Область техники

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, а именно к антителам, а также их применению. Более конкретно, настоящее изобретение относится к биспецифическому антителу, которое специфично связывается с IV субдоменом внеклеточного домена (ECD4) HER2 (рецептор эпидермального фактора роста 2) человека и II субдоменом внеклеточного домена (ECD2) HER2 человека. Изобретение также относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей данное антитело, вектору экспрессии, способу получения антитела и применению антитела для лечения заболеваний или нарушений, связанных с гиперэкспрессией HER2.

Уровень техники

Группа рецепторов эпидермального фактора роста (human epidermal factor receptor, HER) , также именуемая ErbB-рецепторами, относится к семейству трансмембранных рецепторных тирозинкиназ . Это семейство включает в себя рецептор эпидермального фактора роста (epidermal growth factor receptor, EGFR) , также называемый ErbB- 1 (или HER1), и гомологичные рецепторы ErbB-2 (HER2), ErbB-3 (HER3) и ErbB-4 (HER4) . Данные рецепторы экспрессированы на поверхности большинства нормальных клеток, они участвуют в регулировании важнейших клеточных процессов, контролируя пролиферацию, дифференцировку, миграцию и апоптоз. Повышение уровня экспрессии HER рецепторов или их лигандов, таких как херегулин (HRG) или фактор эпидермального роста (EGF) , часто наблюдается у пациентов с онкологическими заболеваниями (Wilson, Fridlyand et al . 2012) .

Структура ERBB-рецептора (HER) представлена тремя доменами: внеклеточным, с 4 субдоменами, трансмембранным и внутриклеточным, представленным юкстамембранным, тирозин-киназным субдоменами и карбоксильным концом (для процессов аутофосфорилирования) .

Связывание лиганда с внеклеточным доменом тирозинкиназ вызывает процесс димеризации рецепторов, который может проходить как между двумя идентичными рецепторами (гомодимеризация) , так и между разными рецепторами внутри одного семейства (гетеродимеризация) . Димеризация активирует внутриклеточные домены тирозинкиназ и вызывает их аутофосфорилирование. Это, в свою очередь, запускает ряд нисходящих пролиферативных сигнальных каскадов, в том числе опосредованных митоген-активируемыми протеинкиназами, а также сигнальный путь АКТ, направленный на выживание клетки (описано в работе Yarden and Pines, 2012) .

Для ErbB-2 (HER2) не удалось обнаружить специфичных эндогенных лигандов, но его внеклеточный домен содержит участок связывания с низкой аффинностью и широкой специфичностью для лигандов других рецепторов, и предполагается, что в норме активация этого рецептора происходит путем гетеродимеризации (Sergina, Rausch et al . 2007), тогда как активация рецептора ErbB-3 может происходить с участием лигандов. К таким лигандам относятся, среди прочих, нейрегулин (NRG) или херегулин (HRG) .

Лиганд-зависимая димеризация характерна для HER1/3/4, опосредована связыванием лиганда с внеклеточным доменом рецептора (1 молекулы лиганда достаточно для поддержания устойчивой конформации димера; диссоциация единственной молекулы лиганда с димером приводит к мгновенной диссоциации димера) .

Лиганд-независимая димеризация характерна при достижении критической точки уровня HER2, начинается процесс спонтанной димеризации, т.е. сама гиперэкспрессия HER2 приводит к смещению равновесия рецептора от мономерного к агрегированному состоянию.

В процессе димеризации обычно участвуют все три домена рецепторов, однако, как внеклеточного, так и внутриклеточного доменов, по-отдельности, достаточно для процесса димеризации и киназной активности (в частности, конститутивной активности внутриклеточного домена) .

Аллостерические взаимодействия, лежащие в основе процесса димеризации, начинаются в области внеклеточного домена. Внеклеточные домены рецепторов отвечают как за связывание лиганда (между I и III субдоменами) , так и за связывание рецепторов друг с другом посредством II субдоменов. При этом «согнутая» конформация II субдомена характерна для лиганд-независимых, неактивных внеклеточных доменов EGFR, «прямая» - для лиганд-зависимых активных димеров.

Нарушение регуляции ErbB-рецепторов приводит к образованию и росту опухолей (Yarden, Sliwkowski et al . 2001) . Известным примером служит амплификация и гиперэкспрессия рецептора ErbB2 (HER2), которая наблюдается в 20-30% случаев рака молочной железы (РМЖ) и рака желудка.

Несмотря на отсутствие высокоаффинных лигандов, ЕгЬВ2 -рецепторы (HER2) успешно участвуют в реализации сигнальных путей, направленных на выживание клеток. Это происходит посредством образования гетеродимеров с другими рецепторами ErbB-семейства, например, с ЕгЬВЗ- рецептором (HER3) .

Наиболее неблагоприятный прогноз течения РМЖ связан с наличием большого количества гетеродимеров HER2-HER3 на поверхности опухолевых клеток, а также с коэкспрессией IGFR и c-Met (ассоциируется с инвазивным фенотипом опухоли, интенсивным метастазированием и устойчивостью к моноспецифической анти-НЕН2 таргетной терапии) .

Высокий уровень HER2-HER2 и HER2-HER3 коррелировал с амплификацией или гиперэкспрессией HER2.

Следует отметить, что существует 2 различных формации гетеродимеров HER2/HER3:

В лиганд-независимых условиях они формируются через 4 субдомены внеклеточного домена (ECD4) HER2. В лиганд-зависимых - через вторые субдомены внеклеточного домена (ECD2 ) HER2.

Лекарственные препараты, направленно действующие на ЕгЬВ2- рецепторы (HER2) (Baselga, Swain et al . 2009), позволили значительно улучшить результаты лечения у многих пациентов с опухолями, характеризующимися повышенной экспрессией ErbB2 (HER2) .

Самыми распространенными препаратами, блокирующими HER2 опосредованные механизмы опухолевого роста являются:

антитело Трастузумаб, которое блокирует IV субдомен внеклеточного домена HER2 рецептора (патент ЕР0590058 (В1 ) , W09222653);

антитело Пертузумаб, которое блокирует II субдомен внеклеточного домена HER2 рецептора (патент RU2270029, W00100245) .

Однако у значительной части пациентов такое лечение оказывается неэффективным, а у тех, кто изначально отвечал на терапию, со временем развивается резистентность (Nahta, Yu et al.2006) .

Основными механизмами формирования резистентности являются:

1. Стерический эффект - мутация р95 в структуре рецептора HER2. Данная мутация заключается в протеолизе внеклеточного домена HER2, образованию усеченной формы р95 с конститутивной киназной активностью, что исключает возможность связывания рецептора с трастузумабом и ингибирования сигнального пути; данный тип мутации не характерен для других рецепторов семейства.

2.Аберрантная активация сигнальных каскадов, регулируемых другими рецепторами семейства EGF/образование HER2-HER3, EGFR-HER3, EGFR-HER2 - гетеродимеров

3. Внутриклеточные изменения в НЕй2-сигналинге, в частности, дефицит/частичная или полная утрата функции PTEN

4. «Маскирование» экстрацеллюлярного доменома HER2 в присутствии мембрано-ассоциированного гликопротеина MUC4.

5. Коэкспрессия IGFR и с-Met

6.Т798М мутация в гене HER2

7.PIK3CA мутации

8.Активация Src

9. Повышенная экспрессия Hsp90 (связываясь с Hsp90 рецептор HER2 избегает присоединения антитела, интернализуется и вскоре возвращается в процессе ресайклинга на поверхность клетки)

10. Ингибирование miR200c

Аберрантная активация сигнальных каскадов, регулируемых другими рецепторами семейства EGF, в частности, образование HER2-HER3, EGFR/HER2 и EGFR/HER3 - гетеродимеров является одним из основных механизмов резистентности к моно-анти HER2 и EGFR антителам.

Для преодоления промблемы с резистентностью был разработан препарат Бейодайм - комбинация трастузумаба и пертузумаба, применяющаяся для лечения метастатического рака молочной железы, при отсутствии ранее проводимой анти-НЕй2 терапии, а также в качестве препарата неоадъювантной терапии РМЖ (патент RU 2430739, WO 01/00245) . Данный препарат обладает неудобным способом введения, так как Бейодайм вводят пациенту двумя раздельными длительными внутривенными инфузиями трастузумаба и пертузумаба.

Вышеуказанная проблема решается с помощью разработки биспецифического антитела, которое специфично связывается с разными субдоменами внеклеточного домена HER2 человека, и вводится пациенту в одну инфузию, таким образом, сокращается время пребывания пациента в стационаре .

