CAMPO TÉCNICO

La presente Invención pertenece al campo de las formulaciones dermatológicas de uso clínico en mamíferos.

Particularmente la presente invención provee una composición o formulación biocida de amplio espectro para proteger la piel, previniendo o tratando infecciones en la piel, con una combinación de sales de cobre pentahidratado y de sales de zinc heptahidratado como compuestos activos biocidas.

En una realización preferida la formulación comprende plastificantes y emolientes para mejorar la adherencia a la piel.

En otra realización preferente de la invención, se provee una formulación útil en la industria de producción de leche por su uso en la prevención y/o el tratamiento de la mastitis en animales de ordeña.

ANTECEDENTES PREVIOS

La mastitis bovina es una enfermedad inflamatoria de la glándula mamaria y representa uno de los principales problemas económicos y productivos que enfrenta la industria lechera mundial. Los altos costos asociados con esta enfermedad se derivan de su impacto en la salud y bienestar animal y en la rentabilidad de las ventas debido al impacto en la producción y la calidad de la leche.

Las pérdidas anuales incluyen el costo de los tratamientos antibióticos, la atención veterinaria, la eliminación y pérdidas de producción de leche.

La mastitis bovina enfermedad comienza con la invasión y colonización de microorganismos a través del orificio del conducto del pezón que provocan la inflamación de la glándula mamaria y deriva en cambios físicos y químicos en la leche.

i Las bacterias son los principales microorganismos involucrado, especialmente S. aureus, E. coli, y Streptococcus uberis entre otros.

Las infecciones intramamarias causan dos estados de mastitis bovina: clínica y subclínica. La manifestación clínica se caracteriza por alteraciones físicas de la glándula y/o de la leche, que manifiesta cambios organolépticos (formación de coágulos y color amarillo). En la mastitis subclínica, los síntomas visuales están ausentes, pero las muestras de leche presentan un recuento de células somáticas elevada (SCC), así, la mastitis bovina subclínica se define de acuerdo con Sch.ukken, cuando el conteo de células somáticas es superior a 200.000 células por mililitro reduciendo el valor comercial de la leche.

Las técnicas clásicas de control de mastitis, incluyen diferentes estrategias, tales como el tratamiento de las vaca tras la suspensión del período de lactancia, las técnicas de ordeña, la desinfección de los pezones con sustancias antisépticas tópicas (pre- inmersión y de inmersión), y el tratamiento antibiótico de mastitis clínica.

Se sabe que la piel del pezón de las vacas está expuesta permanentemente a contaminaciones ambientales, en primer lugar por el sistema de manejo de las vacas de producción de leche, esto es vacas que pastan y duermen en los mismos potreros donde ellas mismas contaminan a través de orines y deposiciones.

Otra forma de contaminación es en el mismo lugar donde se ordeñan (salas de ordeño), aquí existe una gran presión de contaminación a través del equipo de ordeña, en especial las pezoneras que están en contacto directo con la piel de los pezones, las toallas que se utilizan para preparar las vacas antes de iniciar el ordeño, es decir secan los pezones antes de colocar las unidades de ordeño, y las mismas manos de los ordeñadores, todos estos elementos son vectores importantes de contaminación cruzada entre los distintos animales. Por tal razón, es necesario proteger los pezones después de terminado el proceso de ordeño, que dura aproximadamente 5 a 6 minutos, aplicando un producto desinfectante. En el estado del arte existen muchos productos desinfectantes especialmente formulados para los pezones o ubres y se conocen como por su nombre en inglés "teat dipping", muchos de ellos son a base de compuestos de yodo, es decir usan un desinfectante yodado en soluciones que van desde 7.000 a 10.000 ppm de yodo. Aun teniendo esta solución yodada como desinfectante, las vacas se contaminan e infectan hecho que ocurre justo después de la ordeña, cuando el esfínter del pezón aún sigue abierto por efecto de la succión que le provocó la pezonera para extraer la leche y la mastitis bovina sigue siendo un problema en todo el mundo a nivel de la industria lechera.

