalanyl]-[( 3i?)-3-hydroxy-L-leucyl]- L-leucyl-D-arginyl-L-isoleucyl-L-allothreonyl-glycyl-[(35)-3 -hydroxy-L-asparaginyl]-L- serin-C ^π -O ³ "Macton-bis-trifluoracetat

(N ² - ³ -(tert-Butoxycarbonyl)-N ^{4 I0} -[2-(2-{[bis(dimethylamino)methylen]amino}ethoxy)- ethylHysobactin-bis-trifluoracetat)

³

Nach der Arbeitsvorschrift 3 werden das Cyclopeptid (Beispiel 4A, 20.0 mg, 13.41 μmol) und 2,2'-Oxydiethylamin-hydrochlorid (1.4 mg, 8.05 μmol, 0.6 äquivalente) unter Zuhilfenahme von HATU (15.3 mg, 40.23 μmol, 3 äquivalente) und NMM (12 μl, 10.9 mg, 107.28 μmol, 8 äquivalente) in DMF (500 μl) bei RT über

Nacht zum Amid umgesetzt. Nach einer chromatographischen Reinigung (Methode 6) werden 5.3 mg (22% d. Th.) der Titelverbindung erhalten.

HPLC (Methode 15): R, = 21.81 min.

LC-MS (Methode 10): R _t = 2.02 min; MS (ESIpos.): m/z (%) = 782 (100) [M + 2H] ²⁺ ; ESIneg: m/z (%) = 1560 (83) [M - H]-, 780 (28) [M - 2H] ² ", 1606 (100).

HR-TOF-MS (Methode 11): C ₇₂ Hi ₂₅ Ni ₈ O ₂ O ber. 1561.9313, gef. 1561.9352 [M + H] ⁺ .

Beispiel 16A

N ^{4 10} -(2-Aminoethyl)-N ^{2 J} -(tert-butoxycarbonyl)-D-leucyl-L-leucyl-[(3i?)-3-hydroxy- L-phenylalanyl]-[(3i?)-3-hydroxy-L-leucyl]-L-leucyl-D-arginy l-L-isoleucyl-L-allo- threonyl-glycyl-tCSSJ-S-hydroxy-L-asparaginylJ-L-serin-C' ^-O^^-lacton-bis-trifluor- acetat

(N ^{4 I0} -(2-Aminoethyl)-A/ ^{2 /} -(tert-butoxycarbonyl)-lysobactin-bis-trifluoracetat)

Gemäß der Arbeitsvorschrift 2 wird von der Verbindung aus Beispiel 13A (19.0 mg, 11.39 μmol) die Cbz-Schutzgruppe hydrogenolytisch abgespalten. Man erhält nach der Feinreinigung mittels präparativer HPLC (Methode 6) 14.8 mg (78.9% d.Th.) der Titelverbindung.

HPLC (Methode 15): R, = 21.13 min.

LC-MS (Methode 10): R, = 1.91 min; MS (ESIpos.): m/z (%) = 1420 (5) [M + H] ⁺ , 710 (100) [M + 2H] ²⁺ ; ESIneg: m/z (%) = 1418 (55) [M - H]-, 709 (100) [M - 2H] ^2" .

HR-TOF-MS (Methode 11): C ₆₅ Hi _n Ni ₆ Oi ₉ ber. 1419.8206, gef. 1419.8221 [M + H] ⁺ .

Beispiel 17A

[3-tert-Butyl-D-alanyl]-[3-terf-butyl-L-alanyl]-[(3i?)-3- hydroxy-L-phenylalanyI)]-[(3i?)-3- hydroxy-L-leucyl]-L-leucyl-D-arginyl-L-isoleucyl-L-allothreo nyl-glycyl-[(3S)-3-hydroxy-

L-aspartyl]-L-senn-C ^{j ;;} -Q ^? " ^? -lacton-bis-trifluoracetat

(C ^{4 λ} ,C ⁴ ^-Dimethyl-lysobactinsäure-bis-trifluoracetat)

Eine Suspension von [3-terr-Butyl-D-alanyl]-[3-üerr-butyl-L-alanyl]-[(3#)-3-hyd roxy-L- phenylalanyl)]-[(3i?)-3-hydroxy-L-leucyl]-L-leucyl-D-arginyl -L-isoleucyl-L-allothreon- yl-glycyl-[(3S)-3-hydroxy-L-asparaginyl]-L-serin-C ^J ^-O^-lacton-bis-trifluoracetat (150.0 mg, 98 μmol) in Dioxan/50% Wasser (3 ml) wird mit 6 N Salzsäure (9 ml) versetzt und in 5 Tagen unter Rühren zum vollständigen Umsatz gebracht. Die Reaktion wird ständiger HPLC-Kontrolle unterworfen. Zur Aufarbeitung wird das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer bei 3O ⁰ C Badtemperatur entfernt und der Rückstand mittels präparativer RP-HPLC (Methode 6) gereinigt. Man erhält 92.8 mg (67% d.Th.) der Titelverbindung.

