Biguanidhaltige Liposomen

Die vorliegende Erfindung betrifft biguanidhaltige Liposomen, antiseptische Zubereitungen auf Basis -von Liposomen, die mindestens ein Biguanid als mikrobioziden Wirkstoff enthalten, die Herstellung der biguanidhaltigen Liposomen und dieser antiseptischen Zubereitungen sowie ihre Verwendungsmöglichkeiten und die aus ihrer Verwendung hervorgehenden Produkte.

Der Heilungsprozeß einer Wunde verschlechtert sich bei einem Austrocknen der Wunde, einer hohen Bakterienzahl in der Wunde und/oder ihrer Behandlung mit toxischen Agentien deutlich. Dagegen fördern ein feuchtes Milieu, fehlende Keimbesiedlung und das vermehrte Vorhandensein von Wachstumsfaktoren die Epithelisierung und Bildung von Granulationsgeweben. Die Vorteile der feuchten Wundheilung, bei der ein feuchtes Milieu in der Wunde angestrebt wird, um das Zellwachstum zu stimulieren und so die schnellstmögliche Regeneration des geschädigten Gewebes zu erreichen, sind in Fachkreisen unbestritten. Allerdings schafft das feuchte Milieu zugleich gute Vermehrungsbedingungen für Bakterien. Eine mikrobielle Kontamination von Wunden stört deren Wundheilungsverlauf jedoch erheblich und stellt gerade in der jüngeren Zeit durch die zunehmende Resistenz von Mikroorganismen gegenüber Antibiotika ein immer größer werdendes Problem dar.

Da eine geringgradige Kolonisation von Wunden mit Mikroorganismen (umgangssprachlich „Mikroben") den Regelfall darstellt, sollte eine Ausbreitung der mikrobiellen Kontamination von Wunden verhindert oder nach Möglichkeit vermieden werden. Insbesondere eine Kontamination mit multiresistenten Erregern, z. B. Methicillin-resistenter

Staphylococcus aureus (MRSA) , ist zu behandeln, um ihre weitere Ausbreitung zu verhindern.

Mit Mikroorganismen verunreinigte bzw. infizierte Wunden sollten daher antiseptisch behandelt werden, weil

- sich eine Infektion entwickeln kann, solange die Wunde von Mikroorganismen besiedelt ist;

- der Wundheilungsprozeß nicht oder nur verzögert zum Abschluß kommt, solange die Wunde infiziert ist;

- sich die Wundinfektion ausbreiten und zu einer Sepsis führen kann; und

- bei einer Wundkolonisation mit multiresistenten Erregern eine Weiterverbreitung dieser Erreger verhindert werden muß.

Die Notwendigkeit einer frühzeitigen Prävention von Wundinfektionen, insbesondere bei zu erwartender Kontamination großer Wundflächen, besteht insbesondere auch bei Verbrennungswunden.

In der Fachliteratur sind verschiedene Verfahren beschrieben worden, um Wunden auch von Mikroorganismen zu säubern, die gegen Antibiotika resistent sind. Beispielsweise wurde vorgeschlagen, Beläge und grobe Verschmutzungen mit Hilfe von Spüllösungen von der Wunde zu entfernen. Hierfür werden üblicherweise Ringer-Lösungen, Ringer- Lactat-Lösungen oder isotonische Kochsalz-Lösungen verwendet. Diese Lösungen besitzen jedoch keine antiseptische Wirkung, sie führen lediglich zu einer Reinigung der Wunde.

Lösungen zum Reinigen von Wunden, die eine antimikrobielle Wirkung haben, sind ebenfalls im Handel erhältlich. Es handelt sich bei diesen Produkten beispielsweise um Jod-

Lösungen, Wasserstoffperoxid-Lösungen, Silbersalz-Lösungen oder Polyhexanid-Lösungen, die jedoch alle bestimmte Nachteile aufweisen.

Jod hat eine aggressive Oxidationswirkung, die zu einer zuverlässigen xnikrobioziden Wirkung gegen grampositive und gramnegative Bakterien, Pilze und Protozoen führt, sowie gegen eine Reihe von Viren. Die Bereitstellung des wasserlöslichen Povidon-Jod (PVP-Jod, Polyvinylpyrrolidon-Jod) erlaubt zwar eine meist schmerzfreie Behandlung der Wunden gegenüber der Anwendung der davor gebräuchlichen alkoholhaltigen Jod-Lösungen (Jod-Tinktur) , es gibt aber nach wie vor viele Kontraindikationen und Probleme bei der Anwendung von PVP-Jod. Beispielsweise wird Jod aus dem PVP-Jod über die Haut vom Organismus aufgenommen, es sind Jod-Allergien und Jod-Unverträglichkeiten bekannt, die auch der Anwendung von PVP-Jod entgegenstehen, und es wurde nachgewiesen, daß Jod die Zellteilung hemmt. Somit kommt es bei der Behandlung von Wunden mit PVP-Jod zu einer Verzögerung der Wundheilung.

Durch Einarbeitung von PVP-Jod in Liposomen, im Handel erhältlich unter der Bezeichnung Repithel® (Mundipharma GmbH, Limburg, DE) , konnte die Gewebeverträglichkeit des PVP-Jod deutlich verbessert werden, ohne daß die Wirksamkeit des PVP-Jods beeinträchtigt ist . Die Grundsubstanz von Repithel® ist ein Polyacrylatgel, das neben Wasser sogenannte Hydrosomen, also spezielle mehrschichtige Liposomen, enthält. Diese zwiebelschalenförmig aus mehreren Phospholipid-Doppelschichten aufgebauten Liposomen enthalten neben PVP-Jod als niedrig dosiertes Antiseptikum auch eine große Menge Wasser. Dadurch kann Repithel® wie herkömmliche Hydrogel-Formulierungen Wasser abgeben und

aufnehmen; es schafft auf diese Weise eine Feuchtigkeitsbalance .

