Contra Linfadenite Caseosa"

A presente invenção refere-se à produção de uma vacina viva contra linfadenite caseosa que compreende uma cepa atenuada de Corynebacterium 5 pseudotuberculosis obtida a partir de modificação genética.

A linfadenite caseosa é uma doença que acomete caprinos e ovinos, tendo como agente etiológico a bactéria Corynebacterium pseudotuberculosis. A doença é caracterizada pela formação de abscessos em gânglios linfáticos superficiais, podendo também acometer órgãos e linfonodos internos.

í o Atualmente, não existe no mercado um tratamento realmente eficiente para a linfadenite caseosa. O uso de antibióticos não é aconselhável, visto que o tratamento, além de bastante longo (dura de semanas a meses), não é totalmente eficaz. Inspeções periódicas do rebanho, isolamento dos animais doentes, tratamento e desinfecção de qualquer tipo de ferimento superficial,

15 além da limpeza das instalações, são algumas das medidas profiláticas que podem ajudar a conter essa doença (Dorella, FA, Pacheco, LGC, Seyffert, N, Portela, RW, Meyer, R, Miyoshi, A, Azevedo, V., 2009. Antigens of Corynebacterium pseudotuberculosis and prospects for vaccine development. Expert Reviews in Vaccine, 8(2):205-213).

0 Tendo em vista a importância de C. pseudotuberculosis para a caprino e ovinocultura mundial, a presente invenção descreve a construção de uma cepa atenuada desta bactéria, obtida através da utilização de um sistema de transposição in vivo baseado no TnFuZ, que é capaz de estimular resposta imune satisfatória contra linfadenite caseosa (Dorella FA, Estevam EM, 5 Pacheco LG, Guimarães CT, Lana UG, Gomes EA, Barsante MM, Oliveira SC, Meyer R, Miyoshi A, Azevedo V - In vivo insertional mutagenesis in Corynebacterium pseudotuberculosis: an efficient means to identify DNA sequences encoding exported proteins. Appl Environ Microbiol. 2006 Nov;72(1 1 ):7368-72. Epub 2006 Sep 1).

0 O TnFuZ é uma ferramenta genética de descoberta de proteínas exportadas por bactérias Gram-positivas. Baseia-se em um elemento transponível (Tn4001) combinado ao ^' gene da fosfatase alcalina (phoZ) de Enterococcus faecalis, cujas regiões codificadoras do promotor e do peptídeo sinal foram removidas. Uma vez que a fosfatase alcalina está ativa somente quando secretada, a inserção deste transposon em loci gênicos que codificam 5 proteínas exportadas leva a fusões que resultarão em células secretando fosfatase e que poderão ser facilmente detectadas pela visualização in vitro do produto da degradação de um substrato revelador por esta proteína.

Há vários relatos na literatura de testes de vacinas vivas atenuadas contra C. pseudotuberculosis, que mostraram proteger parcialmente os animais í o e reduzir a infecção: Moore RJ, Rothel L, Krywult J, Radford AJ, Lund K, Hodgson AL. ,1999. Foreign gene expression in Corynebacterium pseudotuberculosis: development of a live vaccine vector. Vaccine. Oct 14;18(5-6):487-97.; Simmons CP, Dunstan SJ, Tachedjian M, Krywult J, Hodgson AL, Strugnell RA, 1998. Vaccine potential of attenuated mutants of

15 Corynebacterium pseudotuberculosis in sheep. Infect Immun. Feb;66(2):474-9.;

Pogson CA, Simmons CP, Strugnell RA, Hodgson AL, 1996. Cloning and manipulation of the Corynebacterium pseudotuberculosis recA gene for live vaccine vector development. FEMS Microbiol Lett. Sep 1 ;142(2-3):139-45.; Hodgson AL, Tachedjian M, Corner LA, Radford AJ, 1994. Protection of sheep 0 against caseous lymphadenitis by use of a single oral dose of live recombínant Corynebacterium pseudotuberculosis. Infect Immun. Dec;62(12):5275-80.; Hodgson AL, Krywult J, Corner LA, Rothel JS, Radford AJ, 1992. Rational attenuation of Corynebacterium pseudotuberculosis: potential cheesy gland vaccine and live delivery vehicle. Infect Immun. Jul;60(7):2900-5; EGGLETON, 5 D. G., HAYNES, J. A., MIDDLETON, H. D., COX, J. C. AND MINTY, D. W.