Este espacio que se forma en el conducto del pezón hace que la contaminación sea muy común más aún si el producto desinfectante utilizado pierde efectividad por que se inactiva en presencia de materia orgánica, como ocurre en el caso de los compuestos yodados. Se hace necesario entonces mejorar la calidad de la solución desinfectante utilizada para proteger el pezón de infecciones, la solución debe tener un alto poder biocida para eliminar todas las bacterias o microorganismos presentes en la piel del pezón, no inactivarse en presencia de materia orgánica y persistir activa sobre la piel del pezón hasta la ordeña siguiente. La efectividad debe estar dada por la adherencia a la piel y por la actividad del compuesto activo. Una mala adherencia puede provocar que el producto escurra de la piel, perdiendo toda efectividad, en este caso por un defecto mecánico.

La presente invención se enmarca en la búsqueda de una solución a este problema técnico específico.

ESTADO DEL ARTE

Como fue indicado, en el mercado existen muchos productos para recubrimiento de pezones a base de yodo y a base de clorhexidina. Sin embargo estos productos presentan muchas limitaciones que hacen necesario buscar nuevas alternativas para resolver este problema técnico. Por ejemplo los productos a base de yodo son irritantes y resecan la piel, por lo que su uso continuo puede redundar en heridas y sangramiento del pezón, aún sin infección. Por otra parte, tanto los compuestos de yodo como la clorhexidina se inactivan en presencia de materia orgánica, perdiendo su efectividad biocida.

Los inventores han estudiado este problema técnico desde hace mucho, lo que los llevo a desarrollar un primer producto biocida para proteger la piel en base a sales de cobre, el que se encuentra protegido en la solicitud CL 1774 - 2012. Este producto tiene la ventaja de que no se inactiva en presencia de materia orgánica y que no irrita la piel, no obstante el poder bloclda no es tan elevado, habiendo Infecciones refractarias al tratamiento con este producto.

En el estado del arte también encontramos una composición para tratar afecciones de la piel basada en óxido de cobre y oxido de zinc, la que esta descrita en la solicitud CL 3434-2012. Los óxidos utilizados en esa composición son insolubles en agua, por lo que no puede anticiparse que las propiedades de compuestos insolubles en agua empleados como una dispersión de partículas anticipen el resultado obtenido por sales hidrosolubles de los mismos elementos. Para la aplicación sobre los pezones de los animales es indispensable que la formulación sea liquida, para que el pezón pueda sumergirse en ella, y luego dicha formulación se seque formando una película de recubrimiento. Para lograr esto es indispensable que los compuestos activos sean hidrosolubles, lo que no sucede con la formulación descrita en el CL 3434— 2012, donde el producto obtenido es una crema, no una formulación liquida.

El documento U5200405801 1 (PETERSSON LENNART G) 25 marzo 2004, se refiere a una formulación para el tratamiento de pezones entre ordeñas que contiene clorhexidina combinada con compuestos insolubles de zinc, ver párrafo 1 1 "El zinc está presente en la forma de material que contiene zinc, particulado, finamente dividido, seleccionado del grupo que consiste en estearato de zinc, cloruro de zinc, nitrato de zinc, oleato de zinc, óxido de zinc, fosfato de zinc, peróxido de zinc, yoduro de zinc, zinc elemental y mezclas de los mismos."

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1 . Distribución de las especies bacterianas aisladas de muestras de leche. Se muestran 53 y 43 aislamientos identificados de mastitis clínica y subclínica, respectivamente de la Región Central. En la Región Sur se identificaron 174 y 93 aislamientos de mastitis clínica y subclínica, respectivamente. Otros incluyen microorganismo aislado con frecuencia < 2%.

