CAMPO DE LA INVENCIÓN.

La presente invención corresponde a un método integrado que utiliza microscopía de fuerza atómica para determinar simultáneamente las propiedades biomecánicas (como viscoelasticidad) de células vivas y topografía de biomateriales, lo que permite evaluar la biocompatibilidad entre las células y un material determinado.

ANTECEDENTES.

La presente invención consiste en un método para evaluar biocompatibilidad entre células vivas o tejidos y diversos biomateriales. Corresponde a un método integrado basado en el uso de Microscopía de Fuerza Atómica (AFM) para medir, bajo condiciones fisiológicas, ciertas propiedades biomecánicas (como rigidez, amortiguamiento y viscoelasticidad) de células vivas al estar en contacto con un material. Además, este método permite determinar -simultáneamente- los cambios físicos topográficos de rugosidad ocurridos en la superficie del material a causa de esta interacción, lo que permite predecir la biocompatibilidad entre ambos. A fin de mejor ilustrar la invención, el presente documento describe la presente invención considerando algunos casos en los cuales puede aplicarse; sin embargo, estos ejemplos no deben considerarse como limitantes de la invención.

El análisis de la biocompatibilidad de materiales usados en implantes es un área de vital importancia en biomedicina. Numerosos biomateriales son fabricados cada año; sin embargo, las técnicas empleadas para cuantificar la interacción célula-material son escasas. A la fecha, la mayoría de las pruebas de biocompatibilidad involucran la medición de viabilidad celular o la expresión de marcadores celulares de adhesión. No obstante, estas mediciones no evalúan si la interacción célula-material modifica la superficie del biomaterial ni la posibilidad de que las células puedan unirse al material sin estar correctamente adheridas. Estas variables corresponden a cambios biofísicos, propios de la adaptación celular al entrar en contacto con una superficie y son de vital importancia al momento de considerar cuál es el material más adecuado para una intervención quirúrgica determinada.

Para evaluar los méritos de la invención descrita en este documento, se presenta un breve resumen de los documentos más relevantes presentes en la técnica, para la presente invención. El documento más relevante corresponde al documento US20130347147A1 , el cual describe un método para cuantificar la viscoelasticidad de diferentes polímeros y de diferentes células de mamíferos, por separado. Otro documento relevante corresponde al WO2017068197A1 el cual describe un método para subtipificar tejidos de cáncer de mamas en base a su rigidez, mediante AFM. Si bien ambos documentos describen la cuantificación de propiedades biomecánicas como rigidez y viscoelasticidad en células de mamíferos, y en el documento US20130347147A1 también se describe la caracterización de un material mediante AFM, en ninguno de los documentos se menciona un método que implique analizar la biocompabilidad entre materiales y células. Por otra parte, el documento US9250241 B2, describe un método para medir la adhesión celular a biomateriales mediante micropatrones adhesivos fluorescentes embebidos en la matriz del biomaterial, permitiendo determinar la fuerza de tracción celular y cambios en la forma celular, pero no entrega mediciones directas de la viscoelasticidad celular ni de la relación superficie-célula, a diferencia de la metodología con AFM usada en la presente invención.

En la búsqueda de artículos de investigación relacionados a la presente invención, se encontró una publicación de Merghni y cois. 2016 (Applied Surface Science 379, 323-330) donde se estudió la adhesión de células bacterianas a diferentes materiales de restauración dental mediante AFM y se determinó el efecto de la rugosidad del material en la fuerza de adhesión. En este artículo se utilizó AFM en la determinación de adhesión celular; sin embargo, no se implementó AFM para medir directamente las propiedades biomecánicas intrínsecas de las células tales como rigidez y viscoelasticidad; tampoco se evaluó el efecto de la propia célula sobre la rugosidad del material, siendo todas estas propiedades determinantes para la sobrevida celular en biomateriales y la evaluación de biocompatibilidad.

En resumen, en el estado del arte previo no se encontraron referencias en cuanto a la determinación de la biocompatibilidad de un material con un tejido particular, de la forma en que se hace en la presente invención.