Repithβl® führt jedoch ebenso wie PVP-Jod an sich oder die altbekannte Jod-Tinktur zu einer meist vorübergehenden Färbung der behandelten Fläche. Zwar zeigt die braune Eigenfarbe des PVP-Jods die Wirksamkeit der PVP-Jod- haltigen Zubereitung an, führt aber auch zu einer Verunreinigung von Textilien. Bei der Anwendung von Repithel® wie auch allen anderen Jod-haltigen Zubereitungen sind zudem folgende Kontraindikationen zu beachten: hyperthyreote Schilddrüsenerkrankungen, Dermatitis herpetiformis Duhring, überempfindlichkeit gegen Jod. Ferner ist von der Anwendung vor und nach einer Radiojodtherapie abzusehen. Auch während einer Schwangerschaft und der Stillzeit sowie bei Neugeborenen und Säuglingen bis zu einem Alter von 6 Monaten sollten Jod-haltige Zubereitungen nur nach äußerst sorgfältiger Abwägung und unter Kontrolle der Schilddrüsenfunktion durch einen Arzt angewendet werden.

Wasserstoffperoxid zerfällt in der Wunde rasch unter Freisetzung von Sauerstoff zu Wasser. Der freigesetzte Sauerstoff kann die Zellwände der kontaminierenden Bakterien oxidieren. Aufgrund seiner schäumenden Wirkung durch die rasche Sauerstoff-Freisetzung lassen sich insbesondere verschmutzte und/oder verkrustete Wunden mit Wasserstoffperoxid mechanisch gut reinigen. Allerdings führt die Behandlung mit Wasserstoffperoxid auch zu einer oberflächlichen Verätzung der Wunde, wodurch ihre Heilung zumindest hinausgezögert wird. Für eine Daueranwendung, insbesondere bei chronischen Wunden, ist Wasserstoffperoxid daher nicht geeignet.

Sübersalz-Lösungen wirken bakterizid, indem sie die bakterielle Zellwand zerstören und die bakteriellen Enzyme denaturieren. Problematisch ist jedoch die unzureichende Stabilität von Silbernitrat-Lösungen, die Möglichkeit einer Resorption von Silberionen und die Zerstörung der Hautoberfläche aufgrund der vom Silber verursachten Eiweißfällung. Daher gilt die Verwendung von Silbersalz- Lösungen zur Behandlung von Wunden in Fachkreisen seit längerem als überholt. Die Verwendung von Silbersulfa- diazin, ein Komplex aus Silber und dem Sulfonamid Sulfadiazin, wird allein schon auf Grund des Antibiotikum- Anteils als nicht mehr vertretbar angesehen.

Applikationsfertige Polyhexanid-Lösungen zur Wundbehandlung sind im Handel unter den Namen Lavasept® (Fresenius AG, Bad Homburg, DE) oder Prontosan® W (B. Braun Petzold GmbH, Melsungen, DE) erhältlich. Polyhexanid (Polyhexamethylen- biguanid; PHMB) gilt als Lokalantiseptikum, das ein breites Wirkspektrum und eine gute Verträglichkeit aufweist. Polyhexanid wirkt über seine kationischen Ladungen antimikrobiell, indem es die Permeabilität der bakteriellen Zellmembran erhöht und über den damit verbundenen Verlust an Kalium und anderen Zytoplasmabestandteilen zum Zelltod führt. Aufgrund seiner vergleichsweise langsam eintretenden Wirkung wird Polyhexanid eher für wiederholte Anwendungen auf chronisch schlecht heilenden oder empfindlichen Wunden empfohlen.

Nachteilig bei der Verwendung von Polyhexanid-Lösungen ist jedoch, daß dieses Antiseptikum seine Wirksamkeit in Gegenwart bereits geringer Mengen negativ geladener Ionen, z. B. bei Anwesenheit von Alginat-, Acrylat-, Lactat- oder Jodidionen, verliert. Daher ist darauf zu achten, daß Polyhexanid-Lösungen nicht mit anderen Wundtherapeutika

und/oder moderneren Wundverbänden gemeinsam angewendet wird. Auch bei der Auswahl von Wundabdeckungen ist auf deren Wirkstofffreiheit zu achten.

Neben den antiseptischen Lösungen sind auch eine Reihe von Wundauflagen verfügbar, die zusätzlich Wirkstoffe enthalten, welche die Auflage vor einer mikrobiellen Kolonisation schützen und die Keimzahl in der Wunde verringern sollen. Insbesondere Wundauflagen, die als antimikrobielle Ausrüstung Silber oder Silbersalze enthalten, sind verbreitet, beispielsweise die Produkte Actisorb® (Johnson & Johnson WM, Norderstedt, DE) und Contreet®-H (Coloplast GmbH, Hamburg, DE) . Die Wundauflage Actisorb®, bei der es sich um eine Kombination von elementarem Silber und Aktivkohle handelt, wird speziell bei infizierten und exulzerierenden Wunden zur Beseitigung unangenehmer Gerüche verwendet . Bei Contreet®-H handelt es sich um einen Hydrokolloidverband mit eingeschlossenen Silberionen, der abhängig vom Exsudationsverhalten der Wunde antiseptische Silberkonzentrationen in der Wunde erzeugt .

