CAMPO DE LA INVENCION

La presente invención se refiere al área farmacéutica, y en especial, a nanopartículas biodegradables y biocompatibles cargadas con una droga activa seleccionada de ATP y recubiertas con membranas biológicas seleccionadas de membranas de eritrocitos para alcanzar una liberación lenta de la droga, composición farmacéutica que las contiene. En particular, las nanopartículas biodegradables y biocompatibles comprenden ATP como droga activa y están recubiertas con membranas de eritrocitos, siendo entonces útiles para el tratamiento del cáncer.

ESTADO DEL ARTE

El ATP está formado por una adenina unida al carbono 1 de la ribosa, que en su carbono 5 tienen enlazados tres grupos fosfato. Se produce durante la fosforilación oxidativa, sirve como principal fuente de energía para la mayoría de las funciones celulares y es consumido por muchas enzimas en la catálisis de numerosos procesos químicos, además de participar en la vía de señalización purinérgica (Bours M J Y Col 2006 Pharmacol Ther 1 12(2):358-404). Durante la señalización purinérgica, tanto el ATP y la adenosina actúan como moléculas de señalización extracelulares uniéndose a los receptores de tipo P2 y P1 , respectivamente. Los receptores P1 para adenosina se clasifican en A1 , A2AS, A2B y A3, mientras que los receptores para ATP se clasifican en siete subtipos de receptores de canales iónicos P2X1 al P2X7 y ocho subtipos de receptores acoplados a proteínas G denominadas P2Y1 , P2Y2, P2Y4, P2Y6, P2Y1 1 , P2Y12, P2Y13 y P2Y14 (Burnstock G 2007 Cell and Mol Life Sci 64:1471 -

1483). Estos receptores se expresan en la mayoría de tipos de células tanto normales como cancerígenas y han sido estudiados por su participación en la señalización purinérgica la cual, tiene un rol fisiopatológico en el cáncer y otras muchas enfermedades (Burnstock G 2013 Keiro J Med 62 (3):63-73). Los primeros estudios sobre la actividad anticancerígena de ATP, demostraron que la adición de ATP exógeno a células de cáncer de páncreas y de colon inhibe el crecimiento celular al causar la detención del ciclo celular en la fase S (Rapaport R y col 1983 Cáncer Res 43(9):4402-4406; Rapaport E 1983 J Cell Physiol 1 14(3):279-283). Estudios posteriores han demostrado una acción antineoplásica de nucleótidos extracelulares en el cáncer de colon- rectal, leucemia, cáncer de esófago, cáncer de piel de células escamosas, cáncer de pulmón, cáncer cervical, células de hepatoma H35, cáncer de próstata, cáncer de vejiga, retinoblastoma, neuroblastoma, glioma y melanoma (Burnstock G y Di Virgilio F 2013 Keio J Med 9(4):491 -540). La inhibición del crecimiento de las células cancerosas se produce por incremento en la concentración del ATP extracelular y estaría mediada por la estimulación de los receptores P2X5, P2X7, P2Y1 , P2Y2 y P2Y1 1 . La estimulación de los receptores P2Y1 y P2Y2 induce el incremento del AMP cíclico lo que conlleva la detención de la proliferación y en algunos casos produce apoptosis tanto en células de melanoma como en células de cáncer de piel escamosas. La estimulación de P2X5 y P2Y1 1 produce la detención del ciclo celular deteniendo la proliferación y favoreciendo la diferenciación celular. Finalmente P2X7 es el receptor más aceptado de la vía de señalización purinérgica como mediador de la apoptosis o necrosis de diferentes líneas celulares tumorales (Burnstock G y Di Virgilio F 2013 Keio J Med 9(4):491 -540, Burnstock G y Knight GE (2004) Int Rev Cytol 240:31 -304, White N y Burnstock G 2006 Trends Pharmacoll Scien 27(4):21 1 -217).

