DA SILVA MAIA FILHO HUGO (BR)
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See also references of EP 2617425A4
REIVINDICAÇÕES 1. ASSOCIAÇÃO FARMACÊUTICA PARA TRATAR E/OU PREVENIR MIOMA E/OU ENDOMETRIOSE caracterizada pelo fato de que compreende resveratrol e progestogênio . 2. ASSOCIAÇÃO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende 15 mg a 10.000 mg de resveratrol. 3. ASSOCIAÇÃO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o progestogênio é um ou mais dentre gestodeno, drospirenona, desogestrel, dienogest ou levonogestrel . 4. ASSOCIAÇÃO, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que compreende 35 mcg a 115 mcg de gestodeno. 5. ASSOCIAÇÃO, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que compreende 1,5 mg a 4,5 mg de drospirenona . 6. ASSOCIAÇÃO, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que compreende 75 mcg a 225 mcg de desogestrel. 7. ASSOCIAÇÃO, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que compreende 1 mg a 4mg de dienogest . 8. ASSOCIAÇÃO, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que compreende 40 a 70 mg de levonogestrel . 9. ASSOCIAÇÃO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente um estrogênio . 10. ASSOCIAÇÃO, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que o estrogênio é selecionado dentre etinilestradiol, estradiol, valerato de estradiol ou misturas dos mesmos. 11. ASSOCIAÇÃO, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que compreende 0 a 40 mcg de etinil estradiol. 12. ASSOCIAÇÃO, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 11, caracterizada pelo fato de controlar sintomas associados à mioma e/ou endometriose 13. ASSOCIAÇÃO, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 12, caracterizada pelo fato de ser contraceptiva ou não. 14. USO DE RESVERATROL E PROGESTOGÊNIO caracterizado pelo fato de ser na preparação de um medicamento útil no tratamento e/ou prevenção de mioma e/ou endometriose . 15. USO DE RESVERATROL E PROGESTOGÊNIO caracterizado pelo fato de ser na preparação de um medicamento útil na prevenção e/ou controle de sintomas relacionados a mioma e/ou endometriose. 16. USO, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato dos sintomas incluírem dor pélvica, dismenorréia, sangramento de escape, tensão pré-menstrual . 17. USO, de acordo com uma qualquer das reivindicações 14 ou 15, caracterizado pelo fato de ser útil como contraceptivo ou não. 18. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA PARA TRATAMENTO E/OU PREVENÇÃO DE MIOMA E/OU ENDOMETRIOSE caracterizada pelo fato de que compreende a associação de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 12 e excipientes farmaceuticamente aceitáveis . 19. MEDICAMENTO PARA TRATAMENTO E/OU PREVENÇÃO DE MIOMA E/OU ENDOMETRIOSE caracterizado pelo fato de que compreende a associação de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 12 como princípio ativo e excipientes farmaceuticamente aceitáveis. 20. KIT caracterizado pelo fato de que compreende 20 a 30 formas de dosagem contendo a associação conforme uma qualquer das reivindicações 1 a 12 acondicionadas em uma embalagem juntamente com instruções para utilização. 21. KIT, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que compreende 1 a 11 comprimidos adicionais contendo resveratrol ou placebos. 22. MÉTODO PARA TRATAMENTO E/OU PREVENÇÃO DE MIOMA E/OU ENDOMETRIOSE caracterizado pelo fato de que compreende fornecer a um paciente necessitado uma associação de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 12, de maneira concomitante ou sequencial, por 20 a 30 dias ou continuamente . 23. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de ser seguido de 1 a 10 dias de pausa ou de administração somente de resveratrol. |
TRATAMENTO E/OU PREVENÇÃO DE MIOMA E/OU ENDOMETRIOSE
Campo da Invenção
A presente invenção refere-se a uma associação de resveratrol com progestagênios, assim como composições farmacêuticas e medicamentos contendo a mesma, e sua utilização no tratamento ou prevenção de mioma e/ou endometriose e controle de sintomas relacionados. Também são objetos da presente invenção um método de tratamento e um kit.
Antecedentes da Invenção
O endométrio é a camada de tecido composto por glândulas e estroma que recobre o útero. A descamação desse tecido é responsável pela menstruação ao término no ciclo menstrual .
A endometriose é uma doença crónica, caracterizada pela presença de tecido endometrial em outras partes do corpo que não o útero. Existem diversas teorias sobre as causas dessa doença. A principal delas prega que células do endométrio sejam transportadas a outras partes do corpo durante a menstruação através das tubas uterinas. Acredita-se também que tenha causas genéticas.
A endometriose pode se manifestar em variadas formas, classificadas de acordo com seu tamanho e localização, por exemplo, peritonial ou extraperitoneal, profunda, aderência pélvica, adenomiose, cistos endometrióides no ovário.
O implante endometrial responde da mesma maneira que o tecido endometrial normal às variações das concentrações de progesterona e estrogênio, crescendo da mesma forma que este durante o ciclo menstrual.
A presença desses implantes causa diversificada sintomatologia, incluindo dismenorréia, dor pélvica crónica, e é frequentemente associada com a infertilidade, apesar dessa associação não estar totalmente esclarecida.
Para tratar essa condição, cirurgias para retirada do implante e administração de diversos compostos são realizadas, separadamente ou em conjunto, porém, na maioria das vezes, esses métodos não são curativos.
Os tratamentos medicamentosos disponíveis se limitam a inibir o crescimento do implante endometrial, particularmente por meio da inibição da produção de estrogênio .
Apesar dos tratamentos medicamentosos contribuírem estancando o crescimento do implante, não permitem sua redução, restando como única solução viável até agora, a remoção cirúrgica, ou seja, emprego de indesejáveis métodos invasivos.
Outra afecção comum do trato genital feminino é presença de miomas. Muitas pacientes portadoras de endometriose também apresentam miomas. Estes são tumores benignos, originados nos músculos lisos, podendo estar presentes em diversos órgãos do organismo humano, sendo o mais comum, o mioma uterino.
