La présente invention concerne des biocatalyseurs permettant d'accélérer et d'améliorer la production d'éthanol par fermentation de matières premières amylacées.

La diminution importante et rapide des ressources en énergies fossiles et les problèmes de pollution associés à leur utilisation sont à l'origine de la nécessité de trouver des sources d'énergie alternatives à ces carburants.

La biomasse issue des produits et/ou coproduits agricoles constitue désormais une source de carbone importante et d'intérêt pour remplacer les sources d'énergie fossiles. L'éthanol produit à partir des sucres fermentescibles contenus dans les végétaux peut ainsi être utilisé dans les véhicules dotés de moteurs à combustion. L'augmentation de cette utilisation a entraîné un développement rapide de la production du bioéthanol au cours des dernières années tant en Amérique du Nord qu'en Europe, en particulier à partir de cultures de blé et/ou de maïs ou de leurs coproduits agricoles.

La généralisation de l'utilisation de bioéthanol comme carburant reste cependant toujours recherchée pour lutter par exemple contre le réchauffement climatique.

Une telle généralisation impliquera cependant un besoin d'augmentation des cultures de blé et/ou de maïs destinées à la production de bioéthanol. Or, les surfaces cultivables mondiales restent limitées, générant des tensions entre les surfaces de cultures dédiées à la production d'éthanol et celles dédiées à l'alimentation humaine et animale.

Par conséquent, bien que les procédés de fabrication d'éthanol à partir de matière première amylacée, en particulier à partir de farines de blé ou de maïs, soient désormais couramment utilisés par l'homme du métier, il existe toujours un besoin important d'augmentation des rendements de production de ces procédés. De plus, au vu des quantités visées, même une augmentation de 1 % du rendement de production d'éthanol à partir de matière première amylacée est une augmentation particulièrement bénéfique, tant pour les producteurs que les agriculteurs.

Les présents inventeurs ont identifié, de manière surprenante, une souche d'Aspergillus tubingensis permettant de produire, par fermentation en milieu solide, un biocatalyseur dont la composition enzymatique permet, lorsqu'il est ajouté au cours de l'étape de fermentation, et/ou de propagation de levures, d'un procédé de fabrication d'éthanol à partir de matière première amylacée et notamment de maïs, d'accélérer de manière significative la production d'éthanol, d'augmenter la concentration finale en éthanol d'au moins 1 % et de réduire la production de glycérol, un co-produit de l'éthanol. Cette souche, dénommée souche SCC027, a été déposée le 1 ^er février 2016 auprès du Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS, Uppsalalaan 8, 3584 CT Utrecht, Pays-Bas) sous le numéro CBS 136961 .

En réalisant une étude de protéomique du biocatalyseur obtenu en utilisant cette souche, les inventeurs ont montré que celui-ci présentait une composition enzymatique originale, incluant des activités principalement protéases, cellulases et hémicellulases.

Ils ont également démontré que près de 90% de l'effet observé avec ce biocatalyseur sur la production d'éthanol était dû à une combinaison de 5 familles d'activités enzymatiques: les activités protéase, cellulase, xylanase, β-glucosidase et pectinase, et plus particulièrement à une combinaison de 7 enzymes fongiques spécifiques : une aspergillopepsine A, une endoglucanase, une endoxylanase A, une endoxylanase C, une β-glucosidase A, une cellobiohydrolase et une polygalacturonase C.

Par ailleurs, toutes ces activités enzymatiques sont produites simultanément par la souche d'Aspergillus tubingensis SCC027 par fermentation. Le procédé de production de ce biocatalyseur est donc pratique à mettre en œuvre, puisqu'il ne nécessite pas de conditions de fermentation différentes selon les activités enzymatiques produites.

Les inventeurs ont de plus montré que la production de glycérol, coproduit du procédé de fabrication d'éthanol, était significativement diminuée en présence de ce biocatalyseur. Or le niveau de production de glycérol est un indicateur de la performance de la production d'éthanol par la levure. La réduction du glycérol peut aussi avoir des effets bénéfiques sur le procédé aval de production d'éthanol en conditions industrielles, en particulier sur l'évaporation des vinasses.

La présente invention concerne donc une souche d'Aspergillus tubingensis SCC027 déposée le 1 ^er février 2016 auprès du Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS, Uppsalalaan 8, 3584 CT Utrecht, Pays-Bas) sous le numéro CBS 136961 .

La présente invention a également pour objet un variant naturel de la souche d'Aspergillus tubingensis SCC027 déposée le 1 ^er février 2016 auprès du Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS, Uppsalalaan 8, 3584 CT Utrecht, Pays-Bas) sous le numéro CBS 136961 , permettant de produire, par fermentation en milieu solide sur un substrat comprenant un mélange de son de blé et de tourteau de colza, un biocatalyseur qui, lorsqu'il est ajouté dans le milieu de saccharification-fermentation simultanées d'un procédé de fabrication d'éthanol à partir de farine de maïs, permet d'obtenir un Gain Ethanol au moins égal à celui obtenu dans les mêmes conditions avec un biocatalyseur produit par fermentation en milieu solide de la souche d'Aspergillus tubingensis SCC027 sur un substrat comprenant un mélange de son de blé et de tourteau de colza. La présente invention a également pour objet un procédé de fabrication d'un biocatalyseur pour fabrication d'éthanol à partir de matière première amylacée, comprenant les étapes suivantes :

a) fournir un substrat,

b) ensemencer le substrat fourni à l'étape a) avec la souche d'Aspergillus tubingensis SCC027 selon l'invention ou un variant naturel de celle-ci selon l'invention, et c) fermenter par fermentation en milieu solide ledit substrat avec la souche dans des conditions appropriées pour permettre la production simultanée par la souche d'une activité protéase, d'une activité cellulase qui n'est pas une activité β-glucosidase, et d'une activité β-glucosidase.

Un autre objet de la présente invention concerne un biocatalyseur pour fabrication d'éthanol à partir de matière première amylacée, présentant au moins une activité protéase, une activité cellulase qui n'est pas une activité β-glucosidase, et une activité β- glucosidase, susceptible d'être obtenu par le procédé de fabrication de biocatalyseur selon l'invention.

La présente invention concerne également un biocatalyseur pour fabrication d'éthanol à partir de matière première amylacée, ledit biocatalyseur comprenant :

(i) au moins une activité protéase,

(ii) au moins une activité cellulase qui n'est pas une activité β-glucosidase, (iii) au moins une activité xylanase,

(iv) au moins une activité β-glucosidase, et

(v) au moins une activité pectinase,

lesdites activités protéase, cellulase, xylanase, β-glucosidase et pectinase étant produites simultanément par la même souche de champignon filamenteux.

La présente invention concerne aussi l'utilisation d'un biocatalyseur selon l'invention, pour la fabrication, par fermentation de matière première amylacée, d'éthanol.

Elle a également pour objet un procédé de fabrication d'éthanol à partir de matière première amylacée comprenant une étape de fermentation de la matière première amylacée par une levure en présence du biocatalyseur selon l'invention.

Description détaillée de l'invention

Définitions

La nomenclature utilisée pour la classification des enzymes est la nomenclature des enzymes de l'Union Internationale de Biochimie et de Biologie Moléculaire (IUBMB).

Par "protéase", on entend ici une enzyme de la classe EC 3.4, qui clive les liaisons peptidiques. De préférence, la protéase fongique est une endopeptidase. De manière particulièrement préférée, la protéase fongique est une ou un mélange de protéase(s) d'Aspergillus, en particulier une ou un mélange de protéase(s) d'Aspergillus genre nigri, plus particulièrement une ou un mélange de protéase(s) d'Aspergillus tubingensis, plus particulièrement une aspergillopepsine. De manière préférée entre toutes, la protéase fongique est une aspergillopepsine A.

Par "aspergillopepsine A", on entend ici une enzyme de la classe EC 3.4.23.18, qui est une aspartate-endopeptidase, qui clive les liaisons peptidiques internes des protéines en conditions acides et avec une large spécificité. Cette enzyme possède typiquement au moins 60,4% d'identité de séquence avec Haspergillopepsin A-like aspartic endopeptidase" de séquence SEQ ID NO: 1 , dont le numéro d'accession Gl du National Center for Biotechnology Information (NCBI) est 145249508, issue du séquençage du génome de la souche d'Aspergillus niger CBS 513.88 de DSM.

Par "cellulase", on entend ici une enzyme qui clive les liaisons glycosidiques en β- D-1 ,4 de la cellulose, de la lichenine et des β-glucanes de céréales.

De préférence, la cellulase est une ou un mélange de cellulase(s) d'Aspergillus, en particulier d'Aspergillus genre nigri, plus particulièrement d'Aspergillus niger. De manière préférée, la cellulase est une endoglucanase, une cellobiohydrolase ou un mélange de celles-ci.

Par "endoglucanase", on entend ici une enzyme de la famille des glycosides hydrolases GH6, de la classe EC 3.2.1 .4 clivant les liaisons β-1 ,4-glycosidiques internes des chaînes de cellulose. De manière préférée cette enzyme possède au moins 43,6% d'identité de séquence avec Hendoglucanase" de séquence SEQ ID NO: 2, dont le numéro d'accession Gl du National Center for Biotechnology Information (NCBI) est 350633077, issue du séquençage du génome de la souche d'Aspergillus niger ATCC 1015.

Par "cellobiohydrolase", on entend ici une enzyme de la famille des glycosides hydrolases GH7, de la classe EC 3.2.1 .91 qui libère les molécules de cellobiose des extrémités non réductrices de chaînes de cellulose. Cette enzyme possède typiquement au moins 25,6 % d'identité de séquence avec la "Probable 1 ,4-beta-D-glucan cellobiohydrolase A" de séquence SEQ ID NO: 3, dont le numéro d'accession Gl du National Center for Biotechnology Information (NCBI) est 294956478, issue du séquençage du génome de la souche d'Aspergillus niger CBS 513.88 de DSM.

Par "xylanase", on entend ici une enzyme de la classe EC 3.2.1 .8 de la nomenclature des enzymes de l'Union Internationale de Biochimie et de Biologie Moléculaire (IUBMB) qui dégrade les polymères de xyloses liés par des liaisons β-1 -4, dégradant ainsi en particulier l'hémicellulose.

De préférence, la xylanase est une ou un mélange de xylanase(s) d'Aspergillus, en particulier d'Aspergillus genre nigri, plus particulièrement d'Aspergilus tubingensis. De manière préférée, la xylanase est une endoxylanase de la classe EC 3.2.1 .8. De manière particulièrement préférée la xylanase est une endoxylanase A, une endoxylanase C ou un mélange de celles-ci.

Par "endoxylanase A", on entend ici une enzyme de la famille des glycosides hydrolases GH1 1 , de la classe EC 3.2.1 .8 clivant les liaisons β-1 ,4-xylosidiques internes des chaînes de xylanes. Cette enzyme possède typiquement au moins 73,7 % d'identité de séquence avec l'"endo-1 ,4-beta-xylanase A" de séquence SEQ ID NO: 4, dont le numéro d'accession Gl du National Center for Biotechnology Information (NCBI) est 145228427, issue du séquençage du génome de la souche d'Aspergillus niger CBS 513.88 de DSM.

Par "endoxylanase C", on entend ici une enzyme de la famille des glycosides hydrolases GH10, de la classe EC 3.2.1 .8 clivant les liaisons β-1 ,4-xylosidiques internes des chaînes de xylanes. Cette enzyme possède typiquement au moins 71 ,2 % d'identité de séquence avec la '"Probable endo-1 ,4-beta-xylanase C" de séquence SEQ ID NO: 5, dont le numéro d'accession Gl du National Center for Biotechnology Information (NCBI) est 292495278, issue du séquençage du génome de la souche d'Aspergillus niger CBS 513.88 de DSM.

Par "β-glucosidase", on entend ici une enzyme de la famille des glycosides hydrolases GH3, de la classe EC 3.2.1 .21 clivant les liaisons β-1 ,4-glycosidiques externes des chaînes de cellulose avec libération de β-D-glucose.

De préférence, la β-glucosidase est une ou un mélange de β-glucosidase(s) d'Aspergillus, en particulier d'Aspergillus genre nigri, plus particulièrement d'Aspergillus tubingensis. Plus particulièrement, la beta-glucosidase est une beta-glucosidase A.

De préférence la "β-glucosidase A" possède au moins 30,2 % d'identité de séquence avec la "beta-glucosidase A" de séquence SEQ ID NO: 6, dont le numéro d'accession Gl du National Center for Biotechnology Information (NCBI) est 145254958, issue du séquençage du génome de la souche d'Aspergillus niger CBS 513.88 de DSM.

Par "pectinase", on entend ici une enzyme capable de dégrader la pectine, polysaccharide présent dans les parois cellulaires des plantes.

De préférence, la pectinase est une ou un mélange de pectinase(s) d'Aspergillus, en particulier d'Aspergillus genre nigri, plus particulièrement d'Aspergillus tubingensis. De manière préférée, la pectinase est une polygalacturonase de la classe EC 3.2.1 .15 de la nomenclature des enzymes de l'Union Internationale de Biochimie et de Biologie Moléculaire (IUBMB), qui clive les liaisons glycosidiques a-1 ,4 entre les résidus d'acide galacturonique. Plus particulièrement la pectinase est une polygalacturonase C.