Из уровня техники известны биспецифические антитела, которые специфично связываются с разными субдоменами внеклеточного домена HER2 человека, например, антитела, описанные в следующих патентных документах .

В международной заявке WO2015091738 (заявка RU2016129517 ) описано биспецифическое антитело, специфически связывающееся с HER2, которое содержит первый антигенсвязывающий сайт, специфический в отношении внеклеточного домена II HER2, и второй антигенсвязывающий сайт, специфический в отношении внеклеточного домена IV HER2, где биспецифическое антитело является одновалентным в отношении обоих внеклеточных доменов II и IV HER2, при этом указанное антитело индуцирует комплементзависимую цитотоксичность (CDC) в более высокой степени, чем комбинация пертузумаба и трастузумаба.

Биспецифическое антитело по данному изобретению (BCD-147-02-020) вообще не проявляет комплементзависимую цитотоксичность (CDC) .

В международной заявке WO2015157592 описано биспецифическое антитело, специфически связывающееся с HER2, содержащее первый иммуноглобулиновый антигенсвязывающий домен и второй иммуноглобулиновый антигенсвязывающий домен, где (i) первый и второй иммуноглобулиновые антигенсвязывающие домены специфически связываются с различными сайтами связывания антител HER2, (ii) первый иммуноглобулиновый антигенсвязывающий домен связывается с первым сайтом связывания антител HER2, который содержит эпитоп в домене II HER2, и (iii) первый сайт связывания с антителом HER2 отличается от сайта связывания антитела пертузумаба. Данное антитело эффективно ингибирует HER2 опосредованную клеточную сигнализацию, которая может быть использована для лечения опухолей, экспрессирующих HER2, включая раковые образования, обладающие низким уровнем представленности HER2 (с. 3 описания, предпоследний абзац, WO2015157592 ) . В международной заявке WO2015157592 указано, по данным in vitro и in vivo тестов, что антитело обладает высокой активностью в отношении HER2-экспрессирующих клеток, вне зависимости от уровня экспрессии НЕБ2-рецептора, в частности, в отношении клеток тройного негативного (ER-, PR-, HER2 0- 1+) рака молочной железы. Данное свойство препарата заявлено как потенциальное преимущество, т.к. имеющиеся в настоящее время в разработке анти-НЕБ2 антитела направлены на опухоли с гиперэкспрессией HER2 рецептора (HER2 2+ FISH+, 3+) . Однако, помимо данных о противоопухолевой активности препарата, авторами не представлены доклинические исследования токсичности. Учитывая механизм действия препарата, а также механизм развития токсичности анти-НЕй2 антител (блокада HER2 сигналинга и интернализация HER2 рецептора) , следует предположить усиление токсических свойств антитела, представленного в международной заявке WO2015157592. Данное предположение основано на указанных в заявке свойствах антитела - усиленной интернализации HER2 рецептора и усиленных ADCC свойствах в отношении HER2 -экспрессирующих клеток, а также на данных по безопасности других анти-НЕй2 антител. По данным литературы, HER2 рецептор является неотъемлемой структурной составляющей кардиомиоцитов, клеток эндотелия, эпителия тонкой кишки. Таким образом, указанное в заявке WO2015157592 антитело, с большой вероятностью будет воздействовать на все здоровые клетки организма, экспрессирующие HER2 рецептор. Это подтверждается данными по безопасности, полученными в ходе КИ 1 фазы, где частота возникновения диареи составила 44%, что косвенно свидетельствует о токсичности в отношении кишечного эпителия.

Для доказательства отсутствия влияния разработанного нами биспецифического анти-НЕй2 антитела по данному изобретению (BCD-147- 02-020) на здоровые (немалигнизированные) HER2-экспрессирующие клетки был проведен тест на клетках эндотелия сосудов человека HUVEC, экспрессирующих HER2 рецептор (AGHAJANIAN Н. ЕТ AL . , Coronary vasculature patterning requires a novel endothelial ErbB2 holoreceptor, Nat Commun . , 2016, no. 7:12038. doi: 10.1038/ncommsl2038 ) . По результатам данного in vitro теста активность антитела в отношении данной клеточной линии, а именно антителозависимая клеточная цитотоксичность, минимальна, что позволяет сделать вывод о потенциально низкой токсичности препарата BCD-147-02- 020 и высокой селективности в отношении опухолевых HER2- гиперэкспрессирующих клеток.

В международной заявке WO2015077891 (заявка RU2016125551 ) описана антигенсвязывающая конструкция, содержащая первую антигенсвязывающую полипептидную конструкцию, которая моновалентно и специфически связывает ECD2 (внеклеточный домен 2) антигена HER2, и вторую антигенсвязывающую полипептидную конструкцию, которая моновалентно и специфически связывает ECD4 (внеклеточный домен 4) антигена HER2, причем один или оба из первого или второго антигенсвязывающего полипептида представляют собой scFv. Данное антитело демонстрирует увеличенные эффекторные функции, в том числе комплементзависимую цитотоксичность (CDC) , по сравнению с каждой соответствующей моноспецифической двухвалентной антигенсвязывающей конструкцией (т.е. по сравнению с моноспецифической двухвалентной антигенсвязывающей конструкцией, которая связывается с ECD2, или моноспецифической бивалентной антигенсвязывающей конструкции, которая связывается с ECD4, и/или в сравнение с комбинацией двух моноспецифических двухвалентных антигенсвязывающих конструкций (абзац [00147], с. 36 описания W02015077891 ) . Биспецифическое антитело по данному изобретению (BCD-147-02-020) вообще не проявляет комплементзависимую цитотоксичность (CDC) .

В связи с вышесказанным, актуальным является создание нового нетоксичного биспецифического антитела, которое специфично связывается с IV и II субдоменами внеклеточного домена HER2 у опухолевых HER2- гиперэкспрессирующих клеток, и проявляет антитело-зависимую клеточно- опосредованную цитотоксичность (ADCC) , но не проявляет комплементзависимую цитотоксичность (CDC) .

Биспецифическое антитело BCD-147-02-020 связывается с 4 и 2 субдоменом внеклеточного домена HER2, таким образом, стерически, данному антителу свойственно эффективно блокировать как лиганд- зависимую, так и лиганд-независимую димеризацию.

Биспецифическое антитело BCD-147-02-020 способно предотвращать не только HER2/HER3 димеризацию, но и димеризацию HER2 с EGFR и HER4.

Биспецифическое антитело BCD-147-02-020 проявляет следующие свойства :

1. способствует интернализации и деградации HER2 (посредством убиквитинирования С-СЫ) ;

2. блокирует лиганд-независимую димеризацию HER2 ;

3. предотвращает лиганд-зависимую гетеродимеризацию HER2 с другими рецепторами семейства HER1, HER3, и HER4, так как связывается со II субдоменом внеклеточного домена HER2

4. блокирует PI3K/Akt сигналинг (препятствуя димеризации);

5. проявляет антитело-зависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC) ;

6. не проявляет комплементзависимую цитотоксичность (CDC) ;

7. в присутствии анти-НЕБ2 (IV) компонента антитела HER2 становится высоко пластичным, в особенности в области I и III доменов, и это способствует усиленной ассоциации его с анти-НЕБ2 (II) компонентом антитела.

Краткое описание изобретения

Настоящее изобретение относится к биспецифическому антителу BCD- 147-02-020, которое специфично связывается с IV и II субдоменами внеклеточного домена HER2, и обеспечивает усиленную блокаду HER2 опосредованных сигнальных путей.

Такое антитело может быть использовано для лечения заболевания или нарушения, опосредуемого HER2.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к биспецифическому антителу, которое специфично связывается с IV субдоменом внеклеточного домена (ECD4) HER2 (рецептор эпидермального фактора роста 2) человека и II субдоменом внеклеточного домена (ECD2) HER2 человека, и включает:

1) первую антигенсвязывающую часть, которая специфично связывается с IV субдоменом внеклеточного домена (ECD4) HER2, и представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv) трастузумаба с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO: 1;

2) вторую антигенсвязывающую часть, которая специфично связывается с II субдоменом внеклеточного домена (ECD2) HER2, и представляет собой участок связывания антигена (Fab), включающий вариабельный домен тяжелой цепи (VH) с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO: 2, и вариабельный домен легкой цепи (VL) с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO: 6;

3) кристаллизующийся фрагмент иммуноглобулина ( Fc-фрагмент ) .