HPLC (Methode 3) R, = 1.85 min

LC-MS (Methode 10): R _t = 1.74 min, MS (ESIpos.): m/z (%) = 653.7 (100) [M+2H] ²⁺ , 1306.0 (10) [M+H] ⁺ ; MS (ESIneg): m/z (%) = 651.7 (100) [M-H] ^" , 1339.9 (90) [M-H] ^" .

HR-TOF-MS (Methode 11): C∞HioiNuOiβ [M+H] ⁺ ber.: 1305.7413, gef.: 1305.7433.

Ausführungsbeispiele

Beispiel 1

N ^{4 J0} -(3-Morpholin-4-ylpropyl)-D-leucyl-L-leucyl-[(3i?)-3-hydroxy -L-phenylalanyl]-

[(3ä)-3-hydroxy-L-leucyl]-L-leucyl-D-arginyl-L-isoleucyl-L- allothreonyl-glycyl-[(35)-3- hydroxy-L-asparaginyl]-L-serin-C ^{J π} -O ^3J -lacton-tris-trifluoracetat

(N ^{4 J0} -(3-Morpholin-4-ylpropyl)-lysobactin-tris-trifluoracetat)

Gemäß der Arbeitsvorschrift 2 wird von der Verbindung aus Beispiel 5A (2.5 mg, 1.43 μmol) die Benzyloxycarbonyl-Schutzgruppe hydrogenolytisch abgespalten. Nach der Feinreinigung (Methode 6) und Gefriertrocknung wird die Titelverbindung (2.0 mg, 81% d. Th.) als amorpher Feststoff erhalten.

HPLC (Methode 14): R, = 1.57 min.

LC-MS (Methode 10): R ₁ = 1.91 min; MS (ESIpos.): m/z (%) = 1390 (3) [M + H] ⁺ , 695 (94) [M + 2H] ²⁺ , 464 (100); ESIneg: m/z (%) = 1388 (88) [M - H]", 693 (100) [M - 2H] ^2" .

HR-TOF-MS (Methode 11): C ₆₄ Hi ₀₉ N ₁₆ Oi ₈ ber. 1389.8101, gef. 1389.8116 [M + H] ⁺ .

Beispiel 2

N ^{4 10} -(2-Hydroxyethyl)-D-leucyl-L-leucyl-[(3 _J R)-3-hydroxy-L-phenylalanyl]-[(3i?)-3- hydroxy-L-leucyl]-L-leucyl-D-arginyl-L-isoleucyl-L-allothreo nyl-glycyl-[(3S)-3-hy- droxy-L-asparaginyl]-L-serin-C ^{j π} -O ^3J -lacton-bis-trifluoracetat

(λ/ ^{4 10} -(2-Hydroxyethyl)-lysobactin-bis-trifluoracetat)

Gemäß der Arbeitsvorschrift 2 wird von der Verbindung aus Beispiel 6A (14.5 mg, 9.24 μmol) die Benzyloxycarbonyl-Schutzgruppe hydrogenolytisch abgespalten. Nach der Feinreinigung (Methode 6) und einer Gefriertrocknung wird die Titelverbindung (9.4 mg, 66% d. Th.) als amorpher Feststoff erhalten.

HPLC (Methode 15): R ₁ = 15.70 min.

LC-MS (Methode 10): R, = 1.50 min; MS (ESIpos.): m/z (%) = 1321 (8) [M + H] ⁺ , 661 (100) [M + 2H] ²⁺ ; ESIneg: m/z (%) = 1318 (72) [M - H]", 659 (100) [M - 2H] ^2" .

HR-TOF-MS (Methode 11): C ₆ OHiO ₂ Ni ₅ Oi ₈ ber. 1320.7522, gef. 1320.7504 [M + H] ⁺ .

11

Beispiel 3

JV ^{4 I0} -Methyl-D-leucyl-L-leucyl-[(3i?)-3-hydroxy-L-phenylalanyl]-[ (3i?)-3-hydroxy-L- leucyl]-L-leucyl-D-arginyl-L-isoleucyl-L-allothreonyl-glycyl -[(3S)-3-hydroxy-L-aspara- ginyl]-L-serin-C ^{i π} -O ^J - ^ϊ -lacton-bis-trifluoracetat

(W ' ^O -Methyl-lysobactin-bis-trifluoracetat)

Gemäß der Arbeitsvorschrift 2 wird von der Verbindung aus Beispiel Ik (16.0 mg, 10.40 μmol) die Benzyloxycarbonyl-Schutzgruppe hydrogenolytisch abgespalten. Nach der Feinreinigung (Methode 6) und einer Gefriertrocknung wird die Titelverbindung (10.9 mg, 69% d. Th.) als amorpher Feststoff erhalten.