Considerando las limitaciones de las pruebas convencionales utilizadas para medir biocompatibilidad, la presente invención corresponde un método que permite predecir la biocompatibilidad entre células vivas o tejidos y diferentes materiales, a través del uso de AFM para la medición simultánea de propiedades biomecánicas de las células y topográficas del material escogido al que están adheridas. La información obtenida mediante su utilización permite obtener nuevos antecedentes para la fabricación de implantes más durables y, por sobre todo, más adecuados y biocompatibles para cada tipo celular específico. Además, el método de la presente invención permite reducir costos por la baja cantidad de material que se requiere para el análisis de biocompatibilidad. BREVE DESCRIPCIÓN DE FIGURAS

Figura 1 : Caracterización de la viscoelasticidad en diferentes modelos de célula endotelial. Curvas de acercamiento realizadas sobre diferentes tipos celulares endoteliales. Solamente se seleccionó el segmento a partir de 150 nm desde la zona de contacto, ya que permite una mejor visualización. A. Cultivos primarios de red mesentérica (RM), de arteria (aRM) y de venas (vRM). B. Líneas celulares endoteliales HUVEC y HMD1 .

Figura 2: Caracterización de la rugosidad de algunos biomateriales utilizados en procedimientos de rehabilitación e implantología odontológica, en ausencia de cultivos celulares. Específicamente se estudiaron muestras de titanio utilizado en prótesis dentales con distinto grado de pulido (sin pulir, y con nivel 1 a 4 de pulido), titanio quirúrgico de implantes dentales comerciales y de discos obtenidos desde una barra de titanio quirúrgico no maquinada. Además, se analizaron rectángulos de disilicato de litio y de zirconio monolítico utilizados en coronas dentales, glaseados y no glaseados. El gráfico corresponde a la media + SEM (error estándar de la media) del cuadrado medio de las alturas (Rq) obtenidas por AFM, en modo intermitente, para cada uno de los materiales analizados. Análisis: ANOVA no paramétrico (Kruskal-Wallis) seguido del test de Dunn’s de comparación múltiple. Se presentan las diferencias entre los grupos señalados, n=10- 15 para cada superficie, excepto n=4 para cerámicas no glaseadas ( ^** p<0,01 / ^*** p<0,001

/ ###p<0,001 ).

Figura 3: Propiedades biomecánicas de osteoblastos adsorbidos en titanio quirúrgico (disco cortado, superficie del corte). Se presentan curvas de acercamiento realizadas con el sistema ¡Drive de AFM, utilizando el modo intermitente en líquido, en tres zonas celulares distintas: Núcleo, Borde Nuclear y Periferia Celular. Cada curva posee los canales de Fase, Amplitud y Deflexión, los cuales son analizados mediante Scripts en IgorPro para obtener los parámetros de Amortiguamiento (arriba), Rigidez (centro) y Viscoelasticidad (abajo) de cada zona celular.

Figura 4: Caracterización de la rugosidad del material en interacción con la célula: osteoblasto adsorbido en titanio quirúrgico. Se midió por el modo intermitente en líquido con el sistema ¡Drive de AFM. La imagen A corresponde al canal de altura y la B es la misma imagen, pero procesada para excluir los datos correspondientes a la célula y así determinar la rugosidad del material. Figura 5. Comparación de la rugosidad del vidrio y titanio quirúrgico antes (-MC3T3- E1 ) y durante (+MC3T3-E1 ) la interacción célula (osteoblasto) - material. Los datos graficados corresponden a la media más el error estándar de la media (SEM), n = 8 - 10 en todas las condiciones. Los datos fueron analizados por Anova de dos vías (P < 0,001 ) seguido por un test de Sidak de comparación múltiple ( ^*** P < 0,001 )

