La presente invención se relaciona con el campo técnico de la agricultura, específicamente con biocidas, y en particular proporciona una composición biológica para el control de nemátodos patógenos presentes en las plantas.

Antecedentes de la invención

Los nemátodos parásitos de plantas son un problema actual importante para la agricultura a nivel mundial. Se han identificado más de 4.100 especies de nemátodos fitoparásitos que afectan a diversos tipos de cultivos en diferentes territorios y condiciones de suelo (Nicoi JM, Turner SJ, Coyne DL, den Nijs L, Hockland S, Tahna Maafi Z, Current Nematode Threats to World Agricuiture. Chapter 2. Genomics and Molecular Genetics of Píant-Nematode interactions. 201 1 ), Entre los nemátodos más dañinos a plantas de interés comercial se encuentran especies de ios géneros Meloidogyne spp., RotyienchuÍus spp., Xiphinema spp. y Tyienchulus spp. (Luc, M., Sikora, RA., Bridge, J. (Eds.). Píant parasitic nematodes in subtropical and tropical agriculture. 2005. Cabi. Second edition). Los nemátodos fitoparásitos se encuentran dentro de las pestes más ampliamente distribuidas, cuya erradicación es frecuentemente muy difícil y costosa. Se estima que las pérdidas de cultivos por nemátodos corresponde a un 14,6% y un 8,8% en países sub-desarroliados y países en desarrollo, respectivamente (Nicol JM, Turner SJ, Coyne DL, den Nijs L, Hockland S, Tahna Maafi Z. Current Nematode Threats to World Agriculture. Chapter 2. Genomics and Molecular Genetics of Plant-Nematode Interactions. 201 1 ).

Se han desarrollado diferentes estrategias para el control y eliminación de nemátodos fitoparásitos. Una de estas estrategias incluye la utilización de productos nematicidas derivados de compuestos químicos no fitotóxicos, como fumigantes halogenados, organofosfatos y carbamatos. La desventaja del uso de estos nematicidas químicos es que son altamente peligrosos para la salud humana pues provocan envenenamiento y potencial mortalidad (World Health Organizador!. (1990). Public health impact of pesticides used in agricuiture: p.88.). Algunos países ya han prohibido su uso debido a la presencia de estos tóxicos en aguas subterráneas y potables, y de trazas tóxicas en plantas y frutos. En consecuencia, estos compuestos deben ser aplicados con precaución y para ello requieren personal y maquinaria especializada con el fin de evitar accidentes, lo cual incrementa ios costos (Gowen SR. Chemical control of nematodes: efficiency and side-effects. FAO Plant Production and Profection Paper - 144. Roma 1997). A raíz de lo anterior, el desarrollo de nuevos nematicidas ha avanzado hacia la obtención de productos de origen natural y/o biológico.

Los nematicidas de origen biológico buscan potenciar los enemigos naturales de los nemátodos, utilizando hongos o bacterias capaces de matar nemátodos a través del parasitismo, oportunismo o producción de toxinas o metabolitos. En el control de nemátodos fitoparásitos se han utilizado especies fúngicas de los géneros Arthrobotrys spp., Fusarium spp, y Monacrosporium spp. como se muestra en la solicitud de patente WO2012140207, así como especies bacterianas tales como Baciiius megaterium (WO20141 18401 ), Baciiius subíiiis (WO2013178666), Baciiius firmus (WO2014043058), Pseudomonas aeruginosa y Pseudomonas pulida (WO2014086752) y Pseudomonas fluorescens (WO2012140207).