Par "polygalacturonase C", on entend ici une enzyme de la famille des glycosides hydrolases GH28, de la classe EC 3.2.1 .15 clivant les liaisons a-1 ,4-galacturoniques internes des chaînes d'acides galacturoniques. Cette enzyme possède typiquement au moins 28,7 % d'identité de séquence avec Hendopolygalacturonase C" de séquence SEQ ID NO: 7, dont le numéro d'accession Gl du National Center for Biotechnology Information (NCBI) est 145251 107, issue du séquençage du génome de la souche d'Aspergillus niger CBS 513.88 de DSM.

Dans le cadre de l'invention, le nom d'une classe ou famille enzymatique (e.g. protéase, cellulase, xylanase, β-glucosidase et pectinase) fait de préférence référence à l'activité enzymatique produite par cette famille, tandis que le nom d'une enzyme spécifique (e.g. aspergillopepsine A, endoxylanase A, endoxylanase C, polygalacturonase C) fait référence à la protéine en tant que telle.

Ainsi, une composition comprenant une famille enzymatique X comprend l'activité enzymatique X et éventuellement l'enzyme X, en tant que telle.

Les activités enzymatiques des enzymes mentionnées ci-dessus peuvent être déterminées par toute technique bien connue de l'homme du métier. Des exemples de méthode de détermination de chacune des classes enzymatiques mentionnées ci-dessus sont décrits dans la section "Activités enzymatiques" ci-dessous.

Le pourcentage d'identité tel que défini ici peut être calculé par de nombreuses méthodes bien connues de l'homme du métier. De préférence, le pourcentage d'identité correspond au nombre d'acides aminés identiques obtenus pour un alignement apparié optimal (c'est-à-dire l'alignement maximisant le nombre d'acides aminés identiques) d'une séquence d'une protéine avec une protéine de référence, sur la totalité de leur longueur, divisé par le nombre total d'acides aminés de la plus grande des deux séquences alignées. L'alignement peut être réalisé manuellement ou à l'aide de programmes d'ordinateur tels que le programme EMBOSS-Needle program (Needleman & Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453). Le pourcentage d'identité est de préférence calculé en utilisant le programme EMBOSS:needle (global) avec la matrice Blosum62 et les paramètres suivants: "Gap Open" égal à 10.0, "Gap Extend" égal à 0.5.

Dans le contexte de l'invention, les références Gl du NCBI citées sont celles qui étaient disponibles au 21 décembre 2015.

Souche dAspergillus tubingensis La présente invention a pour objet une souche d'Aspergillus tubingensis SCC027 déposée le 1 ^er février 2016 auprès du Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS, Uppsalalaan 8, 3584 CT Utrecht, Pays-Bas) sous le numéro CBS 136961 .

La présente invention a également pour objet un variant naturel de la souche d'Aspergillus tubingensis SCC027 déposée le 1 ^er février 2016 auprès du Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS, Uppsalalaan 8, 3584 CT Utrecht, Pays-Bas) sous le numéro CBS 136961 , permettant de produire, par fermentation en milieu solide sur un substrat comprenant un mélange de son de blé et de tourteau de colza, en particulier un mélange de son de blé et de tourteau de colza dans un rapport 30/70, un biocatalyseur qui, lorsqu'il est ajouté dans le milieu de saccharification-fermentation simultanées d'un procédé de fabrication d'éthanol à partir de farine de maïs, permet d'obtenir un Gain Ethanol au moins égal à celui obtenu dans les mêmes conditions avec un biocatalyseur produit par fermentation en milieu solide de la souche d'Aspergillus tubingensis SCC027 sur un substrat comprenant un mélange de son de blé et de tourteau de colza, en particulier un mélange de son de blé et de tourteau de colza dans un rapport 30/70.

Par "variant naturel", on entend ici une souche obtenue sans manipulation génétique, à partir d'une souche naturelle de référence, la souche ainsi obtenue permettant de produire, par fermentation en milieu solide sur un substrat comprenant un mélange de son de blé et de tourteau de colza, en particulier un mélange de son de blé et de tourteau de colza dans un rapport 30/70, un biocatalyseur qui, lorsqu'il est ajouté dans le milieu de saccharification-fermentation simultanées d'un procédé de fabrication d'éthanol à partir de farine de maïs, permet d'obtenir un Gain Ethanol tel que décrit à la section "Fabrication d'éthanol" ci-dessous, au moins égal à celui obtenu dans les mêmes conditions avec un biocatalyseur produit par fermentation en milieu solide de la souche de référence sur un substrat comprenant un mélange de son de blé et de tourteau de colza, en particulier un mélange de son de blé et de tourteau de colza dans un rapport 30/70.

Le variant naturel peut ainsi être obtenu par croisement et/ou hybridation de souches d'Aspergillus et/ou par mutation spontanée et/ou par mutagénèse aléatoire, par exemple suite à une exposition à des conditions de stress, à un traitement UV ou à un traitement avec d'autres agents mutagènes.

Le patrimoine génétique d'un variant naturel n'a pas été modifié par génie génétique. Le variant naturel n'est donc pas un organisme génétiquement modifié.

Le "Gain Ethanol" est défini à la section "Fabrication d'éthanol" ci-dessous.

De préférence, le variant naturel selon l'invention permet de produire, dans les conditions décrites dans l'exemple 1 , un biocatalyseur qui, lorsqu'il est ajouté dans le milieu de saccharification-fermentation simultanées d'un procédé de fabrication d'éthanol tel que décrit dans l'exemple 2, permet d'obtenir un Gain Ethanol tel que décrit à la section « Fabrication d'éthanol » au moins égal à celui obtenu dans les mêmes conditions avec un biocatalyseur produit dans les conditions décrites dans l'exemple 1 , par la souche SCC027.

Procédé de fabrication de biocatalyseur

La présente invention concerne également un procédé de fabrication d'un biocatalyseur pour fabrication d'éthanol à partir de matière première amylacée, comprenant les étapes suivantes :

a) fournir un substrat,

b) ensemencer le substrat fourni à l'étape a) avec la souche d'Aspergillus tubingensis SCC027 ou un variant naturel de celle-ci selon l'invention, et

c) fermenter par fermentation en milieu solide ledit substrat avec la souche dans des conditions appropriées pour permettre la production simultanée par la souche d'une activité protéase, d'une activité cellulase qui n'est pas une activité β-glucosidase et d'une activité β-glucosidase.

Substrat

Le substrat utilisé pour la production du biocatalyseur est de préférence un coproduit agricole ou agro-industriel.

Par "coproduit agricole ou agro-industriel", on entend ici un produit créé au cours du même processus de transformation et en même temps qu'un produit agricole ou agroindustriel principal.

Le substrat utilisé pour la production du biocatalyseur peut en particulier être un coproduit céréalier, un coproduit de culture oléagineuse, un coproduit de culture oléoprotéagineuse, un coproduit de culture saccharifère, un coproduit de procédés de la transformation de cultures céréalières, oléagineuses, oléoprotéagineuses, saccharifères, ou un mélange de ceux-ci.

Des exemples de substrats pouvant être utilisés pour produire le biocatalyseur selon l'invention incluent le son de blé, le tourteau de colza, le tourteau de soja, la pulpe de betterave, la radicelle d'orge, les drêches éthanolières de maïs, les drêches éthanolières de blé et des mélanges de ceux-ci.

De préférence, le substrat utilisé pour la production du biocatalyseur est choisi dans le groupe constitué du son de blé, du tourteau de colza, la radicelle d'orge, la drèche éthanolière de maïs, et des mélanges de ceux-ci. De manière davantage préférée, le substrat utilisé pour la production du biocatalyseur comprend du son de blé et/ou du tourteau de colza. De manière préférée entre toutes, le substrat utilisé pour la production du biocatalyseur comprend ou consiste en un mélange de son de blé et de tourteau de colza.

Le son de blé et le tourteau de colza peuvent être présents dans ce mélange dans des proportions massiques allant de 10/90 (autrement dit 10% de son de blé pour 90% de tourteau de colza) à 50/50 (autrement dit 50% de son de blé pour 50% de tourteau de colza), de préférence de 15/85 (autrement dit 15% de son de blé pour 85% de tourteau de colza) à 45/55 (autrement dit 45% de son de blé pour 55% de tourteau de colza), de préférence de 20/80 (autrement dit 20% de son de blé pour 80% de tourteau de colza) à 40/60 (autrement dit 40% de son de blé pour 60% de tourteau de colza), de préférence de 25/75 (autrement dit 25% de son de blé pour 75% de tourteau de colza) à 35/65 (autrement dit 35% de son de blé pour 35% de tourteau de colza), de manière davantage préférée de 30/70 (autrement dit 30% de son de blé pour 70% de tourteau de colza).

Le substrat utilisé pour la production du biocatalyseur peut être préalablement broyé.

Le substrat utilisé pour la production du biocatalyseur est de préférence préhumidifié et traité thermiquement en vue de diminuer la flore endogène du substrat, de le pasteuriser ou le stériliser.

De manière particulièrement préférée, le substrat utilisé pour la fabrication du biocatalyseur est pré-humidifié de manière à atteindre une matière sèche de 35 à 90%, de préférence une matière sèche de 40 à 80%, de préférence une matière sèche de 45 à 70%, de préférence une matière sèche de 50 à 65%, de manière préférée à 55% de matière sèche.

Le traitement thermique peut consister en un chauffage, par exemple dans un autoclave, typiquement à 105°C par exemple pendant 35 min, ou une pasteurisation, typiquement à 105°C par exemple pendant 15 min. Il est également possible d'opérer un traitement thermique du substrat utilisé pour la production du biocatalyseur en y injectant de la vapeur d'eau.

De préférence, le pH est réglé lors de l'humidification dans une gamme de 4 à 5,5, de préférence à 4,9 par exemple avec de l'acide nitrique ou de l'acide sulfurique, afin de favoriser l'implantation du microorganisme cultivé et le démarrage de la fermentation en milieu solide.

L'humidification est de préférence déterminée de manière à ce que la teneur en eau du substrat utilisé pour la production du biocatalyseur soit comprise entre 40 et 70% de la masse totale du substrat et de l'eau. Ainsi, le substrat utilisé pour la production du biocatalyseur présente de préférence une matière sèche initiale comprise entre 30 et 60%, de manière préférée de 45%. Ensemencement

L'ensemencement du substrat utilisé pour la production du biocatalyseur peut être mis en œuvre avec tout inoculum approprié. La souche d'Aspergillus tubingensis utilisée lors de la fermentation en milieu solide peut ainsi être préalablement soumise à une étape de sporulation avant d'être inoculée sous forme de spores. La dose d'inoculum sera alors avantageusement d'au moins 5.10 ⁶ spores viables/g de matière sèche initiale, de préférence au moins 10 ⁷ spores viables/g de matière sèche initiale. Alternativement, la souche d'Aspergillus tubingensis utilisée lors de la fermentation en milieu solide peut être inoculée sous forme de mycélium. La dose d'inoculum sera alors avantageusement comprise entre 100 et 500 g de milieu de culture liquide comprenant le mycélium par kg de matière sèche initiale.

Fermentation en milieu solide

Par "fermentation en milieu solide", on entend ici la culture de microorganismes sur des supports solides humides, sur des supports inertes ou sur des substrats insolubles qui peuvent être utilisés comme source de carbone et d'énergie. Le processus de fermentation a lieu en absence ou quasi-absence d'eau libre dans l'espace entre les particules de substrat.

La fermentation en milieu solide peut être conduite dans tout réacteur approprié. La fermentation en milieu solide est de préférence conduite pour un arrêt maîtrisé avant la sporulation de la souche d'Aspergillus tubingensis utilisée. La fermentation en milieu solide est ainsi de préférence conduite pendant une période de 1 à 4 jours, de préférence entre 20 h et 80 h, entre 35 h et 60 h, entre 40 h et 55 h, de manière particulièrement préférée entre 45 h et 50 h.

La température du milieu est de préférence maintenue entre 30°C et 36°C ± 0,5°C, de manière davantage préférée à 33°C ± 0,5°C, ce qui correspond au domaine d'activité optimum des souches d'Aspergillus tubingensis utilisées pour produire le biocatalyseur.

La teneur en eau du substrat est de préférence sensiblement maintenue entre 45 et 60% au cours de la fermentation, de manière davantage préférée à 55%, par exemple en procédant périodiquement à des apports d'eau pour compenser la perte en eau du milieu. L'expression "sensiblement maintenue" signifie qu'il est tolérable que le taux d'humidité prenne une valeur s'écartant de 2 unités % de l'intervalle 45-60% pendant une relativement brève période entre deux ajustements successifs du taux d'humidité ou en fin de fermentation. Le taux d'humidité du substrat peut en effet avoir tendance à baisser au cours de la fermentation par évaporation sous l'effet de l'augmentation de température générée par la croissance fongique. Une aération, de préférence en continu, est de préférence mise en place pendant la fermentation en milieu solide, afin d'apporter l'oxygène nécessaire à la fermentation et éviter l'accumulation excessive de dioxyde de carbone produit par la fermentation et/ou éviter l'accumulation excessive de chaleur.