Figura 2. Frecuencia de valores de MIC de la composición de acuerdo a la presente invención para los microorganismos aislados a partir de muestras de leche con : A) mastitis subclínica bovina (N = 227) y B) mastitis clínica (N = 136). Cada determinación se hizo por triplicado. Figura 3. Frecuencia MIC de la composición de acuerdo a la presente invención para los aislamientos más frecuentes identificadas en la mastitis clínica bovina. La subdivisión de las barras representa la distribución de frecuencias de los valores de MIC (desde 0,025 hasta 0,5 mg/L) para los diferentes aislamientos de mastitis bovina.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCION.

La invención se refiere a una formulación biocida útil para proteger la piel de infecciones bacterianas, virales o fúngicas, la que comprende una combinación de dos compuestos activos biocidas, sales de cobre pentahidratado y sales de zinc heptahidratado.

El efecto antibacteriano de cobre aparece como una alternativa favorable para prevenir la mastitis, entre otras enfermedades de la piel, que se potencia por el uso conjunto de zinc.

De modo de mejorar el poder biocida, y mantener las propiedades de no inactivarse con la materia orgánica y de no irritar la piel, los inventores desarrollaron la composición de la invención que comprende de 0,01 a 10 % de sales de cobre pentahidratado, y de 0,01 a 10 % de sales de zinc heptahidratado. La nueva composición, como se ve en el ejemplo 3 de esta memoria logra resultados inesperados al controlar totalmente las infecciones bacterianas y eliminar todas las bacterias presentes en las ubres de modo que no se encuentran bacterias en la leche ordeñada.

De acuerdo con lo anteriormente expuesto se demuestra que la invención no ha sido anticipada en el estado del arte previo.

Por otra parte, sin duda la aplicación preferida de la invención es sobre los pezones de animales de ordeña para prevenir o tratar infecciones de la piel. No obstante, como se demuestra, la formulación de la invención tiene importante propiedades biocidas, por lo que es útil para prevenir o tratar infecciones de todo tipo de piel de cualquier animal, incluso el ser humano. Dada las características blocldas de los compuestos activos, la formulación de la invención es útil para prevenir o tratar cualquier tipo de infección de la piel, ya sea bacteriana, viral o fúngica.

Los inventores han descubierto que la combinación de estas sales hidrosolubles de cobre y zinc permiten controlar infecciones de patógenos persistentes en infecciones a la piel.

En una realización preferida la formulación de la invención se utiliza como baño para ubres de animales de ordeña, Ínter ordeñas, siendo efectiva en el tratamiento y prevención de infecciones de la ubre.

Sin perjuicio de esta realización preferida, la formulación de la invención puede aplicarse en cualquier piel que desee ser protegida de una infección, ya sea bacteriana, fúngica o viral. La formulación de la invención se puede aplicar para prevenir o tratar cualquier infección en la piel.

Preferentemente las sales de cobre pentahidratado corresponden a sulfato de cobre pentahidratado y las sales de zinc heptahidratado corresponden a sulfato de zinc heptahidratado.

Dada las altas propiedades biocidas de la combinación de compuestos de la invención, es posible obtener formulaciones biocidas efectivas con muy bajas concentraciones de ambos compuestos, sales de cobre pentahidratado y sales de zinc heptahidratado.

Preferentemente la formulación de la invención tiene entre 0,01 a 2 % de sales de cobre pentahidratado y entre 0,01 a 2 % de sales de zinc heptahidratado. Sin perjuicio de lo anterior, es posible obtener formulaciones más concentradas de ambas sales, ya sea para facilitar el transporte de la formulación o para aplicaciones puntuales en infecciones refractarias, donde estas formulaciones concentradas también están dentro del alcance de esta invención. Las formulaciones concentradas podrían contener entre 2 a 10 % de cada uno de los componentes, o más, por lo que el alcance de la invención es entre 0,01 a 10 % de sales de cobre pentahidratado y entre 0,01 a 10 % de sales de zinc heptahidratado. En una realización preferida la formulación de la invención lista para ser aplicada sobre la piel comprende entre las sales 0,05 a 1 % de sales de cobre pentahidratado y de 0,05 a 1 % de sales de zinc heptahidratado. Y en una realización especialmente preferida la formulación de la invención lista para ser aplicada sobre la piel comprende entre las sales 0,2 a 0,4 % de sales de cobre pentahidratado y de 0,05 a 0,3% de sales de zinc heptahidratado.