HPLC (Methode 15): R _t = 15.79 min.

LC-MS (Methode 10): R, = 1.50 min; MS (ESIpos.): m/z (%) = 1291 (12) [M + H] ⁺ , 646 (100) [M + 2H] ²⁺ ; ESIneg: m/z (%) = 1289 (100) [M - H] ^" , 644 (37) [M - 2H] ^2" .

HR-TOF-MS (Methode 11): C59H100N15O17 ber. 1290.7417, gef. 1290.7404 [M + H] ⁺ .

Beispiel 4

N ^{4 10} -(3-Morpholin-4-yl-propyl)-D-leucyl-L-leucyl-[(3i?)-3-hydrox y-L-phenylalanyl]-

[(3i?)-3-hydroxy-L-leucyl]-L-leucyl-D-arginyl-L-isoleucyl-L- allothreonyl-glycyl-[(3S)-3- hydroxy-L-asparaginyl]-L-serin-C ⁱ "-O^" ^? -lacton-tris-trifluoracetat

(JV ^{4 10} -(3-Morpholin-4-yl-propyl)-lysobactin-tris-trifluoracetat)

Gemäß der Arbeitsvorschrift 2 wird von der Verbindung aus Beispiel 8A (11.0 mg, 6.23 μmol) die Benzyloxycarbonyl-Schutzgruppe hydrogenolytisch abgespalten. Nach der Feinreinigung (Methode 6) und einer Gefriertrocknung wird die Titelverbindung (9.2 mg, 85% d. Th.) als amorpher Feststoff erhalten.

HPLC (Methode 15): R ₁ = 15.61 min.

LC-MS (Methode 10): R _t = 1.38 min; MS (ESIpos.): m/z (%) = 702 (58) [M + 2H] ²⁺ , 469 (100); ESIneg: m/z (%) = 1402 (22) [M - H]", 701 (100) [M - 2H] ^2" .

HR-TOF-MS (Methode 11): C ₆₅ HIIINI ₆ OI ₈ ber. 1403.8257, gef. 1403.8289 [M + H] ⁺ .

Beispiel 5

N ⁴ '°-(Pyridin-3-yl-methyl)-D-leucyl-L-leucyl-[(3λ)-3-hydroxy -L-phenylalanyl]-[(3/?)-3- hydroxy-L-leucyl]-L-leucyl-D-arginyl-L-isoleucyl-L-allothreo nyl-glycyl-[(3S)-3- hydroxy-L-asparaginylJ-L-serin-C' ^-O^-lacton-tris-trifluoracetat

(N ^{4 /0} -(Pyridin-3-yl-methyl)-lysobactin-tris-trifluoracetat)

Gemäß der Arbeitsvorschrift 2 wird von der Verbindung aus Beispiel 9k (8.5 mg, 4.91 μmol) die Benzyloxycarbonyl-Schutzgruppe hydrogenolytisch abgespalten. Nach der Feinreinigung (Methode 6) und einer Gefriertrocknung wird die Titelverbindung (7.5 mg, 89% d. Th.) als amorpher Feststoff erhalten.

HPLC (Methode 15): R _t = 15.56 min.

LC-MS (Methode 10): R _t = 1.45 min; MS (ESIpos.): m/z (%) = 1368 (5) [M + H] ⁺ , 684 (72) [M + 2H] ²⁺ , 456 (100); ESIneg: m/z (%) = 1366 (72) [M - H] ^" , 682 (100) [M - 2H] ^2" .

HR-TOF-MS (Methode 11): C ₆₄ Hi ₀₃ Ni ₆ Oi ₇ ber. 1367.7682, gef. 1367.7684 [M + H] ⁺ .

Beispiel 6

N ^{4 J0} -Benzyl-D-leucyl-L-leucyl-[(3i?)-3-hydroxy-L-phenylalanyl]-[ (3i?)-3-hydroxy-L-leu- cyl]-L-leucyl-D-arginyl-L-isoleucyl-L-allothreonyl-glycyl-[( 3S)-3-hydroxy-L-asparagin- yl]-L-serin-C ^; "-0 ^J " ^? -lacton-bis-trifluoracetat

(N ^{4 J0} -Benzyl-lysobactin-bis-trifluoracetat)

Gemäß der Arbeitsvorschrift 2 wird von der Verbindung aus Beispiel 10A (16.0 mg, 9.91 μmol) die Benzyloxycarbonyl-Schutzgruppe hydrogenolytisch abgespalten. Nach der Feinreinigung (Methode 6) und einer Gefriertrocknung wird die Titelverbindung (12.7 mg, 80% d. Th.) als amorpher Feststoff erhalten.