A causa do surgimento do mioma, assim como da endometriose, não foi completamente elucidada. 0 estado da técnica comumente propõe que se origina de uma única célula, que se multiplica desordenadamente, originando o mioma. Menciona-se também que a presença desses tumores está relacionada com a exposição a elevados níveis de estrogênio .
Os miomas também são classificados de acordo com a localização onde ocorrem, podendo ser subseroso, intramurais e submucosos. Dependendo do local onde se encontram, do tamanho e do número, os sintomas podem incluir dismenorréia, desconforto abdominal, alta frequência urinária ou retenção e, em alguns casos, infertilidade.
O mioma, na maioria dos casos, é tratado apenas quando apresenta sintomas, uma vez que se trata de um tumor benigno e muitas vezes assintomático.
Quando necessário o tratamento, ele é realizado por via medicamentosa, por meio da administração de antiinflamatórios, administração de análogos de hormônios liberadores de gonadotropina - GnRH, que reduzem a liberação de estrogênio pelo ovário, diminuindo seu crescimento. O método cirúrgico, compreendendo a miomectomia e histerectomia, por sua vez, pode ser definitivo .
Os métodos cirúrgicos de diagnóstico e tratamento, embora mais eficazes, envolvem riscos inerentes a qualquer procedimento invasivo, o que leva à baixa adesão, além de que ser comum recorrências em menos de cinco anos .
Já o tratamento clinico sintomático, tanto para endometriose quanto para mioma, apesar de reduzirem a dor e o desconforto imediato, são limitados por cerca de seis meses, devido aos potenciais efeitos negativos na densidade óssea .
Como característica adicional, o tratamento medicamentoso tem com resultado típico apenas o estancamento do crescimento das estruturas, não possibilitando a regressão e potencial eliminação dos cistos, tampouco redução eficiente de todos os sintomas de desconforto, particularmente em relação à dor. A pelve, a qual contém o útero, as tubas uterinas, os ovários, a vagina, a bexiga e o reto, é a parte mais inferior do tronco, localizada abaixo do abdómen e entre os ossos do quadril. A dor na região da pelve ou dor pélvica é frequente em mulheres, mas nem sempre causada por problemas relacionados ao sistema reprodutivo. Outras causas de dor pélvica estão relacionadas aos intestinos, ao trato urinário ou mesmo fatores psicológicos. O tipo e a intensidade da dor variam e a sua causa pode ser de difícil identificação .
Outro tipo de dor que frequentemente acomete as mulheres é a dismenorréia, uma dor abdominal provocada pelas contrações uterinas que ocorre durante a menstruação. Este distúrbio é denominado dismenorréia primária quando nenhuma causa é encontrada e dismenorréia secundária quando a causa é um distúrbio ginecológico. A dismenorréia primária é comum, possivelmente afetando mais de 50% das mulheres. Ela é grave em aproximadamente 5 a 15%.
Frequentemente, associado a fenómenos hormonais a mulher apresenta cefaléia, náusea, constipação ou diarréia, vómito e urgência para urinar frequentemente.
De maneira geral, a dor pode ser aliviada com a administração de antiinflamatórios não esteróides (p.ex., ibuprofeno, naproxeno e ácido mefenâmico) . Esses medicamentos são eficazes quando são iniciados 2 dias antes da menstruação e mantidos por 1 ou 2 dias durante a menstruação. A náusea e o vómito podem ser aliviados com a administração de um medicamento antiemético (contra o vómito) , mas esses sintomas comumente desaparecem sem tratamento quando as cólicas cessam.
Quando a dor persiste e interfere na atividade normal da mulher, a ovulação pode ser suprimida com doses baixas de contraceptivos orais que contêm estrogênio e progestina ou com medroxiprogesterona (de ação mais prolongada) . Quando esses tratamentos fracassam, exames adicionais podem ser necessários, como a laparoscopia .
O tratamento da dismenorréia secundária depende de sua causa. Um canal cervical estreito pode ser ampliado cirurgicamente, provendo frequentemente três a seis meses de alivio. Quando o tratamento não é bem-sucedido e a dor é intensa, a secção de nervos que inervam o útero ocasionalmente é útil. As complicações incluem a lesão de outros órgãos pélvicos (p.ex., ureteres).
Portanto, o diagnóstico clinico a partir da sintomatologia é importante e, em muitos casos, o controle de sintomas é suficiente.
O resveratrol é um polifenol conhecido e empregado na literatura como componente de nutrição, já que sua fonte mais comum é a uva. Este composto pode ser obtido fontes naturais ou sintéticas e foi descrito no estado da técnica como um antagonista de estrogênio empregado no tratamento de doenças cardiovasculares, pois apresenta a capacidade de diminuir os níveis de lipoproteínas de baixa densidade (LDL) , diminuindo sua produção no fígado e impedindo sua oxidação e aumentar os níveis de lipoproteínas de alta densidade (HDL) , favorecendo sua produção no fígado (Harikumar et AL: Resveratrol - A multitargeted agent for age-associated chronic diseases, Celi Cycle 7:8, 1020-1035 15 April 2008).
Além disso, diversos estudos recentes investigam se resveratrol teria atividade antiproliferativa sobre algumas neoplasias, como a de mama, ovário, cólon e próstata. Essa ação ocorreria porque as neoplasias expressam um receptor de estrogênio em grande quantidade nas suas superfícies. Contudo, estudos mais recentes comprovaram que resveratrol tem baixa atividade sobre o receptor de estrogênio quando comparado a outros fitoestrogênios e não apresenta efeito na proliferação celular em sistema modelo usado na investigação de síntese de hormônios esteróides (Chen et. Al.: Effects of genistein, resveratrol, and quercetin on steroidogenesis, Journal of Endocrinology (2007) 192, 527-537). Assim como outros medicamentos disponíveis, mesmo possuindo alguma ação antiproliferativa, o estado da técnica não ensina que resveratrol seja capaz de proporcionar regressão dessas neoplasias .