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención corresponde a un método para determinar biocompatibilidad entre células vivas y biomateriales, utilizando Microscopía de Fuerza atómica (AFM). Por un lado, a partir del parámetro de rugosidad de la superficie del biomaterial, se puede predecir la posible biocompatibilidad de este con los cultivos celulares, ya que el paradigma en implantología sugiere que, a mayor rugosidad, mayor es la biocompatibilidad del material. Por otro lado, el método propuesto permite el registro simultáneo de las propiedades biomecánicas de viscoelasticidad de las células vivas cuando éstas son adsorbidas en un material y los cambios físicos de rugosidad ocurridos en la superficie del material derivados de esta interacción. La integración de las mediciones obtenidas permite predecir la biocompatibilidad entre las células y el material estudiado.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DEL INVENTO

Conforme a lo mencionado anteriormente, la presente invención corresponde a un método para determinar biocompatibilidad entre células y materiales usados en implantes, utilizando Microscopía de Fuerza atómica (AFM). Por un lado, a partir del parámetro de rugosidad de la superficie, se puede predecir la tendencia de biocompatibilidad del material con los cultivos celulares, ya que a mayor rugosidad se espera una mayor biocompatibilidad del material. Por otro lado, este método se basa en el registro simultáneo de las propiedades biomecánicas de las células vivas adsorbidas en un material y los cambios físicos de rugosidad ocurridos en la superficie del material en contacto con las células.

Las etapas del método son las siguientes:

¡.medir rugosidad de material a evaluar, en ausencia de cultivos celulares; ii. medir rugosidad de material a evaluar en presencia de cultivos celulares bajo condiciones fisiológicas; iii. medir propiedades biomecánicas de células adsorbidas sobre material a evaluar; iv.determinar la biocompatibilidad de la interacción célula-material a evaluar. En una realización específica, en la etapa i) del método, la medición de la rugosidad del material en ausencia de cultivos celulares: se realiza mediante un estudio por AFM en aire para caracterizar la rugosidad de la superficie del material. Este estudio se hace mediante el escaneo de cada muestra utilizando el modo“intermitente”, registrando entre 5 y 8 imágenes preferentemente de un tamaño de 90x90pm para realizar la cuantificación de parámetros de rugosidad. La rugosidad se evalúa mediante el valor cuadrático medio de la altura (Rq) y la media aritmética de altura (Ra).

Donde /corresponde a cada punto de escaneo por la punta de AFM, en un total de n puntos, e y corresponde a la altura de la muestra en cada punto.

En otra realización, en la etapa ii) del método, la medición de la rugosidad del material, en presencia de cultivos celulares bajo condiciones fisiológicas, se realiza creciendo cultivos celulares de células para las cuáles se desea determinar la biocompatibilidad con el material, sobre el material y se vuelve a realizar un escaneo de cada muestra utilizando el modo intermitente, pero esta vez en líquido. En una realización más específica, el escaneo en líquido se realiza con el sistema ¡Drive de AFM. Una vez realizado el escaneo, se registran entre 5 y 8 imágenes de un tamaño preferentemente de 90x90pm, de las cuales se puede obtener el valor de rugosidad del material en interacción con la célula, de la misma forma que en la etapa 1 .

En aún otra realización específica, en la etapa iii) del método, la medición de las propiedades biomecánicas de las células adsorbidas en biomateriales, se realiza una vez escaneada la superficie de la célula sobre el material, con dicha información se elaboran curvas de fuerza (también denominadas curvas de acercamiento de la punta de AFM a la muestra) individuales sobre el núcleo celular. Cada curva contiene los canales de fase, amplitud y deflexión. Finalmente, los datos obtenidos son procesados para obtener los valores de rigidez, amortiguamiento y viscoelasticidad de la célula en contacto con la superficie. En otra realización, en la etapa iv) se realiza el análisis cuantitativo de las propiedades biomecánicas de la célula y la rugosidad de la superficie, el cual se correlaciona con otros métodos, actualmente presentes en el mercado, como viabilidad y adhesión celular, y permite establecer una escala de biocompatibilidad de la interacción célula-material.

En una realización preferida este método es usado para predecir la biocompatibilidad entre células vivas y materiales usados en implantología en medicina.

En una modalidad preferida el método es usado para determinar la rugosidad de materiales usados en implantes y coronas dentales, tales como titanio quirúrgico, titanio protésico, disilicato de litio, zirconio monolítico, vidrio.