HPLC (Methode 15): R, = 17.09 min.

LC-MS (Methode 10): R ₁ = 1.60 min; MS (ESIpos.): rn/z (%) = 1366 (15) [M + H] ⁺ , 684 (100) [M + 2H] ²⁺ ; ESIneg: m/z (%) = 1364 (100) [M - H] ^" , 682 (100) [M - 2H] ^2" .

HR-TOF-MS (Methode 11): C ₆ SHiO ₄ Ni ₅ Oi ₇ ber. 1366.7730, gef. 1366.7698 [M + H] ⁺ .

Beispiel 7

N ^{4 10} _/ N ^{4 I0} -Dimethyl-D-leucyl-L-leucyl-[(3^)-3-hydroxy-L-phenylalanyl]- [(3i?)-3- hydroxy-L-leucyl]-L-leucyl-D-arginyl-L-isoleucyl-L-allothreo nyl-glycyl-[(3S)-3- hydroxy-L-asparaginyl]-L-serin-C ^{/ π} -O ^JJ -lacton-bis-trifluoracetat

(N ^{4 W} ,N ⁴ ^-Dimethyl-lysobactin-bis-trifluoracetat)

Gemäß der Arbeitsvorschrift 1 wird von der Verbindung aus Beispiel IIA (7.0 mg, 4.61 μmol) die Boc-Schutzgruppe abgespalten. Nach der Feinreinigung (Methode 6) und Gefriertrocknung wird die Titelverbindung (3.6 mg, 51% d. Th.) als amorpher Feststoff erhalten.

HPLC (Methode 15): R, = 16.13 min.

LC-MS (Methode 10): R, = 1.50 min; MS (ESIpos.): m/z (%) = 1305 (15) [M + H] ⁺ , 653 (100) [M + 2H] ²⁺ ; ESIneg: m/z (%) = 1303 (100) [M - H] ^" , 651 (100) [M - 2H] ² -.

HR-TOF-MS (Methode 11): C ₆ OH ₁₀₂ Ni ₅ Oi ₇ ber. 1304.7573, gef. 1304.7615 [M + H] ⁺ .

Beispiel 8

N ^{4 I0} -(2-(Benzyloxy)-2-oxoethyl)-D-leucyl-L-leucyl-[(3/?)-3-hydro xy-L-phenylalanyl]- [(3i?)-3-hydroxy-L-leucyl]-L-leucyl-D-arginyl-L-isoleucyl-L- allothreonyl-glycyl-[(3S)-3- hydroxy-L-/^asparaginyl]-L-serin-C ^{I II} -O ³ Macton-bis-trifluoracetat

(iV ^{4 J0} -(2-(Benzyloxy)-2-oxoethyl)-lysobactin-bis-trifluoracetat)

Gemäß der Arbeitsvorschrift 1 wird von der Verbindung aus Beispiel 12A (19.0 mg, 11.59 μmol) die Boc-Schutzgruppe abgespalten. Nach der Feinreinigung (Methode 6) und Gefriertrocknung wird die Titelverbindung (16.0 mg, 84% d. Th.) als amorpher Feststoff erhalten.

HPLC (Methode 15): R, = 17.81 min.

LC-MS (Methode 10): R, = 1.64 min; MS (ESIpos.): m/z (%) = 1425 (3) [M + H] ⁺ , 613 (100) [M + 2H] ²⁺ ; ESIneg: m/z (%) = 1423 (18) [M - H] ^" , 711 (100) [M - 2H] ^2" .

HR-TOF-MS (Methode 11): C ₆₇ HiO ₆ Ni ₅ Oi ₉ ber. 1424.7784, gef. 1424.7782 [M + H] ⁺ .

Beispiel 9

N ^{4 10} -(2-{[(Benzyloxy)carbonyl]amino}ethyl)-D-leucyl-L-leucyl-[(3 i?)-3-hydroxy-L- phenylalanyl]-[(3i?)-3-hydroxy-L-leucyl]-L-leucyl-D-arginyl- L-isoleucyl-L-allothreonyl- glycyl-[(3S)-3-hydroxy-L-asparaginyl]-L-serin-C ^; "-O ^JJ -lacton-bis-trifluoracetat

(N ^{4 I0} -(2-{[(Benzyloxy)carbonyl]amino}ethyl)-lysobactin-bis-triflu oracetat)

Gemäß der Arbeitsvorschrift 1 wird von der Verbindung aus Beispiel 13A (10.0 mg, 6.00 μmol) die Boc-Schutzgruppe abgespalten. Nach der Feinreinigung (Methode 6) und Gefriertrocknung wird die Titelverbindung (10.0 mg, 99% d. Th.) als amorpher Feststoff erhalten.