Progestogênios , também conhecidos como progestagênios ou gestagênios, constituem um grupo de hormônios esferóide, que inclui a progesterona . Normalmente, são utilizados isolados ou em associação com estrogenios em contraceptivos orais.
Entre os contraceptivos orais que utilizam a combinação entre um progestagênio e um estrogênio encontram-se o monofásico de primeira, segunda e terceira geração, nos quais as doses administradas são sempre as mesmas e os bifásicos e trifásicos, nos quais as doses administradas mudam para imitar a liberação fisiológica desses hormônios.
Os efeitos adversos do uso dos progestagênios são muitos, entre eles aumento do apetite e ganho lento de peso, depressão, fadiga, cansaço, acne, efeito diabetogênico entre outros. A associação entre progetagênios e estrogênios também causa efeitos adversos, como sensibilidade mamária, cefaléia e hipertensão arterial. Na utilização contínua provoca dor e sangramento de escape. Esses efeitos podem variar, dependendo da dose de estrogênio, do tipo e da dose do progestagênio ou da via de administração.
Os anticonceptivos orais em regime estendido são utilizados para tratar desordens uterinas hiperproliferativas, se mostrando eficazes para tratar a dor e o sangramento ocasionados pela endometriose e pelos miomas. Entretanto, esse tratamento ainda não é eficaz para diminuir o tamanho dessas anormalidades e seu uso continuo causa diversos sintomas desagradáveis, como sangramento de escape .
Assim, resta a necessidade de novos tratamentos, que não somente evitem o crescimento das anormalidades (endometriose e mioma) , mas que sejam eficazes na regressão do tamanho destas e no controle dos sintomas associados, dispensando o emprego de métodos complementamos, como os invasivos .
Breve Descrição das Figuras
A presente invenção é ilustrada pelas seguintes figuras :
A figura 1 mostra um gráfico de efeitos sobre o volume uterino em paciente que recebeu, por 2 a 3 meses, a associação de acordo com a presente invenção, em uma de suas realizações, contendo 3 mg de drospirenona, 0,03 mg de etinilestradiol e 50 mg de resveratrol.
As figuras 2A e 2B são ultrassons, antes e depois respectivamente, mostrando redução de mioma submucoso em paciente que recebeu, por 2 a 3 meses, a associação de acordo com a presente invenção, em uma de suas realizações, contendo 3 mg de drospirenona, 0,03 mg de etinilestradiol e 50 mg de resveratrol.
Breve Descrição das figuras
A figura 3 mostra as células obtidas 24 h após o isolamento. Cultura primária obtida a partir de tecido endometriótico humano após 24 h de isolamento: A- células da amostra de tecido 1. lOOx. B- células da amostra de tecido 2. lOOx. A figura 4 mostra curva de crescimento obtida da amostra de tecido 1 durante 9 dias de plaqueamento.
A figura 5 mostra curva de crescimento obtida da amostra de tecido 2 durante 9 dias de laqueamento.
A figura 6 apresenta um isobolograma traçado a partir dos resultado obtidos.
Descrição da Invenção
Buscando uma alternativa que seja efetiva no tratamento e/ou prevenção dessas anormalidades que acometem um número elevado de mulheres, a Depositante desenvolveu uma associação especifica de compostos que, de maneira sinérgica, proporciona efeitos simultâneos, particularmente a redução de tamanho do mioma e/ou implante endometrial (endometriose) .
De acordo com a presente invenção, por
"associação" entende-se que os princípios ativos sejam disponibilizados em uma única unidade de dosagem ou em unidades distintas para administração conjunta ou sequencial .
Por "eficácia de tratamento" entende-se estancar o crescimento, reduzir o mioma e/ou implante endometrial (endometriose), controle dos sintomas associados.
A presente invenção engloba "reduzir" em qualquer de seus aspectos, ou seja, qualquer diminuição perceptível em termos de tamanho, volume, área, etc.
Por "eficácia na prevenção", entende-se impedir o aparecimento ou a reincidência de aparecimento de miomas e/ou endometriose e/ou controlar os sintomas comumente associados a elas.
Por "controle de sintomas", entende-se a melhoria no quadro sintomatológico geral conforme percepção do paciente .
O termo "endometriose" de acordo com a presente invenção engloba uma ou mais de todas as suas diferentes manifestações, por exemplo, peritonial, extraperitoneal , profunda, aderência pélvica, adenomiose, cistos endometrióides no ovário.
Por "sinérgico", entende-se que os efeitos sejam superiores à mera somatória dos efeitos isolados.
Por "simultâneos", entende-se que uma ou mais manifestações ou sintomas relacionados sejam tratados ao mesmo tempo, sem o emprego de tratamentos medicamentosos adicionais .
Os sintomas de acordo com a presente invenção podem incluir uma ou mais dentre quaisquer manifestações físicas que prejudicam a qualidade de vida do paciente, como dores pélvicas, dores em relações sexuais ou durante o ciclo menstrual (dismenorréia) , sangramentos de escape, tensão pré-menstrual .
Assim, a presente invenção refere-se a uma associação de resveratrol com progestagênios, particularmente gestodeno, desogestrel, levonogestrel, drospirenona e dienogest, opcionalmente na presença de um estrogênio, particularmente etinilestradiol, estradiol, valerato de estradiol, ou misturas dos mesmos.
A presente invenção contempla o composto resveratrol em qualquer de suas formas, como isômeros, sais, hidratos, solvatos, derivados, etc.
Os isômeros podem ser eis ou trans, particularmente na forma trans.
A quantidade de reverastrol por unidade de dosagem pode variar entre 15 mg a 10.000 mg, particularmente 15 a 100 mg. Esta quantidade pode variar de acordo com a fonte de obtenção e as características físico- químicas do composto obtido, por exemplo, pureza, solubilidade, etc. De maneira ainda mais particular, emprega-se quantidade de cerca de 30 mg por unidade de dosagem.