La formulación de la invención es de naturaleza acuosa, dada la condición hidrosoluble de los compuestos activos. De este modo el solvente de la formulación es preferentemente agua, pero también puede utilizarse cualquier solvente hidrofílico compatible con la piel.

La formulación de la invención comprende adicionalmente excipientes de formulación, los que se escogen entre modificadores de la viscosidad, humectantes, emolientes, plastificantes y colorantes. Estos excipientes se escogerán entre los que estén disponibles en la técnica al momento de realizar la invención, sin perjuicio de lo anterior, a continuación indicamos los excipientes preferidos.

Como modificador de la viscosidad o espesante se prefiere Goma Xantana, la que representa entre un 0,2 3 2% de la composición. Como emolientes y humectantes se escogen entre glicerina, sorbitol, propilen glicol, polietilén glicol, aloe vera, lanolina y sus mezclas. Donde los emolientes y humectantes representan entre un 5 a 30% de la composición. Especialmente la composición contiene glicerina la que representa entre un 5 a 12% de la composición. Y adicionalmente de modo preferido la composición comprende sorbitol el que representa entre un 3 a un 10% de la composición.

Si la formulación se realiza como una composición para el tratamiento de las ubres entre ordeñas, es importante que la composición contenga un plastificante que permita que la composición quede adherida a la piel del pezón. Es particularmente preferida el alcohol polivinílico como plastificante el que representa entre un 3 a 10% de la composición, más preferentemente entre un 5 y un 8% de la composición.

El colorante tiene por objeto sólo la identificación visual de la aplicación de la composición. El colorante representa entre un 0,01 a 0,5 % de la composición. Cualquier colorante compatible con la piel es adecuado, no obstante, en una realización preferida se prefiere colorante de nivel aceptable como aditivo alimentario, como es el colorante rojo allura. La formulación de la Invención sirve para preparar un medicamento útil para prevenir o tratar infecciones en la piel. El tratamiento o prevención de la infección se realiza por la aplicación directa del medicamento que contienen la formulación de la invención sobre la zona de piel que se desea proteger, repetidamente con intervalos de horas o días, durante el tiempo que se desee proteger la piel y/o hasta que la infección haya desaparecido.

En una realización, la formulación de la invención se utiliza para recubrir la piel del pezón de un animal de ordeña, entre ordeñas. Donde, después de haber ordeñado al animal, el pezón se sumerge en la formulación de la invención y se permite que la formulación se seque formando una película protectora sobre dicho pezón. En este caso la formulación comprende alcohol polivinílico u otro plastificante que, que forma una capa polimérica sobre la piel, otorgándole una mayor protección y permanencia de los compuestos activos biocidas sobre la piel. También es importante la viscosidad de la formulación, ya que si es muy líquida escurre antes de la formación de la capa polimérica y no se adhiere correctamente, por lo cual, cuando la formulación se utiliza para el tratamiento del pezón de animales de ordeña, se espesa con goma Xantana u otro modificador de la viscosidad. Al usar las realizaciones preferidas de la invención, la formación de la película sobre piel del pezón demora un tiempo de 1 a 2 minutos para sellarla por completo, sellado que permanece por más de 12 horas, que es tiempo habitual entre ordeñas. Antes de la nueva ordeña el operador lava la composición desde el pezón, de modo que la composición no pase a la leche. De este modo, se previenen o tratan las mastitis en las ubres de los animales de ordeña.

Sorprendentemente, se ha encontrado que la formulación de la invención permite tratar infecciones normalmente persistentes en las ubres, tales como las causadas por Staphilococcus aureus, Streptococcus uberis, Nocardia sp. de alta prevalencia y difícil control. Por supuesto, la formulación de la invención también es útil en la prevención y el tratamiento de infecciones causadas por todos los otros patógenos existentes, tales como Streptococcus agalactiae, Streptococcus bovis, Streptococcus dysagalactiae, Streptococcus spp., Staphilococcus coagulasa negativo, Escherichia coli, u otros.