В некоторых вариантах биспецифическое антитело представляет собой антитело IgG.

В некоторых вариантах биспецифическое антитело IgG относится к изотипу IgGl, IgG2, IgG3 или IgG4 человека.

В некоторых вариантах биспецифическое антитело относится к изотипу IgGl человека.

В некоторых вариантах биспецифическое антитело включает кристаллизующийся фрагмент иммуноглобулина (Fc-фрагмент), который содержит две аминокислотные последовательности второго и третьего константных доменов (СН2-СНЗ), представленные SEQ ID NO: 10-11, соответственно .

В некоторых вариантах биспецифическое антитело включает вторую антигенсвязывающую часть, которая специфично связывается с II субдоменом внеклеточного домена (ECD2) HER2, и представляет собой участок связывания антигена (Fab), включающий:

а) вариабельный домен тяжелой цепи (VH) и первый константный домен тяжелой цепи (CHI), с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO: 12;

б) вариабельный домен легкой цепи (VL) и константный домен легкой цепи (СК) , с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO: 13

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к биспецифическому антителу, которое специфично связывается с IV субдоменом внеклеточного домена (ECD4) HER2 (рецептор эпидермального фактора роста 2) человека и II субдоменом внеклеточного домена (ECD2) HER2 человека, и состоит из:

1) аминокислотной последовательности, которая специфично связывается с IV субдоменом внеклеточного домена (ECD4) HER2, включающей константные домены СН2 и СНЗ, и одноцепочечный вариабельного фрагмент (scFv) трастузумаба, с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO: 14;

2) тяжелой цепи антитела, которое специфично связывается с II субдоменом внеклеточного домена (ECD2) HER2, включающей вариабельный домен тяжелой цепи (VH) и первый, второй и третий константные домены тяжелой цепи (СН1-СН2-СНЗ ) , с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO: 15; 3) легкой цепи антитела, которое специфично связывается с II субдоменом внеклеточного домена (ECD2) HER2, включающей вариабельный домен легкой цепи (VL) и константный домен легкой цепи (СК) , с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO: 13,

где части 1)-3) соединены между собой дисульфидными мостиками.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к нуклеиновой кислоте, которая кодирует вышеуказанное антитело.

В некоторых вариантах нуклеиновая кислота представляет собой ДНК.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к экспрессионному вектору, содержащему вышеуказанную нуклеиновую кислоту .

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу получения клетки-хозяина для получения вышеуказанного антитела, который включает трансформирование клетки вышеуказанным вектором.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к клетке- хозяину для получения вышеуказанного антитела, содержащей вышеуказанную нуклеиновую кислоту.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу получения вышеуказанного антитела, который заключается в культивировании вышеуказанной клетки-хозяина в культуральной среде в условиях, достаточных для получения указанного антитела, при необходимости, с последующим выделением и очисткой полученного антитела .

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для лечения заболевания или нарушения, опосредуемого HER2, содержащей вышеуказанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в терапевтически эффективном количестве, в сочетании с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми эксципиентами .

В некоторых вариантах фармацевтическая композиция предназначена для лечения заболевания или нарушения, опосредуемого HER2, которое выбрано из группы: рак молочной железы (РМЖ) , злокачественное новообразование желудка, немелкоклеточный рак лёгкого, злокачественное новообразование головы и/или шеи, плоскоклеточный рак головы и шеи (ПРГШ) , колоректальный рак (КРР) , эзофагеальный рак, рак яичника, рак поджелудочной железы, рак ЖКТ, рак почек, рак шейки матки, рак эндометрия, рак матки, злокачественная меланома, рак глотки, рак ротовой полости или рак кожи.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для лечения заболевания или нарушения, опосредуемого HER2, содержащей вышеуказанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в терапевтически эффективном количестве и по меньшей мере одно терапевтически активное противоопухолевое соединение в терапевтически эффективном количестве.

В некоторых вариантах фармацевтическая композиция предназначена для лечения заболевания или нарушения, опосредуемого HER2, которое выбрано из группы: рак молочной железы (РМЖ) , злокачественное новообразование желудка, немелкоклеточный рак лёгкого, злокачественное новообразование головы и/или шеи, плоскоклеточный рак головы и шеи (ПРГШ) , колоректальный рак (КРР) , эзофагеальный рак, рак яичника, рак поджелудочной железы, рак ЖКТ, рак почек, рак шейки матки, рак эндометрия, рак матки, злокачественная меланома, рак глотки, рак ротовой полости или рак кожи.

В некоторых вариантах фармацевтическая композиция включает терапевтически активное противоопухолевое соединение, которое выбирают из цитотоксического средства, химиотерапевтического средства, антитела или противогормонального средства.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу ингибирования биологической активности HER2 у субъекта, который нуждается в таком ингибировании, включающий введение субъекту эффективного количества вышеуказанного антитела.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу лечения заболевания или нарушения, опосредованного HER2, включающий введение субъекту, нуждающемуся в таком лечении, вышеуказанного антитела или вышеуказанной фармацевтической композиции, в терапевтически эффективном количестве.

В некоторых вариантах способа лечения, заболевание или нарушение выбрают из группы: рак молочной железы (РМЖ) , злокачественное новообразование желудка, немелкоклеточный рак лёгкого, злокачественное новообразование головы и/или шеи, плоскоклеточный рак головы и шеи (ПРГШ) , колоректальный рак (КРР) , эзофагеальный рак, рак яичника, рак поджелудочной железы, рак ЖКТ, рак почек, рак шейки матки, рак эндометрия, рак матки, злокачественная меланома, рак глотки, рак ротовой полости или рак кожи.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к применению вышеуказанного антитела или вышеуказанной фармацевтической композиции для лечения у субъекта, нуждающегося в таком лечении, заболевания или нарушения, опосредуемого HER2.

В некоторых вариантах применения, заболевание или нарушение выбирают из группы: рак молочной железы (РМЖ) , злокачественное новообразование желудка, немелкоклеточный рак лёгкого, злокачественное новообразование головы и/или шеи, плоскоклеточный рак головы и шеи (ПРГШ) , колоректальный рак (КРР) , эзофагеальный рак, рак яичника, рак поджелудочной железы, рак ЖКТ, рак почек, рак шейки матки, рак эндометрия, рак матки, злокачественная меланома, рак глотки, рак ротовой полости или рак кожи. Краткое описание чертежей

Фиг. 1. Кольцевая схема плазмиды pEE-Fc, предназначенной для наработки экстраклеточного домена белка Нег2 человека в клетках млекопитающих. AmpR - ген бета-лактамазы, обеспечивающий устойчивость к ампициллину, CMV promoter - промотор ранних генов цитомегаловируса, oriP - ориджин репликации, START - Старт-кодон, Leader - Лидерный пептид IgGk мыши, hHer2 -Синтетическая последовательность антигена Нег2 человека, Fc - Fc-фрагмент IgGl человека, His - полигистидиновый таг, STOP - стоп-кодоны.

Фиг. 2. Кольцевая схема плазмиды рЕЕ-СК, предназначенной для наработки легкой цепи антитела в клетках млекопитающих. AmpR - ген бета-лактамазы, обеспечивающий устойчивость к ампициллину, CMV promotor - промотор ранних генов цитомегаловируса, oriP - ориджин репликации, START - Старт-кодон, Leader - лидерный пептид IgGk мыши, VL - последовательность вариабельного домена легкой цепи антитела, СК

- константный домен легкой цепи изотипа к IgGl человека, STOP - стоп- кодон, polyA - сайт полиаденилирования .

Фиг. 3. Кольцевая схема плазмид рЕЕ-НС, предназначенных для наработки тяжелой цепи антитела в клетках млекопитающих. AmpR - ген бета-лактамазы, обеспечивающий устойчивость к ампициллину, CMV promotor - промотор ранних генов цитомегаловируса, oriP - ориджин репликации, START - Старт-кодон, Leader - лидерный пептид IgGk, VH - последовательность вариабельного домена тяжелой цепи антитела, НС - константные домены (CHI, СН2, СНЗ) тяжелой цепи IgGl человека, Fchole

- СН2, СНЗ домены IgGl человека с внесенными мутациями hole. STOP - стоп-кодон, polyA - сайт полиаденилирования.