Seit kurzer Zeit existieren auch Wundauflagen auf Basis von Kollagen, Cellulosederivaten oder Alginaten, die als antimikrobiellen Wirkstoff Polyhexanid in Konzentrationen von meist 0,5 bis 2% enthalten. Diese Wundauflagen werden durch Besprühen oder Imprägnieren des Basis- bzw. Trägermaterials mit einer wäßrigen, Polyhexanid enthaltenden Lösung hergestellt. Allerdings hat sich herausgestellt, daß Polyhexanid ausgezeichnet an die Basisbzw. Trägermaterialien bindet, die üblicherweise für die Herstellung von Wundauflagen und Verbänden verwendet werden. Dadurch ist die Freisetzung von Polyhexanid aus den

Wundauflagen und damit einhergehend die antimikrobielle Wirkung des Polyhexanids beeinträchtigt.

Die der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Aufgabe bestand darin, eine antiseptische Zubereitung bereitzustellen, mit der Wunden gereinigt und/oder behandelt werden können, die ein breites Wirkungsspektrum und eine gute Verträglichkeit aufweist, die weder zu Denaturierungserscheinungen noch zu Verfärbungen der Wunde oder von Gegenständen führt, die bei der Behandlung der Wunde mit der Zubereitung oder mit der behandelten Wunde in Kontakt kommen, und die auch für Daueranwendungen bei z . B . chronischen Wunden geeignet ist.

Ein Ziel der Erfindung war, eine antiseptische Zusammensetzung bereitzustellen, mit der das Konzept der feuchten Wundbehandlung aufrecht erhalten werden kann, ohne daß eine Kontamination der Wunde oder einer zu verwendenden Wundauflage befürchtet werden muß.

Ein weiteres Ziel der Erfindung war, ein Verfahren zur Herstellung von Liposomen anzugeben, die stabil sind und mindestens ein Biguanid mit antimikrobieller Wirkung enthalten.

Ein weiteres Ziel der Erfindung war, antiseptische Wundauflagen bereitzustellen, die mindestens ein Biguanid mit antimikrobieller Wirkung umfassen, bei denen die Verfügbarkeit des Biguanids und damit einhergehend dessen antimikrobielle Wirkung verbessert ist.

Erfindungsgemäß werden diese Ziele durch die Bereitstellung von Liposomen bestimmter Zusammensetzung erreicht, die mindestens ein Biguanid mit antimikrobieller Wirkung enthalten.

So lassen sich stabile Liposomen in Gegenwart von Biguaniden herstellen, wenn bei der Herstellung der Liposomen auf Lipide verzichtet wird, die eine anionische Kopfgruppe aufweisen, beispielsweise Phosphatidylglycerol . Zur Herstellung und Beladung von Liposomen mit Biguaniden hat sich das in der WO 02/36257 beschriebene Crossflow- Injektionsverfahren aufgrund seiner sehr schonenden Verfahrensbedingungen und hohen Effizienz als besonders vorteilhaft herausgestellt. Die Herstellung von mit Biguaniden beladenen Liposomen ist jedoch nicht auf dieses Verfahren beschränkt. Auch andere im Stand der Technik bekannte Verfahren zur Herstellung und Beladung von Liposomen können dazu genutzt werden, beispielsweise Hochdruckhomogenisations-, Microfluidizer- oder Ultraschallverfahren.

Biguanide, die in den erfindungsgemäßen Liposomen inkorporiert sein können, sind vorzugsweise aus der Gruppe von pharmakologisch akzeptablen Biguaniden ausgewählt, die 1,1 ^• -Hexamethylen-bis-£5- (4-chlorophenyl) -biguanid} (Chlorhexidin) , 1,1' -Hexamethylen-bis- {5- (4-fluorophenyl) - biguanid} (Fluorhexidine) , Polyhexamethylenbiguanid (FHMB) , Alexidin (N,N"-Bis (2-ethylhexyl) -3, 12-diimino-2,4,ll, 13- tetraazatetradecandiimidamin; 1,1 'hexamethyl-enebis [5- (2- ethylhexyl)biguanide] ) und die Polyhexamethylenbiguanid- Verbindungen des Vantocil® IB Typs (ICI) umfaßt. Darüber hinaus können die Biguanide auch aus den pharmakologisch akzeptabelen Biguaniden der in US 2,684,924, US 2,990,425, US 3,468,898, US 4,022,834, US 4,053,636, US 4,198,392, US 4,891,423, US 5,182,101, US 6,503,952, GB 705,838 und GB 702,268 beschriebenen Verbindungen ausgewählt sein. In besonders bevorzugten Ausführungsformen sind die Biguanide in Form ihrer wasserlöslichen, physiologisch akzeptablen Salze in den Liposomen inkorporiert. Zum Beispiel sind

Polyhexamethylenbiguanidhydrochlorid, Chlorhexidindigluconat, Chlorhθxidindiacetat, Chlorhexidindihydro- chlorid und Alexidinhydrochlorid ganz besonders bevorzugte Biguanide, die in den Liposomen inkorporiert sein können.

Die erfindungsgemäßen Liposomen können zur Herstellung von Wundauflagen in nahezu beliebiger Erscheinungsform verwendet werden, da die antimikrobiellen Eigenschaften der biguanidhaltigen Liposomen überraschenderweise auch nach deren Gefriertrocknung erhalten bleiben.

Die Erfindung wird im folgenden an Hand besonders bevorzugter Ausführungsformen detaillierter beschrieben, ohne daß diese Angaben das Wesen der Erfindung auf die nachfolgend beschriebenen Ausführungsformen beschränkend aufzufassen sind.

überraschenderweise hat sich herausgestellt, daß Polyhexanid in Liposomen stabil inkorporiert werden kann, wenn die Liposomen im wesentlichen frei von Lipiden mit anionischen Kopfgruppen sind.

Liposomen können entweder durch Beladung der Lipidschicht oder durch Beladung der intraliposomalen wäßrigen Phase mit Wirkstoffen beladen werden. Da Polyhexanid eine wasserlösliche Substanz ist, wurde davon ausgegangen, daß diese Moleküle nicht stabil in die Lipid-Doppelschicht von Liposomen inkorporiert werden können, sondern in der intraliposomalen Phase verbleiben sollten. Daher wurde versucht, die intraliposomale wäßrige Phase mit Polyhexanid zu beladen.