As quantidades por unidade de dosagem de gestodeno variam entre 35 mcg a 115 mcg, de drospirenona variam entre 1,5 mg a 4,5 mg, de dienogest variam entre 1 mg a 4mg, de levonogestrel variam entre 40 a 70 mg e de desogestrel variam entre 75 mcg a 225 mcg. Outros progestogênios podem ser utilizados em quantidades terapeuticamente equivalentes. De maneira ainda mais particular, a associação compreende adicionalmente de 0,001 a 40 mcg de etinil estradiol, particularmente 0,1 a 40 mcg. Outros estrogênios ou misturas de estrogênios podem ser utilizados em quantidades terapeuticamente equivalentes .
Quando os progestogênios são empregados em baixa dose, condição em que não são eficazes para contracepção, é vantajosamente obtida uma associação eficaz nos tratamentos aqui descritos, sem impedir a gravidez.
O componente estrogênio contribui de maneira significativa para melhora no padrão de sangramento das pacientes e controle dos sintomas.
Outro objeto da presente invenção consiste em uma composição farmacêutica que contém a associação aqui descrita e excipientes farmaceuticamente aceitáveis. Os excipientes adequados podem ser selecionados dentre aqueles conhecidos da técnica, particularmente, para preparação de comprimidos. Uma obra de referência para formulação de tais formas farmacêuticas é o livro Remington' s Pharmaceutical Sciences, da editora americana Mack Publishing.
Sem impor qualquer limitação, são exemplos de excipientes farmaceuticamente aceitáveis: ácido esteárico, álcool etílico, amido, croscarmelose sódica, dióxido de silício, dl-a-tocoferol, edetato de sódio, estearato de magnésio, lactose, povidona. As composições podem incluir ainda excipientes formadores de revestimento, corantes, etc.
Um terceiro objeto de acordo com a presente invenção consiste em um kit para disponibilização da associação as pacientes. Referido kit compreende, por exemplo, de 20 a 30 formas de dosagem, particularmente 21, 24 ou 28, acondicionadas em uma embalagem juntamente com instruções para utilização. A embalagem pode conter ainda comprimidos adicionais contendo resveratrol ou placebo, por exemplo, 1 a 10, particularmente 7 ou 4 comprimidos.
A associação de acordo com a presente invenção é eficaz no tratamento ou prevenção de endometriose e/ou mioma não só por impedir o crescimento de tais anormalidades, mas também por propiciar uma redução estatisticamente significativa das mesmas.
Referida associação também propicia o controle dos sintomas associados a estas doenças e, de maneira adicional, um efeito contraceptivo em mulheres em idade fértil ou repositor hormonal em mulheres necessitadas, por exemplo, na pré-menopausa ou menopausa. Nesse sentido, as dosagens dos progestogênios empregados na associação de acordo com a presente invenção são aquelas que propiciam efeito contraceptivo.
De maneira surpreendente a associação mostrou-se também eficaz no tratamento dessas manifestações, simultaneamente, o que pode evitar o uso de medicamentos adicionais.
Assim, outro objeto da presente invenção refere- se ao uso de resveratrol e progestogênio na preparação de um medicamento útil no tratamento (redução) e/ou prevenção de mioma e/ou endometriose e/ou controle de sintomas associados . A presente invenção refere-se ainda a um método para tratamento (redução) e/ou prevenção de mioma e/ou endometriose que consiste em fornecer a uma paciente necessitada uma associação de acordo com a presente invenção por 20 a 30 dias, particularmente 21 ou 24 dias, ou continuamente. Os métodos podem ser seguidos de 1 a 10 dias, particularmente 7 ou 4 dias, de pausa ou de administração de resveratrol isoladamente. O fornecimento pode ser concomitante, em uma única unidade de administração ou em diferentes unidades, ou sequencial, em unidades de administração separadas.
EXEMPLOS
São apresentados a seguir exemplos meramente ilustrativos de realização da presente invenção. - Estes exemplos não impõem qualquer limitação ao escopo da presente invenção.
EXEMPLO 1
FORMULAÇÕES
Foram preparadas formulações de controle e formulações de acordo com a presente invenção, em quantidade suficiente para realização dos testes de eficácia .
As formulações contendo somente progestogênio ou progestogênio e estrogênio, utilizadas como controle ou na associação de acordo com a presente invenção, são de acordo com aquelas disponíveis no mercado.
EXEMPLO 2
TESTES DE EFICÁCIA
Para ilustrar a eficácia da associação de acordo com a presente invenção, foram preparadas associações de resveratrol, nas quantidades de 30 mg e 50 mg, com:
A - 75 mcg de gestodeno e 30 mcg de etinilestradiol; B - 3 mg de drospirenona e 30 meg de etinilestradiol e
C - 52 mg levonogestrel (sistema intrauterino) Nas realizações A e B acima, foram empregadas formas de administração por via oral (comprimidos) e na realização C o progestogênio foi empregado como sistema intrauterino juntamente com resveratrol em forma de administração por via oral (comprimidos) .
Para verificar os efeitos simultâneos propiciados pela associação de acordo com a presente invenção foi realizado um teste piloto com 18 pacientes do sexo feminino, com idade variando entre 27 e 43 anos, sendo que 3 pacientes apresentavam adenomiose e mioma, 2 apresentavam adenomiose, 8 apresentavam mioma, 1 apresentava cisto endometrial, 2 apresentavam endometriose e 2 apresentavam mioma e endometriose.
Cada paciente recebeu um dos tipos de associação descritos acima (A a C) , diariamente.
O volume ' uterino foi medido em tempos distintos para cada paciente (entre 2 e 9 meses) . Observou-se que em 17 pacientes houve diminuição percentual significativa do volume uterino.
A figura 1 mostra os efeitos sobre o volume uterino em uma das pacientes que recebeu 3 mg de drospirenona, 0,03 mg de etinilestradiol e 50 mg de resveratrol, por quase 3 meses.
Avaliou-se também o volume dos miomas por ultrassonografia vaginal e a intensidade dos sintomas como sangramento e dor foi avaliada através de questionário respondido antes e após o tratamento.