De acuerdo a los ensayos de susceptibilidad realizados, una concentración tan baja como 0,5 mg/L de la composición o formulación de acuerdo a la presente invención es capaz de inhibir el crecimiento de diferentes especies bacterianas, incluyendo las aisladas de mastitis clínica y subclínica. Este último caso la formulación mostró frecuencias más altas incluso para cepas resistentes a los antibióticos incluyendo neomicina, gentamicina y cefotaxima.

A continuación se incluyen ejemplos de carácter ilustrativo de algunas de las realizaciones preferidas de la invención

EJEMPLOS

Ejemplo 1 : Preparación de una formulación de acuerdo a la invención.

Para preparar una de las formulaciones de la invención se trabajó en un reactor de acero inoxidable de grado alimenticio con agitación constante a 1 ,5 rpm en baño termo regulado a una temperatura entre 50 a 60 °C. En este caso se trabajó a 60°C. Todas las concentraciones están expresadas como porcentajes peso volumen respecto de la solución o formulación obtenida.

El proceso se realiza en dos fases. En la primera etapa se inicia el proceso con 100 litros de agua desmineralizada a 60 , como ya fue indicado. Lentamente se agrega sobre el agua sal de sulfato de cobre pentahidratado al 0,35 %, sulfato de zinc heptahidratado al 0,15%, el colorante allura al 0,03% y goma Xantana al 0,4%, cuidando que no forme grumos. Esta mezcla se mantiene en agitación a 1 ,5 rpm por 30 minutos.

En la segunda fase se mantiene la temperatura a 60°C y la agitación a 1 ,5 rpm, primeramente se incorpora sobre la mezcla anterior alcohol polivinílico al 6% también de manera lenta para no formar grumos, luego se incorpora glicerina usp al 8%; por último se adiciona sorbitol al 5%. Una vez mezclados todos los componentes la formulación se homogeniza manteniéndola a la misma temperatura y agitación rpm por 2,5 horas. Con esto se da estabilidad a la formulación, la formulación así obtenida está lista para ser envasada.

La composición de la formulación de la invención obtenida en este ejemplo se resume en la Tabla 1 , a continuación. Tabla 1 : Ejemplo de composición de la formulación de acuerdo a la presente invención

Ejemplo 2: Sinergismo entre los componentes de la composición de la invención.

De modo de demostrar una de las ventajas de la composición de la invención, se realizó una prueba de inhibición del crecimiento bacteriano en placas, o antibiograma, para las bacterias más comunes en infecciones de la piel de la ubre de animales de ordeña. Para esto se sembraron en placas de agar con medio de cultivo PCA, medio no selectivo, colonias de Staphilococcus aureus, Streptococcus uberis, Nocardia Sp., por separado, de modo de tener crecimiento de la bacteria sobre toda superficie de la placa de Petri. Se sembraron 3 placas para cada bacteria. Posteriormente en el centro de cada placa se puso un circulo de papel impregnado con la composición biocida a analizar. A continuación, todas las placas se incubaron a 37°C por 24 horas. Y se midió el halo de inhibición en cada caso, los resultados se muestran en la Tabla 2.

Tabla 2: Halo de inhibición para cada componente de activo biocida

Como se aprecia en los resultados claramente la composición de la invención muestra una ventaja sobre las composiciones alternativas evaluadas, siendo la mezcla de Cobre y Zinc superior al uso sólo de cobre e inmensamente superior al compuesto biocida más utilizado actualmente, cual es el yodo.

Ejemplo 3: Prueba de campo.

