La présente invention concerne un procédé de préparation et d'analyse d'une pluralité de suspensions cellulaires, du type comprenant au moins les étapes successives suivantes :

(a) chargement d'une pluralité de flacons sur un plateau de réception, chaque flacon comprenant une suspension cellulaire à analyser ;

(b) chargement d'une pluralité de contenants d'analyse sur le plateau de réception ; et

(c) prélèvement d'un échantillon d'une suspension cellulaire dans un flacon et dépôt de cet échantillon dans un contenant d'analyse ; l'étape (c) étant répétée pour chaque flacon à analyser.

L'invention concerne également un automate de préparation et d'analyse mettant en œuvre ce procédé.

L'analyse d'une suspension cellulaire et par exemple d'un étalement cytologique fixé est une opération extrêmement délicate. Le diagnostic cytologique recouvre les techniques de diagnostic se basant sur l'examen morphologique des cellules. Il est très bien adapté au dépistage du cancer et des lésions précancéreuses, notamment du col de l'utérus.

Le but d'une telle analyse est en effet de dépister des cellules pathologiques, il convient donc d'obtenir un dépôt cellulaire parfaitement lisible, afin d'éviter toute erreur de diagnostic, et représentatif de la zone d'intérêt.

Afin de permettre l'analyse d'un grand nombre d'échantillons et avoir une grande cadence de traitement, on cherche à automatiser la préparation des échantillons en vue de leur analyse, ainsi que leur analyse proprement dite. A cet effet, il est connu des automates permettant de préparer des plaques d'analyse à partir de prélèvements, tels que des frottis et autres.

Un automate du type précité est par exemple décrit dans le document

US 2009/0233331 .

Cependant, de tels automates ne permettent pas toujours de préparer des dépôts cellulaires permettant de réaliser une analyse satisfaisante et d'obtenir un diagnostic fiable. De tels automates utilisent des dispositifs engendrant un certain nombre d'artéfacts avec notamment des problèmes de gestion de la pression du filtre, avec des modifications de morphologie cellulaire et des problèmes de bouchage des mailles du filtre par des débris. En outre, les manipulations sont différentes en fonction du type de prélèvement : par exemple, il faut peut-être supprimer les hématies ou mucus avant de recueillir les cellules sur le filtre.

Ainsi il n'est pas possible de mettre en œuvre un procédé standardisé commun à tous les types de prélèvements cytologiques, gynécologiques et non gynécologiques, et limitant l'intervention d'opérateurs au minimum.

L'un des buts de l'invention est de pallier ces inconvénients en automatisant complètement la préparation et l'analyse d'une pluralité de suspensions cytologiques de manière fiable, reproductive et standardisée à grande cadence. Quel que soit le type de cytologie, le procédé de préparation est similaire.

A cet effet, l'invention a pour objet un procédé de prélèvement et d'analyse d'une pluralité de suspensions cellulaires tel que l'étape (c) de prélèvement d'un échantillon d'une suspension cellulaire dans un flacon et dépôt de cet échantillon dans un contenant d'analyse comprend au moins une étape de rupture des amas cellulaires grâce à des moyens de pipetage-distribution.

Selon d'autres caractéristiques du procédé :

- l'étape (c) de prélèvement d'un échantillon d'une suspension cellulaire dans un flacon et dépôt de cet échantillon dans un contenant d'analyse comprend au moins une étape de mélange et de filtration de la suspension cellulaire dans le flacon.

- l'étape (c) de prélèvement d'un échantillon d'une suspension cellulaire dans un flacon et dépôt de cet échantillon dans un contenant d'analyse comprend en outre au moins les étapes suivantes :

(d) remise en suspension de l'échantillon ;

(e) sélection des cellules relevantes par décantation différentielle ;

(f) aspiration d'un volume résultant de la décantation différentielle par des moyens de pipetage, le volume contenant l'échantillon à analyser ;

(g) remise en suspension homogène du volume contenant l'échantillon à analyser dans les moyens de pipetage ;

(h) déplacement des moyens de pipetage afin de les placer au dessus du contenant d'analyse ;

(i) versement de l'échantillon à analyser dans le contenant d'analyse.

- chaque contenant d'analyse comporte un puits de décantation et une lame d'analyse placée en regard du puits de décantation et le procédé comporte au moins les étapes successives suivantes :

(j) mise en place d'une feuille d'absorption sur le plateau de chargement, de telle sorte que chaque lame d'analyse est disposée entre le plateau de chargement et la feuille d'absorption ; (k) chargement d'une pluralité de puits de décantation dans une presse et mise en place de la presse au dessus du plateau de telle sorte que chaque puits de décantation est disposé au dessus et en regard d'une lame d'analyse ; et

(I) réalisation d'un étalement d'analyse cellulaire sur la lame d'analyse, l'étalement cellulaire résultant du dépôt de l'échantillon dans le puits de décantation ;

les étapes (j) et (k) se déroulant après l'étape (b) de chargement d'une pluralité de contenants d'analyse et avant l'étape (c) de prélèvement d'un échantillon d'une suspension cellulaire et l'étape (I) se déroulant après l'étape (c) de prélèvement d'un échantillon d'une suspension cellulaire ;

- il comprend une étape d'analyse du dépôt des cellules au fond des puits de décantation en mesurant la densité cellulaire sur les lames d'analyse ;

- il comprend une étape automatisée de coloration ou de marquage cellulaire ;

- il comprend au préalable une étape de fermeture définitive du flacon contenant la suspension cellulaire à analyser, le procédé étant mis en œuvre sans ouverture ultérieure du flacon ;et