HPLC (Methode 15): Rt = 18.07 min.

LC-MS (Methode 10): R _t = 1.64 min; MS (ESIpos.): m/z (%) = 1455 (5) [M + H] ⁺ , 728 (100) [M + 2H] ²⁺ ; ESIneg: m/z (%) = 1453 (15) [M - H]", 726 (100) [M - 2H] ² ".

HR-TOF-MS (Methode 11): C ₆₈ Hi ₀₉ Ni ₆ O ₁₉ ber. 1453.8050, gef. 1453.8058 [M + H] ⁺ .

Beispiel 10

N ^{4 10} -(2-Amino-2-oxoethyl)-D-leucyl-L-leucyl-[(3i?)-3-hydroxy-L-p henylalanyl]-[(3i?)-3- hydroxy-L-leucyl]-L-leucyl-D-arginyl-L-isoleucyl-L-allothreo nyl-glycyl-[(3S)-3- hydroxy-L-asparaginyl]-L-serin-C ^{/ //} -O- ^? Macton-bis-trifluoracetat

(N ^{4 I0} -(2-Amino-2-oxoethyl)-lysobactin-bis-trifluoracetat)

Gemäß der Arbeitsvorschrift 1 wird von der Verbindung aus Beispiel 14A (11.0 mg, 7.11 μmol) die Boc-Schutzgruppe abgespalten. Nach der Feinreinigung (Methode 6)

und Gefriertrocknung wird die Titelverbindung (7.2 mg, 65% d. Th.) als amorpher Feststoff erhalten.

HPLC (Methode 15): R, = 15.60 min.

LC-MS (Methode 10): R, = 1.48 min; MS (ESIpos.): m/z (%) = 1334 (6) [M + H] ⁺ , 667 (100) [M + 2H] ²⁺ ; ESIneg: m/z (%) = 1332 (20) [M - H]", 665 (100) [M - 2H] ² ".

HR-TOF-MS (Methode 11): CeoHioiNiβOiβ ber. 1333.7475, gef. 1333.7477 [M + H] ⁺ .

Beispiel 11

N ^{4 I0} -[2-(2-{[Bis(dimethylamino)methylen]amino}ethoxy)ethyl]-D-le ucyl-L-leucyl- [(3i?)-3-hydroxy-L-phenylalanyl]-[(3ä)-3-hydroxy-L-leucyl]- L-leucyl-D-arginyl-L-iso- leucyl-L-allothreonylgIycyl-[(3S)-3-hydroxy-L-asparaginyI]-L -serin-C' "-O ^J Macton- tris-trifluoracetat

(jV ^{4 I0} -[2-(2-{[Bis(dimethylamino)methylen]amino}ethoxy)ethyl]-lyso bactin-tris-tri- fluoracetat)

Gemäß der Arbeitsvorschrift 1 wird von der Verbindung aus Beispiel 15A (4.0 mg, 2.22 μmol) die Boc-Schutzgruppe abgespalten. Nach der Feinreinigung (Methode 6) und Gefriertrocknung wird die Titelverbindung (2.7 mg, 67% d. Th.) als amorpher Feststoff erhalten.

HPLC (Methode 15): R ₄ = 16.00 min.

LC-MS (Methode 10): R, = 1.40 min; MS (ESIpos.): m/z (%) = 732 (48) [M + 2H] ²⁺ , 488 (100); ESIneg: m/z (%) = 1462 (20) [M - H]-, 1506 (100).

HR-TOF-MS (Methode 11): C ₆₇ Hn ₇ Ni ₈ Oi ₈ ber. 1461.8788, gef. 1461.8805 [M + H] ⁺ .

Beispiel 12

N ^{4 J0} -(2-Aminoethyl)-D-leucyl-L-leucyl-[(3^)-3-hydroxy-L-phenylal anyl]-[(3ä)-3-hy- droxy-L-leucyl]-L-leucyl-D-arginyl-L-isoleucyl-L-allothreony l-glycyl-[(3S)-3-hydroxy- L-asparaginyl] -L-serin-C "-O ³ -Macton-tris-trifluoracetat

(N ^{4 J0} -(2-Aminoethyl)-lysobactin-tris-trifluoracetat)

Gemäß der Arbeitsvorschrift 2 wird von der Verbindung aus Beispiel 9 (8.0 mg, 4.76 μmol) die Benzyloxycarbonyl-Schutzgruppe hydrogenolytisch abgespalten. Nach der Feinreinigung (Methode 6) und Gefriertrocknung wird die Titelverbindung (5.3 mg, 67% d. Th.) als amorpher Feststoff erhalten.