,1991. Immunisation against ovine caseous lymphadenitis: correlation between Corynebacterium pseudotuberculosis toxoid content and protective efficacy in combinet clostridial-corynebacterial vaccines. Australian Vet. J., 68:322-325.; RIBEIRO, O. C, SILVA, J. A. H., OLIVEIRA, S. C, MEYER, R. E0 FERNANDES, G. B.,1991. Dados preliminares sobre uma vacina viva contra a linfadenite caseosa. Pesq. Agropec. Bras., 4:461-465. Porém, em nenhum destes trabalhos utiliza-se o sistema TnFuZ para a obtenção da cepa atenuada, além de nenhuma das cepas atenuadas apresentarem deleção ou inativação do gene inativado na cepa da presente invenção.

No estado da técnica, encontram-se documentos (CA 2078801 - "Enzymatically inactive phospholipase D of Corynebacterium 5 pseudotuberculosis" , WO 9207582 - "Corynebacteria and related organisms as vaccine vectors") que também reivindicam o uso de vacina viva contra Linfadenite caseosa, porém a atenuação das cepas citadas nestes documentos é feita a partir de inativação ou deleção do gene da fosfolipase D, diferentemente do reivindicado na presente invenção.

í o Dentre as vantagens, a presente invenção protege 81 % dos animais testados (camundongos BALB/c) com uma única dose da vacina, enquanto os documentos citados acima apresentam variações de índices de proteção em torno de 50%, além de não estimularem resposta imune satisfatória com somente uma única dose. Os animais imunizados com a vacina da presente

15 invenção não apresentam quaisquer sinais clínicos externos, ao contrário do descrito nos documentos acima, onde se detectam abscessos indesejáveis no sítio de inoculação.

A cepa recombinante caracterizada na presente invenção, doravante denominada Bluelinfadenina, foi selecionada e utilizada em testes de 0 imunização em camundongos. Os testes de imunização demonstraram que Bluelinfadenina ofereceu 81 % de proteção contra a cepa virulenta, além de não apresentar toxicidade. Dessa forma, Bluelinfadenina constitui uma vacina bacteriana viva atenuada como alternativa vacinai no combate à linfadenite caseosa e muito mais eficaz do que as apresentadas no estado da técnica.5

BREVE DECRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1 : Seqúência nucleotídica do gene interrompido no mutante Bluelinfadenina. A sequência consiste de 906 nucleotídeos em cujos nucleotídeos sublinhados houve a inserção do transposon TnFuZ. O asterisco0 marca exatamente a posição da inserção, entre os nucleotídeos 512 e 513.

Figura 2: Gráfico representando a média de três resultados de proteção utilizando Bluelinfadenina (80%, 80% e 83,3% de proteção). Figura 3: Representação gráfica da produção de IgG específico pelos camundongos imunizados com a cepa mutante Bluelinfadenina. Soros dos animais imunizados foram coletados antes (DIA 0) e 14 dias após a imunização com as respectivas cepas e testados por ELISA. Os resultados estão 5 apresentados como a média e o desvio padrão de um experimento representativo com dez animais por grupo de imunização. Os valores do branco foram subtraídos de cada valor obtido nos grupos. ^* Significativos em relação ao grupo controle PBS (p<0.05).

Figura 4: Representação gráfica dos níveis de lgG2a produzidos após í o imunização com Bluelinfadenina. Soros dos animais imunizados foram coletados antes (DIA 0) e 14 dias após a imunização e testados por ELISA. Os resultados estão apresentados como a média e o desvio padrão de um experimento representativo com dez animais por grupo de imunização. Os valores do branco foram subtraídos de cada valor obtido nos 15 grupos. *Significativo em relação ao grupo controle PBS (p<0,05).

Figura 5: Representação gráfica dos a) padrões de associação e b) viabilidade intracelular de Bluelinfadenina e T1 selvagem após uma hora de interação com as monocamadas de células J774. Resultados são expressos como a média e o desvio padrão de dois experimentos representativos 0 realizados em quadruplicata. ^* Significativo em relação aos demais grupos testados (p<0,05).

Figura 6: Representação gráfica dos a) padrões de associação e b) viabilidade intracelular de Bluelinfadenina e T1 selvagem após três horas de interação com as monocamadas de células J774. Resultados são expressos5 como a média e o desvio padrão de dois experimentos representativos realizados em quadruplicata. *Significativo em relação aos demais grupos testados (p<0,05).

Figura 7: Representação gráfica dos a) padrões de associação e b) viabilidade intracelular de Bluelinfadenina e T1 selvagem após seis horas de0 interação com as monocamadas de células J774. Resultados são expressos como a média e o desvio padrão de dois experimentos representativos realizados em quadruplicata. ^* Significativo em relação aos demais grupos testados (p<0,05).