As figuras 2A e 2B são ultrassons mostrando redução de mioma submucoso em uma das pacientes que recebeu 3 mg de drospirenona, 0,03 mg de etinilestradiol e 50 mg de resveratrol, por quase 3 meses.
Em todas as pacientes, não houve aparecimento de novas anormalidades e a associação de acordo com a presente invenção mostrou-se eficaz para diminuir a dor pélvica e provocar amenorréia. Nas pacientes com mioma foi possível observar diminuição do volume em cerca de 30% entre o segundo e o quarto mês de uso.
Observou-se ainda regularização do padrão de sangramento, ou seja, sem sangramento uterino irregular.
EXEMPLO 3
VOLUME DO ÚTERO MIOMA INTRAMURAL, ADENOMIOSE E ENDOMETRIOSE
Foi realizado experimento com 30 pacientes tratadas com combinações de drospirenona, etinilestradiol e resveratrol e também combinações de gestinol e resveratrol, avaliando-se o volume do útero antes e depois do tratamento.
Tabela 1
Medições de volume do útero
Pacientes com mioma intramural , adenomiose e endometriose
Avaliação antes e depois do tratamento
utilizando combinações de
drospirenona, etinilestradiol e resveratrol e
combinações de gestinol e resveratrol
Volume Volume Tempo de % de
Patologia Compostos
antes depois tratamento diminuição
Drospirenona
621 583 3 meses Mioma Etinilestradiol 6, 11916
Resveratrol
Drospirenona
239 196 1 mês Mioma Etinilestradiol 17, 9916
Resveratrol Volume Volume Tempo de % de
Patologia Compostos
antes depois tratamento diminuição
Drospirenona
143 134 2 meses Endometriose Etinilestradiol 6,29371
Resveratrol
Drospirenona
157 121 3 meses Adenomiose Etinilestradiol 22, 9299
Resveratrol
Drospirenona
87 65 6 meses Endometriose Etinilestradiol 25,2874
Resveratrol
Drospirenona
98 85 1 mês Endometriose Etinilestradiol 13,2653
Resveratrol
Drospirenona
172 160 1 mês Miorna Etinilestradiol 6, 97674
Resveratrol
Drospirenona
243 218 9 meses Miorna Etinilestradiol 10,2881
Resveratrol
Drospirenona
100 80 1 mês Endometriose Etinilestradiol 20
Resveratrol
Drospirenona
609 232 3 meses Mioma Etinilestradiol 61, 9048
Resveratrol Volume Volume Tempo de % de
Patologia Compostos
antes depois tratamento diminuição
Drospirenona
39 28 2 meses Endometriose Etinilestradiol 28,2051
Resveratrol
Drospirenona
244 188 1 mês Mioma Etinilestradiol 22, 9508
Resveratrol
Drospirenona
134 60 12 meses Endometriose Etinilestradiol 55,2239
Resveratrol
Drospirenona
82 73 3 meses Endometriose Etinilestradiol 10, 9756
Resveratrol
Drospirenona
213 130 2 meses Mioma Etinilestradiol 38, 9671
Resveratrol
Drospirenona
150 110 6 meses Adenomiose Etinilestradiol 26, 6667
Resveratrol
Drospirenona
652 414 2 meses Mioma Etinilestradiol 36, 5031
Resveratrol
Drospirenona
112 81 2 meses Adenomiose Etinilestradiol 27, 6786
Resveratrol Volume Volume Tempo de % de
Patologia Compostos
antes depois tratamento diminuição
Gestinol
217 159 3 meses Miorna 26, 7281
Resveratrol
Gestinol
305 235 5 meses Miorna 22, 9508
Resveratrol
Gestinol
62 58 2 meses Endometriose 6, 45161
Resveratrol
Gestinol
141 121 3 meses Mioma 14, 1844
Resveratrol
Gestinol
133 126 6 meses Endometriose 5,26316
Resveratrol
Gestinol
71 37 3 meses Endometriose 47, 8873
Resveratrol
Gestinol
141 93 3 meses Endometriose 34, 0426
Resveratrol
Gestinol
105 86 3 meses Endometriose 18, 0952
Resveratrol
Gestinol
125 85 3 meses Endometriose 32
Resveratrol
Gestinol
70 58 3 meses Mioma 17, 1429
Resveratrol
Gestinol
245 137 3 meses Adenomiose 44, 0816
Resveratrol Volume Volume Tempo de % de
Patologia Compostos
antes depois tratamento diminuição
Gestinol
70 58 3 meses Miorna 17, 1429
Resveratrol
Como pode ser observado, a associação de ativos drospirenona, etinilestradiol e resveratrol levou a uma diminuição de até 61 % para mioma e 55% para endometriose e associação de gestinol e resveratrol resultou em diminuição de até 26% dos miomas e 47% dos implantes endometriais .
Em estudos comparativos com três pacientes A, B e C, apresentando mioma intramural, tratadas apenas com resveratrol, verificou-se resultados de aumento de 32% para paciente A, tratada durante 12 meses; aumento de 27% para paciente B tratada durante 3 meses; e aumento de 22 % para paciente C tratada durante 1 mês.
EXEMPLO 4
AVALIAÇÃO DOS SINTOMAS DE DISMENOKREIA E SANGRAMENTO
■Em um experimento que visava à avaliação dos sintomas de dismenorreia e sangramento, solicitou-se a 83 pacientes com endometriose, mioma ou adenomiose, que avaliassem os referidos sintomas em escalas de 0 a 3, antes e depois do tratamento com combinações de drospirenona, etinilestradiol e resveratrol e combinações de gestinol e resveratrol.
Para dismenorreia classificou-se 0 - ausência de dor; 1 - dor fraca; 2 - dor moderada; e 3 - dor forte. Para sangramento classificou-se 0 - ausência de sangramento; 1 - sangramento fraco; 2 - sangramento moderado; e 3 - sangramento forte.