Une agitation peut être conduite en vue d'éviter la formation de masses imperméables. L'agitation peut être mise en œuvre au moyen de bras agitateurs, de lames ou spatules ou de vis sans fin. L'agitation reste toutefois de préférence modérée. De préférence, l'agitation est discontinue, typiquement l'agitation est conduite toutes les 3 h à 13 h.

L'étape c) de fermentation est mise en œuvre dans des conditions appropriées pour permettre la production simultanée par la souche d'une activité protéase telle que définie dans la section "Définitions" ci-dessus, d'une activité cellulase qui n'est pas une β- glucosidase et d'une activité β-glucosidase, telle que définie à la section "Définitions" ci- dessus.

Par "production simultanée" de plusieurs activités enzymatiques, on entend ici que les activités enzymatiques sont produites par la souche d'Aspergillus tubingensis au cours d'une seule étape de fermentation au cours de laquelle les conditions de fermentation (température, pH, composition du milieu, aération) permettent d'obtenir l'ensemble des activités enzymatiques recherchées.

L'étape c) de fermentation est de préférence mise en œuvre dans des conditions appropriées pour permettre la production simultanée par la souche d'au moins 60 U d'activité protéase PAC par gramme de matière sèche initiale de substrat, de préférence d'au moins 100 U d'activité protéase PAC par gramme de matière sèche initiale de substrat, de préférence d'au moins 130 U d'activité protéase PAC par gramme de matière sèche initiale de substrat, d'au moins 60 U d'activité cellulase CMCell par gramme de matière sèche initiale de substrat, de préférence d'au moins 1 10 U d'activité cellulase CMCell par gramme de matière sèche initiale de substrat, et d'au moins 100 U d'activité β-glucosidase β-Glu par gramme de matière sèche initiale de substrat, de préférence d'au moins 200 U d'activité β-glucosidase β-Glu par gramme de matière sèche initiale de substrat.

De préférence, l'étape c) de fermentation est mise en œuvre dans des conditions appropriées pour permettre en outre la production simultanée par la souche

- d'au moins 75 U d'activité xylanase AXCn par gramme de matière sèche initiale de substrat, de préférence d'au moins 130 U d'activité xylanase AXCn par gramme de matière sèche initiale de substrat, de préférence d'au moins 180 U d'activité xylanase AXCn par gramme de matière sèche initiale de substrat, et/ou

- d'au moins 2000 U d'activité pectinase PG par gramme de matière sèche initiale de substrat, de préférence d'au moins 2900 U d'activité pectinase PG par gramme de matière sèche initiale de substrat, de préférence d'au moins

3800 U d'activité pectinase PG par gramme de matière sèche initiale de substrat, de préférence d'au moins 4500 U d'activité pectinase PG par gramme de matière sèche initiale de substrat.

L'étape c) de fermentation est de préférence mise en œuvre dans des conditions pour permettre la production simultanée par la souche d'au moins une aspergillopepsine A, telle que définie dans la section "Définitions" ci-dessus, comme protéase, d'au moins une endoglucanase, telle que définie dans la section "Définitions" ci-dessus, comme cellulase, et d'au moins une β-glucosidase, telle que définie dans la section "Définition" ci- dessus.

Le produit de fermentation ainsi obtenu est un produit solide humide.

Par "matière sèche initiale de substrat" ou "MSi", on entend ici la masse de matière sèche de substrat utilisée pour réaliser la fabrication du biocatalyseur par fermentation en milieu solide, au début de cette fermentation. Au cours du procédé de fermentation en milieu solide, la croissance de microorganismes tels qu'Aspergillus consomme une partie du substrat, et génère donc une perte de matière sèche de substrat qui représente typiquement entre 15 et 30%, par exemple 20% de la matière sèche initiale.

Les quantités de biocatalyseurs, lors de leur utilisation telle que définie ci-dessous, sont rapportées à la quantité de matière sèche initiale de substrat correspondante.

Les niveaux d'activités enzymatiques sont rapportés à la quantité de matière sèche initiale de substrat correspondante, de telle sorte de pouvoir comparer les formes extraites et les formes brutes du biocatalyseur ou de comparer des biocatalyseurs issus de fermentation ou de souche avec des pertes de masse différentes.

Conditionnement du produit fermenté

Le biocatalyseur obtenu suite à la fermentation en milieu solide ci-dessus peut être sous forme brute ou extraite.

Par "forme brute", on entend ici que le biocatalyseur comprend au moins la protéase, la cellulase et la β-glucosidase, ainsi que la souche d'Aspergillus tubingensis utilisée pour la fermentation en milieu solide et le substrat mis en œuvre lors de la fermentation en milieu solide, éventuellement broyé. Cette forme brute contient typiquement des particules ayant un diamètre compris entre 50 μηι et 5 mm selon le type de broyât généré.

Le biocatalyseur obtenu à l'issue de la fermentation en milieu solide peut en outre être séché ou congelé en vue de sa conservation.

Le séchage est de préférence réalisé à une température modérée pour ne pas affecter les activités enzymatiques, par exemple en étuve de préférence à 40°C, jusqu'à obtenir une humidité par exemple de 8%, ou par exemple de 10%.

La congélation est de préférence réalisée sur le produit fermenté humide, par exemple à -20°C.

Le biocatalyseur obtenu à l'issue de la fermentation en milieu solide peut également subir un nouveau broyage avant d'être conditionné.

Par "forme extraite", on entend ici que la combinaison d'enzymes du biocatalyseur, en particulier au moins les protéase, cellulase et β-glucosidase, plus particulièrement au moins les protéase, cellulase, xylanase, β-glucosidase et pectinase, plus particulièrement, au moins les aspergillopepsine A, endoglucanase, endoxylanase A, endoxylanase C, β- glucosidase A, cellobiohydrolase et polygalacturonase C, sont isolées de la souche d'Aspergillus tubingensis et du substrat mis en œuvre lors de la fermentation en milieu solide avec la souche d'Aspergillus tubingensis par des procédés d'extractions pouvant mettre en œuvre toute technique bien connue de l'homme du métier, en particulier par extraction en solution aqueuse, extraction en solution alcoolique, extraction par solvants, homogénéisation haute pression, extraction supercritique, extraction par lits fluidisés, broyage, broyage cryogénique, décompression, cavitation, bullage, extraction par ultrasons, adsorption sur résines ou zéolites. La combinaison d'enzymes sous forme liquide peut être ensuite purifiée par toute technique bien connue de l'homme du métier, en particulier par centrifugation, filtration, ultrafiltration, chromatographie, utilisation de membranes ou précipitation.

Le biocatalyseur sous forme extraite peut en outre être stabilisé, séché ou congelé en vue de sa conservation.

La stabilisation du biocatalyseur peut être effectuée par tout moyen connu de l'homme du métier, tel que l'ajout de glycérol, de sorbate, de sel de potassium, etc.

Le séchage du biocatalyseur sous forme extraite peut être effectué par tout moyen connu de l'homme du métier, tel que la lyophilisation, l'atomisation, etc.

Biocatalyseur

La présente invention concerne un biocatalyseur pour fabrication d'éthanol à partir de matière première amylacée, comprenant au moins une activité protéase, une activité cellulase qui n'est pas une activité β-glucosidase et une activité β-glucosidase, telles que définies à la section "Définitions" ci-dessus, susceptible d'être obtenu par le procédé de fabrication de biocatalyseur selon l'invention.

Dans un mode de réalisation particulier, le biocatalyseur comprend comme protéase au moins une aspergillopepsine A. Dans un mode de réalisation particulier, le biocatalyseur comprend comme cellulase au moins une endoglucanase et/ou au moins une cellobiohydrolase. Dans un mode de réalisation particulier, le biocatalyseur comprend comme β-glucosidase au moins une β-glucosidase A. Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, le biocatalyseur comprend au moins une aspergillopepsine A, au moins une endoglucanase et au moins une β-glucosidase A.

Dans un mode de réalisation préféré, ladite activité protéase est présente dans le biocatalyseur à une dose d'au moins 60 U PAC / g de matière sèche initiale de substrat, de préférence à une dose d'au moins 100 U PAC / g de matière sèche initiale de substrat, de préférence à une dose d'au moins 130 U PAC / g de matière sèche initiale de substrat. Dans un autre mode de réalisation préféré, ladite activité cellulase qui n'est pas une activité β-glucosidase est présente dans le biocatalyseur à une dose d'au moins 60 U CMCell / g de matière sèche initiale de substrat, de préférence à une dose d'au moins 1 10 U CMCell / g de matière sèche initiale de substrat. Dans un autre mode de réalisation préféré, ladite activité β-glucosidase est présente dans le biocatalyseur à une dose d'au moins 100 U β-Glu / g de matière sèche initiale de substrat, de préférence à une dose d'au moins 200 U β-Glu / g de matière sèche initiale de substrat.

L'expression "matière sèche initiale de substrat" est définie à la section "Procédé de fabrication de biocatalyseur" ci-dessus.

De préférence, le biocatalyseur susceptible d'être obtenu par le procédé de fabrication selon l'invention comprend en outre au moins une activité xylanase et/ou au moins une activité pectinase, cesdites activités étant produites simultanément par la souche d'Aspergillus tubingensis.

De manière particulièrement préférée, le biocatalyseur susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'invention comprend en outre :

- au moins 75 U d'activité xylanase AXCn par gramme de matière sèche initiale de substrat, de préférence au moins 130 U d'activité xylanase AXCn par gramme de matière sèche initiale de substrat, de préférence au moins 180 U d'activité xylanase AXCn par gramme de matière sèche initiale de substrat, et/ou

- au moins 2000 U d'activité pectinase PG par gramme de matière sèche initiale de substrat, de préférence au moins 2900 U d'activité pectinase PG par gramme de matière sèche initiale de substrat, de préférence au moins 3800 U d'activité pectinase PG par gramme de matière sèche initiale de substrat, de préférence d'au moins 4500 U d'activité pectinase PG par gramme de matière sèche initiale de substrat.

De préférence, le biocatalyseur selon l'invention comprend comme xylanase une endoxylanase A, une endoxylanase C ou un mélange de celles-ci, et/ou comme pectinase une polygalacturonase C.

Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, l'ensemble des enzymes présentes dans le biocatalyseur selon l'invention sont produites simultanément par une seule souche de champignon filamenteux, en particulier une seule souche d'Aspergillus, en particulier une seule souche d'Aspergillus genre nigri, plus particulièrement d'Aspergillus tubingensis, de manière davantage préférée la souche d'Aspergillus tubingensis SCC027 ou un variant naturel de celle-ci tels que défini dans la section "Souche dAspergillus tubingensis" ci-dessus.

La présente invention concerne également un biocatalyseur pour fabrication d'éthanol à partir de matière première amylacée, ledit biocatalyseur comprenant :

(i) au moins une activité protéase,

(ii) au moins une activité cellulase qui n'est pas une activité β-glucosidase, (iii) au moins une activité xylanase,

(iv) au moins une activité β-glucosidase, et

(v) au moins une activité pectinase,

lesdites activités protéase, cellulase, xylanase, β-glucosidase et pectinase étant produites simultanément la même souche de champignon filamenteux.

De préférence, le biocatalyseur comprend comme protéase (i) au moins une protéase acide, de préférence au moins une aspergillopepsine, de manière préférée entre toutes au moins une aspergillopepsine A.

De préférence, le biocatalyseur comprend comme cellulase (ii) au moins une endoglucanase, une cellobiohydrolase ou un mélange de celles-ci.

De préférence, le biocatalyseur comprend comme xylanase (iii) au moins une endoxylanase ou un mélange d'endoxylanases, de manière préférée au moins une endoxylanase A, une endoxylanase C ou un mélange de celles-ci.

De préférence, le biocatalyseur comprend comme β-glucosidase (iv) au moins une β-glucosidase A.

De préférence, le biocatalyseur comprend comme pectinase (v) au moins une polygalacturonase, de manière préférée au moins une polygalacturonase C. Dans un mode de réalisation préféré, le biocatalyseur selon l'invention comprend:

(i) au moins une aspergillopepsine A,

(ii) au moins une endoglucanase et une cellobiohydrolase,

(iii) au moins une endoxylanase A et une endoxylanase C,

(iv) au moins une β-glucosidase A, et

(v) au moins une polygalacturonase C,

lesdites aspergillopepsine A, endoglucanase, cellobiohydrolase, endoxylanase A, endoxylanase C, β-glucosidase A et polygalacturonase C, étant produites simultanément par la même souche de champignon filamenteux.

De préférence, ledit champignon filamenteux est un Aspergillus, de manière préférée un Aspergillus section nigri, plus particulièrement un Aspergillus tubingensis, de manière préférée entre toutes la souche d' Aspergillus tubingensis SCC027 ou un variant naturel de celle-ci tels que définis à la section "Souche dAspergillus tubingensis" ci- dessus.