- chaque contenant d'analyse comporte un tube de prélèvement ou d'aliquotage. L'invention a également pour objet un automate de prélèvement et d'analyse d'au moins une suspension cellulaire comprenant :

- au moins un flacon contenant la suspension cellulaire à analyser ;

- au moins un plateau de réception sur lequel le flacon est positionné et maintenu de façon précise et fixe ;

- au moins un puits de décantation de la suspension cellulaire, le puits de décantation étant positionné et maintenu de façon précise et fixe sur le plateau ;

- un système d'analyse comprenant au moins une lame d'analyse destinée à recevoir/contenir un échantillon de la suspension cellulaire, l'échantillon étant une portion en volume de la suspension cellulaire contenant des éléments d'intérêts à analyser et la lame d'analyse étant positionnée et maintenue de façon précise et fixe sur le plateau en dessous et en regard du puits de décantation ;

l'automate comporte des moyens de pipetage aptes à prélever l'échantillon de la suspension cellulaire dans le flacon et à verser cet échantillon dans le puits de décantation sur la lame d'analyse du système d'analyse, ces moyens étant agencés pour permettre une rupture des amas cellulaires.

Selon d'autres caractéristiques de l'automate :

- il comporte un premier bras mobile sur lequel sont fixés les moyens de pipetage, ledit bras se déplaçant au-dessus d'au moins le plateau de réception maintenant les flacons, les puits de décantation et les lames d'analyse ; - il comporte des solutions de marquage ou de coloration qui peuvent être mélangées avec la solution cytologique par les moyens de pipetage ;

- chaque flacon et chaque lame d'analyse comprend un marquage visuel et l'automate comporte des moyens de lecture des marquages visuels ;

- les moyens de lecture comportent une caméra et sont portés par un second bras mobile, ledit second bras se déplaçant au-dessus d'au moins le plateau de réception maintenant les flacons, les puits de décantation et les lames d'analyse ;

- le flacon comprend des moyens de filtrage disposés au-dessus d'un cône de décantation, les moyens de pipetage étant agencés pour pouvoir prélever une partie de la suspension cellulaire sous les moyens de filtrage et réinjecter ladite partie sur le cône de décantation afin de mélanger ladite suspension cellulaire et faire passer au moins une fois une partie de ladite suspension au travers des moyens de filtrage afin de briser les amas cellulaires dont la taille est supérieure à la taille des mailles du filtre ;

- le système d'analyse de l'échantillon comporte des moyens d'analyse de la densité cellulaire des dépôts de cellules au fond du puits de décantation sur la lame d'analyse ;

- les moyens d'analyse de la densité cellulaire des dépôts de cellules au fond de puits de décantation sur la lame d'analyse comportent une caméra ;

- le système d'analyse de l'échantillon comporte un dispositif de réalisation d'une plaque virtuelle de l'échantillon ;

- le dispositif de réalisation d'une plaque virtuelle de l'échantillon comporte une caméra ;

- il comprend une unique caméra formant les moyens de lecture, les moyens d'analyse de la densité cellulaire et le dispositif de réalisation d'une plaque virtuelle ;

- il comporte un support comprenant des moyens de positionnement d'au moins le plateau aptes à maintenir le plateau de façon fixe et précise et un bouton apte à valider la position d'au moins le plateau ;

- il est agencé pour mettre en œuvre le procédé ci-dessus ;

- la suspension cellulaire est une suspension cytologique ; et

- la suspension cytologique comporte une solution de fixation comprenant entre

80% et 95% en volume de :

- 590 ml de sérum physiologique,

- 10 ml de PEG,

- 203 ml d'alcool iso-propylique,

- 193 ml d'éthanol pur,

- 0.01 % en volume d'azide de sodium, et entre 20% et 5% en volume de formol tamponné à 4%.

L'invention sera mieux comprise à la lecture de la description qui va suivre, donnée uniquement à titre d'exemple et faite en se référant aux dessins annexés, sur lesquels :

- la figure 1 est une vue en coupe schématique d'un automate de prélèvement et d'analyse selon l'invention ;

- la figure 2 est une vue schématique en perspective de l'automate de la figure 1 ;

- la figure 3 est une vue schématique de dessus d'un plateau de réception de l'automate de préparation et d'analyse recevant des flacons contenant chacun une suspension cellulaire ;

- la figure 4 est une vue en coupe d'un flacon destiné à être reçu dans l'automate ;

- la figure 5 est une vue en coupe d'un puits de décantation destiné à être reçu dans l'automate ;

- la figure 6 est une vue schématique en perspective des moyens d'analyse de l'automate des figures 1 et 2 ; et

- la figure 7 est une vue en coupe d'un flacon au cours d'une étape de mélange du procédé de préparation et d'analyse de suspension cellulaire.

En référence aux figures, on décrit un automate 2 de préparation et d'analyse d'une suspension cellulaire permettant d'automatiser cette préparation et cette analyse.

On a en effet illustré sur les figures 1 et 2, un automate 2 de préparation et d'analyse d'au moins un flacon 4 contenant une suspension cellulaire 5 à analyser, telle que par exemple une suspension cytologique fixée.

Une telle suspension cytologique 5 peut par exemple provenir d'une opération de dépistage par frottis du col de l'utérus, par exemple à l'aide d'une brosse de prélèvement (non représentée). Cette suspension cytologique comprend en particulier des cellules.

La brosse est ensuite plongée dans un flacon 4 contenant un fixateur et frottée contre le filtre pour extraire et recueillir les cellules et ainsi, former la suspension cellulaire 5.