HPLC (Methode 15): R, = 15.43 min.

LC-MS (Methode 10): R, = 1.48 min; MS (ESIpos.): m/z (%) = 1320 (3) [M + H] ⁺ , 660 (60) [M + 2H] ²⁺ , 440 (100); ESIneg: m/z (%) = 1318 (78) [M - H] ^" , 658 (100) [M - 2H] ^2" .

HR-TOF-MS (Methode 11): C ₆ OHI ₀₃ NI ₆ OI ₇ ber. 1319.7682, gef. 1319.7725 [M + H] ⁺ .

Beispiel 13

N ^{4 10} -(Carboxymethyl)-D-leucyl-L-leucyl-[(3i?)-3-hydroxy-L-phenyl alanyl]-[(3i?)-3- hydroxy-L-leucyl]-L-leucyl-D-arginyl-L-isoleucyl-L-allothreo nyl-glycyl-[(3S)-3- hydroxy-L-/3-asparaginyl]-L-serin-C ^/ "-O- ^? " ^? -lacton-bis-trifluoracetat

(N ^{4 I0} -(Carboxymethyl)-lysobactin-bis-trifluoracetat)

Gemäß der Arbeitsvorschrift 2 wird von der Verbindung aus Beispiel 8 (4.0 mg, 2.42 μmol) die Benzyloxycarbonyl-Schutzgruppe hydrogenolytisch abgespalten. Nach der Feinreinigung (Methode 6) und Gefriertrocknung wird die Titelverbindung (1.7 mg, 45% d. Th.) als amorpher Feststoff erhalten.

HPLC (Methode 15): R _t = 15.88 min.

LC-MS (Methode 10): R, = 1.66 min; MS (ESIpos.): m/z (%) = 1335 (4) [M + H] ⁺ , 668 (100) [M + 2H] ²⁺ ; ESIneg: m/z = 1333 (32) [M - H] ^" , 666 (100) [M - 2H] ^2" .

HR-TOF-MS (Methode 11): C ₆ oHiooN, ₅ Oi9 ber. 1334.7315, gef. 1334.7316 [M + H] ⁺ .

B. Bewertung der physiologischen Wirksamkeit

Die in v/tro-Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindungen kann in folgenden Assays gezeigt werden:

Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration (MHK):

Die MHK wird im Flüssigdilutionstest gemäß der NCCLS-Richtlinien bestimmt. übernachtkulturen von Staphylococcus aureus 133, Enterococcus faecalis 27159, E. faecium 4147 und Streptococcus pneumoniae G9a werden mit den beschriebenen Testsubstanzen in einer 1:2 Verdünnungsreihe inkubiert. Die MHK-Bestimmung wird mit einer Zellzahl von 10 ⁵ Keimen pro ml in Isosensitest-Medium (Fa. Difco, Irvine/USA) durchgeführt, mit Ausnahme von S. pneumoniae, der in BHI-Bouillon (Fa. Difco, Irvine/USA) mit 10% Rinderserum bei einer Zellzahl von 10 ⁶ Keimen pro ml getestet wird. Die Kulturen werden bei 37°C für 18-24 Stunden inkubiert, 5. pneumoniae in Gegenwart von 10% CO ₂ .

Die jeweils niedrigste Substanzkonzentration, bei der kein sichtbares Bakterienwachstum mehr auftritt, wird als MHK definiert. Die MHK-Werte werden in μg/ml angegeben.

Repräsentative in-vitro-Wirkdaten für die erfindungsgemäßen Verbindungen sind in Tabelle A wiedergegeben:

Tabelle A

Die Eignung der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Behandlung von bakteriellen Infektionen kann im folgenden Tiermodell gezeigt werden:

Systemische Infektion mit Staphylococcus aureus 133:

Zellen von S. aureus 133 werden über Nacht in BHI-Bouillon (Fa. Oxoid, New York/ USA) angezüchtet. Die übernachtkultur wird 1:100 in frische BHI-Bouillon verdünnt und für 3 Stunden inkubiert. Die dann in der logarithmischen Wachstumsphase befindlichen Zellen werden abzentrifugiert und zweimal mit gepufferter, physiologischer Kochsalzlösung gewaschen. Danach wird photometrisch eine Zellsuspension in Kochsalzlösung mit einer Extinktion von 50 Einheiten eingestellt. Nach einem Verdünnungsschritt (1:15) wird diese Suspension 1:1 mit einer 10%igen Mucinlösung gemischt. Von dieser Infektionslösung werden 0.25 ml/20 g Maus intraperitoneal (entsprechend IxIO ⁶ Keimen/Maus) appliziert. Die Therapie erfolgt intraperitoneal oder intravenös 30 Minuten nach der Infektion. Für den Infektionsversuch werden weibliche CFWl-Mäuse verwendet. Das überleben der Tiere wird über 6 Tage protokolliert.