Фиг. 4. Кольцевая схема плазмид pEE-HChole, предназначенных для наработки тяжелой цепи антитела в клетках млекопитающих. AmpR - ген бета-лактамазы, обеспечивающий устойчивость к ампициллину, CMV promotor - промотор ранних генов цитомегаловируса, oriP - ориджин репликации, START - Старт-кодон, Leader - лидерный пептид IgGk, VH - последовательность вариабельного домена тяжелой цепи антитела, НС - константные домены (CHI, СН2, СНЗ) тяжелой цепи IgGl человека, Fchole

- СН2, СНЗ домены IgGl человека с внесенными мутациями hole. STOP - стоп-кодон, polyA - сайт полиаденилирования.

Фиг. 5. Дизайн библиотеки с отбором по стабильности Дизайн последовательностей легких цепей.

Фиг. б. Дизайн библиотеки с отбором по стабильности Дизайн последовательностей тяжелых цепей.

Фиг. 7. Дизайн библиотеки с отбором по аффинности . Дизайн последовательностей легких цепей.

Фиг. 8. Дизайн библиотеки с отбором по аффинности . Дизайн последовательностей тяжелых цепей. Фиг. 9. Кольцевая схема плазмиды pBL, предназначенная для экспрессии белков в клетках Е. coli. AmpR - ген бета-лактамазы, обеспечивающий устойчивость к ампициллину, pBR322_ori - ориджин репликации из плазмиды pBR322, lad - ген репрессора лактозного оперона, KmR - ген аминогликозид фосфотрансферазы, обеспечивающий устойчивость к канамицину, Leader - лидерный пептид, обеспечивающий периплазматическую экспрессию в E.coli, VL - последовательность вариабельного домена легкой цепи антитела, СК - константный домен легкой цепи изотипа к IgGl человека, VH - последовательность вариабельного домена тяжелой цепи антитела, СН1 - константный домен IgGl человека, Myc-tag, His-tag - таги.

Фиг. 10. Результаты кинетического анализа для 8 Fab-фрагментов синтетической библиотеки (кривая ассоциации-диссоциации) , продемонстрировавших связывание в иммуноферментном анализе.

Фиг. 11. Схематическое изображение формата асимметрик. Биспецифическое ассиметричное антитело, которое специфично связывается с IV и II субдоменами внеклеточного домена HER2 человека, состоит из 1) Fc-knob - scFv-Трастузумаб, 2) HC-hole - аНЕБ2-кандидат 020-VH, 3) Ck - аНЕБ2-кандидат 020 VL .

Фиг. 12. Кольцевая схема плазмиды pEE-scFvTrast-Fc_knob . AmpR - ген бета-лактамазы, обеспечивающий устойчивость к ампициллину, CMV promoter - промотор ранних генов цитомегаловируса, oriP - ориджин репликации, START - Старт-кодон, Leader - лидерный пептид IgGk, scFv- Trastuzumab - последовательность вариабельных доменов контрольного антитела в формате scFv, S-linker - линкер ASGDKTHT, Fcknob - СН2, СНЗ домены IgGl человека с внесенными мутациями knob, His-tag - полигистидиновый таг, STOP - стоп-кодон, polyA - сайт полиаденилирования .

Фиг. 13. Электрофорез кандидатов антител в полиакриламидном геле в нередуцирующих условиях. Кандидаты 001 - 017 в формате IgGl (146 кДа) , кандидаты 019 - 035 - в формате асимметрик (125,5 кДа) .

1- маркер Bio-Rad Protein Standard

2- BCD147-02-001 Юмкг

3- BCD147-02-002 Юмкг

4- BCD147-02-003 Юмкг

5- BCD147-02-005 Юмкг

6- BCD147-02-007 Юмкг

7- BCD147-02-008 Юмкг

8- BCD147-02-009 Юмкг

9- BCD147-02-010 Юмкг

10- BCD147-02-012 Юмкг

Фиг. 14. Электрофорез кандидатов антител в полиакриламидном геле в нередуцирующих условиях. Кандидаты 001 - 017 в формате IgGl (146 кДа) , кандидаты 019 - 035 - в формате асимметрик (125,5 кДа) .

1- маркер Bio-Rad Protein Standard

2- BCD147-02-013 Юмкг 3- BCD147-02-014 Юмкг

4- BCD147-02-017 Юмкг

5- BCD147-02-019 Юмкг

6- BCD147-02-020 Юмкг

7- BCD147-02-021 Юмкг

8- BCD147-02-022 Юмкг

9- BCD147-02-023 Юмкг

10- BCD147-02-024 Юмкг

Фиг. 15. Электрофорез кандидатов антител в полиакриламидном геле в нередуцирующих условиях. Кандидаты 001 - 017 в формате IgGl (146 кДа) , кандидаты 019 - 035 - в формате асимметрик (125,5 кДа) .

1- маркер Bio-Rad Protein Standard

2- BCD147-02-026 Юмкг

3- BCD147-02-027 Юмкг

4- BCD147-02-028 Юмкг

5- BCD147-02-029 Юмкг

6- BCD147-02-030 Юмкг

7- BCD147-02-031 Юмкг

8- BCD147-02-032 Юмкг

9- BCD147-02-033 Юмкг

Фиг. 16. Электрофорез кандидатов антител в полиакриламидном геле в нередуцирующих условиях. Кандидаты 001 - 017 в формате IgGl (146 кДа) , кандидаты 019 - 035 - в формате асимметрик (125,5 кДа) .

1- маркер Bio-Rad Protein Standard

2- BCD147-02-034 Юмкг

3- BCD147-02-035 Юмкг

Фиг. 17. Результаты кинетического анализа для полноразмерных антител в формате IgGl (кандидаты 001-017) и асимметрик (кандидаты 019

- 035) .

Фиг. 18. Кривые ассоциации-диссоциации конкуренции кандидатов 017 035 с Трастузумаб в формате «Ih-tandem». Подписи над кривыми демонстрируют последовательность загрузки антигена, контрольного антитела и кандидатов на сенсор. Кривые для различных кандидатов накладываются друг на друга.

Фиг. 19. Кривые ассоциации-диссоциации конкуренции кандидатов 017 035 с Pertuzumab в формате «Ih-tandem». Подписи над кривыми демонстрируют последовательность загрузки антигена, контрольного антитела и кандидатов на сенсор. Кривые для различных кандидатов накладываются друг на друга.

Фиг. 20. Кривые ассоциации-диссоциации конкуренции кандидатов 017

- 035 с Trastuzumab и Pertuzumab в формате «Sandwich». Подписи над кривыми демонстрируют последовательность загрузки антигена, контрольных антител и кандидатов на сенсор. Кривые для различных кандидатов накладываются друг на друга.

Фиг. 21. Кольцевая схема векторов pSX. p-CMVe/EFlalpha - синтетический промотор, сосотоящий из энхансера CMV и промотора EF- la, START - Старт-кодон, Leader - лидерный пептид IgGk, INSERT - последовательность вставки (тяжелая или легкая цепь антитела) , STOP - стоп-кодон, polyA - сайт полиаденилирования, Enhancer SV-40 - энхансер вируса обезьян SV-40, beta globin MAR - MAR (matrix attachment region) гена b-глобина человека, Rep origin 1 - pUC Ориджин репликации, AmpR - ген бета-лактамазы, обеспечивающий устойчивость к ампициллину, F1 origin - позволяет плазмиде с таким ориджином репликации упаковываться в фаговые частицы при котрансформации с фагами-помощниками VCSM13 и М13К07, SV40 promoter - эукариотический промотор вируса обезьян SV- 40, Antibiotic_R - Ген устойчивости к антибиотику (пуромицин, бластитидин, гигромицин Б) , позволяет вести селекцию трансфецированной клеточной культуры млекопитающих.

Фиг. 22. Зависимость интенсивности флуоресценции от логарифма концентрации антител в антипролиферативном тесте на клеточной линии ВТ-474. На графике представлены 11-кратные вносимые концентрации антител .

Фиг. 23. Зависимость интенсивности флуоресценции от логарифма концентрации антител в антипролиферативном тесте на клеточной линии ВТ-474 с внесением hrEGF. На графике представлены 11-кратные вносимые концентрации антител.

Фиг. 24. Зависимость интенсивности флуоресценции от логарифма концентрации антител в антипролиферативном тесте на клеточной линии ВТ-474 Clone 5, устойчивых к трастузумабу . На графике представлены 11- кратные вносимые концентрации антител.

Фиг. 25. Анализ ADCC на клеточной линии ВТ-474 с использованием репортерной линии с высокоаффинным FcyRIIIa рецептором. На графике представлены 2-кратные вносимые концентрации антител.