A pesar de los beneficios que presenta el ATP para el tratamiento del cáncer, su desventaja radica en que es rápidamente degradado cuando entra al torrente sanguíneo por lo que requiere usar dosis altas para lograr el efecto terapéutico. Estudios in vivo realizados en ratones demostraron que dosis diarias de 25mM de ATP administradas durante 60 días por vía intraperitoneal, reduce significativamente el tamaño de los tumores versus el grupo de tratamiento (Shabbir M y col 2008 BJU Int 102(1 ):108-1 12). Por otro lado estudios clínicos realizados en humanos reportan que la administración intravenosa de ATP en pacientes con cáncer toleran bien el tratamiento, los efectos secundarios son mínimos y que hay una disminución de la caquexia producida por el cáncer lo que sugiere que al ser usado en combinación con otros tratamientos puede contribuir a la reducción de los efectos secundarios (Haskell CM y col 1996 Med Pediatr Oncol 27:165-173, Haskell CM y col 1998 Invest New Drugs 16:81 -85, Agteresch HJ y col 2000 Eur J Clin Pharmacol 56:49-55). Recientemente Rapaport y colaboradores (Rapaport E y col 2000 Eur J Clin Pharmacol 56:49-55) reportaron que la administración de ATP por infusión continua durante 8 horas no incrementa la concentración extracelular del ATP lo cual podría deberse a que el ATP es rápidamente degradado por múltiples ecto-ATPasas y a que los eritrocitos pueden secuestrar grandes cantidades de esta molécula para su posterior liberación (Rapaport E y col 2000 Eur J Clin Pharmacol 56:49-55). Este tipo de administración representa una desventaja para la aplicación del ATP en pacientes con cáncer debido a que no se logra elevar la concentración de ATP extracelular requerida para generar el efecto anticancerígeno. La presente invención propone el uso de sistemas de transporte de drogas basados en nanopartículas con tiempo prolongado de circulación sanguínea, que permiten incrementar los niveles extracelulares de ATP.

El uso de nanopartículas para el tratamiento del cáncer ofrece numerosas ventajas, con respecto a la quimioterapia convencional, tales como, mejoras en la solubilidad y estabilidad de las drogas, especificidad sobre las células cancerosas, disminución de los efectos secundarios, liberación dentro de la ventana terapéutica por tiempos prolongados, modificación de la superficie de la nanopartícula para incrementar la vida media en circulación sanguínea e influenciar en la biodistribución de la droga, incorporación de ligandos a su superficie para una mayor captación especifica por parte de los tejidos diana, tamaño reducido que permite superar las barreras biológicas e incrementar la captación celular, entre otras (Prabhu RH y col 2015 Purinergic Signal 1 1 (2):251 -262, Debbage P 2009 Curr Pharm Des 15(2):153-72, Zhang L y col 2008 Clin Pharmacol Ther 83(5):761 -769). Específicamente, la presente invención propone el uso de nanopartículas de circulación prolongada hechas con albúmina que se caracterizan por ser biocompatibles, tener gran capacidad de adsorción, una traza de liberación sostenida en el tiempo, ser de fácil preparación y estar siendo usadas como medicamentos en humanos (Zhang L y col 2008 Clin Pharmacol Ther 83(5):761 -769, Woods A1 y col 2015 J Control Release 210:1 -9); a las cuales se recubrieron con membranas de glóbulos rojos para otorgarles mayor tiempo de circulación en sangre y disminuir la tasa de internalización celular (Chou TC y Talaly P 1984 Adv Enzyme Regul 22:27-55). En cuanto al arte previo, se ha reportado encapsulación de ATP en nanopartículas de quitosano para mejorar el diagnóstico del hígado por 31 P-espectroscopia de resonancia magnética (patente CN101596169B). Este tipo de resonancia se utiliza como una herramienta no invasiva para medir las concentraciones intracelulares relativas de varios metabolitos de fósforo en diferentes órganos. Por ello, al encapsular ATP en nanopartículas de quitosano se busca incrementar el contenido de ATP intracelular para facilitar la aplicación de la resonancia, A diferencia de esta invención donde se propone el uso de nanopartículas para favorecer la liberación extracelular de ATP.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION

La presente invención se refiere a nanopartículas biodegradables y biocompatibles cargadas con una droga activa seleccionada de ATP y recubiertas con membranas biológicas seleccionadas de membranas de eritrocitos para alcanzar una liberación lenta de la droga, composiciones farmacéuticas que contienen dichas nanopartículas y su forma de preparación. En particular, la presente invención se refiere a nanopartículas con un núcleo de albúmina cargado con ATP como droga activa y recubiertas con membranas de eritrocitos, las que son útiles para el tratamiento del cáncer.