En otra modalidad preferida el método es usado para determinar propiedades biomecánicas de células vivas adheridas a biomateriales.

En una realización particular, las células adheridas son osteoblastos.

En una realización específica el método se usa para determinar biocompatibilidad entre células osteoblastos y biomateriales usados en implantología que incluyen titanio quirúrgico, titanio protésico, disilicato de litio, zirconio monolítico, vidrio.

En otra realización particular, las células adheridas son microorganismos como bacterias.

En otra realización específica se usa el método para predecir biocompatibilidad en bacterias adheridas a materiales usados en implantología que incluyen titanio quirúrgico, titanio protésico, disilicato de litio, zirconio monolítico, vidrio.

EJEMPLOS

A continuación, se incluyen ejemplos de realización para la presente invención tal como fue antes descrita:

Ejemplo 1 : Aplicación de AFM para el análisis de propiedades biomecánicas de un sistema celular controlado (células endoteliales).

Objetivo del experimento: Estandarizar el método de estudio de propiedades biomecánicas de células mediante AFM y validar el protocolo propuesto de configuración experimental de AFM y análisis de propiedades biomecánicas, mediante el análisis de células endoteliales con características conocidas. Descripción del experimento: Se dispuso de un Microscopio de Fuerza Atómica tipo Stand Alone (AsylumResearch, Santa Barbara). Se utilizaron cantilevers tipo BL-TR400 (Olympus) con excitación directa mediante el dispositivo IDRive (AsylumResearch, Santa Barbara). Previo a la toma de imágenes, la calibración de las puntas de AFM se realizó en aire utilizando el método GetRealTM de AsylumResearch incorporado en el software AsylumResearch de IgorPro versión 13. Mediante esta calibración se obtuvo el valor de la constante de resorte del cantilever.

Una vez preparada la muestra de cultivo celular, se hicieron las calibraciones en líquido (AutoTune) antes de entrar en contacto directo con la célula. La toma de imágenes de los canales de deflexión (A0), amplitud(AI), fase(cp) y extensión del piezo eléctrico en el eje Z (altura), se realizaron con un‘target amplitude’ de 200 mV y una velocidad lateral máxima de 10pm/s. Se tomaron imágenes en el rango de 10x10pm a 90x90pm y dependiendo de la resolución requerida se usaron 256x256 pixeles, 128x128 pixeles o 64x64 pixeles. Una vez tomada una imagen preliminar de baja resolución, se realizó una curva de acercamiento a una velocidad de 1 pm/s y‘trigger point’ de 0, 1 V que permitió alejar la punta a 4pm sobre la superficie de la célula. De esta manera se pudo obtener el‘Q valué’ (Qfar) y a continuación se centró la fase para que el máximo sea 90°.

Las propiedades viscoelásticas de amortiguamiento (cmuestra), rigidez (kmuestra) y viscoelasticidad (tañó) fueron determinadas mediante el protocolo descrito por Cartagena y Raman et al 2014.

Resultados: Se efectuó la estandarización del método de estudio de propiedades biomecánicas de células mediante AFM y se estableció el protocolo de análisis de los datos recopilados. Los resultados se obtuvieron a partir de cultivos primarios o líneas de células endoteliales mantenidas sobre vidrio (un sistema de características conocidas). Se definieron los parámetros de adquisición de datos para realizar las curvas de acercamiento, una vez escaneada la superficie de la célula sobre el material. Se caracterizó la viscoelasticidad (tañó) en diferentes zonas del núcleo celular y se concluyó que se debe considerar el valor promedio de viscoelasticidad desde los 300nm de indentación debido a la variabilidad en los primeros 200nm de indentación. Se probaron diferentes velocidades de indentación de la punta de AFM y se escogió 1 pm/s ya que genera una mayor pendiente en el gráfico de fuerza vs indentación. Se analizó la viscoelasticidad en la zona de núcleo y periferia celular, y se observó que el valor de la propiedad biomecánica es mayor para la zona de la periferia en comparación al núcleo. Se estudió la viscoelasticidad en distintos modelos de células endoteliales (Figura 1 ) y se corroboró que el valor de viscoelasticidad es propio de cada modelo, y por ende, esta propiedad permite la caracterización y distinción de cultivos celulares

Ejemplo 2: Caracterización de los biomateriales en ausencia de cultivos celulares a partir de su análisis por AFM.