De préférence, ladite au moins une activité protéase est présente dans le biocatalyseur à une dose d'au moins 60 U PAC / g de matière sèche initiale de substrat, de préférence à une dose d'au moins 100 U PAC / g de matière sèche initiale de substrat, de préférence à une dose d'au moins 130 U PAC / g de matière sèche initiale de substrat. De préférence, ladite au moins une activité cellulase qui n'est pas une activité β- glucosidase, est présente dans le biocatalyseur à une dose d'au moins 60 U CMCell / g de matière sèche initiale de substrat, de préférence d'au moins 1 10 U CMCell / g de matière sèche initiale de substrat. De préférence, ladite au moins une activité xylanase est présente dans le biocatalyseur à une dose d'au moins 75 U AXCn par gramme de matière sèche initiale de substrat, de préférence au moins 130 U AXCn par gramme de matière sèche initiale de substrat, de préférence au moins 180 U AXCn par gramme de matière sèche initiale de substrat. De préférence, ladite au moins une activité β- glucosidase est présente dans le biocatalyseur à une dose d'au moins 100 U β-Glu par gramme de matière sèche initiale de substrat, de préférence au moins 200 U β-Glu par gramme de matière sèche initiale de substrat. De préférence, ladite au moins une activité pectinase est présente dans le biocatalyseur à une dose d'au moins 2000 U PG par gramme de matière sèche initiale de substrat, de préférence au moins 2900 U PG par gramme de matière sèche initiale de substrat, de préférence au moins 3800 U PG par gramme de matière sèche initiale de substrat, de préférence d'au moins 4500 U PG par gramme de matière sèche initiale de substrat.

De manière particulièrement préféré, le biocatalyseur selon l'invention comprend: (i) au moins une activité protéase à une dose d'au moins 60 U PAC / g de matière sèche initiale de substrat, de préférence à une dose d'au moins 100 U PAC / g de matière sèche initiale de substrat, de préférence à une dose d'au moins 130 U PAC / g de matière sèche initiale de substrat,

(ii) au moins une activité cellulase à une dose d'au moins 60 U CMCell / g de matière sèche initiale de substrat, de préférence d'au moins 1 10 U CMCell / g de matière sèche initiale de substrat,

(iii) au moins une activité xylanase à une dose d'au moins 75 U AXCn par gramme de matière sèche initiale de substrat, de préférence au moins 130 U AXCn par gramme de matière sèche initiale de substrat, de préférence au moins 180 U AXCn par gramme de matière sèche initiale de substrat,

(iv) au moins une activité β-glucosidase à une dose d'au moins 100 U β-Glu / g de matière sèche initiale de substrat, de préférence au moins 200 U β-Glu / g de matière sèche initiale de substrat; et

(v) au moins une activité pectinase à une dose d'au moins 2000 U PG par gramme de matière sèche initiale de substrat, de préférence au moins 2900 U PG par gramme de matière sèche initiale de substrat, de préférence au moins 3800 U PG par gramme de matière sèche initiale de substrat, de préférence d'au moins 4500 U PG par gramme de matière sèche initiale de substrat,

lesdites activités protéase, cellulase, xylanase, β-glucosidase et pectinase étant produites simultanément par la même souche de champignon filamenteux, de préférence la même souche d'Aspergillus, en particulier la même souche d'Aspergillus section nigri, plus particulièrement la même souche d'Aspergillus tubingensis, plus particulièrement la même souche d'Aspergillus tubingensis SCC027 ou un variant naturel de celle-ci tels que défini à la section "Souche dAspergillus tubingensis" ci-dessus.

Fabrication d'éthanol

La présente invention a également pour objet l'utilisation du biocatalyseur selon l'invention pour la fabrication, par fermentation de matière première amylacée, d'éthanol.

La présente invention concerne également un procédé de fabrication d'éthanol à partir de matière première amylacée comprenant une étape de fermentation de la matière première amylacée par une levure en présence du biocatalyseur selon l'invention.

L'étape de fermentation du procédé de fabrication d'éthanol selon l'invention est de préférence une étape de saccharification-fermentation simultanée, en présence du biocatalyseur selon l'invention. Par "matière première amylacée", on entend ici une céréale ou un tubercule, qui contient comme source de carbone majoritaire, de l'amidon. En particulier, par "matière première amylacée", on entend ici du maïs, blé, orge, sorgho, manioc, pomme de terre, seul ou en mélange. De préférence, la matière première amylacée est du maïs ou du blé. Dans un mode de réalisation particulier, la matière première amylacée est du maïs. Dans un autre mode de réalisation particulier, la matière première amylacée est du blé.

Le procédé de fabrication d'éthanol selon l'invention comprend de préférence les étapes suivantes:

A) une étape de mélange d'une mouture de la matière première amylacée avec de l'eau, et optionnellement des vinasses clarifiées,

B) optionnellement une étape de cuisson du mélange préparé à l'étape A),

C) optionnellement une étape de pré-liquéfaction de l'amidon dudit mélange,

D) une étape de liquéfaction de l'amidon, en présence d'enzymes de liquéfaction de l'amidon, permettant d'hydrolyser l'amidon en dextrines,

E) optionnellement une étape de propagation de levures, et

F) une étape de saccharification-fermentation simultanées des dextrines et/ou des sucres fermentescibles, en présence du biocatalyseur selon l'invention, d'enzymes de saccharification des dextrines et de levures, éventuellement propagées à l'étape E), de manière à produire de l'éthanol.

Etape A) de mélange

Le mélange contient typiquement de 20 à 40% en masse de matière sèche, de préférence entre 25 et 35%, de préférence 30% en masse de matière sèche.

Etape B) de cuisson

Le mélange préparé à l'étape A), contenant typiquement de 20 à 40% en masse de matière sèche, de préférence entre 25 et 35%, de préférence 30% en masse de matière sèche, est de préférence envoyé dans un jet-cooker typiquement entre 100 et 130°C, de préférence entre 105 et 120°C, de préférence avec une injection de vapeur, de préférence pendant une durée de 5 à 20 min, de préférence pendant 15 min, de manière à gélatiniser et déstructurer l'amidon granulaire de la matière première en mélange.

Cette étape B) de cuisson est de préférence mise en œuvre lorsque la matière première amylacée est du maïs.

Etape C) de pré-liquéfaction

Le mélange, contenant typiquement de 20 à 40% en masse de matière sèche, de préférence entre 25 et 35%, de préférence 30% en masse de matière sèche, est de préférence mis en présence d'un complexe enzymatique déviscosant. Les enzymes de pré-liquéfaction utilisables pendant cette étape sont bien connues de l'homme du métier. Il s'agit typiquement d'enzymes de réduction de viscosité telles que des hémicellulases et/ou des bêta-glucanases.

Selon les enzymes utilisées, le pH peut être ajusté avec une solution d'acide ou de base, par exemple d'acide sulfurique ou d'hydroxyde d'ammonium. Le pH peut classiquement être ajusté entre 4,5 et 6,5, de préférence à 5,5.

La pré-liquéfaction est de préférence réalisée en appliquant une phase de montée en température de préférence de 15 min permettant d'atteindre une température typiquement de 55°C maintenue pendant 15 à 45 min, de préférence 30 min.

Les cuves dans lesquelles l'étape de pré-liquéfaction est réalisée peuvent en outre être agitées, de préférence en continu.

Cette étape C) de pré-liquéfaction est de préférence mise en œuvre lorsque la matière première amylacée est du blé.

Etape D) de liquéfaction

Le mélange préparé à l'étape A) et ayant optionnellement subi les étapes B) ou C), contenant typiquement de 20 à 40% en masse de matière sèche, de préférence entre 25 et 35%, de préférence 30% en masse de matière sèche, est de préférence mis en présence d'enzymes de liquéfaction. Les enzymes de liquéfaction utilisables pendant cette étape sont bien connues de l'homme du métier. Il s'agit typiquement d'a-amylases, en particulier d'a-amylases bactériennes, de préférence des α-amylases bactériennes thermostables. D'autres enzymes peuvent en outre être utilisées au cours de cette étape.

Selon les enzymes utilisées, le pH peut être préalablement ajusté avec une solution d'acide ou de base, par exemple d'acide sulfurique ou d'hydroxyde d'ammonium. Le pH peut classiquement être ajusté entre 4,5 et 6,5, de préférence à 5,5. Selon l'enzyme utilisée, un sel de calcium peut également être ajouté pour améliorer la stabilité de l'enzyme.

La liquéfaction est de préférence réalisée à une température de 80 à 95°C, de préférence entre 85 et 90°C, pendant 60 à 150 min, de préférence 90 min.

Les cuves dans lesquelles l'étape de liquéfaction est réalisée peuvent en outre être agitées, de préférence en continu.

Etape E) de propagation de levures

Les levures utilisables pour la fabrication d'éthanol sont bien connues de l'homme du métier et peuvent être en particulier des levures du genre Saccharomyces. De préférence, les levures utilisées pour la fabrication d'éthanol ne sont pas des organismes génétiquement modifiés. De préférence, les levures sont introduites dans le milieu de fermentation ou de saccharification-fermentation simultanées, à l'étape F) définie ci-dessous, après avoir subi une étape de propagation. Cette étape de propagation permet un développement des levures suffisant à l'inoculation du milieu de fermentation ou de saccharification- fermentation simultanées à la dose mentionnée ci-dessus. L'étape de propagation est typiquement mise en œuvre par la culture de levures sèches actives dans un moût liquéfié, contenant typiquement de 15 à 30% en masse de matière sèche, de préférence entre 20 et 25%, de préférence 20% en masse de matière sèche. Typiquement, l'étape de propagation selon l'invention présente les caractéristiques suivantes :

• La température est comprise entre 30°C et 37°C, de préférence de 35°C.

• Le pH peut être ajusté au début de l'étape de propagation avec un acide ou une base, par exemple de l'acide sulfurique ou de l'hydroxyde d'ammonium, de préférence entre 4,5 et 5,8, de préférence entre 5 et 5,5, de préférence à 5,3. De préférence, il n'y a pas d'ajustement du pH pendant la suite de l'étape de propagation.

• L'ensemble est de préférence agité pendant toute la durée de l'étape de propagation, de manière à bien aérer le milieu.

• Un ajout d'azote peut être réalisé, sous forme minérale ou organique, par exemple d'urée, de manière à apporter à la levure une source d'azote complémentaire. Par exemple un apport d'urée de 2 à 4 g/l de moût liquéfié peut être effectué, de préférence de 3 g/litre de moût liquéfié.

• Le temps de propagation peut être compris entre 4 h et 24 h, de préférence entre 8h et 12h.

Le biocatalyseur selon l'invention peut être ajouté au cours de l'étape de propagation, au lieu de l'étape de saccharification-fermentation simultanées définie ci- dessous, de manière à garantir un apport, lors de l'étape de saccharification-fermentation simultanées, de l'ordre de 0,01 à 5 kg de matière sèche initiale de substrat de biocatalyseur par tonne de matière première amylacée, de préférence entre 0,4 et 1 ,2 kg de matière sèche initiale de substrat de biocatalyseur par tonne de matière première amylacée.

Etape F) de saccharification-fermentation simultanées

Lors de cette étape, le moût liquéfié selon l'étape D), contenant typiquement de 20 à 40% en masse de matière sèche, de préférence entre 25 et 35%, de préférence 30% en masse de matière sèche, est de préférence mis en présence d'enzymes de saccharification. Les enzymes de saccharification utilisables pendant cette étape sont bien connues de l'homme du métier. Il s'agit typiquement de glucoamylase. D'autres enzymes peuvent en outre être utilisées au cours de cette étape.

Dans l'étape de saccharification-fermentation simultanées du procédé de fabrication d'éthanol selon l'invention, le moût de saccharification-fermentation est mis en présence de levures, éventuellement propagées par l'étape E) ci-dessus. Typiquement, l'étape de saccharification-fermentation simultanées selon l'invention présente les caractéristiques suivantes :

• La température est comprise entre 30°C et 35°C, de préférence de 32°C.

• Le pH peut être ajusté au début de l'étape de saccharification-fermentation simultanées avec un acide ou une base, par exemple de l'acide sulfurique ou de l'hydroxyde d'ammonium, de préférence entre 4,5 et 5,8, de préférence entre 5 et 5,5, de préférence à 5,3. De préférence il n'y a pas d'ajustement du pH pendant la suite de l'étape de saccharification-fermentation simultanées.

• L'ensemble peut être agité pendant toute la durée de l'étape de saccharification-fermentation simultanées, de préférence en continu.

• Un ajout d'azote peut être réalisé, sous forme minérale ou organique, par exemple d'urée, de manière à apporter à la levure une source d'azote complémentaire. Par exemple un apport d'urée de 1 g/l de moût liquéfié peut être effectué.

· La durée de fermentation peut être comprise entre 20 h et 80 h, de préférence entre 40 h et 60 h.

• De préférence, le biocatalyseur selon l'invention est présent au cours de l'étape de fermentation ou de saccharification-fermentation simultanées à une concentration de 0,01 à 5 kg de matière sèche initiale de substrat du biocatalyseur par tonne de matière première amylacée, de préférence entre

0,4 et 1 ,2 kg de matière sèche initiale de substrat du biocatalyseur par tonne de matière première amylacée.

Les levures utilisables pour la fabrication d'éthanol sont bien connues de l'homme du métier et peuvent être en particulier des levures du genre Saccharomyces. De préférence, les levures utilisées pour la fabrication d'éthanol ne sont pas des organismes génétiquement modifiés.