La presente invención comprende una nanopartícula que comprende un núcleo biodegradable y biocompatible y un recubrimiento de membranas celulares. El núcleo biodegradable y biocompatible consiste en albúmina, una proteína producida por el hígado de los mamíferos, entre otros animales, mientras que el recubrimiento consiste en membranas celulares provenientes de eritrocitos obtenidos a partir de muestras de sangre. Estas membranas están compuestas de una bicapa lipídica y de proteínas, varias de las cuales participan en el reconocimiento de lo propio por parte del sistema inmune. La nanopartícula también incluye una molécula cargo que puede estar en cualquier parte del interior o la superficie de la nanopartícula. La molécula cargo es ATP, una droga hidrófila con efecto anticancerígeno (Figura 1 ). Las nanopartículas tienen forma esférica y un tamaño hidrodinámico promedio cercano a los 200 nm, pero el tamaño puede estar dentro del rango de 10 a 800 nm. Estas nanopartículas también se caracterizan por tener un mayor tiempo medio de un sistema de entrega de fármacos y/o composición farmacéutica donde el ATP es el fármaco contenido y administrado por las nanopartículas.

En otro aspecto, las membranas de eritrocitos pueden ser obtenidas del mismo individuo a tratar o de otro de la misma especie, pero con el mismo grupo sanguíneo.

La presente invención describe nanopartículas recubiertas con membranas de eritrocitos y cargadas con ATP, una droga con efecto antitumoral, que podrían ser aplicadas en humanos y otros mamíferos para el tratamiento del cáncer y que presenta las siguientes ventajas:

Disminución del número de aplicaciones de la droga durante el tratamiento frente a tratamientos convencionales debido a que la droga se libera continuamente por días o semanas dentro del organismo.

Disminución del número de visitas de los pacientes a las clínicas como consecuencia de que el número de aplicaciones de las dosis disminuye, permitiendo un ahorro económico significativo en el tratamiento de los pacientes, y aumento de su calidad de vida.

Uso de dosis bajas debido que aumento el tiempo de vida media de la droga, se mejoran los parámetros biodistribución y biodisponibilidad.

Disminución de los efectos secundarios de las alternativas de quimioterapia anticáncer actualmente en uso.

Incremento de la vida media en la circulación sanguínea de la droga permitiendo prolongar la efectividad con una aplicación única. Una liberación continua y prolongada de la droga;

Un mayor tiempo de circulación comprado con nanopartículas similares debido al recubrimiento con las membranas de eritrocitos que permite evadir la respuesta del sistema inmune;

- A diferencia de otros recubrimientos usados con nanopartículas, las membranas celulares son total biocompatibles y biodegradables;

La presente invención se diferencia de otras composiciones farmacológicas basadas en nanopartículas de albúmina en que es la primera vez que se encapsula ATP y que además no se ha reportado el uso de membrana de eritrocitos para recubrir nanopartículas con aplicación en tratamiento anticancerígeno.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS Figura 1 Composición de las nanopartículas de albúmina cargadas con ATP y recubiertas con membranas de eritrocitos.

Figura 2 Tamaño de partícula dependiente de la concentración de albúmina.

Figura 3 Tamaño de partícula dependiente del pH.

Figura 4 Tamaño de partícula dependiente del volumen de etanol.

Figura 5 Eritrocitos sin tratar comparados con eritrocitos lisados luego del tratamiento hipotónico.

Figuras 6A a 6D Tratamiento hipotónico con PBS 0,25x fue efectivo para producir la lisis de los eritrocitos.

Figuras 7A y 7B Figura 7A muestra nanopartículas de albúmina y Figura 7B muestra Nanopartículas de albúmina recubiertas con membranas de eritrocitos.