Tabela 2
Avaliação dos sintomas de dismenorreia e sangramento por 83
pacientes em escalas de 0 - 3. Sintoma Antes do Depois do
Compostos Patologia avaliado tratamento tratamento
Drospirenona
Dismenorreia 3 0 Etinilestradiol Mioma
Resveratrol
Drospirenona
Dismenorreia 3 0 Etinilestradiol Endometriose
Resveratrol
Drospirenona
Dismenorreia 3 1 Etinilestradiol Endometriose
Resveratrol
Drospirenona
Dismenorreia 3 0 Etinilestradiol Endometriose
Resveratrol
Drospirenona
Dismenorreia 3 1 Etinilestradiol Mioma
Resveratrol
Drospirenona
Dismenorreia 3 0 Etinilestradiol Endometriose
Resveratrol
Drospirenona
Dismenorreia 3 0 Etinilestradiol Mioma
Resveratrol
Drospirenona
Dismenorreia 3 1 Etinilestradiol Mioma
Resveratrol
Drospirenona
Dismenorreia 3 0 Etinilestradiol Endometriose
Resveratrol
Drospirenona
Dismenorreia 3 0 Etinilestradiol Mioma
Resveratrol Sintoma Antes do Depois do
Compostos Patologia avaliado tratamento tratamento
Drospirenona
Dismenorreia 3 0 Etinilestradiol Adenomiose
Resveratrol
Drospirenona
Dismenorreia 3 0 Etinilestradiol Adenomiose
Resveratrol
Drospirenona
Dismenorreia 3 1 Etinilestradiol Miorna
Resveratrol
Drospirenona
Dismenorreia 3 1 Etinilestradiol Miorna
Resveratrol
Drospirenona
Dismenorreia 3 0 Etinilestradiol Miorna
Resveratrol
Drospirenona
Dismenorreia 2 0 Etinilestradiol Mioma
Resveratrol
Drospirenona
Dismenorreia 2 0 Etinilestradiol Mioma
Resveratrol
Drospirenona
Dismenorreia 3 0 Etinilestradiol Adenomiose
Resveratrol
Gestinol
Dismenorreia 3 0 mioma
Resveratrol
Gestinol
Dismenorreia 3 0 Mioma
Resveratrol
Gestinol
Dismenorreia 3 0 Endometriose
Resveratrol Sintoma Antes do Depois do
Compostos Patologia avaliado tratamento tratamento
Gestinol
Dismenorreia 3 2 Miorna
Resveratrol
Gestinol
Dismenorreia 3 0 Mioma
Resveratrol
Gestinol
Dismenorreia 3 1 Endometriose
Resveratrol
Gestinol
Dismenorreia 3 0 Endometriose
Resveratrol
Gestinol
Dismenorreia 3 0 Endometriose
Resveratrol
Gestinol
Dismenorreia 3 1 Endometriose
Resveratrol
Gestinol
Dismenorreia 3 1 Endometriose
Resveratrol
Gestinol
Dismenorreia 3 1 Endometriose
Resveratrol
Gestinol
Dismenorreia 3 1 Endometriose
Resveratrol
Gestinol
Dismenorreia 3 0 Endometriose
Resveratrol
Gestinol
Dismenorreia 3 0 Endometriose
Resveratrol
Gestinol
Dismenorreia 3 0 Mioma
Resveratrol
Gestinol
Dismenorreia 3 0 Mioma
Resveratrol
Gestinol
Dismenorreia 2 0 Mioma
Resveratrol
Gestinol
Dismenorreia 3 1 Endometriose
Resveratrol Sintoma Antes do Depois do
Compostos Patologia avaliado tratamento tratamento
Gestinol
Dismenorreia 2 0 Miorna
Resveratrol
Gestinol
Dismenorreia 3 1 Adenomiose
Resveratrol
Gestinol
Dismenorreia 3 1 Adenomiose
Resveratrol
Gestinol
Dismenorreia 3 0 Endometriose
Resveratrol
Drospirenona
Sangramento 3 0 Etinilestradiol Miorna
Resveratrol
Drospirenona
Sangramento 2 0 Etinilestradiol Endometriose
Resveratrol
Drospirenona
Sangramento 3 0 Etinilestradiol Endometriose
Resveratrol
Drospirenona
Sangramento 3 0 Etinilestradiol Endometriose
Resveratrol
Drospirenona
Sangramento 3 0 Etinilestradiol Mioma
Resveratrol
Drospirenona
Sangramento 3 0 Etinilestradiol Endometriose
Resveratrol
Drospirenona
Sangramento 3 0 Etinilestradiol Mioma
Resveratrol Sintoma Antes do Depois do
Compostos Patologia avaliado tratamento tratamento
Drospirenona
Sangramento 2 1 Etinilestradiol ioma
Resveratrol
Drospirenona
Sangramento 3 0 Etinilestradiol Endometriose
Resveratrol
Drospirenona
Sangramento 2 0 Etinilestradiol Endometriose
Resveratrol
Drospirenona
Sangramento 3 0 Etinilestradiol Adenomiose
Resveratrol
Drospirenona
Sangramento 3 0 Etinilestradiol Adenomiose
Resveratrol
Drospirenona
Sangramento 3 0 Etinilestradiol Mioma
Resveratrol
Drospirenona
Sangramento 2 1 Etinilestradiol Mioma
Resveratrol
Drospirenona
Sangramento 2 0 Etinilestradiol Endometriose
Resveratrol
Drospirenona
Sangramento 2 0 Etinilestradiol Mioma
Resveratrol
Drospirenona
Sangramento 3 1 Etinilestradiol Mioma
Resveratrol Sintoma Antes do Depois do
Compostos Patologia avaliado tratamento tratamento
Drospirenona
Sangramento 3 0 Etinilestradiol Adenomiose
Resveratrol
Gestinol
Sangramento 2 0 Miorna
Resveratrol
Gestinol
Sangramento 3 0 Mioma
Resveratrol
Gestinol
Sangramento 3 0 Adenomiose
Resveratrol
Gestinol
Sangramento 3 0 Endometriose
Resveratrol
Gestinol
Sangramento 1 0 Mioma
Resveratrol
Gestinol
Sangramento 3 0 Endometriose
Resveratrol
Gestinol
Sangramento 3 2 Mioma
Resveratrol
Gestinol
Sangramento 3 0 Mioma
Resveratrol
Gestinol
Sangramento 3 0 Mioma
Resveratrol
Gestinol
Sangramento 3 0 Endometriose
Resveratrol
Gestinol
Sangramento 3 0 Endometriose
Resveratrol
Gestinol
Sangramento 3 0 Endometriose
Resveratrol
Gestinol
Sangramento 3 1 Adenomiose
Resveratrol Sintoma Antes do Depois do
Compostos Patologia avaliado tratamento tratamento
Gestinol
Sangramento 3 1 Miorna
Resveratrol
Gestinol
Sangramento 2 0 Endometriose
Resveratrol
Gestinol
Sangramento 3 1 Adenomiose
Resveratrol
Gestinol
Sangramento 3 0 Endometriose
Resveratrol
Gestinol
Sangramento 3 0 Endometriose
Resveratrol
Gestinol
Sangramento 3 0 Endometriose
Resveratrol
Gestinol
Sangramento 3 1 Miorna
Resveratrol
Gestinol
Sangramento 3 0 Endometriose
Resveratrol
Gestinol
Sangramento 3 0 Mioma
Resveratrol
Gestinol
Sangramento 3 0 Miorna
Resveratrol
Gestinol
Sangramento 2 0 Mioma
Resveratrol
Gestinol
Sangramento 3 0 Endometriose
Resveratrol
Observa-se gue a associação de acordo com a presente invenção reduzir significantemente os sintomas avaliados .