Las bacterias Baciiius weihenstephanensis y Brevibacterium frigoritoierans son especies clasificadas dentro del grupo de las rizobacterías, es decir, bacterias que habitan naturalmente las raíces o zona radical de las plantas (que habitan en la rizósfera). En la publicación ZhiFang, L., YingQi, G., íngHe, M., YueQiu, H. Optirnization of the culture condition for Baciiius weihenstephanensis strain ¡V1C67 producing nematicidai volátiles. 2009. Chínese Journal of Biológica! Control, 25:4, 339-347, se describe la optimización de las condiciones de cultivo de la bacteria Baciiius weihenstephanensis (cepa MC67) y se observa una actividad nematicida sobre el nemátodo Bursaphelenchus xyiophiíus, el cual parásita la madera del pino y no sus raíces. Por otra parte, existe un estudio in vitro que analiza individualmente el efecto nematicida de Bacillus weihenstephanensis aislado de suelo alemán en Caenorhabditis e!egans y Pristionchus pacificus (Rae, R., ¡atsenko, I., Witte, H., Sommer, RJ. A subset of naturaily isoiated Bacillus strains show extreme virulence to the free-living nematodes Caenorhabditis eiegans and Pristionchus pacificus. 2010. Environmentai microbioiogy, 12. 11: 3007-3021 ), sin embargo estos nemátodos no son fitopatogenos, es decir, su ciclo vital no incluye la infección de las plantas en ninguna etapa (Dieterich, C, Clifton, SW., Schuster, LN,, Cbinwalla, A,, Deiehaunty, K., Dinkelacker, !., Sommer, RJ. The Pristionchus pacificus genome provides a unique perspective on nematode lifestyle and parasitism. 2008. Nature genetics, 40.10: 1 193-1 198) y no presentan interés económico.

Dentro de las formulaciones biológicas nematicidas existentes en el estado de la técnica, la solicitud de patente CN103952348 menciona un inoculo microbiano que contiene únicamente la cepa china de Brevibacterium frigoritolerans (CGMCC No. 8837), cuya actividad nematicida fue evaluada sólo en el nemátodo Meloidogyne incógnita. Por otro lado, la patente concedida CN102229900 divulga una preparación probiótica a ser utilizada como fertilizante y un método para su preparación que incluye un inoculo de Bacillus weihenstephanensis, entre otros. En este último documento se indican ejemplos beneficiosos de la preparación en el crecimiento de las plantas; pero no se mencionan análisis de las propiedades nematicidas de dicha cepa.

Si bien se han realizado múltiples esfuerzos y combinaciones de agentes para el control de nemátodos, hasta la fecha no se ha logrado obtener una composición nematicida efectiva contra los nemátodos que afectan las plantas de interés económico, especialmente sus raíces, y que sea de fácil uso y amigable con el medio ambiente.

Sumario de la Invención

Un objeto de la presente invención se refiere a las cepas de rizobacterias aisladas y purificadas correspondientes a las especies Brevibacterium frigoritolerans con el código de acceso RGM2156 y Bacillus weihenstephanensis con el código de acceso RGM2155, o mulantes de las mismas con actividad nematicida.

Un segundo objeto de ¡a presente invención se refiere a una composición biocida que comprende ai menos un agente de control biológico seleccionado del grupo que consiste en: la rizobacteria de la cepa Brevibacterium frigorito!erans (código de acceso RGM2156), la rizobacteria de la cepa Bacillus weihenstephanensis (código de acceso RG!Vl 2155), al menos una mulante de estas cepas que mantenga las características de identificación esenciales de su cepa parental, ai menos un metabolito producido por el cultivo de dichas bacterias o mutantes, un sobrenadante obtenido del cultivo de dichas bacterias o mutantes, un iisado de dichas cepas o mutantes de las mismas, o una combinación de los agentes anteriores; y un portador agronómicamente aceptable. Dichos agentes de control biológico poseen actividad nematicida.

Cada cepa rizobacteriana se encuentra en el rango de concentraciones entre 1 x 10 ⁶ y 1 x 10 ⁸ UFC por gramo de composición. La combinación de agentes de control biológico es una mezcla de ¡as cepas de rizobacterias Brevibacterium frigoritolerans (código de acceso RGM2156) y Baciiius weihenstephanensis (código de acceso RGM2155), ¡as cuales se encuentran en ¡a composición en una modalidad preferida de ¡a invención en una relación 1 : 1 .