Figuras 8A y 8B Figura 8A muestra distribución de tamaño de las nanopartículas de albúmina y Figura 8B muestra nanopartículas de albúmina recubiertas.

Figura 9 Tamaño hidrodinámico de membranas de eritrocitos y de nanopartículas. Figura 10 Estabilidad de las nanopartículas de albúmina cargadas con ATP y recubiertas por membranas.

Figura 11 Absorción de ATP a diferentes tiempos de incubación.

Figuras 12A y 12B Número de nanopartículas de albúminas sin membranas internalizadas en comparación con las nanopartículas recubiertas con membranas.

Figura 13 Mediciones de la intensidad de fluorescencia en células tratadas con nanopartículas de albúmina recubiertas comparadas con células tratadas sin nanopartículas sin recubrir.

Figura 14 Liberación acumulativa in vitro de ATP a partir de nanopartículas con y sin recubrimiento de membranas

Figura 15 El efecto del ATP libre sobre la viabilidad de las células HeLa después de 48 y 72 horas de tratamiento

Figura 16 El efecto del ATP encapsulado en nanopartículas recubiertas con membranas de eritrocitos sobre la viabilidad de las células HeLa después de 48 y 72 horas de tratamiento DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION

La presente invención se refiere nanopartículas recubiertas con membranas biológicas que contienen una droga con una actividad terapéutica para el tratamiento del cáncer. Las nanopartículas se preparan de un material natural biodegradable y biocompatible y están cargadas con una droga con actividad anticancerígena asimismo estas nanopartículas cargadas con la droga tienen un recubrimiento con membranas celulares que permite incrementar el tiempo de circulación de las mismas, lo que a su vez permite una mayor liberación de la droga en el tejido blanco.

La presente invención se enmarca dentro del área de los medios de liberación de moléculas farmacológicas activas, es decir, de soportes o transportadores para liberación prolongada y controlada de moléculas farmacológicamente activas de forma intracorporal en humanos y otras especies animales. En particular, la presente invención describe un tipo de nanopartículas poliméricas mejoradas para la administración de un anticancerígeno que en este caso es adenosina 5’-trifosfato (ATP) que a diferencia de otras nanopartículas tiene un recubrimiento de membranas celulares (Figura 1 ). Estas nanopartículas, luego de ser aplicadas por diferentes vías de administración o de inyección, viajan por el flujo sanguíneo y se acumulan en la vecindad y/o en el tejido tumoral para liberar la molécula farmacológicamente activa.

Muchas drogas antitumorales a pesar de tener múltiples mecanismos de acción por los cuales ejercen su actividad anticancerígena, no han podido ser usadas masivamente para el tratamiento del cáncer debido a que presentan una cinética inadecuada para lograr el efecto deseado lo que lleva a la aparición de efectos secundarios no deseados, dificultando la recuperación de los pacientes con cáncer.

Particularmente, para ejercer su actividad farmacológica, el ATP necesita unirse a receptores presentes en la membrana celular. Para lograr este objetivo, el ATP necesita un tiempo prolongado de circulación, sin embargo es rápidamente degradado por ectoATPasas presentes en los glóbulos rojos. Para prolongar su tiempo de circulación y protegerlo de la degradación proponemos encapsularlo en nanopartículas. De esta forma, las nanopartículas de albúmina cargadas con ATP recubiertas con membranas celulares provenientes de eritrocitos de la presente invención, adsorben y liberan el ATP y muestran una tasa de internalización baja que favorece la liberación extracelular de la droga, permitiendo la unión a sus receptores. Las membranas de eritrocitos tienen moléculas de superficie que permiten el reconocimiento de“lo propio” por parte del sistema inmune, haciendo que las nanopartículas recubiertas con estas membranas aumenten su tiempo de circulación, de vida media y disminuyen la taza de internalización por parte de las células. Por otro lado, los componentes de la nanopartículas son todos altamente biodegradables y biocompatibles lo que resuelve el problema de toxicidad presentado por muchos tipos de nanopartículas desarrolladas para aplicaciones médicas. Ejemplo 1 : Obtención de las nanopartículas de albúmina