EXEMPLO 5
AVALIAÇÃO DA AÇÃO DOS COMPOSTOS ISOLADOS E CONJUGADOS
Objetivos Estabelecer a cultura primária de células estromais extraidas de tecidos endometrióticos humanos e avaliar o sinergismo de estrógeno/progestógeno com o fitoesterol (trans-3, 5,4'' -trihidroxystilbene) .
Material e Métodos
Substância - teste:
187A: Dienogest - progesterona sintética, utilizada em pílulas anticoncepcionais e estudada em tratamentos de endometriose (dose fixa de 2 mg) - conjugado com Etinilestradiol - estrógeno sintético utilizado em pílulas contraceptivas (dose variável entre 0 e 40 μg) .
187B: Resveratrol - fitoalexina produzida por diversas plantas, como uva, amendoim e amora, com atividades antioxidante, anticoagulante, antiinflamatória e antiproliferativa.
187C: Conjugado dos fármacos - Dienogest (2 mg) + Etinilestradiol + Resveratrol.
187D: Conjugado de Dienogest (2 mg) + ^Resveratrol .
187E: Dienogest isolado.
187F: Etinilestradiol isolado
Substância de referência:
Controle Positivo (Dan) : Danazol comercial (Ladogal®) ;
Controle Negativo: células estromais de endometrioma incubadas com 200 μΐ, de meio de cultura suplementado com 10 % de soro fetal bovino e 0,1 % de DMSO.
Aplicação e preparação da substância-teste
A definição das concentrações das drogas para avaliação in vitro foi estabelecida a partir de estudos de farmacocinética publicados; relacionando a dose oral administrada para humanos juntamente com concentração plasmática máxima (Cmax) equivalente a esta dose.
Com esses dados traçou-se uma curva de correlação e realizou-se a regressão linear para cálculo das concentrações plasmáticas desconhecidas, utilizando o software Graphpad Instat 3.0.
Após o cálculo das concentrações, as substâncias- teste foram diluídas em 100% de DMSO, sendo a concentração da solução estoque de 1 mM para o Etinilestradiol e 10 ri para o Dienogest, Resveratrol e Danazol. A solução de uso foi obtida por meio de diluições seriadas 1:10 em meio de cultura suplementado com 10 % de soro fetal bovino e 1 % de antibiótico/antimicótico. A concentração final de DMSO nas
soluções foi de 0,1 %.
Preparação do sis ema- es e
Coleta dos Tecidos
Tecidos endometrióticos foram obtidos de 2 doadoras voluntárias por meio de videolaparoscopia, com assinatura dos respectivos termos de consentimento e idades entre 18 e 45 anos. Das amostras teciduais, foi retirado um fragmento para confirmação histológica de endometriose e o excedente, acondicionado em frasco estéril contendo meio de cultura DMEM/Ham' s F12 (Gibco®) com antibiótico ampicilina e estreptomicina (Merck®) e encaminhado imediatamente para o laboratório.
Isolamento e Cultura das Células Endometrióticas
No laboratório, o tecido foi lavado com PBS pH 7,4 e fracionado em pequenos pedaços (1-2 mm 3 ), incubado em DMEM/Ham' s F12 (Gibco®) suplementado com Colagenase tipo I (Sigma®), na concentração de 1,2 mg/mL, por 2 horas em estufa com atmosfera de 5 % de C02 a 37 °C. A suspensão resultante foi centrifugada e ressuspendida em meio de cultura e em seguida transferida para uma garrafa de cultura de 25 cm 2 .
A pureza da cultura de células foi testada por imuno-citoquímica utilizando anticorpo primário monoclonal de coelho anti-vimentina humana (Spring Bioscience®) e anticorpo secundário policlonal de cabra anti-IgG de coelho marcado com Texas Red ( Invitrogen®) .
As células foram mantidas e amplificadas em meio DME /Ham' s F12 (Gibco®) 10% SBF, com os antibióticos ampicilina e estreptomicina na concentração 50 mg/mL, em garrafa de cultura até atingirem a sub-confluência (90% da confluência) , em seguida transferidas para placas de 96 poços para condução dos ensaios de avaliação da atividade antiproliferativa .
Avaliação da Atividade Antiproliferativa As células foram transferidas para placas de 96 poços a uma densidade de 10.000 células por poço em meio de cultura com 10 % de SBF e incubadas por 48 horas. Após este período, o meio foi removido e substituído por 200 μΙ> de meio experimental, contendo concentrações dos fármacos (dienogest, etinilestradiol e resveratrol, isolados ou em associação) e conduziu-se a incubação por mais 24 horas. Em seguida, foi adicionado o sal tetrazólico MTT (Invitrogen®) a uma concentração de 1 mg/mL, seguindo os tempos de incubação descritos pelo manual do fabricante.