La formulación de la invención obtenida en el ejemplo 1 se aplico como protector de ubres entre ordeñas a un grupo de 100 vacas, las que anteriormente habían recibido 2 tratamientos distintos. El rebaño llevaba años siendo tratado con un compuesto comercial a base de yodo, lo que se considera como condición inicial, ya que a pesar del tratamiento había una alta presencia de bacterias en la leche y un alto grado de infecciones en las ubres. Posteriormente, el rebaño se trato con una formulación de propiedad de los inventores, protegida en la patente CL 1774-2012, la que contiene solamente sulfato de cobre pentahidratado como compuesto activo, cuya formulación se resume en la Tabla 3.

Tabla 3: Ejemplo de composición de la formulación

El rebaño fue tratado por alrededor de un mes con la composición de la Tabla 3 y se observó una reducción importante de patógenos y células somáticas en el estanque de leche ordeñada. No obstante, los inventores observaron que algunas infecciones fueron refractarias al tratamiento, ya que persistían después de 1 mes (31 días) de aplicación diaria. Por esta razón se desarrolló la nueva composición de la invención la que fue aplicada durante 25 días al mismo rebaño, como protector de ubres entre ordeñas.

Después de los 25 días de tratamiento se analizó la leche del estanque del rebaño y prácticamente no habían patógenos detectables. Asimismo las ubres de las vacas se observaban sanas. Los resultados de estos tratamientos se ven en la Tabla 4 a continuación. Tabla 4: Análisis bacteriológico para cada tipo de tratamiento.

Como puede apreciarse, la composición de la invención eliminó las infecciones bacterianas y los patógenos ambientales de la leche ordeñada, y en consecuencia, también disminuyeron notablemente las células somáticas en la misma. Es notable destacar que al tiempo 0, la condición inicial, no se trataba de rebaño sin tratamiento alguno sino que, como ya fue indicado, se estaba aplicando una composición de recubrimiento de ubres comercial en base a yodo, con la que— como se ve en los análisis— habían muchas infecciones y patógenos en las ubres que eran traspasados a la leche. El primer tratamiento, con la composición a base de cobre, por 31 días, logró disminuir en un 41 ,8% las bacterias totales en la leche, lo que si bien es muy bueno, no es suficiente, mientras que la composición de la invención en base a cobre y zinc disminuye las bacterias totales bajo el límite de detección.

Ejemplo 4: Determinación de la prevalencia de las cepas bacterianas

Se analizó un total de 386 muestras de leche de bovinos con mastitis de dos regiones geográficas de Chile. Se aisló un total de 363 cepas, con diferente prevalencia según el origen de las muestras y la clasificación de la severidad de la mastitis bovina (subclínica o clínica). Por el contrario S. aureus (30%) fue el más frecuente en el sur, donde la producción es a base de pastos.

Los animales analizados son sometidos a desinfección previa utilizando yodo como sellador antes del ordeño. Las muestras para el aislamiento e identificación de la microbiota bacteriana se centrifugaron a 3.000 rpm durante 5 minutos y sembradas en placas con medio selectivo y de enriquecimiento como agar McConkey y agar de sangre de oveja 5% bajo atmósfera aeróbica y anaeróbica, para apoyar el buen crecimiento de la mayoría de anaerobios facultativos, aerobios y bacterias microaerofílicas. Después de incubar, las colonias sospechosas fueron re-cultivadas en medios selectivos después de la tinción de Gram. De acuerdo con estos resultados las bacterias se sometieron a análisis bioquímico como API 20 C AUX (Biomerieux), API 20E (Biomerieux), API Coryne (Biomerieux) y Crystal Bundesliga (BBL) para confirmar el diagnóstico microbiológico inicial. Todos los mircoorganismos aislados identificados se almacenaron a -80 ^S C hasta su uso posterior.

Las muestras de leche de la región sur con signos de mastitis clínica fueron 27% del total, en contraste con la región central donde las muestras de mastitis clínica alcanzaron 56% de las muestras recibidas.