Para la síntesis de las nanopartículas de albúmina se optimizaron algunos parámetros como la concentración de albúmina, los valores de pH y la concentración de etanol, necesarios para obtener nanopartículas con un tamaño cercano a los 200 nm y con la menor polidispersidad. Para ello se pesaron 10, 20 o 40 mg de albúmina sérica de bovino (BSA) la cual fue diluida en 1 mi de una solución de NaCI 10mM con agitación constante en un agitador magnético a 800 rpm durante 10 minutos. Luego, se ajustó el valor de pH de la solución en una rango de 7 a 10, agregando gotas de una solución de NaOH 0,1 N luego, la solución fue agitada bajo las mismas condiciones por 5 minutos adicionales. Cumplido el tiempo, se agregó etanol absoluto por goteo continuo a una frecuencia de 1 ml/min y en agitación hasta observar que la solución se torna blanquecina, los que es indicativo de la formación de las nanopartículas. Luego, las nanopartículas fueron centrifugadas a 13000 rpm, se descartó el sobrenandante y fueron resuspendidas en PBS, este procedimiento fue repetido 3 veces. La obtención de las nanopartículas fue verificada por microscopía electrónica de transmisión y dispersión dinámica de luz.

Los resultados obtenidos en cuando al efecto de la concentración de albúmina sobre el tamaño de las nanopartículas (Figura 2) se pudo observar que con la concentración de 10 mg/ml de BSA se logró un tamaño promedio de 224,4 ± 6,9 nm, con un índice de polidispersidad de 0,23 ± 0,024 lo que indica que se tratan de nanopartículas monodispersas por tener un valor menor a 0,3. Con las concentraciones de 20 y 40 mg/ml se obtuvieron tamaños de 350,5 ± 17,9 y 559,1 ± 22,1 nm respectivamente con un índice de polidispersidad de 0,135 ± 0,01 y 0,445 ± 0,06 nm. Para los experimentos posteriores se usó la concentración de 10 mg/ml debido a que con ella se obtienen los tamaños más pequeños de nanopartículas.

El valor de pH de la solución de albúmina es un factor que influye fuertemente la distribución de tamaño de las nanopartículas. A pH 7 se observó un tamaño promedio de 313,4 ± 3,4 nm mientras que los valores de pH de 8, 9 y 10 se observó una disminución del tamaño a medida que el pH se tornaba más alcalino (Figura 3). En cuanto al índice de polidispersidad se pudo observar valores, menores a 0,1 para todos los grupos, lo que indica una población de nanopartículas monodispersas. Se muestran los valores de tamaño de nanopartículas de albúmina en nanómetros y los valores del índice de polidispersidad, ver tabla 1 . Tabla 1

Para mantener el tamaño de nanopartículas cercano a los 200 nm se usó el pH de 9 en las soluciones de albúmina en experimentos posteriores. El volumen de etanol adicionado también influye en el tamaño de las nanopartículas ya que a mayor volumen las nanopartículas tienden a agregarse. Según los resultados obtenidos el mejor volumen de etanol para la precipitación de la albúmina en la formación de las nanopartículas se encuentra en un rango de 2 y 3 mi (Figura 4) Ejemplo 2: Obtención de las membranas de eritrocitos, inactivación de ecto-ATPasas y recubrimiento de nanopartículas de albúmina

Para la obtención de las membranas de eritrocitos se tomó 1 mi de sangre de un tubo con heparina y luego fue centrifugada a 1000 g por 5 minutos a 4 ^e C para separar el suero de la fracción celular. El suero fue eliminado y los eritrocitos fueron resuspendidos en 1 mi de PBS pH 7,2 y centrifugados como se mencionó anteriormente, este procedimiento fue repetido 2 veces, Luego los eritrocitos fueron colocados en una solución hipotónica de PBS 0,25x y mantenidos en un baño de hielo por 40 minutos para producir la lisis de los eritrocitos y eliminar el contenido citoplasmático. Después se realizaron 2 lavados con PBS pH 7,2 tal como ya ha sido mencionado. La lisis de los eritrocitos fue verificada por microscopía de campo claro (Figura 5).