Typiquement, le milieu de fermentation ou de saccharification-fermentation simultanées est ensemencé avec environ 10 ⁶ à environ 5.10 ⁸ UFC (unités formant colonies) de levure par ml de milieu de saccharification-fermentation, de préférence environ 10 ⁷ UFC de levure par ml de milieu de fermentation ou de saccharification- fermentation simultanées. De préférence, les levures sont introduites dans le milieu de fermentation ou de saccharification-fermentation simultanées après avoir subi une étape de propagation E) telle que définie ci-dessus.

Le biocatalyseur selon l'invention peut être ajouté en partie au cours de l'étape de propagation E) définie ci-dessus et en partie au cours de l'étape de saccharification- fermentation simultanées F), de manière à garantir un apport total, lors de l'étape de saccharification-fermentation simultanées, de l'ordre de 0,01 à 5 kg de matière sèche initiale de substrat du biocatalyseur par tonne de matière première amylacée, de préférence entre 0,4 et 1 ,2 kg de matière sèche initiale de substrat du biocatalyseur par tonne de matière première amylacée.

La performance du procédé de fabrication d'éthanol est mesurée par la concentration d'éthanol dans le moût à la fin de l'étape de saccharification-fermentation simultanées, rapportée au taux de matière sèche de matière première amylacée.

Par "Gain Ethanol", on entend ici l'amélioration de la production d'éthanol, en particulier au terme d'une fermentation, de préférence d'une saccharification-fermentation simultanées, de préférence au terme de 51 h de fermentation, de préférence au terme de 51 h de saccharification-fermentation simultanées, conduite en présence d'un biocatalyseur obtenu avec la souche considérée, par rapport à la production d'éthanol dans les mêmes conditions en l'absence de biocatalyseur (témoin), typiquement déterminée par l'équation suivante :

Gain éthanol (%) = ([Ethanol] biocatalyseur - [Ethanol] témoin ) / [Ethanol] témoin

Les inventeurs ont montré que, de manière surprenante, l'utilisation du biocatalyseur selon l'invention permettait d'obtenir un rendement en éthanol plus élevé, une cinétique de production d'éthanol plus rapide, et une production de glycérol plus faible qu'en l'absence de biocatalyseur ou qu'en utilisant une composition enzymatique obtenue par fermentation en milieu solide avec une autre souche d'Aspergillus tubingensis présentant des activités enzymatiques différentes.

Mesure des activités enzymatiques

Activité xylanase

La mesure de l'activité xylanase peut typiquement être mise en œuvre sur xylane de bouleau lié à un chromophore, le Rémazol Brillant Blue R. L'hydrolyse de ce substrat par les activités xylanases libère en effet des oligomères liés au chromophore non précipitables après addition d'une solution d'éthanol dans le milieu réactionnel. La concentration en oligomères non précipitables est évaluée par une mesure de l'absorbance à 590 nm. Le milieu réactionnel préférablement utilisé dans cette méthode est composé de 130 μ\- d'une solution commerciale d'azo-xylane de Birchwood (MEGAZYME) à 10 g/L, 50 μ\- de solution enzymatique diluée dans du tampon acétate 0,4 M, pH 4,70. On effectue de préférence la réaction à 30°C pendant 20 minutes. La réaction est typiquement arrêtée par ajout de 500 μ\- d'éthanol à 96%. La densité optique du surnageant obtenu après centrifugation (10 minutes à 3000 tours/minute à 20°C) est lue à 590 nm.

Une unité d'activité xylanase (AXCn) peut alors être définie comme la quantité d'enzyme qui, diluée à raison de 1 unité/mL, à pH 4,70 et à 30°C, libère, à partir d'une solution de Rémazol Brillant Blue R xylane, des oligomères non précipitables dans l'éthanol tels que la densité optique du surnageant soit de 0,93 à 590 nm.

Activité protéase acide

La mesure de l'activité protéase acide peut typiquement être mise en œuvre sur caséine. La caséine peut ainsi être hydrolysée en fragments peptidiques solubles dans l'acide trichloracétique (TCA).

Une unité PAC est typiquement définie comme étant la quantité d'enzyme qui libère à 40°C et à pH 3,0 des peptides solubles en quantité telle que la densité optique à 275 nm de l'hydrolysat obtenu après précipitation au TCA est équivalente à celle d'une solution de tyrosine à 120 μg/mL.

Une technique de mesure appropriée de l'activité protéase acide est décrite ci- dessous.

Le milieu réactionnel préférablement utilisé dans cette méthode est composé de 500 μ\- d'une solution de caséine limpide et filtrée à 12 g/L (tampon lactate 0,06 M, pH = 3), 100 μ\- de solution enzymatique diluée dans du tampon lactate à 0,05 M, pH = 3. On effectue de préférence la réaction à 40°C pendant 120 minutes. La réaction est typiquement arrêtée par ajout de 300 μ\- d'une solution d'acide trichloracétique à 10 %. La densité optique du surnageant obtenu après centrifugation, pendant 15 minutes à 3000 tours/minute à 20°C, est lue à 275 nm.

Activité polygalacturonase

La mesure de l'activité polygalacturonase peut typiquement être mise en œuvre sur pectines. Les polygalacturonases hydrolysent en effet les chaînes de pectines de faible degré de méthylation et génèrent ainsi aux extrémités de la chaîne des groupements réducteurs sur les résidus d'acides galacturoniques constitutifs de la pectine. Ces groupements réducteurs peuvent être dosés avec le 2 cyano-acétamide. Le dosage est de préférence une cinétique en 40 minutes à 31 °C.

Une unité polygalacturonase (PG) est typiquement définie comme la quantité d'enzyme qui libère 1 μηιοΐβ de groupements réducteurs en 1 min à 31 °C et à pH = 4,7, à partir de polygalacturonate de sodium.

Une technique de mesure appropriée de l'activité polygalacturonase est décrite ci- dessous.

Le milieu réactionnel préférablement utilisé dans cette méthode est composé de 750 μ\- de tampon succinate à 0,1 M et pH = 4,7, 750 μ\- d'une solution aqueuse d'acide polygalacturonique d'orange commerciale (Sigma) à 6,5 g/L (ajustée à pH = 4,7 avec de la soude), 15 μ\- de solution enzymatique diluée dans du tampon succinate à pH = 4,7 supplémenté en sérum albumine bovine (0,1 g/L). On effectue de préférence une cinétique enzymatique à 31 °C en arrêtant la réaction à 10, 20, 30 et 40 minutes. Pour chaque temps, la réaction est typiquement arrêtée en ajoutant 70 μ\- du milieu réactionnel dans une solution d'arrêt composée de 140 μ\- de tampon borate (0,2 M, pH = 10) et de 70 μ\- d'une solution de 2 cyano-acétamide à 20 g/L. Une étape de révélation est réalisée par chauffage de l'échantillon pendant 12 minutes à 120 °C, puis en le refroidissant à - 20 °C pendant 10 minutes. La densité optique du surnageant est lue à 280 nm contre de l'eau. Une gamme d'étalonnage construite avec une gamme de concentration en acide monogalacturonique permet de convertir les densités optiques obtenues en moles de groupements réducteurs équivalents.

Activité bêta-glucosidase

La mesure de l'activité β-Glucosidase (β-Glu) peut typiquement être mise en œuvre sur cellobiose. L'enzyme agit en effet sur ce composé en libérant du glucose.

Une unité β-Glu est définie comme étant la quantité d'enzymes qui catalyse la libération d'une micromole de glucose par minute dans les conditions de l'essai (50°C, pH = 4,8).

Une technique de mesure appropriée de l'activité β-Glucosidase est décrite ci- dessous.

Le milieu réactionnel préférablement utilisé dans cette méthode est composé de 150 μ\- d'une solution de cellobiose à 5,13 g/L (tampon acétate à pH = 4,8), 150 μ\- de solution enzymatique diluée dans du tampon acétate 0,1 M à pH = 4,8. On effectue de préférence la réaction à 50°C pendant 30 minutes. La réaction est typiquement arrêtée en chauffant le milieu réactionnel à 100 °C pendant 10 minutes. Le milieu réactionnel est alors refroidi pendant 10 minutes dans l'eau froide. Après une centrifugation à 3000 rpm à 20 °C pendant 10 minutes, la concentration en glucose libérée dans le surnageant est alors dosée au moyen d'un kit enzymatique commercial de dosage du glucose.

Activité cellulase

La mesure de l'activité cellulase, en particulier endoglucanase, peut typiquement être mise en œuvre sur carboxyméthyl cellulose partiellement dépolymérisé et lié à un chromophore : le Rémazol Brilliant Blue R. L'hydrolyse du substrat libère en effet des oligomères de faible poids moléculaire liés au chromophore. Ceux-ci se retrouvent dans le surnageant après précipitation à l'éthanol et centrifugation. Une mesure de l'absorbance à 590 nm permet de déterminer l'activité cellulase.

Une unité cellulase sur carboxyméthyl cellulose (CMCell) peut être définie comme la quantité d'enzyme qui, diluée à raison de 1 U/ml et utilisée dans les conditions du dosage conduit à une libération d'oligomères non précipitables par la solution de précipitation, tels que la densité optique du surnageant soit de 1 .

Une technique de mesure appropriée de l'activité cellulase est décrite ci-dessous.

Le milieu réactionnel préférablement utilisé dans cette méthode est composé de 100 μ\- de solution commerciale d'azo-CM-cellulose (MEGAZYME), 100 μ\- de solution enzymatique diluée dans du tampon acétate 0,1 M, pH 4,60. On effectue de préférence la réaction à 41 °C pendant 10 minutes. La réaction est typiquement arrêtée par ajout de 500 μ\- de solution de précipitation (40 g d'acétate de sodium trihydraté et 4 g d'acétate de zinc dans 1 litre d'éthanol à 96%). La densité optique du surnageant obtenu après centrifugation (10 minutes à 3000 tours/minute à 20°C) est lue à 590 nm.

La présente invention sera illustrée plus en détail par les figures et exemples ci- dessous.

Brève description des figures

Figure 1 : Abondance relative de 7 enzymes sélectionnées parmi l'ensemble des enzymes identifiées dans le biocatalyseur de l'exemple 1 par analyse de protéomique. Figure 2: Suivi de la production de C0 ₂ en réacteurs au cours de la réaction de SSF d'un moût liquéfié de maïs industriel, en présence ou non du biocatalyseur selon l'invention, produit avec la souche SCC027 incorporé à 1 ,2 kg MSi/t de maïs, tel que décrit dans l'exemple 4.

Figure 3 : Effet des enzymes spécifiques du biocatalyseur selon l'invention, mises en œuvre seules ou en mélange, par rapport à l'effet global du biocatalyseur selon l'invention, produit avec la souche SCC027, sur le gain Ethanol obtenu au terme de 51 h de SSF. La valeur 100% correspond à un gain Ethanol de 1 ,5% calculé entre la condition Témoin et la condition biocatalyseur.

Exemples

Exemple 1 : Production et caractérisation du biocatalyseur selon l'invention

Cet exemple décrit un procédé de production du biocatalyseur selon l'invention obtenu par fermentation en milieu solide avec la souche d'Aspergillus tubingensis SCC027.

10 kg de matière sèche initiale de substrat constitué d'un mélange de tourteau de colza et de son de blé, dans un ratio 70/30 sont utilisés.

Le substrat est prétraité par humidification à 60% de matière sèche puis prétraité en autoclave à 105°C pendant 35 min.

Le substrat est ensuite inoculé avec 1 x 10 ⁷ spores viables d'Aspergillus tubingensis SCC027 / g de matière sèche initiale.

Le substrat présente une matière sèche initiale avant fermentation de 45%.

La fermentation en milieu solide est alors mise en œuvre pendant 51 h dans les conditions suivantes :

- Température: 33°C ± 0.5°C

- Matière sèche: 45% ± 2%

Ventilation 35 HZ en continu

- Agitation discontinue

Au terme de 51 h de fermentation, la culture est stoppée par ajout d'acide propionique, puis le milieu est séché à 45°C pendant 18 h, jusqu'à obtenir une teneur en matière sèche < 10%.

Le biocatalyseur est broyé finement à l'aide d'un broyeur centrifuge Retsch ZM300, monté avec une grille de 0,85 mm (18000 rpm). Il est stocké à l'abri de la lumière et au froid (- 20°C). Pour son utilisation en saccharification-fermentation simultanées de matière première amylacée (voir exemples 2 à 6), le biocatalyseur peut être ajouté soit directement au moût sous forme de poudre, soit extrait dans l'eau (1 /10 ou 1/20 p/v, agitation à température ambiante 10 à 15 min).

Pour les caractérisations enzymatiques, l'extrait aqueux du biocatalyseur est centrifugé (10 min, 3000 rpm, 20°C) afin de séparer les particules insolubles.

La détermination de la structure primaire des protéines, afin de les identifier, est réalisée par une analyse de protéomique selon la stratégie nommée «bottom-up» qui consiste à analyser les peptides constitutifs des protéines à identifier par spectrométrie de masse. Les protéines solubles ont subi, après une étape de réduction et d'alkylation, une digestion par la trypsine.