Die Eigenschaften der erfindungsgemäßen Verbindungen im Hinblick auf die Nierenverträglichkeit können im folgenden Tiermodell gezeigt werden:

Maus-Modell zur Bestimmung nephrotoxischer Effekte:

Nephrotoxische Nebenwirkungen der Nonadepsipeptide werden durch histopatholo- gische Untersuchungen der Nieren in Mäusen und/oder Ratten nach mehrfacher Gabe einer bestimmten Dosierung analysiert. Dafür werden 5 bis 6 Tiere täglich entweder intravenös (i.v.) oder intraperitoneal (i.p.) mit Substanzen behandelt, die in wässriger Lösung oder unter Zusatz von Solutol gelöst werden. Nierentoxische Effekte werden durch lichtmikroskopische Auswertung Hämatoxilin und Eosin (H&E) gefärbter Paraffinschnitte der Nieren bestimmt. Eine 'Periodic-Acid Schiff (PAS)- Reaktion wird wahlweise zur besseren Darstellung von Glykoproteinen durchgeführt. Nephrotoxische Effekte werden semiquantitativ für jedes Tier als Schweregrade der auftretenden tubulären Basophilie und Degeneration/Regeneration festgelegt (Schweregrade: 0 = kein Effekt; 1 = minimaler Effekt; 2 = leichter Effekt; 3 = moderater Effekt;

4 = schwere Läsionen). Der durchschnittliche Schweregrad der tubulären Degeneration/Regeneration sowie die Inzidenz (Anzahl der betroffenen Tiere) wird pro Tiergruppe oder Derivat berechnet. Darüber hinausgehende Nierenveränderungen wie tubuläre Dilatation sowie Nekrosen und Ansammlung nekrotischen Materials werden ebenfalls aufgeführt.

Prinzip der Bestimmung der freien Fraktion via Transil:

Die hier beschriebene Methode zur Bestimmung der freien Fraktion (f _u ) einer Prüfsubstanz gliedert sich in 2 Teile:

a) Bestimmung des Transil ^® /Puffer- Verteilungsverhältnisses (MAbuffer) durch Inkubation der Prüfsubstanz in einer Transil ^® -Puffer (pH 7.4)-Dispersion und anschließende Bestimmung der Konzentration in der Dispersion und im Puffer-überstand.

b) Bestimmung des Transil ^® /Plasma-Verteilungsverhältnisses (MApi _aS ma) durch Inkubation der Prüfsubstanz in einer Transil ^® -Plasma-Dispersion und anschließende Bestimmung der Konzentration in der Dispersion und im Plasma.

Der Quotient der beiden Verteilungsverhältnisse ergibt f _u .

Bei hochproteingebundenen Substanzen wird das Plasma in der Regel mit isotonischem Phosphatpuffer (pH 7.4) verdünnt und anschließend mit Transil ^® suspendiert. Die Bestimmung von f _u ' (freie Fraktion in verdünntem Plasma) in dieser verdünnten Proteinlösung erfolgt analog zur Bestimmung von f _u . Die freie Fraktion in unverdünntem Plasma wird aus f _u ' und dem Verdünnungsfaktor berechnet.

Vergleich zu dieser Methode auch: Schuhmacher, Joachim; Kohlsdorfer, Christian; Buehner, Klaus; Brandenburger, Tim; Kruk, Renate, "High-throughput determination

of the free fraction of drugs strongly bound to plasma proteins." Journal ofPharmaceu- tical Sciences 2004, 93, 816-830.

Repräsentative Daten aus der Bestimmung der freien Fraktion für die erfindungsgemäßen Verbindungen sind in Tabelle B wiedergegeben:

Tabelle B

Bestimmung der Membranaffinität einer Prüfsubstanz nach Verteilung zwischen

Alle Inkubationen werden in geeigneten Glasgefäßen, z.B. Glasvials, Schliffreagenzgläsern, durchgeführt. In der Regel beträgt das Gesamtvolumen 0.5-5 mL, das Transil ^® Volumen 10-100 μl. Im Falle von hohen erwarteten Membranaffinitäten kann die Transil ^® Dispersion mit Phosphatpuffer pH 7.4 z.B. Dulbeccos PBS bis zu 20fach verdünnt werden. Phosphatpuffer pH 7.4 wird in die Inkubationsgefäße vorgelegt und das Transil ^® nach gründlichem Mischen zupipettiert. Die Prüfsubstanz wird in einer Konzentration von z.B. 200 ng/mL, n = 6, zupipettiert. Der Anteil an organischem Lösungsmittel sollte <2% sein. Die Ansätze werden 30 min bei Raumtemperatur z.B. auf einem Mini-Shaker im Winkel von ca. 45° bei ca. 400 UPM inkubiert. Zur Bestimmung des 100% Wertes wird mindestens ein Aliquot von z.B. 100 μl entnommen, der restliche Ansatz wird ca. 10 min bei ca. 1800 g zentrifugiert.