Objetivo del experimento: Establecer las características de rugosidad de distintos biomateriales libres de células, para, en experimentos posteriores, usar estos datos como referencia y evaluar si los parámetros de rugosidad del material cambian como consecuencia de su interacción con células.

Descripción del experimento: Se estudiaron muestras de titanio utilizado en prótesis dentales con distinto grado de pulido (sin pulir y con nivel 1 a 4 de pulido), titanio quirúrgico de implantes dentales y de discos obtenidos desde una barra de titanio quirúrgico no maquinada. Además, se analizaron rectángulos de disilicato de litio y zirconio monolítico utilizados en coronas dentales que habían pasado o no por el proceso de glaseado. También se analizó vidrio (control) ya que es un material ampliamente utilizado para estudiar cultivos celulares y por ende es un buen control de partida para las posteriores mediciones de biocompatibilidad celular. Estas muestras cumplían con la altura máxima (3mm) para efectuar la visualización por AFM, además se limpiaron previo a cada escaneo con acetona y etanol 70% v/v para eliminar impurezas, y se pasaron por flujo de nitrógeno gaseoso para asegurar que no quedase humedad en la superficie.

Cada biomaterial se visualizó mediante el modo intermitente en aire por AFM para obtener imágenes topográficas. Se calibraron en aire mediante AutoTune cantilevers tipo AC160TS. Se tomaron imágenes para registrar los canales de altura y amplitud de cada superficie a un Target Amplitude entre 0,1 -1 V según la superficie, con un Sean fíate de 0,2 Flz. Se tomaron imágenes de 90x90pm de 128x128 a 256x256 pixeles. Una vez tomada la imagen se obtuvo el valor de Ra dado por el canal de altura; estos valores se promediaron desde 10 a 14 imágenes tomadas por muestra para calcular el índice de rugosidad. Al recopilar todos los valores de Ra de todas las muestras se hizo análisis de ANOVA no paramétrico (Kruskal-Wallis) y test de Dunn’s comparación múltiple a posteriori para evaluar si existían diferencias de rugosidad entre los biomateriales.

Resultados: A partir del análisis de los valores de Ra (rugosidad determinada como la media aritmética de todas las alturas presentes en la superficie) (Figura 2), se ve que para el caso de titanio protésico el proceso de pulido disminuye significativamente los valores de rugosidad, mientras que no hay diferencias en el caso de titanio quirúrgico al comparar zonas diferentes de implantes y discos; por otro lado las cerámicas disminuyen su rugosidad luego del proceso de glaseado, dejándolas como la superficie de biomaterial más lisa dentro del estudio. En el caso del vidrio (control) se observó que la superficie de este material es la más lisa y uniforme de todas las muestras que fueron analizadas, con valores de rugosidad menores al nanómetro, por lo que entregará importante información respecto al comportamiento de las células frente a sustratos planos.

Con estos datos será posible verificar si existe correlación entre los distintos niveles de rugosidad de estos biomateriales y la viscoelasticidad que presenten las células en contacto con ellos.

Ejemplo 3: Aplicación de AFM para el análisis de las propiedades biomecánicas de osteoblastos adsorbidos en titanio quirúrgico.

Objetivo del experimento: Entender cómo las propiedades biofísicas de las células cambian en función de la superficie a la que se encuentran adheridas.