Фиг. 26. Анализ ADCC на клеточной линии ВТ-474 с использованием репортерной линии с низкоаффинным FcyRIIIa рецептором. На графике представлены 2-кратные вносимые концентрации антител.

Фиг. 27. Анализ CDC на клеточных линиях ВТ-474 и SK-BR-3. Антитела представлены в концентрации 50 мкг/мл (3-кратная вносимая концентрация антител) , «0 point» - точка без внесения антител, «РС» - положительный контроль CDC (ритуксимаб и WIL2-S) .

Фиг. 28. Анализ ADCC на клеточной линии HUVEC с использованием репортерной линии с высокоаффинным FcyRIIIa рецептором. На графике представлены 4-кратные вносимые концентрации антител.

Фиг. 29. Динамика значения индекса прироста опухоли (опухолевая линия ZR-75-1) .

Фиг. 30. Значение показателя торможения роста опухоли (ТРО) (опухолевая линия ZR-75-1) .

Фиг. 31. Динамика значения индекса прироста опухоли (опухолевая линия SKBR3) .

Фиг. 32. Значение показателя торможения роста опухоли (ТРО) (опухолевая линия SKBR3) . Фиг. 33. Динамика значения индекса прироста опухоли (опухолевая линия ВТ-474 ) .

Фиг. 34. Значение показателя торможения роста опухоли (ТРО) (опухолевая линия ВТ-474) .

Описание изобретения

Определения и общие методы

Если иное не определено в настоящем документе, научные и технические термины, используемые в связи с настоящим изобретением, будут иметь значения, которые обычно понятны специалистам в данной области .

Кроме того, если по контексту не требуется иное, термины в единственном числе включают в себя термины во множественном числе, и термины во множественном числе включают в себя термины в единственном числе. Как правило, используемая классификация и методы культивирования клеток, молекулярной биологии, иммунологии, микробиологии, генетики, аналитической химии, химии органического синтеза, медицинской и фармацевтической химии, а также гибридизации и химии белка и нуклеиновых кислот, описанные в настоящем документе, хорошо известны специалистам и широко применяются в данной области. Ферментативные реакции и способы очистки осуществляют в соответствии с инструкциями производителя, как это обычно осуществляется в данной области, или как описано в настоящем документе.

Определения , связанные с антителом

"HER-рецептор" является рецепторной тирозиновой протеинкиназой, которая относится к семейству HER-рецепторов и включает рецепторы EGFR, HER2, HER3 и HER4 и других представителей такого семейства, которые будут идентифицированы в будущем. HER-рецептор, как правило, может содержать внеклеточный домен, который может связывать лиганд HER; липофильный трансмембранный домен; консервативный внутриклеточный тирозинкиназный домен; и находящийся на карбоксильном конце домен передачи сигнала, несущий несколько остатков тирозина, которые могут быть фосфорилированы. Предпочтительно HER-рецептор представляет собой HER-рецептор человека с нативной последовательностью.

Выражения «ЕгЬВ2» и «HER2» используют в настоящем описании взаимозаменяемо, и они относятся к белку HER2 человека, описанному, например, в Semba et al . , PNAS (USA) 82: 6497-6501 (1985) и Yamamoto et al . Nature 319: 230-234 (1986) (номер доступа в Genebank X03363) . Термин «егЬВ2» относится к гену, кодирующему ЕгЬВ2 человека. Предпочтительный HER2 представляет собой HER2 человека с нативной последовательностью . Внеклеточный домен HER2 содержит четыре домена: домен I (аминокислотные остатки примерно от 1 до 195) , домен II (аминокислотные остатки примерно от 196 до 319) , домен III (аминокислотные остатки примерно от 320 до 488) и домен IV (аминокислотные остатки примерно от 489 до 630) (нумерация остатков без сигнального пептида) . См. Garrett et al . Mol. Cell. 11: 495-505 (2003), Cho et al . Nature 421: 756-760 (2003), Franklin et al . Cancer Cell 5: 317-328 (2004) и Plowman et al . Proc. Natl. Acad. Sci. 90: 1746-1750 (1993) . Также см. фиг. 1 в данном описании.

Под «лигандом HER» подразумевают полипептид, который связывается и/или активирует рецептор HER.

Используемые в данном документе термины «связывающийся с человеческим HER2», или «специфически связывающийся с человеческим HER2», или «анти-НЕй2-антитело» являются взаимозаменяемыми и относятся к антителу, специфически связывающемуся с человеческим НЕй2-антигеном с аффинностью связывания, которая имеет значение KD 1*10 ⁸ моль/л или ниже при 25 °С, в одном воплощении имеет значение KD 1*10 ⁹ моль /л или ниже при 25 °С. Аффинность связывания определяют в стандартном анализе связывания при 25°С, таком как методика поверхностного плазменного резонанса (BIAcore®, GE-Healthcare, Упсала, Швеция) . Способ определения значения KD аффинности связывания описан в примере 2b) . Таким образом, термин «антитело, связывающееся с человеческим HER2», используемый в данном документе, относится к антителу, специфически связывающемуся с человеческим НЕй2-антигеном с аффинностью связывания со значением KD 1*10 ⁸ моль/л или ниже (предпочтительно 1 ^c 10 ⁸ моль/л - 1, 0х10 ¹² моль/л) при 25°С.

Амплификация этого гена и/или сверхэкспрессия его белка были обнаружены при многих раковых заболеваниях, в том числе при раке молочной железы (РМЖ) , злокачественном новообразовании желудка, немелкоклеточном раке лёгкого, злокачественном новообразовании головы и/или шеи, плоскоклеточном раке головы и шеи (ПРГШ) , колоректальном раке (КРР) , эзофагеальном раке, раке яичника, раке поджелудочной железы, раке ЖКТ, раке почек, раке шейки матки, раке эндометрия, раке матки, злокачественной меланоме, раке глотки, раке ротовой полости или раке кожи.

Термин «связывающая молекула» включает в себя антитела и иммуноглобулины .

Термин «антитело» или «иммуноглобулин» (Ig), как использовано в данном описании, включает целые антитела и любой антигенсвязывающий фрагмент (т.е. «антигенсвязывающую часть») или его отдельные цепи. Термин "антитело» относится к гликопротеину, содержащему по меньшей мере две тяжелые (Н) цепи и две легкие (L) цепи, взаимосвязанные дисульфидными связями, или его антигенсвязывающей части. Каждая тяжелая цепь содержит вариабельную область тяжелой цепи (сокращенно называемую в данном описании как VH) и константную область тяжелой цепи. Известно пять типов тяжелых цепей антител млекопитающих, которые обозначают греческими буквами: a, d, e, g и m. Присутствующий тип тяжелой цепи определяет класс антитела; указанные цепи обнаружены в антителах типа IgA, IgD, IgE, IgG и IgM соответственно. Различные тяжелые цепи отличаются по размеру и составу; и g содержат примерно 450 аминокислот, а m и e состоят примерно из 550 аминокислот. Каждая тяжелая цепь содержит две области, т.е. константную область и вариабельную область . Константная область является идентичной во всех антителах одного и того же изотипа, но отличается в антителах различного изотипа. Тяжелые цепи g, и d содержат константную область, которая состоит из трех константных доменов CHI, СН2 и СНЗ (выстроены в ряд) и шарнирной области, которая придает гибкость (Woof J., Burton D., Nat Rev Immunol 4, 2004, cc.89-99); тяжелые цепи m и e содержат константную область, которая состоит из четырех константных доменов CHI, СН2, СНЗ и СН4. У млекопитающих известно только два типа легких цепей, которые обозначают как лямбда (l) и каппа (к) . Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (сокращенно называемой в данном описании как VL) и константной области легкой цепи. Примерная длина легкой цепи составляет 211-217 аминокислот. Предпочтительно легкая цепь представляет собой легкую каппа (к) -цепь, а константный домен CL предпочтительно представляет собой С-каппа (к) .

«Антитела» согласно изобретению могут представлять собой антитела любого класса (например, IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, предпочтительно IgG) или подкласса (например, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl и IgA2, предпочтительно IgGl) .

Области VH и VL могут быть дополнительно подразделены на области гипервариабельности, называемые определяющими комплементарность областями (CDR) , разбросанные между областями, которые являются более консервативными, называемыми каркасными областями (FR) . Каждая VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных от амино-конца к карбокси-концу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Вариабельные области тяжелой и легкой цепей содержат домен связывания, который взаимодействует с антигеном. Константные области антител могут опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями хозяина или факторами, включая различные клетки иммунной системы (например, эффекторными клетками) , и первый компонент (Clq) классической системы комплемента.