Otro objeto de ¡a presente invención se refiere a un método para el control biológico de nemátodos fitoparásitos, el cuai comprende proporcionar ¡a composición descrita previamente en cualquiera de sus variantes, y aplicarla a un terreno de cultivo de una planta de interés mediante una técnica apropiada tal como inyección al suelo, riego por goteo, aspersión, pulverización, riego manual, aplicación directa en forma de polvo, gránulos, cápsulas, botos o una combinación de ¡os mismos.

La Figura 1 es un gráfico con los resultados de ¡a evaluación del efecto nematicida de los sobrenadantes del cultivo de ¡as rizobacterias Brevibacterium frigoritolerans (código de acceso RG 2156) y Baciiius weihenstephanensis (código de acceso RGM2155) sobre ¡os estados móviles del nemátodo Xiphinema índex.

La Figura 2 es un gráfico con los resultados de ¡a evaluación del efecto nematicida de los sobrenadantes del cultivo de ¡as rizobacterias Brevibacterium frigoritolerans (código de acceso RG 2156) y Bacilíus weihenstephanensis (código de acceso RGM2155) sobre ¡os estados móviles del nemátodo Meloidogyne ethiopica.

La Figura 3 es un gráfico con los resultados de ¡a evaluación del efecto nematicida de los sobrenadantes del cultivo de ¡as rizobacterias Brevibacterium frigoritolerans (código de acceso RGM2156) y Bacilíus weihenstephanensis (código de acceso RGM2155) sobre ¡os estados móviles del nemátodo Tyienchulus semipenetrans.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a una composición biocida que comprende agentes de control biológico con actividad nematicida y un método para e! control biológico de nemátodos fitoparásitos que utiliza dicha composición nematicida, ¡a cual se aplica sobre terrenos de cultivos infectados con estos patógenos, de manera que la composición acceda a las raíces de las plantas, donde se asientan preferentemente los nemátodos. La composición nematicida comprende un inoculo del cultivo de las rizobacterias aisladas a partir del suelo de la zona central de Chile Brevibacterium frigoritolerans (código de acceso RGM2156), Bacilíus weihenstephanensis (código de acceso RGM2155) o una combinación de las mismas; o bien ios sobrenadantes, metabolitos o iisados obtenidos por el cultivo de dichas bacterias, o una combinación de los agentes mencionados. La invención también puede comprender cualquier cepa mutante derivada de ¡as rizobacterias Brevibacterium frigoritolerans (código de acceso RGM2156) o Bacilíus weihenstephanensis (código de acceso RGM2155) que posea las características de identificación esenciales de las cepas de rizobacterias mencionadas y que posea actividad nematicida. Ambas cepas se depositaron en el Banco de Recursos Genéticos Microbianos del INIA (Instituto de Investigaciones Agropecuarias) - Chile con los códigos de acceso previamente referenciados.

La composición nematicida de la invención contiene adicionalmente un portador agronómicamente aceptable que permite su aplicación adecuada. La composición puede tener un formato líquido o en polvo, dependiendo del portador utilizado. Los microorganismos añadidos a la composición se encuentran en el rango entre 1 x 10 ⁶ - 1 x 10 ⁸ UFC por gramo de composición. En una modalidad preferida la composición comprende la mezcla de las cepas de rizobacterias Brevibacterium frigoritoierans (código de acceso RGIV12156) y Bacillus weihenstephanensis (código de acceso RG1V12155) o los sobrenadantes de su cultivo en una relación 1 : 1 .

Se entenderá en el contexto de la presente invención por "control biológico" a la regulación del número de patógenos o parásitos de las plantas mediante la utilización de un segundo organismo biológico perteneciente al grupo de las rizobacterias o de agentes derivados de este, tales como el sobrenadante de su cultivo, ios metabolitos producidos por el mismo o un lisado de dicho cultivo, de manera que son igualmente efectivos para atacar al patógeno y/o afectar su sobrevivencia.

El término "aislado" se refiere a las cepas de rizobacterias de la presente invención que han sido removidas y purificadas desde su medio ambiente natural.

El término "mutante", tal como se utiliza en la presente invención, se refiere a una variante de la cepa bacteriana parental que posee cualquier cambio en la secuencia de ADN y una actividad nematicida mayor o igual que la cepa parental,.