Descripción del experimento: Células MC3T3-E1 (osteoblastos de ratón) fueron cultivadas en medio de cultivo MEM a 2mM Glutamina, suplementado con 10% de Suero fetal bovino, a 37°C y 5% CO2. A una confluencia entre el 60-80% fueron cultivadas sobre portaobjetos de vidrio o discos de titanio quirúrgico bajo las condiciones experimentales descritas. Luego de 48h de cultivo sobre las superficies mencionadas, las células fueron analizadas por AFM para la medición de los parámetros de rigidez, amortiguamiento y viscoelasticidad como propiedades biomecánicas. Para ello, se realizaron curvas de acercamiento, con el sistema ¡Drive de AFM, utilizando el modo intermitente en líquido, en tres zonas celulares distintas: Núcleo, Borde Nuclear y Periferia Celular. Cada curva posee los canales de Fase, Amplitud y Deflexión, los cuales son analizados mediante Scripts en IgorPro para obtener los parámetros de amortiguamiento, rigidez y viscoelasticidad de cada zona celular. Un ejemplo de las curvas obtenidas para osteoblastos adsorbidos sobre titanio quirúrgico se muestra en la Figura 3.

Resultados: Células de osteoblasto de ratón, MC3T3-E1 , se cultivaron sobre vidrio o discos de titanio quirúrgico. Mientras la rigidez celular fue similar en superficies de vidrio y titanio (2,36 ± 0,3 x10 ^-3 N/m y 1 ,67 ± 0,3 x10 ^-3 N/m, respectivamente), el amortiguamiento celular en vidrio fue significativamente mayor que en titanio (1 ,46 ± 0,13 x 10 ⁷ N-s/m versus 0,91 ± 0,17 x 10- ⁷ N-s/ m). No obstante lo anterior, la viscoelasticidad celular, parámetro global biomecánico que engloba la participación de ambos componentes simultáneamente, fue similar en las superficies de vidrio y titanio (3,68 ± 0,47 y 2,97 ± 0,12). Por otro lado, la rugosidad celular es menor en vidrio que en titanio (337 ± 23 nm versus 441 ± 33 nm), lo cual indicaría un efecto morfológico del titanio sobre la célula. Ejemplo 4: Medición de la rugosidad del material en presencia de cultivos celulares bajo condiciones fisiológicas.

Objetivo del experimento: Analizar el efecto que tienen las células sobre el material en que se encuentran adheridas.

Descripción del experimento: De la misma manera descrita en el ejemplo 3, células MC3T3-E1 (osteoblastos de ratón) fueron cultivadas sobre portaobjetos de vidrio o discos de titanio quirúrgico. Luego de 48h de cultivo sobre las superficies mencionadas, se analizó la rugosidad de la superficie en interacción con el cultivo celular por AFM.

Para la medición de la rugosidad de las superficies se utilizaron las imágenes del canal de altura obtenidas de la misma forma descrita para el ejemplo 3. Mediante el uso del software IgorPro en modo Análisis, se selecciona la sección de la imagen correspondiente a la zona de la célula y otra sección correspondiente a la superficie alrededor de la o las células, según corresponda (Figura 4). Luego, el software calcula los parámetros de rugosidad de cada sección, donde la rugosidad corresponde a la media aritmética de todas las alturas presentes en la superficie seleccionada (Ra). Este valor se utilizó para comparar la rugosidad de la superficie antes y durante la interacción con el cultivo celular.

Resultados: Al analizar el efecto celular sobre la rugosidad del biomaterial (Figura 5), se observó que la rugosidad del vidrio aumenta considerablemente desde 0,5 ± 0,08 nm hasta 193 ± 28 nm; en cambio, la rugosidad del titanio no se afecta (234 ±30 nm hasta 240 ± 25 nm), sugiriendo que este biomaterial es menos proclive a daño enzimático o de exposición. El material de vidrio es ampliamente usado para el estudio bioquímico y de viabilidad celular por numerosas técnicas, por lo tanto, se considera de máxima biocompatibilidad. Los resultados muestran que la viscoelasticidad celular es similar entre vidrio y titanio, pero la rugosidad celular aumenta en presencia de titanio. Además, la rugosidad del titanio no se modifica por la presencia celular, a diferencia del vidrio, que aumenta enormemente su rugosidad. Estos experimentos demuestran la importancia de la interacción célula- biomaterial para el estudio de la biocompatibilidad, donde es necesario caracterizar simultáneamente los efectos en ambos componentes.