Le fixateur, ou solution de fixation, est destiné à préserver et conserver des prélèvements ou échantillons cytologiques, comprenant des cellules, en vue de leur analyse ultérieure par un cytologiste. Par conséquent le fixateur doit conserver l'intégrité des cellules nucléées et des hématies, en particulier leur morphologie, dans l'état où elles se trouvaient avant leur prélèvement.

La solution de fixation est destinée à préserver in vitro un échantillon cytologique comprenant des cellules biologiques destinées à être analysées par un cytologiste. De façon connue et déjà publiée par Saccomanno et collaborateurs, la solution de fixation alcoolique peut également comprendre du Carbowax® ou Polyéthylène Glycol (PEG). De façon connue et déjà publiée, le formol peut être associé à des agents décalcifiants ou antiagrégants tels que l'acide éthylène diamine tetracétique (EDTA) et ses sels. De façon également connue et déjà publiée, un agent mucolytique tel que le dithiothreitol (DTT) ou de l'acetylcystéine peut être ajouté aux prélèvements renfermant du mucus.

Le formol permet de conserver les hématies et les cellules nucléées sans les lyser garantissant une référence en termes de taille permettant de faire un diagnostic plus pertinent au cytologiste.

L'exemple suivant illustre la solution de fixation sans en limiter la portée :

Exemple :

solution formée à 80% en volume de :

- 590 ml de sérum physiologique,

- 10 ml de PEG,

- 203 ml d'alcool iso-propylique,

- 193 ml d'éthanol pur,

- 0.01 % en volume d'azide de sodium,

et à 20 % en volume de formol tamponné à 4%.

La solution de fixation selon l'invention ne contient pas d'acétone ou de composés de la famille des cétones, ni d'acide acétique, car ces produits lysent les hématies qui, en éclatant libère l'hémoglobine qui se fixe sur les cellules. Certains types de coloration, telle que la coloration de Papanicolaou, du fait de la complexité des agents colorants associant plusieurs colorants nucléaires et de l'hémoglobine, rendent alors l'analyse cytologique, et notamment nucléaire très difficile voire impossible. De même, les études immuno-cyto- chimique sont souvent gênées par les dépôts d'hémoglobine.

Selon l'invention, les analyses ultérieures de l'échantillon par coloration de Papanicolaou ou les études immuno-cyto-chimique du prélèvement fixé dans la solution de fixation, décrite ici et ne contenant pas d'acétone ou de composés de la famille des cétones, ni d'acide acétique, sont améliorées.

La solution de fixation décrite ci-dessus permet donc une excellente conservation de l'intégrité des cellules nucléées et des hématies en vue de leur analyse.

En outre, la solution de fixation décrite ci-avant, comportant du PEG et/ou du formaldéhyde, a ainsi une densité différente des fixateurs classiques utilisés en cytologie, qui sont essentiellement alcooliques. La Demanderesse a constaté que la solution de fixation permet ainsi la sélection des cellules d'intérêt au travers d'un gradient de densité de façon plus efficace que les fixateurs classiques utilisés en cytologie.

L'automate 2 comprend en outre au moins un plateau 6 de réception portant au moins le flacon 4 contenant la suspension cellulaire 5 à analyser et un support 8 sur lequel est disposé le plateau de réception 6.

Le plateau de réception 6 est destiné à supporter une pluralité de flacons 4 contenant chacun une suspension cellulaire 5, afin de réaliser de façon rapide et automatique la préparation d'une pluralité de suspensions cellulaires 5 à analyser, de façon simultanée ou séquentielle, de tout ou partie des suspensions. Un tel plateau de réception 4 a déjà été décrit dans la demande de brevet EP-2 1 1 1 300, déposé au nom de la déposante, et permet de positionner et de maintenir de façon précise et fixe au moins le flacon 4 sur le plateau 6. L'homme du métier pourra se référer à ce document et ce plateau ne sera donc pas décrit plus en détail ici. Une vue schématique du plateau est présentée sur la figure 3.

Le support 8 comprend des moyens de positionnement du plateau 6 aptes à maintenir le plateau de façon fixe et précise dans l'automate 2. Ces moyens de positionnement comportent des moyens de réception 9 d'une partie extrême du plateau 6, le plateau étant disposé contre ou dans lesdits moyens 9 lorsqu'il est positionné dans l'automate 2.

En outre, le plateau 6 comprend des moyens de positionnement sur le support 8.

Ces moyens de positionnement comprennent au moins un orifice 10 creusé dans l'épaisseur du plateau sans le traverser et destiné à fixer de façon précise le plateau sur le support 8 de l'automate 2. De préférence, le plateau 6 comprend deux orifices 10 identiques disposés orthogonalement au côté le plus long du plateau 4.

Le support 8 de l'automate 2 comprend des moyens de positionnement complémentaires à ceux du plateau 6. Ces moyens comportent au moins un ergot 12 et de préférence autant d'ergots que d'orifices 10 du plateau 6. La forme de l'ergot 12 est complémentaire de celle de l'orifice 10 du plateau et de taille légèrement inférieure afin qu'au cours de la mise en place du plateau 6 sur le support 8, l'ergot 12 soit situé à l'intérieur de l'orifice 10 correspondant. Ainsi, le plateau 6 est maintenu de façon fixe et précise sur le support 8.

En outre, le support 8 de l'automate 2 comprend un bouton 14 ou pressoir, destiné à valider la bonne mise en place horizontale du plateau 6 sur le support 8. En effet, lorsque le plateau 6 est bien placé, c'est-à-dire lorsque l'intégralité de la face inférieure du plateau est en contact avec le support 8, car les ergots 12 sont reçus dans les orifices 10, le bouton 14 est enfoncé dans le support 8, dans un espace 16 prévu à cet effet, assurant ainsi la bonne mise en place du plateau 6 et autorisant l'automate 2 à fonctionner.