El término "cepa parental" se refiere a cada cepa originalmente depositada en el Banco de Recursos Genéticos Microbianos del ¡NIA (Chile) antes de ser modificada por alguna técnica apropiada. Para obtener cepas mutantes a partir de las cepas parentaies divulgadas en la presente invención se pueden utilizar diversos métodos de mutagénesis convencional, tales como el tratamiento con nitrosoguanidina, metanosuifonato de etilo, radiación gamma, radiación ultravioleta, rayos X u otras técnicas ampliamente conocidas en el estado del arte. También se pueden utilizar técnicas de ingeniería genética, las cuales son conocidas por cualquier experto en la materia, para la obtención de cepas mutantes con mejorada actividad nernaticída u otro tipo de ventaja que permita su aplicación conveniente para el control de los fitoparásitos.

El término "metabolito" se refiere a cualquier compuesto, sustancia o subproducto del cultivo de las rizobacterias objeto de la presente invención que posea actividad nematicida. El término "sobrenadante" se refiere al fluido condicionado por el cultivo de las rizobacterias objeto de la presente invención una vez que ha sido separado de las bacterias.

El término "iisado" se refiere ai fluido que contiene células bacterianas que han sido previamente cultivadas o conformen una suspensión, y que son destruidas por mecanismos que comprometen la integridad de la célula, los cuales son ampliamente conocidos en el estado de la técnica.

Se entenderá por "características de identificación esenciales" aquellas propiedades que presentan las rizobacterias aisladas objeto de la presente invención. En particular, las propiedades características de Brevibacterium frigoritolerans se describen por ejemplo en la publicación Selvakumar, G., Sushii, S. NL, Stanley, J., Mohán, M., Deol, A., Rai, D., ... & Gupta, H. S. (201 1 ). Brevibacterium frigoritolerans a novel entomopathogen of Anómala dimidiata and Holotrichia iongipennis (Scarabaeidae: Coleóptera). Biocontroi Science and Technology, 21(7), 821 -827. Como un segundo ejemplo, en la publicación Thorsen, L, Hansen, B. M., IMielsen, K. F., Hendriksen, N. B., Phipps, R. K., & Budde, B. B, (2006). Characterization of emetic Baciiius weihenstephanensis, a new cereulide-producing bacterium. Applied and environmentai microbioiogy, 72(7), 51 18-5121 se describen las características que identifican a Baciiius weihenstephanensis. Un segundo objeto de la invención es un método para el control de los nemátodos fitoparásitos en cultivos, el cual comprende la aplicación de la composición nematicida previamente mencionada en cualquiera de sus variantes en el terreno de cultivo para alcanzar las raíces de las plantas. La aplicación de la composición ai terreno se puede realizar por diversas técnicas también conocidas, tales como: inyección al suelo, riego por goteo, aspersión, pulverización, riego manual, aplicación directa en forma de polvo, gránulos, cápsulas, bolos o una combinación de ios mismos. La composición se puede aplicar a plantas de cualquier edad, jóvenes o adultas, ya sea se encuentren plantadas o bien en proceso de trasplante, mediante la inmersión de las raíces de las mismas en la composición en cualquiera de sus variantes. La composición puede ser utilizada en cualquier suelo, como por ejemplo en tierras de cultivo masivo, invernaderos, macetas, aimácigos y jardines. Los cultivos de interés donde se puede utilizar la composición sin restricción de ningún tipo son por ejemplo: vid, olivo, mango, tomate, papaya, kiwi, pistacho, plátano, arándanos y árboles de frutales cítricos y en general en cualquier cultivo de plantas susceptibles de ser infectadas por los nemátodos pertenecientes a ios géneros Xiphinema, Meíoidogyne y Tylenchulus principalmente, u otros nemátodos susceptibles de ser bio-controiados por la composición en base a las bacterias Bacillus weihenstephanensis (código de acceso RGM2155), Brevibacierium fñgorifolerans (código de acceso RGIV12156) o una combinación de las mismas en cualquiera de sus variantes, o rnutantes de dichas cepas con actividad nematicida.