Les peptides ainsi obtenus, après purification sur microcolonne ZipTip C ₁₈ , sont séparés par chromatographie liquide en phase inverse type nanoLC. Les séparations chromatographiques sont réalisées sur une colonne C18 75 μηι de 50 cm avec une taille des particules de 5 μηι (colonne Acclaim PepMapl OO C18 de chez Thermoscientific). La nanoLC est une Ultimate 3000 Rapid Séparation LC Systems de chez Thermoscientific. Le gradient utilisé est un gradient binaire. La solution A est un mélange d'acétonitrile/acide formique 0,1 % (2/98, v/v). La solution B est un mélange d'acétonitrile/acide formique 0,1 % (90/10, v/v). Le débit est de 0,220 μΙ_Ληίη au niveau de la pompe nano et 15 μίΛηίη au niveau de la pompe de chargement. La colonne est thermostatée à 35°C.

Les peptides ainsi séparés sont séquencés par spectrométrie de masse haute résolution en tandem type LTQ-FT-ICR pour obtenir des informations précises sur la séquence en acides aminés. L'ionisation des peptides se fait par une source de type électrospray. Le voltage appliqué est de +1 ,70 kV. La méthode d'acquisition en spectrométrie de masse est une méthode dite data dépendant acquisition en top 7, avec exclusion dynamique, sauvegardé en mode LTQ centroid. La mesure des masses est réalisée avec une haute précision (de l'ordre du ppm) entre 470 et 2000 m/z.

Toutes les masses expérimentales sont comparées à des masses théoriques issues de banques de données protéiques où une digestion in silico a été réalisée. L'identification des protéines de l'échantillon se fait par comparaison des deux listes de masses. La quantification relative est réalisée en sommant l'intensité ou l'aire des 3 peptides majoritaires de la protéine identifiée. Le rapport de l'aire obtenue de chaque protéine sur la somme des aires de toutes les protéines identifiées permet d'estimer le niveau d'abondance de la protéine dans l'échantillon. Plus de 70 enzymes ont été identifiées par cette analyse.

Les différentes proportions de protéines identifiées par analyse de protéomique et sélectionnées pour l'invention sont représentées sur la Figure 1 .

Cette figure montre que l'enzyme principale du biocatalyseur ainsi obtenu est une aspergillopepsine A (33,1 %). Sont également présentes une endopolygalacturonase C (8,8%), une 1 ,4-3-D-glucane cellobiohydrolase (6,6%), une endo-1 ,4-3-xylanase A (3,6%), une endo-1 ,4-3-xylanase C (2,9%), une endoglucanase (2,5%) et une β- glucosidase (1 ,1 %).

Les inventeurs ont également déterminé le niveau des différentes activités enzymatiques du biocatalyseur obtenu par ce protocole de production. Ils ont comparé ces différentes activités avec celles obtenues en utilisant d'autres souches d'Aspergillus tubingensis (A tubingensis A et B) et un variant naturel selon l'invention de la souche SCC027 dans un protocole de production similaire. Les activités enzymatiques ont été déterminées en mettant en œuvre les méthodes décrites ci-dessus.

Le tableau 1 récapitule les différentes activités enzymatiques mesurées. Tableau 1 : Comparaison du profil enzymatique de biocatalyseurs obtenus avec la souche SCC027 et un variant naturel de SCC027 par rapport à d'autres souches d'A. tubingensis

TC: tourteau de colza

SB: son de blé

ND: non déterminé

Ces résultats montrent que le biocatalyseur obtenu grâce à la souche d'Aspergillus tubingensis SCC027 présente des activités enzymatiques différentes d'une composition obtenue avec d'autres souches d'Aspergillus tubingensis.

Exemple 2 : Utilisation du biocatalyseur selon l'invention dans la production d'éthanol à partir de farine de maïs, en fiole Cet exemple montre l'effet bénéfique du biocatalyseur selon l'invention sur la production d'éthanol à partir de farine de maïs, en particulier sur la quantité d'éthanol produite.

Matériel et méthodes

Description générale du procédé de production d'éthanol

Le procédé de production d'éthanol mis en œuvre comporte les étapes suivantes : la matière première, ici le maïs, est conditionnée, empâtée puis liquéfiée avant d'être soumise à une étape de saccharification-fermentation simultanées. En parallèle, la levure est réhydratée avant d'être incorporée dans le moût pour l'étape de saccharification- fermentation simultanées.

Conditionnement de la matière première maïs

Le maïs entier a été conditionné de manière à obtenir une mouture, autrement dit une farine. Pour cela, le maïs a été broyé à l'aide d'un broyeur à marteau (Electra). La taille de la grille utilisée a été fixée à 0,8 mm. La mouture obtenue présente un taux d'humidité de 10% (+/- 2%). Sous forme de farine, la matière première est stockée à l'abri de la lumière dans un endroit sec à température ambiante.

Production du moût liquéfié de maïs

L'étape de liquéfaction de la mouture de maïs permet d'hydrolyser l'amidon en dextrines. Le principe est de constituer un mélange de farine de maïs, d'eau et de vinasses claires de qualité industrielle et de le chauffer en présence d'enzymes de liquéfaction, de manière à obtenir un moût liquéfié. Ainsi, le moût se compose de 34% de farine de maïs, de 10% de vinasses claires et de 56% d'eau. Ce moût a été préparé en bioréacteur de 4L en verre à double enveloppe (Cloup), à température ambiante, sous agitation entre 250 et 350 rpm. Après homogénéisation le pH du moût a été ajusté à 5,5 (par ajout de H ₂ S0 ₄ ) afin d'optimiser l'action des enzymes de liquéfaction. L'alpha-amylase (Liquozyme SC DS, Novozymes) a été ajoutée à 0,15 kg/t de maïs. Le moût a été porté à 90°C et liquéfié à cette même température pendant 2h dans le réacteur agité entre 200 et 300 rpm. Au terme de la liquéfaction, le moût a été refroidi à température ambiante et ajusté à pH 5,3 (par ajout de H ₂ S0 ₄ ).

Production d'éthanol en fiole

L'étape de saccharification-fermentation simultanées (SSF) a été faite en fioles bafflées. Il s'agit de fioles à baffles de 250 ml, fermées par des bouchons en caoutchouc hermétiques, présentant une sortie de C0 ₂ par aiguille de 1 ,2 mm de diamètre. La SSF a consisté à mettre en présence :

• 140 g de moût liquéfié de maïs, à 30% de matière sèche, pH 5,3 ;

• la levure sèche active Ethanol Red (LEAF Technologies), incorporée à 0,25 mg/ml de moût liquéfié de maïs, après avoir été réhydratée 30 min à 32°C dans un bouillon Tryptone Sel, pour assurer un ensemencement initial de l'ordre de 1 .10 ⁷ UFC levures/ml de moût ;

• de l'urée à 1 g/l de moût liquéfié de maïs ;

• la glucoamylase (Spirizyme Excel XHS, Novozymes) à 0,42 kg/t de maïs, de manière à saccharifier le moût liquéfié de maïs.

Le moût de SSF ainsi constitué a été mis sous agitation à 120 rpm. La température a été maintenue constante tout au long de cette étape à 32°C. Aucun maintien de pH n'a été effectué. La fermentation a été conduite pendant une durée de 51 h.

Enfin, le biocatalyseur obtenu dans l'exemple 1 , produit à partir de la souche SCC027 ou d'un de ses variants, a été ajouté en début de SSF à différentes concentrations. Dans la condition dite « témoin », aucun ajout de biocatalyseur n'a été effectué.

Chaque condition a été appliquée dans deux fioles distinctes (n=2).

Résultats

En suivant l'évolution du poids de chacune des fioles, il est possible de déterminer la quantité de C0 ₂ produite au cours de la fermentation. Considérée dans l'équation stœchiométrique de la production d'éthanol à partir de glucose, la quantité de C0 ₂ produite permet d'estimer la production d'éthanol pour chacune des fermentations conduites en fiole.

1 mole glucose -> 2 moles de C0 ₂ + 2 moles d'éthanol

Ainsi, en comparant la production d'éthanol au terme de 51 h de la fermentation dite « témoin » par rapport à celle de fermentations conduites en présence de biocatalyseurs (« condition »), il est possible de calculer le gain éthanol:

Gain éthanol (%) = ([Ethanol] condition [Ethanol] témoin ) / [Ethanol] témoin

Tableau 2 : Gains éthanol obtenus en fioles au terme de 51 h de SSF d'un moût liquéfié de maïs, en présence de biocatalyseur SCC027 ou d'un biocatalyseur obtenu avec l'un de ses variants naturels (variant SCC027-2), à différentes doses d'incorporation.

Dose d'ajout du biocatalyseur Gain Ethanol 51 h

Souche

(kg MSi/T maïs) vs. Témoin

variant SCC027-2 0,03 0,4%

variant SCC027-2 0,1 0,7% variant SCC027-2 0,3 0,8% variant SCC027-2 0,45 1 ,2%

variant SCC027-2 0,6 1 ,4%

SCC027 1 ,2 1 ,5%

Comme le montre le tableau 2, la production d'éthanol au terme de 51 h de fermentation conduite en fiole est améliorée avec la mise en œuvre de biocatalyseurs obtenus avec la souche SCC027 ou ses variants. Le gain est variable selon la souche et selon la dose d'incorporation. Un gain en éthanol de 1 ,5% est obtenu avec la souche SCC027 à la dose d'incorporation de 1 ,2 kg MSi/t de maïs. Un variant de la souche SCC027 donne lieu à un gain éthanol similaire (1 ,4%) à la dose de 0,6 kg MSi/t de maïs, soit une dose deux fois moindre qu'avec la souche SCC027.

Exemple 3 : Avantage du biocatalyseur selon l'invention dans la production d'éthanol à partir de farine de maïs, en fiole, par rapport à l'utilisation d'une protéase commerciale

Cet exemple montre l'effet bénéfique et avantageux du biocatalyseur selon l'invention sur la production d'éthanol à partir de farine de maïs, en particulier sur la quantité d'éthanol produite, comparativement à la mise en œuvre d'une protéase.

Matériel et méthodes

Description générale du procédé de production d'éthanol

Le procédé de production d'éthanol mis en œuvre comporte les étapes suivantes : la matière première, ici du moût de maïs industriel, déjà liquéfié, est directement soumise à une étape de saccharification-fermentation simultanées. La levure est réhydratée avant d'être incorporée au moût pour l'étape de saccharification-fermentation simultanées. Production d'éthanol en fiole

L'étape de saccharification-fermentation simultanées (SSF) est faite en fioles bafflées. Il s'agit de fioles à baffles de 250 ml, fermées par des bouchons en caoutchouc hermétiques, présentant une sortie de C0 ₂ par aiguille de 1 ,2 mm de diamètre. La SSF a consisté à mettre en présence :

· 140 g de moût de maïs liquéfié industriellement, à 32% de matière sèche, pH 5,2;

• la levure sèche active Ethanol Red (LEAF Technologies), incorporée à 0,25 mg/ml de moût liquéfié de maïs, après avoir été réhydratée 30 min à 32°C dans un bouillon Tryptone Sel, pour assurer un ensemencement initial de l'ordre de 1 .10 ⁷ UFC levures/ml de moût ;

• de l'urée à 1 g/l de moût liquéfié de maïs ;

• la glucoamylase (Spirizyme Excel XHS, Novozymes) à 0,42 kg/t de maïs, de manière à saccharifier le moût liquéfié de maïs.

Le moût de SSF ainsi constitué a été mis sous agitation à 120 rpm. La température a été maintenue constante tout au long de cette étape à 32°C. Aucun maintien de pH n'a été effectué. La fermentation a été conduite pendant une durée de 52h. Enfin, le biocatalyseur obtenu dans l'exemple 1 , produit à partir de la souche SCC027, a été ajouté en début de fermentation à différentes concentrations. En comparaison, la protéase commerciale Lyvanol Acid® (Lyven -Soufflet Biotechnologies) a été ajoutée en début de fermentation, à différentes concentrations, de manière à garantir les mêmes apports en activité protéase (PAC) qu'avec le biocatalyseur produit avec la souche SCC027. Dans la condition dite « témoin », aucun ajout de biocatalyseur n'a été effectué. Chaque condition a été appliquée dans deux fioles distinctes (n=2).

Résultats

En suivant l'évolution du poids de chacune des fioles, il est possible de déterminer la quantité de C0 ₂ produite au cours de la fermentation. Considérée dans l'équation stœchiométrique de la production d'éthanol à partir de glucose, la quantité de C0 ₂ produite permet d'estimer la production d'éthanol pour chacune des fermentations conduites en fiole.

1 mole glucose -> 2 moles de C0 ₂ + 2 moles d'éthanol Ainsi, en comparant la production d'éthanol au terme de 52 h de la fermentation dite « témoin » par rapport à celle de fermentations conduites en présence de biocatalyseurs (« condition »), il est possible de calculer le gain éthanol:

Gain éthanol (%) = ([Ethanol] condition - [Ethanol] _témoin ) / [Ethanol] _témoi n Tableau 3 : Gains éthanol obtenus en fiole au terme de 52h de SSF d'un moût liquéfié de maïs industriel en présence du biocatalyseur selon l'invention produit avec la souche SCC027 ou de la protéase commerciale Lyvanol Acid® (Lyven - Soufflet Biotechnologies) à différentes doses d'incorporation.