Lorsque le bouton 14 n'est pas enfoncé, l'automate est empêché de fonctionner.

De plus, l'automate 2 comporte des moyens 20 de pipetage-distribution, appelés moyens de pipetage ou de prélèvement par la suite, c'est-à-dire permettant de prélever et/ou de verser/remplir un échantillon de la suspension cellulaire 5. Ces moyens 20 de pipetage s'étendent au dessus du plateau de réception 6. L'échantillon est une portion précise en volume de la suspension cellulaire 5 contenant des éléments d'intérêts à analyser, par exemple des cellules.

Ces moyens 20 de pipetage sont mobiles de sorte à passer au-dessus de chaque flacon 4 pour effectuer un prélèvement et/ou un remplissage comme représenté par les flèches de la figure 1 . Les moyens 20 de pipetage sont formés d'au moins une pipette 22 ou aiguille, et de préférence une pluralité de pipettes, par exemple quatre ou huit, agencées de façon parallèle afin de pourvoir prélever simultanément des échantillons dans une pluralité de flacons 4 et les préparer simultanément en vue de leur analyse.

Les moyens de pipetage 20 sont fixés sur un premier bras robotisé mobile sur l'automate 2 au-dessus des plateaux 6.

Le dispositif (orifices 10/ergots 12 et bouton 14) assurant le positionnement du plateau de façon précise sur le support permet d'éviter de casser les aiguilles ou pipettes

22 en empêchant celles-ci de heurter les bords des flacons 4, ce qui pourrait se produire si le plateau était mal positionné par rapport aux moyens de pipetage 20. Cela permet donc d'éviter des coûts supplémentaires d'intervention technique pour le remplacement du matériel cassé ou déformé.

En outre, l'automate 2 comprend un système 30 de préparation et d'analyse comprenant au moins un support d'analyse destiné à recevoir/contenir l'échantillon de la suspension cellulaire 5, prélevé et versé dans ou sur le support d'analyse par les moyens

20 de pipetage.

Par exemple, les supports d'analyse de ce système 30 de préparation et d'analyse peuvent comporter des lames d'étalement 32, des tubes de prélèvement ou d'aliquotage 34, des puits d'analyse ou de décantation 36 selon le mode d'analyse choisi par le praticien.

Les supports d'analyse 32, 34, 36 sont maintenus de façon précise et fixe sur le plateau 6.

Ce système 30 de préparation et d'analyse sera détaillé par la suite.

Le flacon 4 contenant la suspension cellulaire 5 à analyser va maintenant être détaillé en regard de la figure 4. De préférence, ce flacon 4 présente les mêmes caractéristiques que celles décrites dans le document EP-2 1 1 1 300 afin de pouvoir fixer le flacon 4 sur le plateau de réception 6 et certaines caractéristiques décrites dans le document WO-2006/058989 afin de pouvoir préparer et analyser la suspension cellulaire.

En regard de la figure 4, le flacon 4 contenant la suspension cytologique 5 comprend un corps 40, par exemple sensiblement cylindrique. A partir de ce corps 40 s'étend un bord inférieur 42 et des moyens de blocage 44 disposés de part et d'autre du corps et saillants de celui-ci, permettant de bloquer le flacon 4 sur le plateau 6 de réception comme décrit dans le document EP-2 1 1 1 300 dans des directions longitudinale et d'élévation. Les moyens de blocage 44 sont destinés à s'engager dans des empreintes des rails du plateau 6 de sorte à bloquer le flacon 4 selon une direction préférentielle. L'homme du métier pourra se référer à ce document pour comprendre le fonctionnement de ce flacon 4 avec le plateau de réception 6.

De plus, le flacon 4 comprend également un couvercle 46, par exemple muni d'une membrane 48 perçable et auto-cicatrisante permettant le passage des moyens 10 de pipetage de l'automate, par exemple d'une pipette. Cette portion 48 perçable et autocicatrisante permet en particulier, de ne pas enlever le couvercle 46 du flacon pour réaliser un prélèvement de solution cellulaire et par conséquent de conserver l'intégrité du prélèvement en assurant une sécurité totale pour celui-ci qui après le recueil par le médecin ou le laboratoire reste dans un flacon fermé tout au long du procédé de préparation et d'analyse. En outre, cela permet une absence totale de risque de contamination ou d'inhalation du fixateur pour le technicien au laboratoire.

Le couvercle 46 de chaque flacon 4 comporte en outre un marquage visuel 50 ou identifiant destiné à identifier la suspension cellulaire 5 contenue dans le flacon 4. Par exemple, ce marquage visuel 50 est un code barre. Cet identifiant 50 permet une traçabilité totale lors de la préparation et de l'analyse par une gestion informatisée des numéros d'échantillons.

Selon d'autres modes de réalisation, les moyens d'identification sont différents, par exemple une étiquette portant des informations ou une puce électronique du type puce RFID dont le contenu peut être lu à distance par des moyens de lecture.

Selon un mode de réalisation destiné à la préparation de prélèvements cytologiques nécessitant l'utilisation d'une brosse de prélèvement, le flacon 4 est équipé de moyens 52 de filtrage au moins en partie immergés dans la suspension tels que décrits dans le document WO-2006/058989. Ces moyens 52 de filtrage se présentent sous la forme d'un voile de matériau filtrant, par exemple formant un panier, dont la périphérie est fixée sur le corps 40 du flacon et dont le centre est raccordé à un tube 54, s'étendant en direction de l'ouverture du flacon, associé à des moyens de maintien en position dans le flacon et adapté pour permettre le passage des moyens 20 de prélèvement de solution cellulaire de l'automate sous les moyens de filtrage, en particulier de la pipette 22 d'aspiration de la suspension.