Dazu wurden Liposomen unterschiedlicher Zusammensetzung in einem geeigneten Beladungspuffer, vorzugsweise Tris-HCl (pH 7,5) und HEPES (pH 7,0) hergestellt. Zur Herstellung

der Liposomen wurden die jeweils verwendeten Lipide in 96 % Ethanol gelöst und mittels des Crossflow-Injektionsverfahrens in die wäßrige Phase druckgesteuert injiziert. Die Größe der dabei entstehenden Liposomen kann durch die lokale Lipidkonzentration am Injektionspunkt eingestellt werden, die durch die Lipidkonzentration in der ethanolischen Phase, der Ethanolkonzentration, dem Injektionsdruck, der Injektionsbohrung und der Fließgeschwindigkeit der wäßrigen Phase am Injektionspunkt bestimmt wird. Unmittelbar nach Injektion der Lipide in die wäßrige Phase wurde die Suspension mit einer weiteren Menge der wäßrigen Phase verdünnt, um die Ethanolkonzentration auf ein tolerierbares Niveau, vorzugsweise auf 7,5 bis 15 %, zu reduzieren.

Als Vorversuch wurden zunächst 2 Liposomensuspensionen hergestellt. Suspension #1 bestand aus hydriertem Soja- Phosphatidylcholin (S100-3 = 87 % Distearylphosphatidyl- cholin (DSPC) und 13 % Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC; 10 μmol/ml) ) sowie Cholesterol (2 μmol/ml) . Suspension #2 bestand aus hydriertem Soja-Phosphatidylcholin (5 μmol/ml), Ei-Phosphatidylglycerol (E-PG; 5 μmol/ml) und Cholesterol (2 μmol/ml) . Beide Liposomensuspensionen wurden in Bezug auf Vesikelgröße und Größenverteilung mittels dynamischer Lichtstreuung untersucht und zeigten mit einer durchschnittlichen Vesikelgröße von 120 bis 130 nm Durchmesser und einem Polydispersitätsindex (PDI), der als Maß für die Streuung dient, von 0,23 bis 0,24 vergleichbare Präparationsergebnisse.

Anschließend wurde diesen Liposomensuspensionen Cosmocil® CQ (Arch Chemicals, Ine, US) zugesetzt (9 Volumenteile Liposomensuspension + 1 Volumenteil Cosmocil® GQ), bei der es sich um eine 20 %-ige, wäßrige

Polyhβxanid-Lösung (PoIy(iminimidocarbonyl) iminohexa- methylenhydrochlorid-Lösung) handelt, so daß die Liposomensuspension 2% Polyhexanid enthält . Innerhalb weniger Minuten war bei Suspension #2 eine starke Sedimentation zu beobachten, nicht jedoch bei Suspension #1. Vergleichende Lichtstreumessungen zeigten keine Veränderung der Liposomengröße bei Suspension #1. Bei Suspension #2 mit Polyhexanid zeigte die Vergleichsmessung mit einer durchschnittlichen Vesikelgröße von > 4.000 bis 5.000 im eine deutliche Veränderung gegenüber der Liposomengröße in Suspension #2 ohne Zusatz von Polyhexanid.

Auch die Präparation von Liposomen mit den gleichen Lipidzusammensetzungen wie bei Suspension #1 und Suspension #2 in Gegenwart von Polyhexanid führte zu einem vergleichbaren Ergebnis . Für die Präparation dieser Liposomen wurde Cosmocil® GQ 1:1 mit PBS verdünnt, um eine 10 %-ige Polyhexanid-Lösung zu bereiten. Diese Lösung wurde mittels Crossflow-Injektionsverfahren bei 55°C in die Lipid/Ethanol-Lösung injiziert und anschließend 1:5 mit PBS verdünnt. Suspension #3 (S 100-3, Cholesterol und Polyhexanid) enthielt Liposomen mit einer durchschnittlichen Größe von 360 bis 370 um, wie die LichtStreumessung zeigte. Suspension #4 (S 100-3, E-PG, Cholesterol und Polyhexanid) hingegen zeigte ein ähnliches Sedimentationsverhalten wie Suspension #2 nach Zugabe von Polyhexanid. Die Vesikelgröße in Suspension #4 lag bei 3.000 - 4.000 im.

Diese Ergebnisse zeigen, daß Liposomen in Gegenwart von Polyhexanid hergestellt werden können, sofern kein Phosphatidylglycerol in die Liposomenmembran inkorporiert

wird. Phosphatidylglycerol ist ein Phospholipid mit einer anionischen Kopfgruppe.

Des weiteren konnte bei diesen Versuchen beobachtet werden, daß sich die PBS/Polyhexanid-Lösungen während des Temperierungsprozesses wiederholt leicht trübten. Daher scheint PBS nicht der optimale Puffer für die Herstellung von Polyhexanid-haltigen Liposomen zu sein, auch wenn PBS grundsätzlich als Puffer für die wäßrige Phase geeignet ist.