Gains éthanol avec la Gains éthanol avec le

Dose d'incorporation

Protéase commerciale Biocatalyseur

(U PAC/kg maïs)

(Lyvanol Acid - Lyven) (SCC027)

10 0,1 % 0,7% 30 0,4% 1 ,2%

50 0,9% 1 ,8%

100 0,7% 1 ,6%

Cet exemple démontre l'avantage de la mise en œuvre du biocatalyseur comparativement à celle d'une protéase seule. Comme le montre le tableau 3, le potentiel de gain éthanol suit une courbe en cloche dans les deux cas. Il dépasse 1 ,5% avec l'utilisation du biocatalyseur selon l'invention tandis qu'il est maintenu sous le seuil de 1 % avec l'utilisation de la protéase, même à des doses élevées. Un gain éthanol de 0,7% est atteint avec le biocatalyseur selon l'invention pour un apport d'activité protéase de trois à cinq fois inférieur à l'apport nécessaire de protéase commerciale pour le même gain éthanol.

Exemple 4 : Utilisation du biocatalyseur selon l'invention dans la production d'éthanol à partir de farine de maïs, en fermenteur de laboratoire

Cet exemple montre l'effet bénéfique du biocatalyseur selon l'invention sur la production d'éthanol à partir de farine de maïs, en particulier sur la quantité finale d'éthanol produit et sur la vitesse de production d'éthanol.

Matériel et méthodes

Description générale du procédé de production d'éthanol

Le procédé de production d'éthanol mis en œuvre comporte les étapes suivantes : la matière première, ici du moût de maïs industriel, déjà liquéfié, est directement soumise à une étape de saccharification-fermentation simultanées. La levure est réhydratée avant d'être incorporée au moût pour l'étape de saccharification-fermentation simultanées. Production d'éthanol en fiole

L'étape de saccharification-fermentation simultanées (SSF) a été réalisée en fermenteurs, modèle Biostat A+ (Sartorius). Il s'agit de réacteurs d'une capacité de 2,5 I, équipés en sortie d'un condenseur et d'un compteur gaz, modèle Milli GasCounter MGC-10 (Ritter), pour le suivi en ligne de la production de C0 ₂ . La SSF a consisté à mettre en présence :

· 2220 g de moût de maïs liquéfié industriellement, à 32% de matière sèche, pH 5,3;

• la levure sèche active Ethanol Red (LEAF Technologies), incorporée à 0,25 g/l de moût liquéfié de maïs, après avoir été réhydratée 30 min à 32°C dans un bouillon Tryptone Sel, pour assurer un ensemencement initial de l'ordre de 1 .10 ⁷ UFC levures/ml de moût ; • de l'urée à1 g/l de moût liquéfié de maïs ;

• la glucoamylase (Spirizyme Excel XHS, Novozymes) à 0,42 kg/t de maïs, de manière à saccharifier le moût liquéfié de maïs.

Le moût de SSF ainsi constitué a été mis sous agitation à 350 rpm. La température a été maintenue constante tout au long de cette étape à 32°C. Aucun maintien de pH n'a été effectué. La fermentation a été conduite pendant une durée de 51 h.

Enfin, le biocatalyseur obtenu dans l'exemple 1 , produit à partir de la souche SCC027, a été ajouté en début de SSF à 1 ,2 kg MSi/t de maïs. Dans la condition dite « témoin », aucun ajout de biocatalyseur n'a été effectué.

Chaque condition a été appliquée dans deux bioréacteurs distincts (n=2).

A la fin de la réaction de SSF des prélèvements sont réalisés en double et analysés par HPLC-RI (HPLC modulaire Waters Isocratic e1515, colonne Ion Exclusion Wat010295) pour mesurer les concentrations d'éthanol, de glycérol et de sucres résiduels présents dans le milieu.

Résultats

La Figure 2 illustre l'effet significatif de la mise en œuvre du biocatalyseur selon l'invention sur la vitesse de production de l'éthanol. En effet, pour les deux fermenteurs dans lesquels le biocatalyseur selon l'invention a été ajouté en début de fermentation, la vitesse de production de C0 ₂ est augmentée de manière significative par rapport aux fermenteurs témoin. La vitesse maximale de production de C0 ₂ en présence du biocatalyseur selon l'invention est 7,7 l/h alors qu'elle est de 6 l/h dans la condition témoin. La vitesse maximale est mesurée après 12 h de SSF en condition d'ajout de biocatalyseur, et après 13 h en condition témoin.

Le plateau de la production de C0 ₂ est atteint après 45 h de SSF en condition d'ajout de biocatalyseur, tandis qu'il n'a toujours pas été atteint après 51 h de SSF en condition témoin.

Tableau 4 : Concentrations en éthanol et glycérol après 51 h de SSF d'un moût liquéfié de maïs, en présence ou en l'absence du biocatalyseur SCC027 selon l'invention incorporé à 1 ,2 kg MSi/t de maïs.

Bioréacteur 1 Bioréacteur 2 Différence

Moyenne Ecart-type

Plvtl Plvt2 Plvtl Plvt2 SCC027 vs témoin

Ethanol (g/1)

Témoin 124,9 | 125,8 126,5 127,4 126,2 1 ,08 SCC027 134,6 135,3 134,0 135,0 134,7 0,57 +6,8%

Glycérol (g/i)

Témoin 11 ,8 12,3 12,0 12,1 12,0 0,21

SCC027 9,8 10,3 9,8 10,2 10,0 0,26 -16,5%

Le tableau 4 ci-dessus confirme l'effet significatif de la mise en œuvre du biocatalyseur selon l'invention sur la production d'éthanol après 51 h de SSF. En effet, l'éthanol dosé dans les fermenteurs ayant contenu le biocatalyseur est plus élevé de 6 à 8% par rapport à l'éthanol dosé dans les fermenteurs témoin après 51 h de SSF, en précisant qu'à ce stade la réaction de SSF du témoin n'est pas terminée et n'a pas atteint son asymptote. De plus, la production de glycérol est significativement diminuée en présence de biocatalyseur par rapport au témoin. En effet, au terme de 51 h de fermentation, le glycérol dosé est plus faible de 16%. Le glycérol est un co-produit de l'éthanol. Une moindre production de glycérol indique une modification de l'utilisation du glucose par la levure et confirme l'augmentation du rendement de conversion du glucose en éthanol par la levure.

Exemple 5 : Utilisation du biocatalyseur selon l'invention dans la production d'éthanol à partir de farine de blé, en fiole

Cet exemple montre l'effet bénéfique du biocatalyseur selon l'invention sur la production d'éthanol à partir de matières premières amylacées autres que le maïs, en particulier de farine de blé, en particulier sur la quantité d'éthanol produite et sur la vitesse de production d'éthanol.

Matériel et méthodes

Description générale du procédé de production d'éthanol

Le procédé de production d'éthanol mis en œuvre comporte les étapes suivantes : la matière première, ici une mouture de blé industrielle, est liquéfiée avant d'être soumise à une étape de saccharification-fermentation simultanées. En parallèle, la levure est réhydratée avant d'être incorporée au moût liquéfié pour l'étape de saccharification- fermentation simultanées.

Production du moût liquéfié de blé

L'étape de liquéfaction de la mouture de blé permet d'hydrolyser l'amidon en dextrines. Le principe est de mélanger la farine de blé avec de l'eau et des vinasses claires, et chauffer le mélange en présence d'enzymes de liquéfaction, de manière à obtenir un moût liquéfié. Ainsi, le moût se compose de 28% de farine de blé, de 6% de vinasses claires et de 66% d'eau. Ce moût a été préparé en bioréacteur de 4 I en verre à double enveloppe (Cloup), à température ambiante, sous agitation à 250 rpm. Le pH du moût a été ajusté à 5,5 (par ajout de NaOH) afin d'optimiser l'action des enzymes de liquéfaction. Deux enzymes de liquéfaction ont été utilisées, à savoir l'alpha-amylase (Liquozyme SC DS, Novozymes) ajoutée à 0,15 kg/t de blé et le complexe hémicellulolytique déviscosant (Lyvanol Devisco Plus, Lyven-Soufflet Biotechnologies) ajouté à 0,15 kg/t de blé. Le moût a d'abord été préliquéfié à 55°C pendant 30 min en présence des enzymes puis liquéfié à 85°C pendant 1 ,5 h dans le réacteur maintenu sous agitation à 250 rpm. Au terme de la liquéfaction, le moût a été refroidi à température ambiante et ajusté à pH 4,5 (par ajout de H ₂ S0 ₄ ).

Production d'éthanol en fiole

L'étape de saccharification-fermentation simultanées (SSF) a été faite en fioles bafflées. Il s'agit de fioles à baffles de 250 ml, fermées par des bouchons en coton cardé. La SSF a consisté à mettre en présence :

· 140 g de moût liquéfié de blé, à 27,5% de matière sèche, pH 4,5 ;

• la levure sèche active Ethanol Red (LEAF Technologies), incorporée à 0,25 mg/ml de moût liquéfié de blé, après avoir été réhydratée 30 min à 32°C dans un bouillon Tryptone Sel, pour assurer un ensemencement initial de l'ordre de 1 .10 ⁷ UFC levures/ml de moût ;

· de l'urée à 1 g/l de moût liquéfié de blé ;

• la glucoamylase (Distillase CS, Genencor) à 0,29 kg/t de blé, de manière à saccharifier le moût liquéfié de blé.

Le moût ainsi constitué a été mis sous agitation à 105 rpm. La température a été maintenue constante tout au long de cette étape à 32°C. Aucun maintien de pH n'a été effectué. La SSF a été conduite pendant une durée de 48h.

Enfin, le biocatalyseur obtenu dans l'exemple 1 , produit à partir de la souche SCC027, a été ajouté en début de fermentation à 3 kg MSi/t de blé. Dans la condition dite « témoin », aucun ajout de biocatalyseur n'a été effectué.

Chaque condition a été appliquée dans deux fioles distinctes (n=2).

Résultats

Au cours de la réaction de SSF des prélèvements ont été réalisés et analysés par HPLC- Rl (HPLC modulaire Waters Isocratic E1515, colonne Ion Exclusion Wat010295) pour mesurer les concentrations d'éthanol, de glycérol et de sucres présents dans le milieu. Tableau 5 : Concentrations en éthanol et glucose après 24 h, 40 h et 48 h de SSF d'un moût liquéfié de blé, en présence ou en l'absence du biocatalyseur SCC027 incorporé à 3 kg MSi/t de blé.

Le tableau 5 démontre l'effet bénéfique de la mise en œuvre du biocatalyseur sur la production d'éthanol à partir de blé. En effet, la production d'éthanol au terme de 48h de fermentation est augmentée significativement de 3,8%. La vitesse de production d'éthanol est également augmentée avec des différences de concentration d'éthanol significatives à 24 et 40 h de SSF, respectivement de 31 % et 9%.

L'effet cinétique de la mise en œuvre du biocatalyseur en fermentation est également visible sur la vitesse de consommation du glucose par la levure. Après 40 h de SSF la concentration de glucose dans le milieu contenant le biocatalyseur est similaire à la concentration mesurée dans le milieu témoin après 48 h de SSF, indiquant une accélération de la fin de la réaction d'environ 8 h.

Exemple 6 : Comparaison de l'effet du biocatalyseur selon l'invention par rapport à des compositions enzymatiques obtenues avec d'autres souches d'Aspergillus

Cet exemple montre que l'effet bénéfique du biocatalyseur selon l'invention sur la production d'éthanol à partir de farine de maïs, en particulier sur la quantité d'éthanol produite, n'est pas observé avec d'autres compositions enzymatiques obtenues avec d'autres souches d'Aspergillus tubingensis que la souche SCC027 et ses variants.

Matériel et méthodes

Description générale du procédé de production d'éthanol

Le procédé de production d'éthanol mis en œuvre comporte les étapes suivantes : la matière première, ici le maïs, est conditionnée, empâtée puis liquéfiée avant d'être soumise à une étape de saccharification-fermentation simultanées. En parallèle, la levure est réhydratée avant d'être incorporée dans le moût pour l'étape de saccharification- fermentation simultanées.

Conditionnement de la matière première maïs

Le maïs entier a été conditionné de manière à obtenir une mouture, autrement dit une farine. Pour cela, le maïs a été broyé à l'aide d'un broyeur à marteau (Electra). La taille de la grille utilisée a été fixée à 0,8 mm. La mouture obtenue présente un taux d'humidité de 10% (+/- 2%). Sous forme de farine, la matière première est stockée à l'abri de la lumière dans un endroit sec à température ambiante.