De préférence, le voile de matériau filtrant est en nylon tressé, permettant une action mécanique de détachement des cellules lorsque l'on frotte la brosse sur le matériau sans endommager le prélèvement.

De plus, la partie inférieure du flacon 4 comporte un cône de décantation 56.

En outre et de façon connue, le flacon 4 est muni d'une ouverture destinée à recevoir une brosse de prélèvement cytologique, fixée de façon détachable sur un manche de manipulation. L'ouverture du flacon comporte des moyens de butée pour la brosse, permettant de bloquer celle-ci dans le flacon et de la détacher du manche.

L'homme du métier pourra se référer à ce document pour connaître les particularités de ce flacon, qui ne sera pas décrit plus en détail ici. Un tel flacon permet ainsi de conserver la brosse sans gêner et casser l'aiguille de prélèvement.

Selon un mode de réalisation destiné à la préparation de prélèvements cytologiques ne nécessitant pas l'utilisation d'une brosse de prélèvement, par exemple les prélèvements de type biopsie ou recueil de liquides, le flacon 4 n'est équipé ni de tube central ni de moyens de filtrage.

Le système 30 de préparation et d'analyse va maintenant être détaillé.

En regard de la figure 5, le système 30 de préparation et d'analyse comporte de préférence un dispositif 60 de dépôt de cellules par décantation sur une lame d'analyse. Un tel dispositif 60 de dépôt de cellules par décantation sur une plaque d'analyse a déjà été décrit dans le document FR-2 917 165 et l'homme du métier pourra se référer à ce document.

Ce dispositif 60 comporte au moins un puits de décantation 36 placé au dessus d'une lame d'analyse 32, et un matériau absorbant 62.

La lame d'analyse 32 comporte à une partie extrême un moyen d'identification 50 par exemple un marquage visuel du type code barre.

La suspension est versée, par les moyens de pipetage 20, dans la chambre 64 de réception du puits de décantation 36 placée au-dessus de la lame d'analyse 32, et dont le fond est ouvert et s'étend en regard d'une zone de dépôt de cellules de la lame d'analyse 32. Le fond de la chambre est en communication fluidique avec le matériau absorbant 62 du liquide de conservation ou fixateur afin d'absorber progressivement celui-ci et de permettre un dépôt homogène par décantation des cellules sur la zone de dépôt de cellules de la lame d'analyse 32. On obtient ainsi un dépôt cellulaire uniforme dans un temps de décantation réduit.

Le matériau absorbant 62 est partiellement comprimé par une presse de décantation 66 entre le fond de la chambre de réception et la plaque d'analyse autour de la zone de dépôt de cellules.

En regard des figures 5 et 6, le système 30 de préparation et d'analyse comporte des moyens 70 de mesure de la densité cellulaire dans la chambre de décantation, de sorte à réaliser une lame d'analyse 32. De tels moyens 70 de mesure de la densité cellulaire sont décrits dans le document FR 2 922 019 auquel l'homme du métier pourra se référer.

Ainsi, les moyens 70 de mesure de la densité cellulaire comportent une caméra 72 agencée pour enregistrer des images du plateau 6, c'est-à-dire du contenu de la chambre de décantation 64 et de la lame d'analyse 32.

En outre, les moyens 70 de mesure de la densité cellulaire comprennent un manchon 74 fixé autour de la caméra de manière à, lorsque la caméra 72 est abaissée et placée au dessus de la chambre de décantation 64 pour réaliser l'acquisition des images du contenu de cette chambre, ce que le manchon 74 soit en contact avec la presse de décantation 66 afin de réaliser une chambre noire en obtenant une étanchéité à la lumière afin d'optimiser la qualité de l'acquisition des images.

Les moyens 70 de mesure de la densité cellulaire comportent en outre des moyens d'illumination de la chambre de décantation afin de permettre à la caméra 72 d'effectuer la mesure de densité. Ces moyens d'illumination comprennent par exemple une source lumineuse 76 fixée à la caméra 72. Lorsque la caméra 72 est abaissée, la source lumineuse 76 vient au plus près du bord de la lame d'analyse 32, afin d'avoir une transmission de lumière optimale. La source lumineuse 76 diffuse alors de la lumière dans la lame d'analyse 32.

Les moyens 70 de mesure de la densité cellulaire sont fixés sur un second bras robotisé mobile au-dessus des flacons 4 des plateaux 6.

Selon une variante, les supports d'analyse de ce système 30 comportent au moins un tube de prélèvement ou d'aliquotage 34 et un support 80 dans lequel une pluralité de tubes 34 peuvent s'insérer afin de les maintenir en position fixe. Ce support 80 des tubes d'aliquotage 34 se fixe de manière précise sur le plateau 6 afin que les moyens 20 de pipetage prélèvent les échantillons des solutions cytologiques 5 contenues dans les flacons 4 et les versent dans des tubes 34 d'aliquotage, les flacons étant fixés sur le même plateau que les tubes d'aliquotage. Les deux possibilités correspondant pour l'un au puits de décantation 36 placé au- dessus d'une lame d'analyse 32, et un matériau absorbant 62 et pour l'autre au tube de prélèvement ou d'aliquotage 34, peuvent être associées sur le même portoir pour une réalisation simultanée ou décalée de techniques complémentaires de façon systématique ou corrélation avec les résultats de l'analyse de la densité sur lame non colorée permettant un meilleur contrôle de l'étape pré-analytique.