Von jeder Probe werden mindestens 2 Aliquote (z.B. 100 μl) des überstandes für die Konzentrationsbestimmung entnommen.

Bestimmung von MA _P i _a<ma in unverdünntem oder verdünntem Plasma:

Das Gesamtinkubationsvolumen und das zugesetzte Transil ^® Volumen hängen von der erwarteten freien Fraktion ab. In der Regel beträgt das Gesamtvolumen 0.5 -1 mL, das Transil ^® Volumen 10-100 μl. Im Falle von sehr niedrigen freien Fraktionen wird das Plasma der zu untersuchenden Spezies mit isotonischer Pufferlösung, pH 7.4 z.B. 10 -400fach verdünnt und anschließend mit Transil ^® versetzt. Das weitere Vorgehen erfolgt wie oben für die Bestimmung der MAbuffer Werte beschrieben.

Prinzip der Bestimmung der freien Fraktion via Ultrafiltration:

Das Plasma der zu untersuchenden Spezies wird über eine semipermeable Membran filtriert. Die Substanzkonzentration im Filtrat wird gemessen und daraus die freie Fraktion f _u berechnet. Das Centrifree micropartition System von Millipore/Amicon wird verwendet. Die Ultrafiltrationsmembranen haben eine Ausschlussgröße von 30 000 Da. Die Substanz wird zu 1 mL Plasma in einer Konzentration von ca. 1 μg/mL zudotiert. Der Lösungsmittelanteil sollte < 2 % sein. Nach 30 minütiger Inkubation bei Raumtemperatur wird das Plasma in das Ultrafiltrationssystem pipettiert und 10 Minuten bei 1800 g zentrifugiert. Die Substanzkonzentration im Ultrafiltrat (C _u; ungebundene Substanzkonzentration) und im Plasma vor der Zentrifugation (C; Gesamtsubstanzkonzentration) wird gemessen. Die freie Fraktion errechnet sich nach der Formel: f _u (%) = C _u /C *100.

Die Löslichkeit einer Verbindung wird nach dem Fachmann bekannten Methoden bestimmt.

C. Ausführungsbeispiele für pharmazeutische Zusammensetzungen

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können folgendermaßen in pharmazeutische Zubereitungen überführt werden:

Tablette:

Zusammensetzung:

100 mg der Verbindung von Beispiel 1, 50 mg Lactose (Monohydrat), 50 mg Maisstärke (nativ), 10 mg Polyvinylpyrrolidon (PVP 25) (Fa. BASF, Ludwigshafen, Deutschland) und 2 mg Magnesiumstearat.

Tablettengewicht 212 mg. Durchmesser 8 mm, Wölbungsradius 12 mm.

Herstellung:

Die Mischung aus Wirkstoff, Lactose und Stärke wird mit einer 5%-igen Lösung (m/m) des PVPs in Wasser granuliert. Das Granulat wird nach dem Trocknen mit dem Magnesiumstearat für 5 min gemischt. Diese Mischung wird mit einer üblichen Tablettenpresse verpresst (Format der Tablette siehe oben). Als Richtwert für die Ver- pressung wird eine Presskraft von 15 kN verwendet.

Oral applizierbare Suspension:

Zusammensetzung:

1000 mg der Verbindung von Beispiel 1, 1000 mg Ethanol (96%), 400 mg Rhodigel (Xanthan gum der Fa. FMC, Pennsylvania, USA) und 99 g Wasser.

Einer Einzeldosis von 100 mg der erfindungsgemäßen Verbindung entsprechen 10 ml orale Suspension.

Herstellung:

Das Rhodigel wird in Ethanol suspendiert, der Wirkstoff wird der Suspension zugefügt. Unter Rühren erfolgt die Zugabe des Wassers. Bis zum Abschluss der Quellung des Rhodigels wird ca. 6h gerührt.

Intravenös applizierbare Lösung:

Zusammensetzung:

100-200 mg der Verbindung von Beispiel 1, 15 g Polyethylenglykol 400 und 250 g Wasser für Injektionszwecke.

Herstellung:

Die Verbindung von Beispiel 1 wird zusammen mit Polyethylenglykol 400 in dem Wasser unter Rühren gelöst. Die Lösung wird sterilfiltriert (Porendurchmesser 0.22 μm) und unter aseptischen Bedingungen in hitzesterilisierte Infusionsflaschen abgefüllt. Diese werden mit Infusionsstopfen und Bördelkappen verschlossen.