Se pudo observar que el tratamiento hipotónico con PBS 0,25x fue efectivo para producir la lisis de los eritrocitos tal como se aprecia en la Figura 6. Los eritrocitos lisados si bien mantienen una forma y tamaño similar a los eritrocitos sin tratar, se puede observar la pérdida del contenido citoplasmático por lo que se tornan transparentes. Debido a que los eritrocitos presentan en su membrana celular enzimas que degradan ATP conocidas como ectoATPasas se hizo necesario inactivar estas enzimas, previamente al recubrimiento de las nanopartículas cargadas con ATP. Para ello los eritrocitos lisados fueron sometidos a diferentes temperaturas de 45, 50 o 56 ^e C por 30 minutos con el objetivo de determinar la temperatura óptima para la inactivación de las enzimas sin pérdida de la morfología de los eritrocitos lisados. Para verificar la inactivación de las ectoATPasas luego de ser calentados, los eritrocitos lisados fueron incubados con una solución de ATP de 1 mg/ml en PBS por una hora a 37 ^e C. Luego de la incubación, los eritrocitos lisados fueron centrifugados y los sobrenadantes fueron usados para detectar y determinar la concentración de ATP por HPLC. Así mismo, para verificar que los eritrocitos lisados mantenían su estructura y morfología luego del tratamiento por calor, se realizaron observaciones de las diferentes muestras por microscopía de campo (Figura 6). Evaluación del efecto de la temperatura sobre la estabilidad de las membranas de glóbulos rojos, post inhibición de ectoATPasas. Se usaron temperaturas de 25 ^e C (A), 45 ^e C (B), 50 ^e C (C) o 56 ^e C (D) por 30 minutos. Se pudo observar que la estructura de las membranas se puede mantener solo hasta 45 ^e C. Luego del tratamiento por calor, los eritrocitos lisados fueron resuspendidos en 1 mi de PBS pH 7 y sonicados en un sonicador de baño con una frecuencia de 47 kHz y una potencia de 154 W, durante 5 minutos. Las vesículas de membranas de eritrocitos obtenidas fueron extruidas a través de una membrana de policarbonato de 400 nm y luego por otra de 200 nm de porosidad con ayuda de un miniextrusor y reservadas para luego recubrir las nanopartículas de albúmina. Para recubrir las nanopartículas, se tomó 1 mi de suspensión de nanopartículas de albúmina cargadas con ATP y se le agregó 20 mI de la suspensión de membrana de eritrocitos obtenidas. Esta mezcla fue luego extruida 10 veces a través de una membrana de policarbonato de 200 nm con ayuda de un miniextrusor.

Ejemplo 3: Caracterización de la morfología, tamaño, potencial Z y estabilidad de las nanopartículas.

La morfología de las nanopartículas fue determinada por microscopía electrónica. Para ello, se tomaron muestras de las nanopartículas las cuales fueron colocadas sobre grillas de cobre y secadas a temperatura ambiente antes de su observación. Así mismo, se tomaron mediciones del diámetro de las nanopartículas para determinar la distribución de tamaño. Las nanopartículas fueron colocadas en una grilla de cobre de malla 300 recubierta con carbón (Ted Pella Inc., USA). Las observaciones fueron realizadas en el microscopio electrónico de transmisión Philips Tecnai 12 BioTwin la distribución de tamaño de las nanopartículas se realizaron mediciones de diámetros de 300 nanopartículas elegidas aleatoriamente en distintos campos.

Se pudo observar la presencia de las membranas de eritrocitos cubriendo las nanopartículas de albúmina (Figura 7 y 8). Los resultados obtenidos mostraron un tamaño promedio de 98,2 ± 1 ,42 nm para las nanopartículas sin recubrir y de 102,6 ± 1 ,67 nm para las nanopartículas recubiertas con membranas (Figura 9).

El tamaño hidrodinámico también fue determinado por dispersión dinámica de luz, la cual es una técnica física que permite determinar la distribución de tamaño de un conjunto de partículas en suspensión gracias a los valores de dispersión de la luz que incide sobre las muestras (Bruce y col. 200). Se usó el equipo Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, Uk) que opera a una longitud de onda de 633 nm y un ángulo de dispersión fijo de 173 ^e para medir las dimensiones de las nanopartículas. Una alícuota de 1 mi de cada solución fue colocada en una celda para los análisis de DDL. Todas las mediciones se realizaron a temperatura constante de 25 ^e C.