Anstelle von PBS als Puffer wurden verschiedene Puffer für Vorversuche ausgewählt, wobei darauf geachtet wurde, daß der Puffer bei etwa pH 7,0 eingesetzt werden kann, da die für die Herstellung der Liposomen in Betracht gezogenen Lipide bei diesem pH-Wert eine gute Stabilität aufweisen. Bei diesen Versuchen zeigte sich, daß 50 mM Zitronensäure (pH 7,0) bei Zugabe von Polyhexanid zu einer starken Trübungsreaktion führte, die bei der Temperierung auf die Prozeßtemperatur von 40 bis 50 ⁰ C zwar verschwand, aber bei Abkühlung wieder auftrat. Als Pufferlösungen, die sich für die Verdünnung von Polyhexanid im Rahmen der Herstellung von Polyhexanid-haltigen Liposomen als besonders geeignet herausstellten, sind beispielsweise 20 mM Tris-Puffer (pH 7,5) und 20 mM HEPES-Puffβr (pH 7,0) zu nennen, die beide in Gegenwart von Polyhexanid zu keiner Trübungs- reaktion führten. Darüber hinaus führte die Verwendung der beiden letztgenannten Puffer zu Polyhexanid-haltigen Liposomen, die sich hinsichtlich ihrer Größe, Beladung mit Polyhexanid und Stabilität nicht voneinander unterschieden.

In einer weiteren Serie von Versuchen wurden unterschiedliche Lipide verwendet, um Polyhexanid-haltige Liposomen herzustellen, nämlich

- S 100-3 = hydriertes Soja-Phosphatidylcholin

(gemischtkettiges, hydriertes Phospholipid aus 87 % Distearylphosphatidylcholin (DSPC) und 13 % Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPFC));

- E-PC = Phosphatidylcholin aus Ei (natürliches, gemischtkettiges Phospholipid mit ungesättigten Fettsäuren) ;

- E80 S = Mischung aus 80 % Phosphatidylcholin (E-PC) und 20 % Phosphatidylethanol (E-PE; l-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3- phosphoethanol) aus Ei (natürliches, gemischtkettiges Phospholipid mit ungesättigten Fettsäuren und einem Ladungsanteil) ;

- DMPC = Dimyristσylphosphatidylcholin; und

- DPPC = Dipalmitoylphosphatidylcholin.

Die Größenverteilung der Liposomen zeigte ein heterogenes Ergebnis. Liposomen, die mit S 100-3 bei 55°C mit 10 % Polyhexanid hergestellt wurden, zeigten in Abwesenheit von Cholesterol (Suspension #6) eine monoxnodale Verteilung mit einer durchschnittlichen Liposomengröße von 200 - 250 um. Die Anwesenheit von Cholesterol (Suspension #5) führte dagegen zu einer multimodal verteilten Liposomensuspension, die nicht für weitere Untersuchungen verwendet wurde. Bei Polyhexanid-haltigen Liposomen, die mit E-PC bei 35°C hergestellt worden waren, wurde in Anwesenheit von Cholesterol (Suspension #7) eine homogene monomodale Vesikθlpopulation mit einem Durchmesser von durchschnittlich 200 um erhalten, nicht jedoch bei Abwesenheit von Cholesterol (Suspension #8) . Bei Suspensionen, die mit E 80-S hergestellt wurden, hatte die An- bzw. Abwesenheit von 15 bis 20 Mol-% Cholesterol (Suspensionen #9 und #10) keinen Einfluß auf die

Iiiposomenbildung. Cholesterol dürfte sogar in Mengen bis zu oder knapp unter 50 Mol-% einsetzbar sein, ohne die Liposomenbildung zu beeinträchtigen, denn Cholesterol ist kein membranbildendes Lipid _*

Die monomodalθ Größenverteilung der Liposomen in den Suspensionen #6, #7, #9 und #10 lassen auf eine geringe oder keine Interaktion von Polyhexanid mit Membranlipiden schließen. Bei den multimodalen Größenverteilungen dürfte das Polyhexanid während des Präparationsprozesses mit der Membran oder einzelnen ihrer Bestandteile interagieren und so eine homogene Vesikelbildung stören.

Für weitere Analysen und Präparationen wurden nur Liposomensuspensionen mit monomodaler Größenverteilung der Vesikel verwendet. Diese Suspensionen wurde in einer 10 ml Amicon-Rührzelle mit einer Celluloseacetat-Membran, welche eine Ausschlußgrenze von 100 kDa hatte, filtriert, um den Anteil nicht inkorporierten Polyhexanids zu entfernen. Anschließend wurde der Polyhexanid-Gehalt aller im Rahmen der Filtration erhaltenen Fraktionen unter Verwendung der Eosin-Testmethode bestimmt. Bei den untersuchten Liposomen waren durchschnittlich 15 bis 25 % des zugesetzten Polyhexanids inkorporiert worden. Die Analyse der FiItrate zeigte auch, daß Polyhexanid stabil in den Liposomen verbleibt, das die Menge Polyhexanid in den aufeinanderfolgenden Filtraten kontinuierlich abnahm und sich der Polyhexanid-Gehalt im Retentat im erwarteten Bereich bewegte.

Entsprechende Versuche wurden auch mit den synthetischen Lipiden DPPC (Dipalmitoylphosphatidylcholin) und DMPC (Dixnyristoylphosphatidylcholin) durchgeführt. Dabei wurde gefunden, daß mit DPPC die bei 50 bis 55°C hergestellten

Liposomensuspensionen eine multimodale Größenverteilung aufwiesen, unabhängig von der Anwesenheit von Cholesterol (Suspension #11) bzw. Abwesenheit von Cholesterol (Suspension #12) . Liposomen aus DMPC und Chclestβrol (Suspension #13), die wie auch die Liposomen aus ungesättigten Lipidmischungen (Suspensionen #7 und #8) bei 35°C hergestellt wurden, zeigten mit einem durchschnittlichen Durchmesser der Liposomen von etwa 400 - 500 um und einer stabilen Inkorporation von etwa 30 - 40 % des zugesetzten PHMB bessere Ergebnisse.