La forma de administración de la composición puede ser en seco, como polvo, cápsulas, gránulos, bolos o comprimidos, o como un líquido, tai como una solución, o en forma de espuma, geles, emulsiones o cualquier otra forma aceptable en la agricultura. Las formulaciones finales pueden contener además excipientes agronómicamente aceptables, tales como agentes disgregantes y/o aglutinantes, agentes humectantes, tensioactivos y estabilizantes.

La composición en cualquiera de sus variantes se prepara de acuerdo a procedimientos y formulaciones convencionales conocidas en el estado del arte agrícola - químico. Las composiciones granulares o en polvo usualmente se dispersan en portadores agronómicos aceptables sólidos tales como arcilla, polvo de caolinita, piedra volcánica, tierra de diatomeas, silicatos, harina de madera, tierra de Fuüer, yeso, polvo de calcita o similares, entre otros. Las composiciones líquidas usualmente se dispersan o diluyen en portadores agronómicos aceptables líquidos tales como agua o solventes orgánicos (compuestos aromáticos, terpénicos o cetonas), entre otros. Opcionalmente la composición puede incluir agentes químicos atrayentes de nemátodos y/o fitohormonas o metabolitos adicionales para promover el crecimiento saludable de la planta.

La presente invención proporciona una alternativa a los nematicidas químicos comúnmente usados y a las composiciones nematicidas en base a controladores biológicos conocidos, a través de una composición en base a cepas de rizobacterias específicas para el control de nemátodos fitopatógenos o sus mezclas, con demostrada eficiencia. La composición nematicida es efectiva en controlar un amplio rango de especies y géneros de nemátodos, en diversos tipos de cultivos y suelos. Adicionaimente, la composición de la invención promueve el crecimiento radicular de las plantas, facilitando el sano desarrollo de misma,

A continuación se presentan ejemplos de realización de la invención, los cuales se han incluido con el objetivo de ilustrar la invención, sus modalidades preferidas y ejemplos comparativos, pero en ningún caso deben considerarse para restringir el alcance de la solicitud de patente, el cual solo está delimitado por el contenido de las reivindicaciones que aquí se adjuntan.

EJEMPLOS

EJEMPLO 1 : Ensayos in vitro para evaluar la eficacia de la composición para el control biológico de nemátodos, s¾ Evaluación de la actividad nematicida de ¡a composición sobre la mortalidad de estados móviles de 3 especies de nemátodos fitoparásitos.

Para llevar a cabo la evaluación de la actividad nematicida de la composición de la invención sobre la mortalidad de estados móviles de ios nemátodos fitoparásitos Xiphinema índex, Meioidogyne ethiopica y Tylenchulus semipenetrans, las rizobacterias Brevibacterium frigoritolerans (código de acceso RGM2156) y Baciilus weihenstephanensis (código de acceso RGM2155) se cultivaron en un medio conteniendo caldo tríptico de soya (TSB, de la sigla en inglés Tryptic Soy Broth) 15 g/L a 22°C por 44 horas en un agitador a 180 rpm, hasta alcanzar una concentración de 1 x 10 ⁶ unidades formadoras de colonias UFC/mL Luego de realizar el cultivo de las bacterias, la suspensión se centrifugó dos veces a 4000 rpm por 20 minutos y se colectó el sobrenadante y en este se realizó una inmersión de 50 nemátodos en estados móviles por 48 y 72 horas, luego de lo cual se determinó la mortalidad de los nemátodos. Se consideraron muertos aquellos individuos inmóviles, aún después de pincharlos con una aguja. Se determinó el efecto de los sobrenadantes de ambas cepas por separado y en una mezcla (en proporción 1 : 1 ). Se realizó un estudio para cada uno de los tres nemátodos mencionados anteriormente en condiciones de laboratorio. Como tratamiento control se utilizaron nemátodos no tratados presentes en la misma solución nutritiva TSB usada para el cultivo bacteriano. En las Tablas 1 , 2 y 3 se muestran los resultados de ensayos de mortalidad sobre estados móviles de ios nemátodos Xiphinema índex,

Meioidogyne ethiopica y Tylenchulus semipenetrans, re spectivamente, los cuales también se reflejan en ios gráficos de las Figuras 1 ,2 y 3, respectivamente.