L'automate 2 comprend en outre des moyens 90 de lecture à distance destinés à identifier le marquage visuel 32 des flacons 4. Ces moyens 90 de lecture comportent une caméra grand champ et s'étendent au dessus du plateau de réception 6. Ces moyens 90 de lecture à distance sont portés par un second bras robotisé mobile de l'automate, ledit second bras se déplaçant de chaque flacon 4 fixé sur le plateau 6 pour effectuer la lecture du marquage visuel 50 ou identifiant situé sur le couvercle 46.

La caméra est placée de telle sorte qu'elle puisse lire les informations d'identification 50 de la lame d'analyse 32. Ces informations sont par exemple transmises à un système de traitement informatique assurant le suivi qualité d'une pluralité de lames d'analyse et regroupant des informations sur l'étalement cellulaire disposé sur cette lame. Ces informations comprennent notamment la provenance de l'étalement cellulaire, le marquage de la lame d'analyse étant couplé au marquage des flacons 4.

Selon un mode de réalisation préférentiel, la caméra 72 des moyens 70 d'analyse de la densité cellulaire permet de lire les marquages visuels 50. Ainsi les moyens 70 d'analyse de la densité cellulaire et les moyens 90 de lecture à distance sont combinés permettant un gain d'espace.

De préférence, les marquages 50 sont orientés selon une direction précise et invariable lorsque le couvercle est fixé sur le corps, ce qui permet d'utiliser facilement les moyens de lecture 90 à distance des marquages. L'orientation invariable peut être obtenue grâce aux moyens de blocage 44 du flacon 4 décrit dans le document EP-2 1 1 1 300.

Ces moyens de lecture 90 à distance offrent, du fait de l'orientation spécifique des flacons 4, une visualisation unitaire ou multiple de ces flacons dans le but de les appareiller de façon unitaire ou multiple au système d'analyse envisagé (lames d'étalement 32, tubes de prélèvement ou d'aliquotage 34, puits d'analyse 36...) présentant lui-même un positionnement fixe. C'est-à-dire que les moyens de lecture 90 permettent de lire le marquage 50 d'un seul flacon 4 ou plusieurs marquages à la fois. Ce positionnement fixe, qui correspond par exemple à des lames 32 d'analyse positionnées dans la presse de décantation 66, se fait dans le prolongement des rails, décrits dans le document EP-2 1 1 1 300, servant de support aux flacons 4, de sorte qu'un seul et même plateau permet le bon positionnement des flacons 4 et des lames 32 pour des moyens de lecture à distance offrant une visualisation unitaire ou multiple. Ainsi, un traitement groupé des flacons est possible, ce qui permet une plus grande cadence d'analyse.

L'automate comporte en outre un processeur, non représenté, pour recueillir les choix de paramétrages faits par l'utilisateur en fonction de la nature du prélèvement cytologique, puis pour contrôler les bras robotisés, les moyens de pipetage 20, les moyens de lecture 90, les moyens d'analyse 70 de la densité cellulaire, le bouton 14 (déplacements, volumes prélevés, acquisition par la caméra, source lumineuse...).

Selon un mode de réalisation, l'automate comprend en outre un support, non représenté, fixé de manière précise sur le support 8 de l'automate 2 comportant des flacons contenant des solutions généralement utilisés pour des colorations ou marquages d'entités spécifiques des cellules telles que les noyaux, cytoplasmes ou autres éléments constitutifs de la cellule. Ce support de solutions de coloration ou « de marquage » permet de réaliser des étapes de coloration ou de marquage sur les lames d'analyse telles que couramment effectuées par l'homme du métier. Cette étape de coloration ou de marquage est alors réalisée grâce aux moyens de pipetage 20 qui, après avoir été placés au dessus des flacons de solutions de coloration ou de marquage, prélèvent le volume nécessaire, puis se déplacent au dessus des lames d'analyse où les moyens de pipetage versent leur contenu.

Selon un mode de réalisation, le système d'analyse 30 de l'automate 2 comprend en outre un dispositif de réalisation d'une plaque virtuelle de l'échantillon tel que décrit dans le document FR-2 931 966 et comprenant une caméra. Selon un mode de réalisation, la même caméra que celle des moyens d'analyse et/ou des moyens de lecture est utilisée.

Ainsi, l'automate comprend alors une unique caméra formant les moyens de lecture 90, les moyens d'analyse 70 de la densité cellulaire et le dispositif de réalisation d'une plaque virtuelle, permettant un gain de place.

Le procédé de préparation et d'analyse de ces suspensions mis en œuvre par l'automate 2 décrit précédemment va à présent être détaillé, dans le cas de la préparation de lames d'analyse 32.

Au préalable, après avoir prélevé les échantillons cellulaires 5 à préparer et analyser et les avoir transférés dans des flacons 4, le praticien ferme définitivement les flacons 4 au moyen de leurs couvercles 46. En effet, le procédé de préparation et d'analyse de ces suspensions est mis en œuvre par la suite sans ouverture ultérieure des flacons 4. Dans un autre mode de réalisation, en cas de prélèvement cytologique par ponction à l'aiguille fine (Fine Needle Aspiration), le praticien peut insérer le prélèvement cellulaire en piquant son aiguille de prélèvement à travers la membrane cicatrisante du flacon, sans avoir à ouvrir le couvercle à aucun moment.

Puis, le technicien ou utilisateur, après un temps de fixation des cellules suffisant, par exemple d'au moins deux heures, charge les flacons 4 de suspensions cellulaires 5 sur le plateau 6 de chargement ainsi qu'autant de contenants du système d'analyse 30, de préférence des lames d'analyse 32.