Термин «антигенсвязывающая часть» антитела или «антигенсвязывающий фрагмент» (или просто «часть антитела» или «фрагмент антитела») , как использовано в данном описании, относится к одному или нескольким фрагментам антитела, которые сохраняют способность специфически связываться с антигеном. Было показано, что антигенсвязывающая функция антитела может выполняться фрагментами полноразмерного антитела. Примеры связывающих фрагментов, включенных в термин "антигенсвязывающая часть» антитела включают (i) Fab- фрагмент, одновалентный фрагмент, состоящий из доменов VL, VH, CL и CHI; (ii) F (ab ^f ) 2-фрагмент, двухвалентный фрагмент, содержащий два Fab-фрагмента, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (iii) Fd- фрагмент, состоящий из доменов VH и CHI; (iv) Fv-фрагмент, состоящий из доменов VL и VH в едином плече антитела, (v) dAb-фрагмент (Ward et al . , (1989) Nature 341:544-546), который состоит из домена VH/VHH; и (vi) выделенная определяющая комплементарность область (CDR) . Кроме того, две области Fv-фрагмента, VL и VH, кодируются разными генами, они могут быть соединены при помощи рекомбинантных способов с использованием синтетического линкера, который дает возможность получать их в виде единой белковой цепи, в которой области VL и VH спариваются с образованием одновалентных молекул (известных как одноцепочечный Fv (scFv); см., например, Bird et al . (1988) Science 242:423-426; и Huston et al . (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879- 5883) . Предполагается, что такие одноцепочечные молекулы также включены в термин "антигенсвязывающая часть» антитела. Такие фрагменты антител получают с использованием общепринятых способов, известных специалистам в данной области, и эти фрагменты подвергают скринингу таким же образом, как и интактные антитела.

Предпочтительно CDR антигенсвязывающего участка или весь антигенсвязывающий участок антител по изобретению имеет происхождение из мыши, ламы или донорской человеческой библиотеки или по существу человеческое происхождение с определенными аминокислотными остатками, измененными, например, замещенными разными аминокислотными остатками с тем, чтобы оптимизировать конкретные свойства антитела, например KD, koff, IC50, ЕС50, ED50. Предпочтительно каркасные участки антитела по изобретению имеют человеческое происхождение или по существу человеческое происхождение (по крайней мере на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% человеческое происхождение) .

В других вариантах осуществления антигенсвязывающий участок антитела по изобретению может происходить из других нечеловеческих видов, включая мыши, ламы, кролика, крысу или хомяка, но не ограничиваясь ими. Альтернативно, антигенсвязывающий участок может происходить из человеческих видов.

Термин «вариабельный» относится к тому факту, что определенные сегменты вариабельных доменов широко отличаются в последовательности среди антител. Домен V опосредует связывание антигена и определяет специфичность конкретного антитела к его конкретному антигену. Однако вариабельность неравномерно распределяется на участке вариабельных доменов из 110 аминокислот. Напротив, V области состоят из инвариантных фрагментов, называемых каркасными областями (FR) из 15-30 аминокислот, разделенных более короткими участками чрезвычайной вариабельности, называемых «гипервариабельными областями» или CDR. Каждый вариабельный домен нативных тяжелых и легких цепей содержит четыре FR, в основном принимающих конфигурацию бета-листов, связанных тремя гипервариабельными областями, которые образуют петли, связывающие, и в некоторых случаях являющиеся частью бета-складчатой структуры. Гипервариабельные области в каждой цепи удерживаются вместе в тесной близости с помощью FR и с гипервариабельными областями другой цепи вносят вклад в образование антигенсвязывающего сайта антител. Константные домены не принимают непосредственного участия в связывании антитела с антигеном, но проявляют различные эффекторные функции, такие как участие антитела в антителозависимой клеточной цитотоксичности (АЗКЦ, ADCC) .

Термин «гипервариабельная область» по данному описанию относится к аминокислотным остаткам антитела, которые отвечают за связывание антигена. Обычно гипервариабельная область содержит аминокислотные остатки из «области, определяющей комплементарность» или «CDR», и/или такие остатки из «гипервариабельной петли».

В некоторых случаях может также быть предпочтительным изменение одного или более остатков аминокислот CDR-участков с целью повышения аффинности связывания с целевым эпитопом. Это известно, как «созревание аффиности» и в некоторых случаях может выполняться в связи с гуманизацией, например, в ситуациях, когда гуманизация антитела приводит к снижению специфичности или аффинности связывания, и не представляется возможным в достаточной степени улучшить специфичность или аффинность связывания с помощью только обратных мутаций. Различные методы созревания аффинности известны в данной области техники, например, способ in vitro сканирующего насыщающего мутагенеза, описанный Burks et al . , Proc Natl Acad Sci USA, 94:412-417 (1997), и способ пошагового in vitro созревания аффинности, предложенный Wu et al . , Proc Natl Acad Sci USA 95:6037 6042 (1998) .

«Каркасные области» (FR) представляют собой остатки вариабельного домена, отличные от CDR остатков. Обычно каждый вариабельный домен имеет четыре FR, определяемые как FR1, FR2, FR3 и FR4. Если CDR определяются согласно Rabat, FR остатки легкой цепи локализуются, приблизительно, в области остатков 1-23 (LCFR1), 35-49 (LCFR2), 57-88 (LCFR3) и 98-107 (LCFR4), а остатки FR тяжелой цепи локализуются, приблизительно, в области остатков 1-30 (HCFR1), 36-49 (HCFR2), 66-94 (HCFR3) и 103- 113 (HCFR4) в тяжелой цепи. Если участки CDR содержат аминокислотные остатки из гипервариабельных петель, FR остатки легкой цепи локализуются, приблизительно, в остатках 1-25 (LCFR1), 33-49 (LCFR2), 53-90 (LCFR3) и 97-107 (LCFR4) в легкой цепи, a FR остатки тяжелой цепи локализуются, примерно, в остатках 1-25 (HCFRI), 33-52 (HCFR2), 56-95 (HCFR3) и 102-113 (HCFR4) в остатках тяжелой цепи. В некоторых примерах, когда CDR содержит аминокислоты как из CDR по Rabat, так и аминокислоты из гипервариабельной петли, FR соответствующим образом корректируются. Например, когда CDRH1 включает аминокислоты Н26-Н35, остатки FR1 тяжелой цепи находятся в положениях 1-25, а остатки FR2 находятся в положениях 36-49.

Кристаллизующийся фрагмент иммуноглобулина (англ. fragment crystallizable region, Fc region, Fc) — это концевая часть молекулы иммуноглобулина, которая взаимодействует с Fc-рецептором на поверхности клетки и с некоторыми белками системы комплемента. Данное свойство позволяет антителам активировать иммунную систему. Fc-участок IgG, IgA и IgD изотипов состоит из двух одинаковых белковых фрагментов, соответственно, второго и третьего константных доменов двух тяжелых цепей; в случае изотипов IgM и IgE Fc содержит три константных домена тяжелых цепей (домены СН 2-4) в каждой полипептидной цепочке.

Антитело по данному изобретению, «которое связывает» целевой антиген, представляет собой антитело, которое связывает антиген с достаточной аффинностью так, что антитело можно применять в качестве диагностического и/или терапевтического агента при нацеливании на белок или клетку, или ткань, экспрессирующую антиген, и в незначительной степени перекрестно реагирует с другими белками. По данным аналитических методов: сортинга флуоресцентно-активированных клеток (FACS), радиоиммунопреципитации (RIA) или ИФА (ELISA), в таких вариантах изобретения степень связывания антитела с белком, не являющимся «мишенью» (с «нецелевым белком») , составляет менее 10% от связывания антитела с конкретным белком-мишенью. По отношению к связыванию антитела с молекулой-мишенью термин «специфическое связывание» или выражения «специфически связывается с» или «специфический к» конкретному полипептиду или эпитопу на конкретном полипептиде-мишени означает связывание, которое заметно (измеримо) отличается от неспецифического взаимодействия (например, в случае ЬН1- 44 или ЬН1-81 неспецифическое взаимодействие представляет собой связывание с бычьим сывороточным альбумином, казеином, фетальной бычьей сывороткой или нейтравидином) .