Tabla 1. Efecto nematicida del sobrenadante del cultivo de rizobacterias sobre estados móviles de Xiphinema índex.

{%) / Tiempo

Tratamientos

48h 72h

Brevibacterium frígoritolerans (código de .

53,7 b acceso RGM2158)

Bacilíus weihenstephanensis (código de ₄ „ _ .

80,5 b acceso RGM2155) '

B, frígoritolerans (código de acceso

RGIV12156) + B. weihenstephanensis 54,04 b 88,61 b (código de acceso RGM2155) (1 :1 )

Control 3,25 a 9,46 a

Los datos corresponden a las medias de cuatro repeticiones. Letras diferentes en una misma columna, son estadísticamente diferentes del tratamiento control de acuerdo al test de Dunnet p < 0,05. Tabla 2. Efecto nematicida del sobrenadante i del cultivo de rizobí meterías sobre estados móviles de Meioiá ogyne ethiopica.

Mortandad (%) / Tiempo

Tratamientos

48h 72h

Brevibacterium frígoritoíerans (código de

3,2 a 53 b acceso RG1V12156)

Badil us weihenstephanensis (código de

41 ,5 b 54,2 b acceso RGM2155)

B. frígoritoíerans (código de acceso

RGM2158)+ B. weihenstephanensis 30,71 b 70,51 b

(código de acceso RG1V12155) (1 :1 )

Control 2, 18 a 3, 10 a

Los datos corresponden a las medias de cuatro repeticiones. Letras diferentes en una misma columna, son estadísticamente diferentes del tratamiento control de acuerdo al test de Dunnet p < 0,05.

Tabla 3. Efecto nematicida del sobrenadante del cultivo de rizobacterias sobre estados móviles de Tyienchuius semipenetrans.

Tratamientos

Brevibacterium frígoritoíerans (código de

12. 5 3 42,8 b acceso RGM2158)

Baciilus weihenstephanensis (código de

10,2 a 25,3 b acceso RGM2155)

B, frígoritoíerans (código de acceso

RGM2156)+ B. weihenstephanensis 20,24 b 71 , 12 c

(código de acceso RGM2155) (1 :1 )

Control 9,50 a 1 1 ,73 a

Los datos corresponden a las medias de cuatro repeticiones. Letras diferentes en una misma columna, son estadísticamente diferentes del tratamiento control de acuerdo al test de Dunnet p < 0,05.

Los resultados de estos ensayos muestran que la composición nematicida formada por la mezcla de los sobrenadantes del cultivo de rizobacterias Brevibacterium frígoritoíerans (código de acceso RG1V12156) y Baciilus weihenstephanensis (código de acceso RGM2155) es altamente eficiente dado que produce un elevado porcentaje de mortalidad sobre las tres especies de nemátodos analizadas, el cual es estadísticamente significativo en comparación al control no tratado, como se muestra en las Tablas 1 , 2 y 3. Además se encontró que la utilización de la mezcla de los sobrenadantes del cultivo de las cepas Brevibacterium frigorito!erans (código de acceso RGM2156) y Baciüus weihenstephanensis (código de acceso RGM2155) aumenta el rango de acción de la composición nematicida pues permite obtener un alto porcentaje de mortalidad sobre los nemátodos analizados, el cual es mayor al obtenido por los sobrenadantes de cada bacteria por separado. Estas diferencias incluso son significativas como se muestra en los tratamientos a las 72 horas sobre el nemátodo Tylenchulus semipenetrans en la Tabla 3. Estos resultados demuestran que la composición nematicida permite de forma sinérgica ampliar el espectro de los nemátodos objetivo.

Las especies estudiadas son muy frecuentes en viñedos y frutales chilenos. Las primeras dos especies se consideran como representativas de otras especies de los mismos géneros, tales como X. americanum s./., M. incógnita, M. javanica o M. hapia, de aquí que este estudio permite extrapolar los resultados obtenidos con la composición de la invención a otros nemátodos fitopatógenos.