Da nicht zweifelsfrei geklärt werden konnte, ob der für die vorgenannten Versuche verwendete Tris-Puffer für pharmazeutische Formulierungen oder Medizinprodukte eingesetzt werden kann, wurden die Liposomenpräparationen, die unter Verwendung von Tris-Puffer ein zufriedenstellendes Ergebnis erbracht hatten, nämlich Suspensionen #7, #9, #10 und #13, unter Verwendung von 20 itiM HEPES-Puffer (pH 7,0) anstelle von Tris-Puffer wiederholt, denn HEPES-Puffer werden nachgewiesenermaßen in pharmazeutischen Formulierungen verwendet.

Es konnten keine Unterschiede zwischen den mit Tris-Puffer und HEPES-Puffer hergestellten Liposomen festgestellt werden, wie der Vergleich der Versikelgrößen und der Polyhexanid-Beladung der Suspensionen #7, #9, #10 und #13 mit denen der Suspensionen #15 bis #18 zeigt (siehe Tabelle 1) . Sowohl hinsichtlich der Vesikelgröße und ihrer Größenverteilung, als auch im Einschlußverhalten von Polyhexanid waren keine signifikanten Unterschiede nachzuweisen. Lediglich die E-PC/Cholesterol-haltige Liposomensuspensionen (Suspensionen #7 und #15) zeigten bei den Analysen eine größere Streuung der Meßwerte als die übrigen Liposomenpräparationen.

In weiteren Experimenten wurde der Lipid/Ethanol-Lösung im Präparationsprozeß noch Vitamin E zugesetzt, um die aus ungesättigten Lipiden hergestellten Liposomen während ihrer Lagerung vor oxidativem Abbau zu schützen und um die Wundheilung durch Zugabe dieses Radikalfängers verbessern zu können.

Zunächst wurde die optimale Menge an Vitamin E bestimmt, die den Vesikelformulierungsprozeß nicht störend beeinflußt. Dabei wurde ermittelt, daß der Lipidphase bis zu 40 Mol-5s an Vitamin E zugesetzt werden konnte, ohne daß die Vesikelbildung beeinträchtigt wurde.

Auf diesen Ergebnissen aufbauend wurden in einer weiteren Serie Polyhexanid-haltige Liposomen mit 20 Mol-% Vitamin E hergestellt, anschließend filtriert und analysiert. Die Eigenschaften der aus diesen Präparationen hergestellten Liposomen (Suspensionen #19 bis #21) glichen hinsichtlich Vesikelgröße und Einschlußmengen an Polyhexanid den Eigenschaften der Lioposomen aus den Präparationen ohne Zusatz von Vitamin E (Suspensionen #15, #16, #17) . Auch unter Verwendung von Vitamin E wurden etwa 20 bis 25 % des zugesetzten PHMB liposomal inkorporiert.

Die Beladung von Liposomen mit Polyhexanid ist abhängig von ihrer Vesikelgröße. Liposomen mit 150 bis 200 im Durchmesser können konstant mit 15 bis 20% des zur Präparation zugesetzten Polyhexanids, Liposomen mit 400 bis 500 um Durchmesser können konstant mit 30 bis 40% des zur Präparation zugesetzten Polyhexanids beladen werden.

Zur Herstellung von antiseptisch wirkenden Liposomen- suspensionen können neben dem bevorzugten Polyhexanid, dessen gute Verträglichkeit und breites Wirkungsspektrum

nachgewiesen ist, auch alle anderen Biguanide verwendet werden, die eine antimikrobielle Wirkung besitzen und physiologisch akzeptabel sind.

Die Molekulargewichte, die die zu verwendenden Polyhexanide aufweisen sollten, unterliegen keiner wesentlichen Beschränkung. Polyhexanide aller bislang üblichen Molekulargewichte können verwendet werden. Das bevorzugte PHMB weist ein Molekulargewicht im Bereich von 1.500 bis 15.000 g/mol auf. Bevorzugt werden Polyhexanide mit einem Polymerisationsgrad von 12-16. Der Polymerisationsgrad gibt an, wie viele monomere Moleküle während der Polymerisation durchschnittlich zu einem Makromolekül verbunden werden.

Die Einarbeitung von liposomal inkorporiertem Polyhexanid oder einem anderen liposomal inkorporierten Biguanid in eine Wundaufläge kann auf verschiedene Weise erfolgen. Die Polyhexanid-haltigen Liposomen können beispielsweise in eine Polymerlösung des Trägermaterials für die Wundaufläge eingearbeitet werden. Durch Abdampfen oder Gefriertrocknen wird anschließend das Lösungsmittel entfernt. Um eine feuchte Wundauflage zu erzeugen, kann das Lösungsmittel ganz oder teilweise in der Wundaufläge bzw. dem Trägermaterial für die Wundauflage verbleiben, bevor diese weiterverarbeitet wird.

Alternativ kann man die Suspension biguanidhaltiger Liposomen auch mit Verfahren auf ein Trägermaterial aufbringen, die bei Polyhexanid-Lösungen angewendet werden. So können die biguanidhaltige Liposomen durch Berieseln oder Besprühen auf das Trägermaterial aufgetragen werden.

Die vorliegende Erfindung betrifft somit antiseptische Zubereitungen auf Basis eines in Liposomen eingeschlossenen antimikrobiellen Wirkstoffs, die sich dadurch auszeichnen.

daß die Liposomen keine Lipide mit anionischen Kopfgruppen enthalten, in ihrem Inneren ein wäßriges Milieu aufweisen und in dem wäßrigen Milieu mindestens ein antimikrobieller Wirkstoff aus der Gruppe der Biguanide enthalten ist.

Tabelle 1: übersicht über die Zusammensetzungen und Eigenschaften der hergestellten Liposomensuspensionen

Vorzugsweise umfassen die erfindungsgemäßen Liposomen Phospholipide, die aus der Gruppe der natürlichen und synthetischen Phospholipide ausgewählt sind, die Phosphatidylcholin,- Phosphatidylethanol, Dimyristoylphosphatidylcholin und deren Mischungen miteinander umfaßt. Die natürlichen Phospholipide stammen vorzugsweise aus Eiern oder Sojabohnen.