Специфическое связывание можно определять количественно, например, определяя связывание молекулы по сравнению со связыванием контрольной молекулы. Например, специфическое связывание можно определять конкурентной реакцией с другой молекулой, аналогичной мишени, например, с избытком немеченой мишени. В этом случае специфическое связывание указывается, если связывание меченой мишени с зондом конкурентно ингибируется избытком немеченой мишени. В данном описании термин «специфическое связывание» или выражения «специфически связывается с» или «специфический к» конкретному полипептиду или эпитопу на конкретном полипептиде-мишени можно характеризовать на примере молекулы, имеющей Kd к мишени по меньшей мере около 200 нМ, или же по меньшей мере около 150 нМ, или же по меньшей мере около 100 нМ, или же по меньшей мере около 60 нМ, или же по меньшей мере около 50 нМ, или же по меньшей мере около 40 нМ, или же по меньшей мере около 30 нМ, или же по меньшей мере около 20 нМ, или же по меньшей мере около 10 нМ, или же по меньшей мере около 8 нМ, или же по меньшей мере около 6 нМ, или же по меньшей мере около 4 нМ, или же по меньшей мере около 2 нМ, или же по меньшей мере около 1 нМ или выше . В одном варианте изобретения термин «специфическое связывание» относится к связыванию, при котором молекула связывается с конкретным полипептидом или эпитопом на конкретном полипептиде, практически не связываясь с каким-либо другим полипептидом или эпитопом на полипептиде . Термин «Ка», как использовано в данном описании, относится к скорости ассоциации конкретного взаимодействия антитело-антиген.

Термин «Kd», как использовано в данном описании, относится к скорости диссоциации конкретного взаимодействия антитело-антиген.

«Аффинность связывания» обычно относится к силе совокупных нековалентных взаимодействий между единичным сайтом связывания молекулы (например, антитела) и ее партнером по связыванию (например, антигеном) . Если не указано иначе, «аффинность связывания» относится к внутренней (характерной, истинной) аффинности связывания, которая отражает 1:1 взаимодействие между членами пары связывания (например, антителом и антигеном) . Аффинность молекулы X к своему партнеру Y обычно можно представить константной диссоциации (Kd) . Желательно, чтобы величина Kd составляла, примерно, 200 нМ, 150 нМ, 100 нМ, 60 нМ, 50 нМ, 40 нМ, 30 нМ, 20 нМ, 10 нМ, 8 нМ, 6 нМ, 4 нМ, 2 нМ, 1 нМ или менее. Аффинность можно измерять обычными методами, известными в уровне техники, включая методы по данному описанию. Низкоаффинные антитела обычно медленно связываются с антигеном и имеют тенденцию легко диссоциировать, тогда как высокоаффинные антитела обычно быстрее связывают антиген и имеют тенденцию дольше оставаться в связанном состоянии. В уровне техники известны различные методы измерения аффинности связывания, любой из этих методов можно использовать для целей настоящего изобретения.

В одном варианте изобретения «Kd» или «величину Kd» по данному изобретению измеряют методами поверхностного плазмонного резонанса на приборе В1Асоге™-2000 или BIAcore™-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) при 25°C, используя чипы с иммобилизованным антигеном СМ5 при ~10 относительных единицах (единицах отклика, RU) . Коротко говоря, биосенсорные чипы с карбоксиметилдекстраном (СМ5, BIAcore Inc.) активируют гидрохлоридом -этил- ' - ( 3-диметиламинопропил) - карбодиимида (EDC) и N-гидроксисукцинимидом (NHS) в соответствии с инструкциями производителя. Антиген разводят 10 мМ раствором ацетата натрия, pH 4.8, до концентрации 5 мкг/мл (~0.2 мкМ) , а затем вводят (инжекция) при скорости потока 5 мкл/минута до достижения, примерно, 10 относительных единиц (RU) связанного белка. После введения антигена вводят 1 М раствор этаноламина, чтобы блокировать непрореагировавшие группы. Для кинетических измерений двукратные серийные разведения Fab (например, от 0.78 нМ до 500 нМ) вводят в PBS с 0.05% Tween 20 (PBST) при 25 °С при скорости потока, примерно, 25 мкл/мин. Величины скорости ассоциации (коп) и скорости диссоциации (koff) рассчитывают, применяя простую модель Ленгмюра для связывания один-плюс-один (BIAcore Evaluation Software версия 3.2), с помощью одновременного получения сенсограммы ассоциации и диссоциации. Константу равновесной диссоциации (Kd) рассчитывают как отношение koff/kon. См., например, Chen, Y., et al . , (1999) J. Mol. Biol. 293: 865-881. Если по данным вышеуказанного метода поверхностного плазмонного резонанса скорость ассоциации превышает 106 М-1 сек-1, тогда ее можно определять методом тушения флуоресценции, который измеряет увеличение или уменьшение интенсивности флуоресцентной эмиссии (возбуждение=295 нм; эмиссия (излучение ) =340 нм, полоса 16 нм) при 25°С раствора антитела против антигена (Fab форма) с концентрацией 20 нМ в PBS, pH 7.2, в присутствии увеличивающихся концентраций антигена, измеряемых с помощью спектрометра, такого как спектрофотометр остановленного потока (Aviv Instruments) или спектрофотометр SLM-Aminco ( ThermoSpectronie ) серии 8000 с кюветой с перемешиванием.

Термин «koff» относится к константе скорости диссоциации конкретного взаимодействия связывающей молекулы и антигена. Константу скорости диссоциации koff можно измерить посредством биослойной интерферометрии, например, с помощью системы Octet™.

«Скорость ассоциации» («oh-rate») или «коп» по данному изобретению можно также определять тем же самым описанным выше методом поверхностного плазмонного резонанса на приборе В1Асоге™-2000 или BIAcore™-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) при 25°C, используя чипы с иммобилизованным антигеном СМ5 при ~10 относительных единицах (единицах отклика, RU) . Коротко говоря, биосенсорные чипы с карбоксиметилдекстраном (СМ5, BIAcore Inc.) активируют гидрохлоридом -этил- ' - ( 3-диметиламино пропил) -карбодиимида (EDC) и N- гидроксисукцинимидом (NHS) в соответствии с инструкциями производителя. Антиген разводят 10 мМ раствором ацетата натрия, pH 4.8, до концентрации 5 мкг/мл (~0.2 мкМ) , а затем вводят (инжекция) при скорости потока 5 мкл/минута до достижения, примерно, 10 относительных единиц (RU) связанного белка. После введения антигена вводят 1 М раствор этаноламина, чтобы блокировать непрореагировавшие группы .

Если специально не указано иначе, выражения «биологически активный», и «биологическая активность», и «биологические характеристики», по отношению к полипептиду по данному изобретению, означают обладание способностью связываться с биологической молекулой.

Выражение «биологическая молекула» относится к нуклеиновой кислоте, белку, углеводу, липиду и их комбинации. В одном варианте изобретения биологическая молекула существует в природе.

Участки антител, такие как Fab- и F (ab ' ) 2-фрагменты, могут быть получены из целых антител с использованием традиционных методов, таких как папаиновый или пепсиновый гидролиз целых антител. Более того, антитела, части антител и молекулы иммуноадгезии могут быть получены с использованием стандартных методов рекомбинантной ДНК, например, как описано в настоящем документе.

Термин «рекомбинантное антитело» означает антитело, которое экспрессируется в клетке или клеточной линии, содержащей нуклеотидную последовательность (нуклеотидные последовательности) , которая кодирует антитела, при этом указанная нуклеотидная последовательность (нуклеотидные последовательности) не ассоциирована с клеткой в природе . Термин «вариантное» антитело, используемый в данном документе, относится к антителу, имеющему аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности его «родительского» антитела путем добавления, удаления и/или замены одного или более аминокислотных остатков относительно последовательности родительского антитела. В предпочтительном варианте осуществления изобретения вариантное антитело содержит по меньшей мере одно или более (например, от одного до двенадцати, например, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь или девять, десять, одиннадцать или двенадцать; и в некоторых вариантах осуществления изобретения от одного до примерно десяти) добавлений, делеций и/или замен аминокислот относительно родительского антитела. В некоторых вариантах осуществления изобретение добавления, делеции и/или замены осуществляются на CDR-участках вариантного антитела. Идентичность или гомология по отношению к последовательности вариантного антитела определяется в настоящем документе как процент аминокислотных остатков в последовательности вариантного антитела, которые идентичны остаткам родительского антитела, после выравнивания последовательностей и введения гэпов, если это необходимо, для достижения максимального процента идентичности последовательности. Вариантное антитело сохраняет способность связываться с тем же антигеном, и предпочтительно эпитопом, с которым связывается родительское антитело, и в некоторых вариантах осуществления изобретения по меньшей мере одно свойство или биологическая активность превосходит аналогичные свойства родительского антитела. Например, вариантное антитело может иметь, например, более выраженную аффинность связывания, более длительный период полувыведения, более низкое значение ИК50 или повышенную способность подавлять биологическую активность антигена по сравнению с родительским антителом. Особый интерес в настоящем документе представляет вариантное антитело, показывающее биологическую активность, превышающую по меньшей мере в 2 раза (предпочтительно, по меньшей мере в 5 раз, 10 раз или 20 раз) биологическую активность родительского антитела.