^" ú) Evaluación de ta actividad nematicida ele la composición sobre la

Para determinar la actividad nematicida de la composición sobre la eclosión de huevos del nemátodo fitoparásito Meioidogyne ethiopica se incubaron aproximadamente 50 huevos con 3 mL de los sobrenadantes del cultivo de dichas cepas en placas Petri de 5 mL por 48 horas y posteriormente se evaluó el porcentaje de eclosión. Como se observa en la Tabla 4, el tratamiento con los sobrenadantes del cultivo de las rizobacterias mencionadas disminuye significativamente el porcentaje de eclosión de ios huevos de M. ethiopica en comparación a la condición control sin tratar en solución nutritiva TSB .

Tabla 4. Efecto nematicida del sobrenadante del cultivo de rizobacterias sobre huevos de Meioidogyne ethiopica.

Tratamiento

Eclosión (%} (aislamiento bacteriano)

Brevibacterium frigoritoierans (código de acceso RG 2158) 15,0 ^* ± 2,2 Bacii!us weihenstephanensis (código de acceso RGM2155)

Control (medio TSB) 90, 1 ± 4,8

^* : p< 0,05 según el test de Dunnett, n = 6.

EJEMPLO 2: Ensayos en maceta para eva r la efsca i composición para el control biológico de nernátodos

¾emat¡aaa de la composición sobre

Para evaluar el efecto de la composición nernaticida que comprende cada cepa de las rizobacterias Brevihacierium frigoritolerans (código de acceso RG 2156) y Bacillus weihenstephanensis (código de acceso RG 2155) por separado, se realizaron ensayos con 8 plantas de vid var. Thompson Seedless de dos meses de edad por cada bacteria y testigo en macetas en condiciones de invernadero. Estas plantas se cultivaron a partir de estacas en macetas de 0,5 L con sustrato perüta estéril, posteriormente se sacaron de estos recipientes, el sistema radical se sumergió en la suspensión bacteriana a una concentración de 1 x 10 ⁶ UFC/mL, se establecieron en las macetas definitivas de 5 L y se inocularon con 400 ejemplares del nemátodo Xiphinema índex por maceta. Luego se regó cada maceta con la misma suspensión bacteriana, con 100 mL por maceta. Al cabo de 6 meses las plantas se retiraron de las macetas, se midió la densidad pobiacional de nernátodos vivos en el sustrato luego de ios tratamientos y la masa vegetal aérea. Luego las raíces se lavaron y se midió la masa de las mismas y el número de daños por gramo de raíz. Para esto se determinó mediante una lupa el número de nodulos apicales presentes en las raíces, que es el síntoma causado por los nernátodos al alimentarse. Los resultados se muestran en la Tabla 5, donde se observa que las plantas tratadas con cada cepa de rizobacteria presentan un daño significativamente menor en sus raíces y una mayor masa aérea y radical en comparación ai control (sólo nernátodos). Además se observa que los tratamientos con las cepas de rizobacterias mencionadas reducen significativamente el número de nernátodos vivos presentes en cada maceta. Tabla 5. Efecto nematicida de las cepas de rizobacterias sobre vides infestadas con 400 ejemplares de Xiphinema índex.

: p< 0,01 ; ^* : p< 0,05 (según el test de Dunnetf) indican diferencias en comparación al control 2. n = 4. Posteriormente se realizó un estudio con plantas francas de vides var.

Thompson Seedless de 3 meses desarrolladas en macetas de 5 L cultivadas esta vez con suelo agrícola e inoculadas con 1000 ejemplares del nemátodo Xiphinema índex por maceta. Este estudio tuvo una duración de 2 temporadas (20 meses) y se llevó a cabo en forma paralela con un segundo ensayo bajo las mismas condiciones con el objetivo de analizar la eficacia de las cepas de las rizobacterias. Transcurrido dicho período se evaluó el daño producido en la planta mediante el recuento de las agallas de las raíces generadas por la infección de dicho nemátodo. Los resultados se muestran en la Tabla 6, donde se observa que los tratamientos con las cepas de rizobacterias mencionadas reducen el número de agallas de las raíces de las plantas producidas por la infección por el nemátodo en comparación con las plantas infestadas y no tratadas (control). Tabla 6. Efecto nematicida de las cepas de rizobacterias sobre vides infestadas con 1000 ejemplares de Xiphinema índex.