A proliferação celular foi indiretamente avaliada utilizando-se o método colorimétrico MTT (Invitrogen®) e mensuração da absorbância a 540 nm na leitora de placas SpectraMax M2 - Molecular Devices com o software SoftMax Pro 5.2. Deste modo, pode-se obter resultados da atividade antiproliferativa dos fármacos sobre as células. Os dados foram calculados com a razão dos valores obtidos das culturas expostas aos fármacos (e em diferentes concentrações, associados ou não) e das culturas não expostas. Foi considerada a referência de 100% de viabilidade celular, as células cultivadas sem a presença de fármacos. Análise dos efeitos de fármacos conjugados
Os efeitos conjugados entre os fármacos dienogest (fixo 52,94 ng/mL) , etinilestradiol e resveratrol, e do conjugado dienogest (fixo 52,94 ng/mL) e etinilestradiol foram avaliados a partir das concentrações necessárias para observarmos efeitos equipotentes com os fármacos isolados. Para a analise deste resultado aplicou-se a equação proposta por Tallarida. Resumidamente, as concentrações do fármaco 1 e do fármaco 2, quando conjugados, que produzem um dado efeito são chamadas de Zl* e Z2*, respectivamente. As concentrações do fármaco 1 e do fármaco 2, quando isolados e que produzem o mesmo efeito, são chamadas de Zl e Z2, respectivamente. Desta forma é descrito que:
a) Para conjugação aditiva esta relação satisfaz a seguinte equação:
Z1*/Z1 + Z2*/Z2 = 1
b) Para conjugação sinérgica esta relação satisfaz a seguinte equação:
Z1*/Z1 + Z2*/Z2 < 1
c) Para conjugação antagónica esta relação satisfaz a seguinte equação:
Z1*/Z1 + Z2*/Z2 > 1
Esses dados foram utilizados para traçar a curva de C max em função da dose oral administrada. A partir da curva calcularam-se os pontos de Cmax das doses estipuladas no estudo .
EXEMPLO 6
ANÁLISE DE EFICÁCIA PELO MÉTODO DE TALLARIDA
A partir das equações da reta descritas por Tallarida (Tallarida RJ. Statístical analysis of drug combinations for synergism. Pain. 1992; 49: 93-97; Tallarida RJ. Drug synergism: Its detection and applications . The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics . 2001; 298: 865-872) calculou-se, para cada fármaco isolado, a concentração que produziria o mesmo efeito dos fármacos conjugados (efeito equipotente) .
A tabela a seguir mostra o resultado obtido para o conjugado (dienogest + etinilestradiol + resveratrol) , nomeado de amostra 187C.
Tabela 3A
Valores de concentração para efeitos equxpotentes entre os fármacos isolados e a conjugação entre dienogest,
etinilestradiol e resveratrol
Em todos os ensaios a dose de dienogest empregada foi de 2 mg, que corresponde a concentração de 52,4 ng/mL
As concentrações foram selecionadas de experimentos que mostraram o melhor efeito.
As concentrações de 197,7 ng/mL de resveratrol e de 0,034 ng/mL de etinilestradiol foram eleitas como concentrações 100% para verificação das concentrações proporcionais, segundo ensinamento de Tallarida. Verificaram-se então as concentrações de 98,99 ng/mL de resveratrol e 0,017 ng/mL de etinilestradiol que correspondem a 50% das concentrações 100% previamente eleitas. Também se verificaram as concentrações de 75% de resveratrol correspondente a 148,5 ng/mL e 25% de etinilestradiol correspondente a 0,009 ng/mL.
Com base nos resultados obtidos conforme tabela acima, calculou-se o coeficiente pela equação de relação de Tallarida, a fim de obter-se a avaliação de efeitos conjugados .
O resultado indica sinergismo das combinações nos ensaios realizados, notadamente onde a relação etinilestradiol/resveratrol é menor, conforme pode ser verificado na tabela a seguir.
Tabela 3B
Análise dos Resultados
Onde: Zl e Z2 são as concentrações dos fármacos isolados e Zl* e Z2* são as concentrações dos compostos conjugados .
Tabela 4
Massa relativa dos fármacos no conjugado 187C (em relação à massa total em ng/mL (C M a ) ·
Tabela 5 Massa relativa dos fármacos no conjugado 187C (em relação à massa total em mg (dose oral)
Verificou-se que a manutenção de proporção entre os fármacos impacta diretamente no efeito, particularmente considerando doses baixas de etinilestradiol.
EXEMPLO 7
ENSAIOS DE PROLIFERAÇÃO CELULAR
As Tabelas a seguir mostram os valores de proliferação celular obtidos. Esses resultados foram utilizados para obtenção das curvas dose-resposta de cada fármaco isolado e conjugado.
Tabela 6
Resultados brutos de proliferação celular utilizados para a construção da curva dose-resposta do resveratrol isolado
Concentração de utilizada no conjugad ' Tabela 7
Resultados brutos de proliferação celular utilizados para a construção da curva dose-resposta do conjugado 187A
Tabela 8
Resultados brutos de proliferação celular utilizados para a construção da curva dose-resposta do conjugado 187C.
As tabela comparativas 6-8 mostram que o conjugado obteve o melhor resultado em relação a inibição da proliferação.
Deve-se compreender que as realizações descritas acima são meramente ilustrativas e que qualquer modificação ao longo delas pode ocorrer para um técnico no assunto. Consequentemente, a presente invenção não deve ser considerada limitada às realizações descritas no presente.
0 homem da técnica saberá prontamente avaliar, por meio dos ensinamentos contidos no texto e nos exemplos apresentados, vantagens da invenção e propor variações e alternativas equivalentes de realização, sem no entanto fugir ao escopo da invenção, conforme definido nas reivindicações anexas.