Bei Verwendung von synthetischen Phospholipiden zur

Herstellung der Liposomen können Phospholipide mit

Kettanlangen von 14 bis 24 Kohlenstoffatomen verwendet werden. Je langer die Kohlenstoff-Ketten der Phospholipide, desto besser dürfte das Biguanid in den Liposomen verbleiben

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfaßt die erfindungsgemäße Zusammensetzung Polyhexanid als lineares polymeres Biguanid mit antimikrobieller Wirkung, wobei Polyhexanide mit einem Molekulargewicht von 1.500 bis 15.000 g/znol und/oder mit einem Polymerisationsgrad von 12 - 16 ganz besonders bevorzugt werden.

Vorzugsweise handelt es sich bei dem wäßrigen Milieu um einen Puffer, wobei PBS, Tris-Puffer und HEPES-Puffer ganz besonders bevorzugt werden. Das wäßrige Milieu sollte einen pH-Wert von 6 bis 8 aufweisen, vorzugsweise liegt der pH-Wert bei 7,0 bis 7,5.

In einer bevorzugten Ausführungsform enthalten die Liposomen, genauer gesagt die Lipid-Doppelschichten der Liposomen, Cholesterol.

Der Cholesterol-Gehalt in den Liposomen kann bis zu 50 MoI- % betragen, vorzugsweise liegt der Cholesterol-Gehalt bei 15 bis 20 Mol-%.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthalten die Liposomen, genauer gesagt die Lipid-Doppelschichten der Liposomen, gegebenenfalls zusätzlich zu dem Cholesterol, Vitamin E in einer Menge von bis zu 40 Mol-%, vorzugsweise eine Menge von 20 Mol-%, jeweils bezogen auf die Gesamtlipide .

Die erfindungsgemäßen Liposomen weisen vorzugsweise eine mittlere Größe von 50 bis 800 um auf, besonders bevorzugt werden Liposomen mit einer mittleren Größe von 150 bis

500 um.

Die erfindungsgemäße Zubereitung kann beispielsweise in Form einer Suspension, Emulsion, Lotion, Tinktur, eines Sprays, Gels, einer Creme oder Salbe vorliegen.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch Verfahren zur Herstellung antiseptischer Zusammensetzungen auf Basis eines in Liposomen eingeschlossenen antimikrobiellen Wirkstoffs aus der Gruppe der Biguanide, wobei die Liposomen keine Lipide mit anionischen Kopfgruppen enthalten und sich das Verfahren dadurch auszeichnet, daß zunächst eine ethanolische Lipidphase in eine wäßrige, den antimikrobiellen Wirkstoff aus der Gruppe der Biguanide enthaltende Phase druckgesteuert injiziert, die wäßrige Phase nach erfolgter Vesikelbildung mit einem Puffer verdünnt, und nicht inkorporierter Wirkstoff anschließend entfernt wird. Vorzugsweise wird der Puffer zur Verdünnung der Liposomensuspension verwendet, der zur Bereitung der wäßrigen Phase verwendet wurde.

Vorzugsweise werden bei dem erfindungsgemäßen Verfahren für die Lipidphase Phospholipide der Gruppe der natürlichen oder synthetischen Phospholipide verwendet, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Phosphatidylcholin,

Phosphatidylethanol, Dimyristoylphosphatidylcholin und deren Mischungen miteinander besteht, wobei die natürlichen Phospholipide vorzugsweise aus Eiern oder Sojabohnen stammen.

Als bevorzugtes Biguanid mit antimikrobieller Wirkung werden vorzugsweise Chlorhexidin, Fluorhexidin, Alexidin oder Polyhexanide verwendet, besonders bevorzugt Polyhexanide mit einem Molekulargewicht von 1.500 bis 15.000 g/mol und/oder mit einem Polymerisationsgrad von 12 bis 16.

Die wäßrige Phase wird bei dem erfindungsgemäßen Verfahren vorzugsweise aus einem Puffer-System gebildet, besonders bevorzugt aus der Gruppe, die aus PBS (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung), Tris-Puffer und HEPES-Puffer besteht. Der pH der wäßrigen Phase wird auf einen Wert von 6 bis 8 eingestellt, besonders bevorzugt liegt der pH-Wert bei 7,0 bis 7,5.

In einem besonders bevorzugten Verfahren enthält die Lipidphase Cholesterol in einer Menge von 0 bis 50 Mol-%, vorzugsweise 15 bis 20 Mol-% und/oder Vitamin E in einer Menge von 0 bis 40 Mol-%, vorzugsweise von 20 Mol-%, jeweils bezogen auf die Gesamtlipide.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung der erfindungsgemäßen antiseptischen Zusammensetzung, insbesondere die Verwendung zur Herstellung von Wundauflagen, deren Trägermaterial beispielsweise durch Berieseln, Besprühen oder Imprägnieren mit den antimikrobiellen Liposomen versehen werden können.

Als Trägermaterialien für die Herstellung der Wundauflagen kommen alle dafür gebräuchlichen und dem Fachmann

geläufigen Materialien in Betracht, z. B. Kollagen, Cellulosen und Cellulosederivaten, Polyurethane, Alginate, allein oder in Kombination mit Polysacchariden aus der Gruppe, die aus Alginaten, Hyaluronsäur© und ihren Salzen (Hyaluronaten) , Pektinen, Carrageenanen, Xanthanen, sulfatierten Dextranen, Cellulosederivaten, oxidierter Cellulose wie oxidierter regenerierter Cellulose, Chondroitin, Chondroitin-4-sulfat, Chondroitin-6-sulfat, Heparin, Heparansulfat, Keratansulfat, Dermatansulfat, Stärkederivaten und deren Mischungen besteht.