Descrição detalhada da tecnologia

A cepa atenuada foi produzida utilizando-se o protocolo para eletrotransformação da bactéria C. pseudotuberculosis previamente descrito (DORELLA FA, ESTEVAM EM, CARDOSO PG, SAVASSI BM, OLIVEIRA SC, AZEVEDO V, MIYOSHI A, 2006. An improved protocol for electrotransformation of Corynebacterium pseudotuberculosis Vet Microbiol. 114:298-3030). Este protocolo permite que o sistema de transposição TnFuZ, contido em um plasmídeo, seja introduzido na bactéria. Uma vez dentro da bactéria, este sistema é capaz de realizar recombinações aleatórias com o genoma, gerando assim cepas geneticamente modificadas. O processo da mutagênese aleatória de C. pseudotuberculosis através do sistema TnFuZ compreende os seguintes passos:

a) Obtenção de células eletrocompetentes: células eletrocompetentes de C. pseudotuberculosis foram preparadas e transformadas com o plasmídeo não replicativo pCMG8 contendo o transposon TnFuZ.

b) Detecção de colónias: os transformantes foram isolados através de plaqueamento em Agar BHI contendo canamicina e o substrato BCIP (5-bromo- 4-cloro-3-indolil fosfato), que permite a detecção de colónias azuis (fenótipo fosfatase alcalina positivo).

c) Extração do DNA: após a seleção dos mutantes fosfatase alcalina positivos, os DNAs cromossômicos dos mesmos foram extraídos e então diretamente sequenciados com o uso de um iniciador específico, denominado EnPhoRI (5 ^' - TGC CTT CGC TTC AGC AAC CTC TGT TTG-3 ^' ), de acordo com GIBSON, C. M. AND CAPARON, M. G., 2002. (Alkaline phosphatase repórter transposon for Identification of genes encoding secreted proteins in gram-positive microorganisms. Appl. Environ. Microbiol., 68:928-932). Para cada transformante foi analisada a inserção do transposon TnFuZ em uma matriz de leitura e orientação corretas, levando assim à codificação de uma proteína de fusão híbrida. d) Comparação das sequências: apôs o seqiienciamento, foram realizadas análises por similaridade de sequência, através do programa Ártemis, contra a sequência genômica de C. pseudotuberculosis (RGMG).

e) Análise da sequência de Bluelinfadenina: a sequência de DNA que flanqueia a inserção de transposon no mutante Bluelinfadenina apresenta 906 nucleotídeos, como mostrado na Figura 1. Os nucleotídeos assinalados com um asterisco representam o ponto de inserção do transposon que interrompeu a sequência deste gene, 512 (T) e 513 (G). O gene interrompido no mutante Bluelinfadenina apresentou alta similaridade com uma provável proteína secretada ligada ao sistema de transporte de ferro de C. diphtheriae gravis. As análises nucleotídicas revelaram um E-value de 2e-128, um Score de 518 e 74% de identidade de sequência, e as análises protéicas mostraram um E- value de 4e-1 17, um Score de 1091 e 76% de identidade. A procura por motivos conservados, realizada no InterProScan, revelou a possível existência de um sítio de ligação de ferro-enxofre (2Fe-2S ferredoxina). A principal característica de proteínas que possuem este sítio é mediar a transferência de elétrons em várias reações metabólicas da bactéria. Usando o programa SignalP 3.0, foi verificada a presença de um peptídeo sinal, composto de 43 resíduos de aminoácidos com um sítio de clivagem entre os resíduos Ala43 e Gly44. Duas hélices transmembrânicas, uma primária compreendida entre os resíduos Asn1 - Ser35, reveladas pelo programa TMHMM, e uma secundária entre Val58 -Val80 foram identificadas. O ponto isoelétrico e o peso molecular da proteína em sua forma madura foram 5,46 e 32,6 kDa, respectivamente.

Os resultados obtidos mostram que o gene interrompido no mutante Bluelinfadenina codifica uma proteína secretada ligadora do sistema de transporte de ferro similar àquela encontrada em C. diphtheriae NCTC 13129. Esta proteína é similar à proteína FecB de Escherichia coli, a qual pertence à família de proteínas ligadoras de soluto bacterianas e está envolvida no transporte de ferro a partir de citrato férrico. Em geral, proteínas relacionadas ao transporte de ferro são bastante utilizadas por bactérias patogênicas para captar sinais que indiquem condições limitantes de ferro do hospedeiro e como um sinal ambiental para induzir a expressão de fatores de virulência. Além disso, o ferro modula a adesão bacteriana às células do hospedeiro e aumenta a capacidade da bactéria em desenvolver uma infecção persistente,