Ensuite, il dispose la feuille absorbante 62 sur le plateau 6 de telle sorte que chaque lame d'analyse (32) est disposée entre le plateau (6) de chargement et la feuille d'absorption (62). Une pluralité de puits 36 de décantation sont chargés dans une presse 66. La presse 66 de décantation est installée au dessus du plateau 6 de telle sorte que chaque puits 36 de décantation est disposé au dessus d'une lame d'analyse 32, tel que décrit dans le document FR-2 917 165.

Les plateaux 6 sont ensuite chargés dans l'automate 2 sur le support 8 de celui-ci, et fixés de manière précise grâce aux moyens de positionnement complémentaires 10, 12 des plateaux 6 et du support 8 de l'automate 2 et au bouton 14 qui valide cette position si elle est correcte.

Le technicien ou utilisateur démarre le logiciel, choisit les paramétrages, très simples, en fonction du nombre et du type de prélèvements disposés sur l'automate, et démarre la session de préparation.

Les moyens de lecture 90 identifient les marquages visuels 50 des flacons 4 et des lames d'analyse 32 permettant d'établir une corrélation entre les flacons 4 contenant les solutions à analyser et les lames d'analyse 32 à préparer.

Les moyens de prélèvement 20 sont déplacés au dessus du flacon 4 contenant la solution cellulaire 5 à analyser. L'aiguille ou pipette 22 des moyens de prélèvement 20 passe à travers la membrane 48 auto-cicatrisante du couvercle 46 du flacon 4 jusqu'à la suspension cellulaire.

Un prélèvement d'une suspension cellulaire dans un flacon 4 est ensuite réalisé par la pipette 22 des moyens 20 de prélèvement.

Pour cela, la suspension cellulaire 5 est mélangée dans le flacon 4 d'analyse grâce à la pipette 22 des moyens 20 de pipetage, en aspirant/prélevant un premier volume de la solution cellulaire puis en expirant/éjectant le premier volume dans la solution cellulaire, tel que représenté par la flèche F sur la figure 7. De préférence, le premier volume est sensiblement compris entre 50 μ\- et 2000 μ\- de la solution cellulaire. Cette étape a pour but de casser/rompre les amas cellulaires du prélèvement cytologique 5 à analyser sur la paroi du cône de décantation 56 du flacon 4. En outre, les cellules réinjectées dans le flacon repassent au dessus des moyens de filtrage afin de briser les amas cellulaires dont la taille est supérieure à la taille des mailles du filtre, ce qui permet d'obtenir une deuxième filtration du prélèvement et une remise en suspension de l'échantillon.

On réalise ensuite une première décantation de la solution cellulaire pendant une première durée. De préférence, la première durée est sensiblement comprise entre 5 minutes et 12 heures selon le mode d'analyse choisi, par exemple égale à 15 minutes pour la préparation d'une lame d'analyse. Cette étape permet d'établir un gradient entre les cellules d'intérêt à analyser et les cellules inflammatoires ou hémorragiques, c'est une décantation différentielle.

Ensuite, on réalise une étape d'aspiration des solutions qui seront déposées ensuite dans le contenant d'analyse. Cette étape comprend i) l'aspiration par les moyens 20 de pipetage d'un volume de colle, adaptée pour faire adhérer les cellules sur la lame d'analyse 32 quel que soit son type, ou de tampon, ii) éventuellement un volume d'air tel que décrit dans le document FR 2 919 054, puis iii) un volume de solution cellulaire au fond du cône de décantation 56, comprenant des cellules pertinentes dites relevantes, c'est-à-dire les cellules situées dans la partie inférieure de la solution suite à la première décantation différentielle.

De préférence, les volumes de colle et de solution cellulaire sont équivalents et sensiblement compris entre 50 μΙ_ et 1000 μΙ_, par exemple 250 μΙ_.

Dans le mode de réalisation avec des tubes d'aliquotage, le volume de colle est nul.

De préférence également, cette dernière étape de prélèvement d'un volume de solution cellulaire se fait elle-même en deux sous-étapes : une première sous-étape dite de « micro-mélange » puis une deuxième sous-étape d'aspiration du volume souhaité de solution cellulaire.

Le « micro-mélange » consiste en l'aspiration d'un volume de la solution cytologique juste au dessus du fond du cône de décantation du flacon, par exemple à 2 mm, le volume étant compris entre 20 μΙ_ et 200 μΙ_, par exemple 100 μΙ_, puis les moyens 20 de pipetage réinjectent une partie du volume prélevé, par exemple 50 μΙ_, sensiblement au même endroit, afin d'éviter le « volume ou culot mort » 100, c'est-à-dire pour décoller les cellules du fond du cône de décantation 56 grâce à la force d'injection des moyens 20 de pipetage et créer une remise en suspension très localisée.

Cette étape de « micro-mélange » est facultative et peut être remplacée par une simple étape de prélèvement d'un volume de la solution cytologique. L'utilisation de la colle adaptée pour faire adhérer les cellules sur les lames d'analyse 32 permet d'utiliser des lames n'ayant pas subi de traitement spécifique d'adhérence des cellules et diminue ainsi les coûts de préparation et d'analyse des solutions cytologiques à analyser.

Par exemple, on prélève 250 μΙ_ de colle et 100 μΙ_ de la solution cytologique contenant les cellules d'intérêt, puis on réinjecte 50 μΙ_ du prélèvement de la solution cytologique, contenu dans la pipette, et on prélève 200 μΙ_ de la solution cytologique afin d'avoir la même quantité de colle ou de tampon et de cellules d'intérêt.