Se tomaron mediciones tanto de las membranas de eritrocitos vacías como de las nanopartículas. Se observó una reducción del diámetro de las membranas vacías luego del proceso de sonicación y de extrusión. Asimismo, el tamaño de las nanopartículas fue cercano a 200 nm (Figura 10).

El potencial zeta es la medida de la carga superficial neta que está presente en cualquier tipo de nanopartícula en suspensión, un potencial Z negativo y alto es equivalente a una baja toxicidad exhibida por las nanopartículas. Las nanopartículas fueron medidas cinco veces en solución con una cubeta desechable de policarbonato (DTS 1061 , Malvern) a temperatura constante (25 ^e C) y pH 7,4 (Zetasizer 3000, Malvern Instruments, Reino Unido). Los resultados mostraron que las nanopartículas de albúmina tiene una carga superficial positiva pero esta cambia a negativa luego de la absorción de ATP y del recubrimiento con las membranas, los resultados se resumen en la tabla 2.

Tabla 2

La estabilidad de las nanopartículas de albúmina recubiertas con membranas también fue analizada. Por ello, las nanopartículas fueron mantenidas en PBS y se realizaron mediciones del tamaño hidrodinámico durante 1 , 2, 4, 7 y 15 días post síntesis, tal como ya ha sido mencionado. Se pudo observar que el tamaño tiende a aumentar a medida que pasa el tiempo pero este aumento no supera el 10%. Los datos se muestran en la Figura 1 1 , además se muestran los valores del índice de polidispersidad.

Ejemplo 4: Absorción de ATP

Para la absorción de ATP en las nanopartículas, se mezclaron 10 mg de nanopartículas de albúmina sin recubrir con 5 mg/ml de ATP diluido en PBS. Diferentes alícuotas de esta suspensión fueron incubadas por 0, 2, 4, 12, 24 y 48 horas. Luego, las muestras fueron centrifugadas a 12000 g por 20 minutos para recuperar los sobrenandantes y guardarlos a - 80 ^e C. Posteriormente, los sobrenandantes fueron usados para determinar la concentración de ATP mediante la técnica de HPLC.

Se pudo observar que luego de 48 horas de incubación se obtuvo el máximo de absorción, donde las nanopartículas mostraron una eficacia de encapsulación del 89,4%. Los resultados se muestran en la Figura 12.

Ejemplo 5: Internalización de nanopartículas de células HeLa

Se realizaron ensayos de internalización celular en la línea celular HeLa bajo condiciones fisiológicas. Para los ensayos se usaron nanopartículas de albúmina sin recubrimiento o recubiertas con membranas de eritrocitos (Mes). Las nanopartículas de albúmina fueron coloreadas con un colorante de fluorescencia verde (Alexa flúor 488) y las recubiertas con Mes fueron coloreadas con colorante de fluorescencia roja (DiO). Luego de 24 horas post tratamiento, las células fueron fijadas y analizadas por microscopía confocal.

Para determinar la capacidad celular de captar nanopartículas, se cultivaron células HeLa en placas de 12 pocilios con 1 mi de medio de cultivo D-MEN suplementado con 1 mM de piruvato de sodio, 100 Ul/ml penicilina, 100 mg/ml estreptomicina y 10% suero fetal bovino y mantenidas en un ambiente húmedo con 37 ^e C y 95% de aire y 5% de C0 ₂ . Luego que las células sembradas alcanzaron una confluencia del 80%, se les cambió de medio y se les colocó medio sin suplementar con 1 ng/ml de nanopartículas de albúmina fluorescentes. Luego de 6 horas de incubación las células fueron fijadas con paraformaldehido al 2% y montadas con DABCO para luego ser observadas al microscopio confocal. Las muestras de nanopartículas y de células fueron observadas y analizadas con una excitación de 488 nm para nanopartículas con Alexa flúor y 556 para las nanopartículas con DiO, en un microscopio láser de barrido confocal Zeiss modelo LSM 510 (Cari Zeiss; Jena, Germany). Se tomaron fotos seriadas de las células cada 1 mhi hasta 10 pm de profundidad (eje Z) para poder observar variaciones de la distribución de las nanopartículas al interior de las células.