Production du moût liquéfié de maïs

L'étape de liquéfaction de la mouture de maïs permet d'hydrolyser l'amidon en dextrines. Le principe est de constituer un mélange de farine de maïs, d'eau et de vinasses claires et de le chauffer en présence d'enzymes de liquéfaction, de manière à obtenir un moût liquéfié. Ainsi, le moût se compose de 34% de farine de maïs, de 10% de vinasses claires et de 56% d'eau. Ce moût a été préparé en bioréacteur de 4L en verre à double enveloppe (Cloup), à température ambiante, sous agitation entre 250 et 350 rpm. Après homogénéisation le pH du moût a été ajusté à 5,5 (par ajout de H ₂ S0 ₄ ) afin d'optimiser l'action des enzymes de liquéfaction. L'alpha-amylase (Liquozyme SC DS, Novozymes) a été ajoutée à 0,15 kg/t de maïs. Le moût a été porté à 90°C et liquéfié à cette même température pendant 2h dans le réacteur agité entre 200 et 300 rpm. Au terme de la liquéfaction, le moût a été refroidi à température ambiante et ajusté à pH 5,3 (par ajout de H ₂ S0 ₄ ). Production d'éthanol en fiole

L'étape de saccharification-fermentation simultanée (SSF) a été faite en fioles bafflées. Il s'agit de fioles à baffles de 250 ml, fermées par des bouchons en caoutchouc hermétiques, présentant une sortie de C0 ₂ par aiguille de 1 ,2 mm de diamètre. La SSF a consisté à mettre en présence :

· 140 g de moût liquéfié de maïs, à 30% de matière sèche, pH ajusté à 5,3 ;

• la levure sèche Ethanol Red (LEAF Technologies), incorporée à 0,25 mg/ml de moût liquéfié de maïs, après avoir été réhydratée 30 min à 32°C dans un bouillon Tryptone Sel, pour assurer un ensemencement initial de l'ordre de 1 .10 ⁷ UFC levures/ml de moût ;

· de l'urée à 1 g/l de moût liquéfié de maïs ; • la glucoamylase (Spirizyme Excel XHS, Novozymes) à 0,42 kg/t de maïs, de manière à saccharifier le moût liquéfié de maïs.

Le moût de SSF ainsi constitué a été mis sous agitation à 120 rpm. La température a été maintenue constante tout au long de cette étape à 32°C. Aucun maintien de pH n'a été effectué. La fermentation a été conduite pendant une durée de 51 h.

Enfin, le biocatalyseur obtenu dans l'exemple 1 , produit à partir de la souche SCC027, a été ajouté en début de SSF à différentes concentrations. En comparaison, d'autres biocatalyseurs produits à partir des souches Aspergillus tubingensis B ou Aspergillus tubingensis A ont été ajoutés en début de SSF, à différentes concentrations. Dans la condition dite « témoin », aucun ajout de biocatalyseur n'a été effectué.

Chaque condition a été appliquée dans deux fioles distinctes (n=2).

Résultats

En suivant l'évolution du poids de chacune des fioles, il est possible de déterminer la quantité de C0 ₂ produite au cours de la fermentation. Considérée dans l'équation stœchiométrique de la production d'éthanol à partir de glucose, la quantité de C0 ₂ produite permet d'estimer la production d'éthanol pour chacune des fermentations conduites en fiole.

1 mole glucose -> 2 moles de C0 ₂ + 2 moles d'éthanol

Ainsi, en comparant la production d'éthanol au terme de 51 h de la fermentation dite « témoin » par rapport à celle conduite en présence de biocatalyseur, il est possible de déterminer le gain éthanol.

Gain éthanol (%) = ([Ethanol] _con dition - [Ethanol] _tém oin) / [Ethanol] _tém oin

Tableau 6 : Gains éthanol obtenus en fiole au terme de 51 h de SSF d'un moût liquéfié de maïs, en présence du biocatalyseur selon l'invention obtenu avec la souche SCC027 ou d'autres biocatalyseurs obtenus avec des souches <ϋ Aspergillus tubingensis A ou B (celles analysées dans l'exemple 1 ), à différentes doses d'incorporation.

Souche Dose d'incorporation (g MSi/T maïs) Gain Ethanol 51 h (%)

SCC027 690 0,9

SCC027 1 150 U

SCC027 2300 1 ,5

A tubingensis souche B 690 -0,5

A tubingensis souche B 1 150 -1 ,5

A tubingensis souche B 2300 -2,4

A tubingensis souche A 4600 0,3 L'effet bénéfique de la mise en œuvre du biocatalyseur SCC027 sur la production d'éthanol n'est pas retrouvé avec la mise en œuvre de biocatalyseurs obtenus par fermentations d'autres souches d'Aspergillus tubingensis, comme le montre le tableau 6. Aux mêmes doses d'incorporation et à doses plus élevées que SCC027, aucun biocatalyseur produit avec les autres souches testées n'a permis d'obtenir des gains éthanol significatifs après 51 h de SSF.

Exemple 7 : Comparaison de l'effet du biocatalyseur selon l'invention par rapport à des enzymes purifiées à partir de la souche SCC027

Cet exemple montre que l'effet bénéfique du biocatalyseur selon l'invention sur la production d'éthanol à partir de farine de maïs, en particulier sur la quantité totale d'éthanol produite, résulte de la combinaison de nombreuses enzymes produites lors du procédé de fermentation en milieu solide de la souche.

Matériel et méthodes

Procédé de purification des enzymes du biocatalyseur SCC027

7 enzymes ont été purifiées à partir du biocatalyseur obtenu dans l'exemple 1 : l'aspergillopepsine A, la polygalacturonase C, l'endoxylanase A, l'endoglucanase, la β- glucosidase, l'endoxylanase C et la cellobiohydrolase (ces deux dernières ont été obtenues en mélange).

La purification de ces enzymes a été réalisée après extraction du biocatalyseur dans un tampon Histidine 0,02 M pH 6,0 (1 :10), centrifugation et filtration. Plusieurs techniques de séparation ont été combinées : la chromatographie d'échange d'anions, la chromatographie d'interactions hydrophobes, la chromatographie d'exclusion stérique et la précipitation au sulfate d'ammonium ont été utilisées au cours du procédé de purification.

La chromatographie d'échange d'anions est effectuée sur une colonne montée manuellement de 50 ml de gel Sephadex Q FF (GE Healthcare).

La chromatographie se fait sur un ÀKTA prime plus à 4°C. Le débit est de 10 ml/min. Le gradient utilisé est un gradient binaire. Le tampon A est une solution d'Histidine 0,02 M pH 6,0. Le tampon B est une solution d'Histidine 0,02 M pH 6,0 et de chlorure de sodium 1 ,0 M. Les fractions collectées sont de 6 ml.

La chromatographie d'interactions hydrophobes est réalisée sur une colonne Hiprep phényl HP 16/10 20 mL (GE Healthcare). La chromatographie se fait sur un ÀKTA prime plus à 20°C. Le débit est de 3 ml/min. Le gradient utilisé est un gradient binaire. Le tampon A est une solution d'Histidine 0,02 M pH 6,0 et de sulfate d'ammonium 1 ,0 M. Le tampon B est une solution d'Histidine 0,02 M pH 6,0. Les fractions collectées sont de 6 mL.

La chromatographie d'exclusion stérique est réalisée sur une colonne Hiload Superdex 75 pg de 16 mm de diamètre et de 600 mm de longueur de chez GE Healthcare (120 ml de gel). La chromatographie se fait sur un ÀKTA purifier à 20°C. La phase mobile est une solution d'acétate d'ammonium 0,1 M pH 5,0. Le débit est de 1 ml/min. Le volume d'échantillon injecté est de 2 ml. Les fractions collectées sont de 2 ml.

Le mélange protéique est fractionné par précipitation au sulfate d'ammonium en cascade à 40 %, 55 %, 65 % et 100 % de saturation en sel. L'ajout de sulfate d'ammonium se fait progressivement, sous forme de pluie. La précipitation est effectuée 30 min sous agitation dans la glace. Le mélange précipité est centrifugé à 5000 g pendant 15 min à 4°C. Le volume de surnageant est mesuré et un nouvel ajout de sulfate d'ammonium est effectué pour atteindre le deuxième palier de saturation en sel. Ce mélange est à nouveau précipité 30 min dans la glace sous agitation. Ces étapes sont répétées pour les différents paliers.

Description générale du procédé de production d'éthanol

Le procédé de production d'éthanol mis en œuvre comporte les étapes suivantes : la matière première, ici le maïs, est conditionnée, empâtée puis liquéfiée avant d'être soumise à une étape de saccharification-fermentation simultanées. En parallèle, la levure est réhydratée avant d'être incorporée dans le moût de saccharification-fermentation simultanées. Conditionnement de la matière première maïs

Le maïs entier a été conditionné de manière à obtenir une mouture, autrement dit une farine. Pour cela, le maïs a été broyé à l'aide d'un broyeur à marteau (Electra). La taille de la grille utilisée a été fixée à 0,8 mm. La mouture obtenue présente un taux d'humidité de 10% (+/- 2%). Sous forme de farine, la matière première est stockée à l'abri de la lumière dans un endroit sec à température ambiante.

Production du moût liquéfié de maïs

L'étape de liquéfaction de la mouture de maïs permet d'hydrolyser l'amidon en dextrines. Le principe est de constituer un mélange de farine de maïs, d'eau et de vinasses claires et de le chauffer en présence d'enzymes de liquéfaction, de manière à obtenir un moût liquéfié. Ainsi, le moût se compose de 34% de farine de maïs, de 10% de vinasses claires et de 56% d'eau. Ce moût a été préparé en bioréacteur de 4L en verre à double enveloppe (Cloup), à température ambiante, sous agitation entre 250 et 350 rpm. Après homogénéisation le pH du moût a été ajusté à 5,5 (par ajout de H ₂ S0 ₄ ) afin d'optimiser l'action des enzymes de liquéfaction. L'alpha-amylase (Liquozyme SC DS, Novozymes) a été ajoutée à 0,15 kg/t de maïs. Le moût a été porté à 90°C et liquéfié à cette même température pendant 2h dans le réacteur agité entre 200 et 300 rpm. Au terme de la liquéfaction, le moût a été refroidi à température ambiante et ajusté à pH 5,3 (par ajout de H ₂ S0 ₄ ). Production d'éthanol en fiole

L'étape de saccharification-fermentation simultanées (SSF) a été faite en fioles bafflées. Il s'agit de fioles à baffles de 250 ml, fermées par des bouchons en caoutchouc hermétiques, présentant une sortie de C0 ₂ par aiguille de 1 ,2 mm de diamètre. La SSF a consisté à mettre en présence :

· 140 g de moût liquéfié de maïs, à 30% de matière sèche, pH 5,3 ;

• la levure sèche Ethanol Red (LEAF Technologies), incorporée à 0,25 mg/ml de moût liquéfié de maïs, après avoir été réhydratée 30 min à 32°C dans un bouillon Tryptone Sel, pour assurer un ensemencement initial de l'ordre de 1 .10 ⁷ UFC levures/ml de moût ;

· de l'urée à 1 g/l de moût liquéfié de maïs ;

• la glucoamylase (Spirizyme Excel XHS, Novozymes) à 0,42 kg/t de maïs, de manière à saccharifier le moût liquéfié de maïs.

Le moût de SSF ainsi constitué a été mis sous agitation à 120 rpm. La température a été maintenue constante tout au long de cette étape à 32°C. Aucun maintien de pH n'a été effectué. La fermentation a été conduite pendant une durée de 51 h.

Enfin, le biocatalyseur obtenu dans l'exemple 1 , produit à partir de la souche SCC027, a été ajouté en début de SSF à 1 ,2 kg MSi/t de maïs. En comparaison, une ou des fractions d'enzymes purifiées de la souche SCC027 a ou ont été ajoutée(s) en début de SSF, de manière à garantir les mêmes niveaux d'apports en activité(s) enzymatique(s) qu'avec le biocatalyseur obtenu avec la souche SCC027. Dans la condition dite « témoin », aucun ajout de biocatalyseur n'a été effectué.

Résultats

En suivant l'évolution du poids de chacune des fioles, il est possible de déterminer la quantité de C0 ₂ produite au cours de la fermentation. Considérée dans l'équation stœchiométrique de la production d'éthanol à partir de glucose, la quantité de C0 ₂ produite permet d'estimer la production d'éthanol pour chacune des fermentations conduites en fiole.

1 mole glucose -> 2 moles de C0 ₂ + 2 moles d'éthanol Ainsi, en comparant la production d'éthanol au terme des 51 h de la fermentation dite « témoin » par rapport à celle conduite en présence de biocatalyseur, il est possible de déterminer le gain éthanol.

Gain éthanol (%) = ([Ethanol] _con dition - [Ethanol] _témoi n) / [Ethanol] _témoi n Comme le montre la Figure 3, les inventeurs ont ainsi déterminé qu'avec un mélange d'aspergillopepsine A, d'endoglucanase et de β-glucosidase A, il était possible d'augmenter la production d'éthanol de 1 ,2% soit 80% du gain éthanol obtenu avec le biocatalyseur brut. Il est à noter qu'un mélange d'aspergillopepsine A et de β- glucosidase A permet d'atteindre 70% du gain éthanol obtenu avec le biocatalyseur, ce qui représente la meilleure combinaison de 2 enzymes parmi les enzymes testées produites par la souche SCC027, alors que cette combinaison ne correspond pas à la combinaison des deux enzymes majoritairement produites par cette souche.

Le mélange de 7 enzymes parmi les 70 enzymes identifiées du biocatalyseur (aspergillopepsine A, polygalacturonase C, endoxylanase A, endoglucanase, β- glucosidase A, endoxylanase C et cellobiohydrolase), permet d'augmenter la production d'éthanol à 51 h SSF de manière à atteindre près de 90% du gain en éthanol obtenu avec le biocatalyseur brut.

L'effet optimal mesuré avec le biocatalyseur obtenu selon le procédé de l'invention avec la souche SCC027 est dû à la combinaison des multiples enzymes produites, dont les 7 enzymes purifiées à partir du biocatalyseur selon l'invention.