f) Verificação da proteção de Bluelinfadenina: para verificar o nível de proteção oferecido pelo mutante contra a infecção com a cepa selvagem virulenta, ensaios de imunização utilizando modelo murino (camundongos da raça BALB/c, com idades entre seis e oito semanas) foram realizados. Foram realizadas contagens de células e preparadas 10 ⁶ unidades formadoras de colónias diluídas em 100 microlitros de salina estéril para injeção intraperitoneal nos animais. No dia 0, um grupo de cinco camundongos foi imunizado com 300μΙ de uma vacina comercial, Glanvac™3 (controle positivo; Pfizer Animal Health, Austrália). Quatro semanas depois, no dia 28, esse mesmo grupo de camundongos recebeu uma segunda dose desta vacina (revacinação) e grupos de cinco animais receberam, cada um, uma dose de 100 microlitros de Bluelinfadenina, ou de PBS (controle negativo), ou da cepa T1 (controle negativo: cepa selvagem parental utilizada na obtenção do mutante Bluelinfadenina). Quatorze dias após o segundo período de imunização (dia 42) todos os animais foram desafiados com 10 ⁶ UFC/ ml da cepa virulenta MIC-6.

Exemplo 1 - Ensaios de proteção em camundongos utilizando composição contendo a cepa mutante Bluelinfadenina

Os níveis de proteção são calculados por contagem dos animais imunizados com a cepa mutante que sobreviveram ao desafio (infecção) com a cepa selvagem virulenta. A sobrevivência dos animais (em porcentagem) foi acompanhada até 30 dias após o desafio com a cepa selvagem MIC-6 de C. pseudotuberculosis. Na Figura 2 está representado o resultado de três testes de proteção com Bluelinfadenina. Comparando-se com os grupos controle PBS, T1 selvagem e grupos imunizados com uma vacina comercial, Glanvac™3, o grupo imunizado com Bluelinfadenina atingiu um nível de proteção significativo de 81 % em média. Além disso, os animais imunizados com esta cepa não apresentaram qualquer sinal de morbidez. Exemplo 2 - Detecção de imunoglobulinas a partir das amostras de soro dos animais imunizados com Bluelinfadenina Os animais imunizados com BlUelinfadenina foram submetidos à coleta de sangue nos dias 0 e 14 contados a partir do período de imunização. O sangue foi coletado da veia do plexo retro-orbital. Após a coagulação, o sangue foi centrifugado e o soro dos camundongos imunizados foi utilizado em ensaios imunoenzimáticos (ELISA) para a detecção de imunoglobulinas do tipo IgG e seus subtipos lgG1 e lgG2a. A Figura 3 mostra os resultados obtidos no ensaio de ELISA para a análise da produção de IgG.

Os resultados obtidos mostram que os camundongos imunizados com o mutante Bluelinfadenina desenvolveram altos níveis de anticorpos IgG quando comparados aos produzidos pelo grupo controle PBS. Níveis semelhantes e também significativos foram observados pelos animais imunizados com a vacina Glanvac™3.

A imunização com a cepa mutante Bluelinfadenina induziu a produção de lgG1 e lgG2. Porém, o aumento na produção de lgG1 não foi significativo (dado não mostrado). Em relação aos níveis de lgG2a, a vacinação com Bluelinfadenina induziu níveis bastante significativos dessa imunoglobulina em relação ao grupo PBS (Figura 4).

A produção de lgG2a, em camundongos, é característica do tipo de resposta imune Th1 , responsável pela eliminação de patógenos intracelulares como C. pseudotuberculosis, sugerindo assim que o tipo de resposta induzida por Bluelinfadenina condiz com aquela esperada no combate à bactéria.

Exemplo 3 - Ensaios de viabilidade e interação de Bluelinfadenina com células murinas J774

Sendo C. pseudotuberculosis uma bactéria intracelular, ela tem que ser capaz de, durante o curso da infecção, aderir-se à parede da célula hospedeira, internalizar-se e sobreviver dentro deste "ambiente" causando então a doença. Deste modo, com o intuito de entender as modificações acarretadas pela mutação sofrida por Bluelinfadenina, estudamos o padrão de adesão destas comparados à cepa parental T1 , bem como sua viabilidade no interior de células J774 de camundongos.