Según el análisis microbiológico, 101 (26%) presentaron cultivos negativos y de las muestras restantes, se aisló un total de 363 microorganismos (Tabla 5). Se identificó una alta diversidad de microorganismos, principalmente en bovinos con mastitis subclínica (Figura 1 ). Tabla 5. Número de muestras de leche y microorganismos aislados

Región Central Región Sur

Muestras de leche

Mastitis Clínica 63 75

Mastitis Subclínica

49

Microorganismos aislados

Mastitis Clínica 43 93

Mastitis Subclínica 53 174

En los animales de la región central, del sistema nervioso central y S. uberis fueron los agentes más prevalentes detectados en las muestras de mastitis subclínica en 15 (28%) y 9 (17%), respectivamente. En los animales con mastitis clínica E. coli (13, 31 %) fue el agente más frecuente detectado y CNS en la segunda frecuencia. S. dysgalactiaewas identificado solamente en las muestras de mastitis clínica en esta región.

Para las muestras tomadas en la región sur, S. aureus, CNS y S. uberis fueron las bacterias prevalentes, tanto de la mastitis clínica y subclínica (Figura 1 ).

Cuando se comparó la microbiota bacteriana aislada de mastitis clínica en ambas regiones geográficas, los resultados demostraron que E. coli fue identificado sólo en la región central, mientras que S. aureus en la región sur solamente. La frecuencia de aislamiento de S. uberis fue mayor en la región sur en comparación con la región central (23% frente a 5%, respectivamente). Adicionalmente, aislamientos de Corynebacterium spp. fueron identificados en muestras de mastitis subclínica y clínica con frecuencias similares en las dos regiones.

En la región central, E. coli fue la bacteria prevalente (31 % en la mastitis clínica); lo que probablemente está relacionado con el sistema de confinamiento del ganado de la región. Ejemplo 5: Determinación de la concentración mínima inhibitoria para la composición de la presente invención

Tras incubar las 386 muestras de leche de bovinos con mastitis en medios selectivos e identificar las colonias por análisis bioquímico, todos los aislamientos fueron evaluados de acuerdo a la susceptibilidad de la composición de acuerdo a la presente invención por determinación de la concentración inhibitoria mínima mediante el método de dilución en agar. También fue determinada la susceptibilidad a los antibióticos por el método de difusión en agar.

La concentración mínima inhibitoria (MIC) se determinó por el método de dilución en agar, aplicando métodos bacteriológicos estándar (CLSI 2012a). Así, placas de agar Mueller Hinton (MH) se suplementaron con la composición de acuerdo a la presente invención en diferentes concentraciones que van desde 0,03 mg/L a 1 mg/L. Los cultivos de una noche se diluyeron hasta una concentración de 1 x10 ⁶ cells/ml y 5 μΙ de ellos fueron inoculados en forma de manchas con un replicador de microplacas. Cada ensayo se realizó por triplicado. La MIC para la composición de acuerdo a la presente invención se definió como la concentración más baja de la formulación en la que no se observó crecimiento después de la incubación durante la noche a 37 °C.

Los resultados mostraron que una gran mayoría de los microorganismos aislados fueron inhibidos con concentraciones de 0,13 mg/L (146/363) y 0,25 mg/L (92/363), el resto (32/363) se inhibió con concentraciones mayores que oscilan entre 0,37 mg/L y 0,5 mg/L de la composición de acuerdo a la presente invención.

El comportamiento de las especies de bacterias aparentemente no tenía relación con el origen de las muestras de leche. Se observó una ligera diferencia en la frecuencia de los valores de MIC entre los aislados de mastitis clínica y subclínica (Figura 2). Un total de 77 (57%) de los aislamientos con mastitis clínica mostró valores MIC entre 0,25 a 0,5 mg/L de la composición de acuerdo a la presente invención; en contraste solamente 47 (21 %) de los aislados de mastitis subclínica requieren dicho rango para ser eliminados.