In einer anderen bevorzugten Verwendung wird eine Polymerlösung, z. B. eine Kollagenlösung, mit der Liposomensuspension vermischt und anschließend das bzw. die Lösungsmittel durch Trocknen oder Gefriertrocknen ganz oder teilweise entfernt, so daß man Schwämme erhalten kann, die mit den antimikrobiell wirksamen Liposomen versehen sind.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich daher auch auf Wundauflagen, die biguanidhaltige Liposomen umfaßt und beispielsweise auf Cellulose, einem Cellulosederivat wie Carboxymethylcellulosen, Alginaten, Chitosan, Stärke oder Stärkederivaten, Kollagen, Polyacrylaten, Polyurethan oder Mischungen der vorgenannten Verbindungen als Trägermaterial basiert .

Die bevorzugten Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Wundauflagen sind Hydrogele, Hydrocolloide, Schwämme, Folien, Membranen, Vliese, Gewebe, Gewirke, andere textile Flächengebilde, Kardenbänder, Tamponaden und dergleichen.

Ganz besonders bevorzugt enthalten die erfindungsgemäßen Wundauflagen das liposomal inkorporierte, antimikrobiell wirksame Biguanid, vorzugsweise Polyhexanid, in einer Menge von 0,01 bis 1,0 Gew.-%, bezogen auf das Trockengewicht der Auflage.

Ausführungsbeispiel

Zur Herstellung von antiseptisch ausgerüsteten Kollagenschwämmen wurden 1%-ige Kollagensuspensionen (bovinen Urprungs) mit definierten Mengen einer Liposomensuspension (in Tris-Puffer) intensiv durchmischt und anschließend in eine Kunststoffschale gegeben. Die Mischung wurde dann bei -50 ⁰ C tiefgefroren und anschließend lyophilisiert. Auf diese Weise wurden Kollagenschwämme mit einem Polyhexanid-Gehalt von 0,05 Gew.-%, 0,1 Gew.-%, 0,5 Gew. -Ss oder 1 Gew. -%, bezogen auf das Trockengewicht des Kollagens, hergestellt.

Es wurden drei unterschiedliche Liposomensuspensionen verwendet :

I. Liposomen aus E 80-S, Cholesterol und Vitamin E (Suspension #20);

II. Liposomen aus E 80-S und Vitamin E (Suspension #21); und

III. Liposomen aus DMPC und Cholesterol (Suspension #22).

Die antimikrobielle Wirkung der Polyhexanid-haltige Liposomen umfassenden Kollagenschwämme sowie der für die Herstellung dieser Kollagenschwämme verwendeten Liposomensuspensionen auf Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa und Candida albicans wurde mittels Agar-Diffusions-Tests näher untersucht. Zu diesem Zweck wurden die Mikroorganismen für 24 h bei 30 bis 35°C in einem nicht selektiven Flüssigmedium kultiviert und anschließend mit einer 1 %-igen NaCl-Lösung, die 1 % Pepton enthielt, auf 1x1O ⁸ CFU/ml (colony forming units) bzw. 3,8xlO ⁷ CFU/ml (C. albicans) verdünnt. Jeweils 100 μl der Verdünnungen wurden auf CSA- bzw. SDA-Platten (CSA = Casein-Soja-Pepton-Agar; SDA = Sabouraud-Dextrose-Agar)

ausgestrichen. Die Agar-Platten wurden 3 bis 5 Minuten getrocknet .

Nach Aufbringen der Lösungen, Liposomensuspensionen oder Kollagenschwäxnme wurden die Platten für 24 h bei 30 bis 35°C bzw. 48 h bei 20 bis 25°C (C. albicans) inkubiert, bevor der Bereich der Hemmung ermittelt wurde. Der Bereich der Hemmung wurde quantifiziert, indem der Abstand vom Schwämmchen bzw. dem Loch in der Agarplatte für die einzufüllende Lösung oder Suspension zum Rand des Hemmhofs gemessen wird. Die Ergebnisse sind in semiquantitativer Form in Tabelle 2 zusammengefaßt.

Die Kollagenschwämme, die mit Polyhexanid beladene Liposomen umfaßten, zeigten eine gute antimikrobielle Wirkung gegenüber den drei untersuchten Mikroorganismen (S. aureus, P. aeruginosa und C. albicans) . Bei diesen Untersuchungen zeigten die Kollagenschwämme mit Polyhexanid-haltigen Liposomen auf Basis von DMPC die schwächste mikrobiozide Wirkung gegenüber den untersuchten Mikroorganismen, verglichen mit den Kollagenschwämmen, die mit Polyhexanid-haltigen Liposomen auf Basis von E 80-S versehen waren. Die Kollagenauflagen mit Polyhexanid- haltigen Liposomen auf Basis von E 80-S zeigten bereits bei Beladung mit geringen Polyhexanid-Mengen eine gute Wirkungen gegenüber S. aureus und C. albicans. Die mikrobiozide Wirkung dieser Wundauflagen gegenüber P. aeruginosa war uneinheitlich, allerdings kam es auch bei den Wundauflagen mit niedriger Polyhexanid-Beladung zu keiner Verkeimung der Wundauflage.

Eine Gefriertrocknung der Liposomensuspension hatte keine negativen Einflüsse auf die antimikrobielle Wirkung der Präparationen.

Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, daß sich mit liposomal inkorporiertem Polyhexanid Wundauflagen, zumindest auf Basis von oder mit Kollagen, herstellen lassen, die eine ausgezeichnete antimikrobielle Wirkung aufweisen.

Tabelle 2: Semiquantitative Auswertung der antimikrobiellen Wirkung von Polyhexanid-haltigen Zubereitungen