A linhagem celular J774, originada de linfoma murino, que se diferencia em macrófagos, foi cultivada em meio essencial de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Sigma) suplementado com antimicrobianos (50pg/ml de gentamicina e 2,5pg/ml de fungizona) e 5% de Soro Fetal Bovino. As células foram mantidas sob temperatura de 37°C, em atmosfera de 5% de C0 ₂ . As monocamadas confluentes foram tripsinizadas em intervalos de dois dias, 5 utilizando-se a solução isotônica (salina) contendo tripsina 0,2% (p/v) e EDTA 0,02% (p/v). Após aproximadamente três minutos de interação, a tripsina foi removida da garrafa e nova partida de meio DMEM completo foi adicionado à monocamada e agitada vigorosamente para que as células soltassem do fundo da garrafa plástica. A suspensão foi contada em câmara de Neubauer e diluída í o de modo a conter em torno de 1 x 10 ⁶ células/ml. Para os ensaios de aderência, 500 μΙ a suspensão celular (em torno de 5 x 10 ⁵ células/ml) foram distribuídos em microplacas de 24 poços. As placas foram incubadas em estufa de C0 ₂ por 48 horas, até que a monocamada apresentasse acima de 95% de confluência.

15 As cepas de C. pseudotuberculosis foram cultivadas em meio líquido

BHI e incubadas por 24h a 37°C. Após três lavagens das amostras com solução salina tamponada de Dulbecco (PBS, 0,01 M, pH7.4, contendo 10mM de MgC e 10 mM CaC^) estéril, as cepas foram ressuspensas em meio DMEM sem aditivos. As suspensões padrão bacterianas foram diluídas em0 meio DMEM de modo à obtenção de turvação bacteriana de 0.1 em comprimento de onda de 580 nm (cerca de 107 UFC/ml) em espectrofotômetro de tubos de vidro (Micronal 580D). A suspensão foi em seguida diluída 1 :10 (em torno de 5 x 10 ⁶ UFC/ml) em DMEM, para uma multiplicidade de infecção (MOI) de 10 bactérias por célula J774, em volume final de 500μΙ. Após5 interação por 1 , 3 e 6 horas, alíquotas dos sobrenadantes foram removidas, diluídas e contadas para a determinação das UFC/ml. Em seguida as monocamadas foram lavadas seis vezes com PBSD de forma branda, para que as células não se soltassem do fundo, e ressuspensas em 500μΙ tampão de lise [(PBSD 0.1 % de Triton X 00 (BioRad)]. O lisado foi diluído para a contagem0 das UFC/ml e semeados em placas de BHI-ágar (Difco). O percentual de células aderidas foi determinado a partir do somatório das UFC no sobrenadante + UFC associadas às monocamadas (assumido como 100% dos microrganismos) de acordo com a seguinte fórmula: UFC associadas às monocamadas/ UFC no sobrenadante + UFC associadas às monocamadas X 100.

Os ensaios de viabilidade intracelular foram realizados através da exclusão pela gentamicina. Após os tempos de incubação de 1 , 3 e 6 horas, as monocamadas foram lavadas de forma branda por seis vezes e nova partida de meio DMEM contendo 150pg de gentamicina (Sigma) foi adicionada por uma hora. Controles da associação às monocamadas também foram realizados, da forma descrita anteriormente. Após três lavagens com PBSD, as monocamadas foram lisadas com tampão de lise, diluídos em PBSD e plaqueados em BHI-ágar, para a determinação das UFC. O percentual de microrganismos viáveis intracelulares foi determinado a partir do controle das bactérias associadas (sem a exposição à gentamicina).

A significância da diferença entre os grupos foi calculada utilizando-se o teste ANOVA, seguido do teste "Bonferroni" (análise de proteção, produção de imunoglobulinas e citocinas) ou "Turkey" (análises de aderência e viabilidade intracelular), ambos disponíveis no software GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software). Um valor de p <0,05 foi utilizado como limite da significância estatística.

Os resultados após uma hora de interação estão apresentados na

Figura 5. Estes resultados mostram uma diferença estatisticamente significativa entre Bluelinfadenina e a cepa T1 selvagem. Após uma hora de interação, os mutantes Bluelinfadenina aderidos penetraram no interior das células e apresentaram maior e mais significativo percentual de células viáveis.

Os resultados do padrão de interação das cepas após três horas estão apresentados na Figura 6. Após três horas de interação com as monocamadas de células J774, Bluelinfadenina apresentou os menores percentuais de células viáveis intracelulares, apesar de ter apresentado o maior percentual de bactérias viáveis intracelulares após uma hora. Este resultado sugere que Bluelinfadenina é mais facilmente eliminada por fagocitose ou é incapaz de sobreviver dentro da célula hospedeira. Após interação por seis horas còm as monocamadas de células (Figura 7), Bluelinfadenina apresentou o menor índice de viabilidade intracelular, sugerindo que o mutante é mais facilmente eliminado através do processo de fagocitose ou, ainda, sugerindo que este mutante não seja capaz de sobreviver dentro da célula devido à mutação sofrida.