^* : p< 0,05 (según el test de Dunnett) indica diferencias en comparación al control, n = 6 para cada ensayo. U) Evaluación de ia actividad nematicida de la composición sobre

Se realizaron cultivos en condiciones de invernadero de plantas de vides de mesa de 2 meses de edad var. Chardonnay en macetas de 5 L rellenas con suelo naturalmente infestado con nemátodos fitoparásitos. Las plantas a raíz desnuda se inocularon por un minuto con suspensiones de las cepas Brevibacterium frigoritoierans (código de acceso RGM2156) y Bacillus weihenstephanensis (código de acceso RGM2155) a una concentración de 1 x 10 ⁶ UFC/mL en una solución isotónica de MgS0 ₄ . Luego de 5 meses de estudio se evaluó el índice reproductivo del nemátodo Meloidogyne ethiopica, para lo cual se calculó ia razón entre ia población o número de nemátodos presentes al comienzo (Pi) y ai término del estudio (Pf). Los resultados indican que las cepas utilizadas en ios tratamientos son eficaces en disminuir ia población del nemátodo fitoparásito estudiado, disminuyendo su índice reproductivo en comparación ai testigo absoluto (plantas sin tratamiento de control de nemátodos, sólo recibieron riego con agua al igual que los tratamientos restantes), siendo incluso más eficaces que el nematicida químico fosforado de contacto utilizado (Cadusafos - Rugby 200 CS en dosis equivalente a 15 L de producto comercial por hectárea), según se muestra en la Tabla 7,

Tabla 7. Efecto nematicida de las cepas de rizobacterias sobre vides infestadas naturalmente con Meloidogyne ethiopica.

p< 0,05 indica diferencias significativas con el testigo absoluto según el test de Dunnett n = 6.

EJEMPLO 3: Estudios en terreno para

composición para el control biológico de neroá' i¾ Evaluación de la actividad nematicida de la composición sobre

Se realizó un estudio en terreno en la localidad de Casablanca, V región, Chile, en plantas de vid var. Syrah de 6 meses. Se inocularon los sistemas radicales de las plantas en receso invernal previo a su establecimiento en una viña, en un sector de replante, mediante la inmersión en una suspensión de las cepas Brevibacterium frigoritoíerans (código de acceso RG1V12156) y Bacilius weihenstephanensis (código de acceso RGM2155) a una concentración de 1 x 10 ⁶ UFC/mL de agua corriente y posteriormente se plantaron en suelo franco arcilloso con riego por goteo. Los tratamientos fueron distribuidos ai azar, utilizando parcelas de 4 plantas, 4 m ² , con 4 repeticiones por cada tratamiento. Las poblaciones naturales de nemátodos fitoparásitos dominantes en dicho terreno de cultivo pertenecen a los géneros Pratyienchus, Paratyienchus y Tylenchorhynchus. Luego del transcurso de 15 meses post-plantación se evaluó el número de nemátodos presentes en una muestra de 250 cm ³ de suelo (población final, Pf), el cual se comparó con el número inicial de nemátodos (Pi) y se calculó la tasa reproductiva de ios mismos (Pf/Pi). En la Tabla 8 se observa que las plantas tratadas con las suspensiones de las cepas de nzobacterias mencionadas presentaron una disminución significativa de la tasa reproductiva de las poblaciones de nemátodos presentes en ei terreno de cultivo en comparación a las plantas controles que no recibieron ningún tratamiento.

Tabla 8. Efecto nematicida de las cepas de rizobacferias sobre vides infestadas naturalmente con nemátodos de ios géneros Pratylenchus, Paratylenchus y

Tylenchorhynchus.

p< 0,05 según el test de las diferencias significativas mínimas de Fisher n = 4.