La distribución de frecuencias de los valores de MIC para los aislamientos más frecuentes identificadas en muestras de mastitis clínica se muestra en la Figura 3. Diferentes cepas aisladas a partir de mastitis clínica variaron en un rango de 0.37mg/L a 0,5 mg/L de MIC, donde 1 1 (39%) de S. aureus presentó los valores más altos de MIC (0,5 mg/L). Más de la mitad de los aislados de CNS y S. uberis se inhibió con 0,12 mg/L o de menos de la preparación de la composición de acuerdo a la presente Invención.

Ejemplo 6: Pruebas de sensibilidad a los antlmlcroblanos

Se evaluaron los siguientes agentes antlmlcroblanos (Oxold Ltd. Hampshlre Inglaterra):

• amoxlclllna / ácido clavulánlco (AMC),

• trlmetoprlm / sulfametoxazol (SXT),

• cefotaxlma (CTX),

• tetraclcllna (TET),

• gentamlclna (GN) y

• neomlclna (NE).

Se analizaron los especímenes bacterianos de acuerdo con la metodología de discos de Klrby-Bauer siguiendo las recomendaciones de las guías del Instituto de Estándards de Laboratorios Clínicos (CLSI 2012b) y el estándar BSAC (Andrews y Ensayo 2008).

Los microorganismos se Incubaron en placas de agar Mueller Hlnton a 35 ^S C durante 18-24 horas en atmósfera aerobia. Se utilizaron como control de calidad E. coll (ATCC 25922) y Staphylococcus aureus (25923). Los puntos de corte del CLSI se utilizaron para la Interpretación de la susceptibilidad a todos agentes microbianos. Para determinar el valor de punto de corte de neomlclna (NE), se aplicó la norma BSAC.

El patrón de resistencia a antibióticos demostró que 245/363 (67,5%) de los microorganismos aislados fueron simultáneamente sensibles a todos los antibióticos ensayados. De estos aislamientos, 81/245 (33%) eran de las muestras de leche de mastitis clínicas. Los aislados de mastitis subclínlca mostraron frecuencias más bajas de resistencia en relación a las personas con mastitis clínica. En la reglón central se observó que los antibióticos CTX, AMC, Tet y Ne presentan una frecuencia de resistencia superior a 10% en aislamientos de mastitis clínica. En la reglón sur solamente AMC y Ne cumplen esta condición.

Las cepas con mayor frecuencia de resistencia a los antibióticos aisladas a partir de mastitis clínica se muestran en la Tabla 6. E. coll, aisladas de la reglón central, tenían una frecuencia de resistencia variable a diferentes antibióticos probados, en particular, 7/13 (54%) de los aislamientos resultaron resistentes a Ne. S. uberis aislado de muestras de leche de mastitis clínicas en la región sur mostró alta frecuencia de resistencia a los aminoglucósidos GN y Ne (43 y 52%). Algunos aislados de S. uberis también eran resistentes a CTX (24%). S. aureus y CNS aislados de las regiones del centro y sur presentan una baja frecuencia de resistencia a casi todos los antibióticos probados.

Tabla 6. Resistencia a los antimicrobianos de las bacterias aisladas con mayor frecuencia de mastitis bovina clínica.

Región Central Región Sur

E. coli CNS S. aureus S. uberis CNS

N° resistentes N° resistentes N° resistentes N° resistentes N° resistentes

(%) (%) (%) (%) (%)

GN 2 (15,4) 0 (0,0) 0 (0,0) 9 (42,9) 0 (0,0)

CTX 2 (15,4) 0 (0,0) 1 (3,6) 5 (23,8) 1 (5,9)

AMC 3 (23,0) 0 (0,0) 2 (7, 1 ) 0 (0,0) 0 (0,0)

TET 3 (23,0) 1 (7,7) 1 (3,6) 0 (0,0) 0 (0,0)

SXT 2 (15,4) 0 (0,0) 1 (3,6) 0 (0,0) 0 (0,0)

Ne 7 (53,8) 2 (15,4) 6 (21 ,4) 1 1 (52,4) 1 (5,9)

Los ejemplos incluidos en esta solicitud son de carácter ilustrativo, y no limitan el alcance de la invención protegida en el pliego de reivindicaciones.