Se pudo observar un mayor número de nanopartículas de albúminas sin membranas internalizadas en comparación con las nanopartículas recubiertas con membranas (Figura 13) además se realizaron mediciones de la intensidad de fluorescencia en diferentes células y se pudo comprobar que las células tratadas con nanopartículas de albúmina recubiertas se internalizan en menor proporción que las nanopartículas sin recubrir (Figura 14).

Ejemplo 6: Liberación lenta del agente activo de las nanopartículas

Para evaluar la tasa de liberación de ATP a partir de las nanopartículas, se realizó un estudio de liberación in vitro utilizando nanopartículas con y sin recubrimiento de membrana de eritrocitos. Se colocó 10 mg de nanopartículas con y sin recubrimiento en tubos Eppendorf dispersadas en un volumen total de 1 mi de PBS (pH 7,4) se colocaron en un baño de agitación a 37 ^e C con agitación constante. A intervalos de tiempo predeterminados, las muestras se centrifugaron a 10 000 g durante 10 minutos y 100 pL del sobrenadante recogido se mezclaron con 100 mI de una solución de ácido tricloroacético al 10% y se incubaron durante 20 minutos para precipitar las proteínas de la muestra; esta mezcla se centrifugó a 10 000 g durante 10 min. El sobrenadante recogido se diluyó en 800 pL de agua destilada y la cantidad de ATP en las muestras se determinó mediante un espectrofotómetro UV / Vis a 257 nm, utilizando el procedimiento descrito anteriormente. Los estudios in vitro del porcentaje de liberación de ATP a partir de las nanopartículas mostraron que el recubrimiento con las membranas de eritrocitos disminuye la tasa de liberación de las drogas, haciendo que esta sea más lenta en comparación con las nanopartículas sin recubrir (figura 14).

Ejemplo 7: Uso de las nanopartículas en líneas celulares cancerígenas

La citotoxicidad del ATP libre o encapsulado en las nanopartículas fue evaluada en cultivos de la línea celular HeLa mediante el ensayo de proliferación celular MTS (CelITiter 96® AQueous One Solution Cell, Promega Corporation, Wl, EE. UU.). Las células se sembraron primero (~ 5x10 ³ por pocilio) en placas de 96 pocilios y se incubaron durante la noche. Después, se adicionó ATP libre o en nanopartículas recubiertas y las células se incubaron durante 72 horas adicionales. La viabilidad celular se determinó luego utilizando un compuesto de tetrazolio [3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -5- (3-carboximetoxifenil) -2- (4-sulfofenil) -2H-tetrazolio, sal interna; MTS] siguiendo el protocolo proporcionado por el fabricante.

Diferentes concentraciones de ATP libre inhibieron el crecimiento de las células HeLa, después de un tratamiento de 48 horas con una Cl ₅₀ = 3,82 mM y después de un tratamiento de 72 horas con una Cl ₅₀ = 2,38 mM (Figura 14). El tratamiento con ATP en nanopartículas después de 48 horas no mostró señales de inhibición del crecimiento celular; sin embargo, después de 72 horas, se registró una disminución de la viabilidad celular hasta 48.6 ± 2.0% con 400 mM de

ATP cargado en nanopartículas (Figura 15) con una Cl ₅₀ = 0.039 mM. Los ensayos de viabilidad celular con ATP encapsulado en nanopartículas mostraron una disminución de casi 100 veces en la concentración necesaria para inhibir el 50% del crecimiento celular comparado con el ATP libre. Este efecto puedo ser observado luego de 72 horas a diferencia del ATP libre que actúa a 48 horas, y puede deberse a las propiedades de liberación lenta de drogas que observadas por estas nanopartículas. La liberación sostenida de compuestos terapéuticos por parte de las nanopartículas recubiertas ofrece la oportunidad de reducir la dosis requerida y mejorar la eficacia del tratamiento.