La pipette 22 est ensuite actionnée de façon automatique pour mélanger de façon homogène son contenu, c'est-à-dire la colle ou le tampon et le prélèvement de la solution cytologique, tel que décrit dans le document FR 2 919 054. Cette étape permet également de diluer et de remettre en suspension homogène le prélèvement dans la colle ou le tampon selon un procédé de dilution tel que décrit dans le document FR-2 919 054.

Dans un autre mode de réalisation, la solution de tampon peut être complétée avec des éléments de marquage ou de coloration.

Les moyens 20 de pipetage sont ensuite déplacés au dessus d'un puits 36 de décantation afin de verser/déposer le prélèvement dans la chambre de décantation 64 et de réaliser une lame d'analyse 32 comprenant un étalement cellulaire à analyser. L'étalement cellulaire résulte du dépôt du prélèvement dans le puits de décantation tel que décrit dans le document FR-2 917 165 et auquel l'homme du métier pourra se référer.

Une seconde décantation a lieu sur la lame pendant une seconde durée. De préférence, la seconde durée est sensiblement comprise entre 5 et 60 minutes et de préférence égale à 15 minutes pour la préparation d'une lame d'analyse.

Les étapes de prélèvement et de réalisation de la lame 32 sont répétées pour chaque flacon 4 à analyser en sélectionnant de façon différentielle des cellules pathologiques et relevantes nécessaires au diagnostic du cytologiste.

Une étape d'analyse du dépôt des cellules au fond des puits de décantation 36 en mesurant la densité cellulaire sur les lames d'analyse 32, afin de proposer un contrôle pré-analytique pour l'ensemble des échantillons qu'ils soient destinés à l'analyse cytologique ou à des techniques complémentaires de biologie, est ensuite réalisée, par exemple tel que décrit dans le document FR-2 922 019. Cette étape permet de déterminer si la suspension cellulaire contient suffisamment de cellules pour obtenir un dépôt cellulaire satisfaisant pouvant mener à un diagnostic fiable et ainsi pouvoir réajuster automatiquement le prélèvement pour obtenir une densité cellulaire convenable pour une analyse de la lame 32. Cette étape permet d'assurer un suivi qualité de la lame d'analyse 32 préparée à partir de la solution cellulaire 5. Selon un mode de réalisation, cette étape d'analyse du dépôt des cellules est suivie par une étape de coloration ou de marquage de manière automatisée.

Selon un mode de réalisation, les moyens 20 de pipetage comprennent une pluralité d'aiguilles, de préférence quatre ou huit, permettant de préparer et d'analyser une pluralité de suspensions cellulaires en parallèle et d'augmenter ainsi la cadence de préparation des plaques d'analyse.

L'automate selon l'invention permet la réalisation automatisée des frottis et autres prélèvements cytologiques en couche mince.

L'un des avantages de l'automate 2, selon l'invention, est qu'il est entièrement fermé du flacon 4 à la lame d'analyse 32 assurant ainsi l'intégrité de toutes les solutions et prélèvements cytologiques en évitant totalement les risques de contamination et assurant une plus grande sécurité pour le praticien (pas d'inhalation du fixateur). Cet avantage résulte également de l'utilisation de flacon associant à la fois des moyens de filtration et des moyens de décantation pour réaliser un étalement cytologique en couche mince.

En outre, contrairement aux automates tels que celui décrit dans le document US 2009/0233331 , les flacons 4 sont fixes sur le support de l'automate 2, ce sont les autres systèmes tels que les moyens de pipetage 20, les moyens de lecture 70 et les moyens d'analyse de la densité 90 qui sont mobiles au-dessus des flacons 4 assurant une plus grande sécurité de manipulation au laboratoire.

De plus, il permet une meilleure standardisation. En effet, tous les prélèvements sont prélevés :

- au même endroit au dixième de millimètre dans les cônes de décantation des flacons grâce au positionnement précis et fixe des plateaux comportant les flacons et autres contenants (lames d'analyse, tubes d'aliquotage, puits de décantation) ;

- en même quantité au microlitre près grâce aux moyens de pipetage ; et

- dans le même temps, puisque tous les prélèvements sont effectués selon le même procédé.

En outre, une complète traçabilité lors de l'analyse par une gestion informatisée des numéros d'échantillons est obtenue grâce aux marquages visuels 50 disposés sur les couvercles des flacons mis en corrélation avec ceux des contenants de préparation tels que les lames d'analyse grâce aux moyens de lecture à distance de ces marquages visuels.

Le procédé d'ajustement de la densité cellulaire mis en œuvre par l'automate pour la réalisation des plaques d'analyse permet d'augmenter si nécessaire la densité relative en cellules pathologiques, tout en gardant un contexte d'analyse épuré mais informatif, et en améliorant la qualité de l'étalement et la conservation des éléments sélectionnés. Cela permet une interprétation plus sûre par rapport à la technique traditionnelle ou aux techniques de cytologie en couche mince semi-automatisée.

En outre, la préparation automatisée d'un flacon ou d'un groupe de flacons simultanément permet une réduction significative de 90% du temps de préparation technique par rapport à la technique traditionnelle ou aux techniques de cytologie en couche mince semi-automatisée.

En conclusion, l'automatisation permet la mise en place d'un vrai système d'assurance qualité et une standardisation du dépôt en couche mince améliorant la reproductibilité de l'étalement, assurant le respect de l'intégrité cellulaire, et une lecture facilité. Elle permet en outre une diminution nette des coûts de technique et de lecture.