Термин «биспецифическое антитело» означает антитело, содержащее антигенсвязывающий домен или антигенсвязывающие домены, которые способны к специфическому связыванию с двумя различными эпитопами на одной биологической молекуле или способны к специфическому связыванию с эпитопами на двух различных биологических молекулах. Биспецифичное антитело также упоминается в настоящем документе, как обладающее «двойной специфичностью» или как являющееся антителом с «двойной специфичностью» или «бипаратопное антитело».

Термин «химерное антитело» относится в широком смысле к антителу, которое содержит одну или более областей из одного антитела, и одну или более областей из одного или нескольких других антител, как правило, антитело, частично человеческого происхождения и частично нечеловеческого происхождения, то есть полученное частично из не относящегося к человеку животного, например, мыши, крысы или другого грызуна или верблюдовых, таких как лама или альпака. Химерные антитела являются предпочтительными по сравнению с нечеловеческими антителами для того, чтобы снизить риск иммунного ответа, направленного против антител у человека, например, ответа, направленного против мышиных антител у человека в случае мышиного антитела. Примером типичного химерного антитела является то, в котором последовательности вариабельного участка являются мышиными, в то время как последовательности константного участка являются человеческими. В случае химерного антитела нечеловеческие части могут быть подвергнуты дальнейшему изменению с целью гуманизации антитела.

Термин «гуманизация» относится к факту, что когда антитело имеет полностью или частично нечеловеческое происхождение, например, антитело мыши или ламы, полученное при иммунизации мышей или лам, соответственно, с представляющим интерес антигеном, или является химерным антителом на основе такого антитела мыши или ламы, можно заменить некоторые аминокислоты, например, в каркасных областях и константных доменах тяжелой и легкой цепей, с тем чтобы избежать или свести к минимуму иммунный ответ у человека. Специфичность взаимодействия антитела с антигеном-мишенью присуща главным образом аминокислотным остаткам, расположенных в шести CDR-участках тяжелой и легкой цепи. Поэтому аминокислотные последовательности внутри CDR- участков, являются гораздо более вариабельными между отдельными антителами, по сравнению с последовательностями вне CDR-участков . Поскольку последовательности CDR участков отвечают за большинство антитело-антиген взаимодействий, можно экспрессировать рекомбинантные антитела, которые имитируют свойства специфического природного антитела, или в более общем плане какого-либо специфического антитела с данной аминокислотной последовательностью, например, путем конструирования экспрессионных векторов, которые экспрессируют последовательности CDR-участков из специфического антитела и каркасные последовательности другого антитела. В результате, можно «гуманизировать» нечеловеческое антитело и в значительной степени сохранить специфичность связывания и аффинность исходного антитела. Несмотря на то, что невозможно точно предсказать иммуногенность и тем самым иммунный ответ, направленный против антитела у человека на конкретное антитело, нечеловеческие антитела, как правило, более иммуногенны, чем человеческие антитела. Химерные антитела, у которых инородные (например, грызуна или верблюда) константные участки были заменены последовательностями человеческого происхождения, показали в целом более низкую иммуногенность, чем антитела полностью инородного происхождения, и существует тенденция использовать в терапевтических антителах гуманизированные или полностью человеческие антитела. Химерные антитела или другие антитела нечеловеческого происхождения, таким образом, могут быть гуманизированы, чтобы снизить риск иммунного ответа, направленного против антитела, у человека. Для химерных антител, гуманизация обычно включает в себя модификацию каркасных участков последовательностей вариабельного участка. Аминокислотные остатки, которые являются частью участков, определяющих комплементарность (CDR участков) , чаще всего не будут изменяться в связи с гуманизацией, хотя в некоторых случаях это может быть желательным, чтобы изменить отдельные аминокислотные остатки CDR- участка, например, чтобы удалить участок гликозилирования, участок дезамидирования, участок изомеризации аспартата или нежелательный остаток цистеина или метионина. N-связанное гликозилирование происходит путем присоединения олигосахаридной цепи к остатку аспарагина в трипептидной последовательности Asn-X-Ser или Asn-X-Thr, где X может быть любой аминокислотой, кроме Pro. Удаление участка N- гликозилирования может быть достигнуто путем мутирования Asn или Ser/Thr остатка другим остатком, предпочтительно путем консервативной замены. Дезамидирование остатков аспарагина и глутамина может происходить в зависимости от таких факторов, как pH и обнажение поверхности. Остатки аспарагина особенно восприимчивы к дезамидированию, прежде всего, если они присутствуют в последовательности Asn-Gly, и в меньшей степени в других дипептидных последовательностях, таких как Asn-Ala. При наличии такого дезамидированного участка, например, Asn-Gly в последовательности CDR- участка, может быть предпочтительным удалить этот участок, как правило, путем консервативной замены для удаления одного из вовлеченных остатков.

В данной области техники известны многочисленные способы гуманизации последовательности антитела. Одним из наиболее часто используемых методов является трансплантация CDR-участков. Трансплантация CDR участка может быть основана на определениях CDR- участков по Rabat, хотя в более поздней публикации (Magdelaine- Beuzelin et al . , Crit Rev. Oncol Hematol. 64:210 225 (2007)) предполагается, что определение no IMGT® (the international ImMunoGeneTics information system®, www.imgt.org) может улучшить результат гуманизации (см Lefranc et al . , Dev. Comp Immunol. 27:55-77 (2003)) . В некоторых случаях, трансплантация CDR-участкка может уменьшить специфичность и аффинность связывания, и, следовательно, биологическую активность, в CDR трансплантированном нечеловеческом антителе, по сравнению с родительским антителом, из которого получены CDR-участки. Обратные мутации (иногда именуемые «ремонт каркасного участка») , могут применяться в выбранных положениях CDR трансплантированного антитела, как правило, в каркасных участках, для того, чтобы восстановить специфичность и аффинность связывания родительского антитела. Определение позиций для возможных обратных мутаций может быть выполнено с использованием информации, имеющейся в литературе и в базах данных антител. Аминокислотные остатки, которые являются кандидатами для обратных мутаций, как правило, расположены на поверхности молекулы антитела, в то время как остатки, которые углублены или имеют низкую степень обнажения поверхности обычно не будут подвержены изменениям. Метод гуманизации, альтернативный трансплантации CDR-участка и обратной мутации, представляет собой изменение поверхности, при котором неэкспонированные на поверхности остатки нечеловеческого происхождения, сохраняются, в то время как экспонированные на поверхности остатки изменяются в человеческие остатки .

Существует две технологии получения полностью человеческих антител: с использованием in vitro собранных фаговых библиотек или in vivo иммунизацией гуманизированных животных (мышей, крыс и т.д.) .

Конструирование комбинаторных фаговых библиотек антител начинается с выбора источника генного репертуара, в зависимости от которого можно выделить несколько видов библиотек антител: наивные, иммунные или синтетические. Наивные и иммунные библиотеки конструируют, используя естественным образом реорганизованные гены, кодирующие вариабельные домены иммуноглобулинов здоровых или иммунных к какому-либо антигену доноров, соответственно. Для этого выделяют мРНК клеток лимфоидного ряда, продуцирующих антитела. Чаще всего это лимфоциты периферической крови, но в некоторых случаях используют спленоциты [Sheets MD, Amersdorfer Р, Finnern R, Sargent P, Lindquist E, Schier R, et al. Efficient construction of a large nonimmune phage antibody library: the production of high-affinity human single-chain antibodies to protein antigens. Proc Natl Acad Sci U S A 1998,95:6157- 6162 и de Haard HJ, van Neer N, Reurs A, Hufton SE, Roovers RC, Henderikx P, et al . A large non-immunized human Fab fragment phage library that permits rapid isolation and kinetic analysis of high affinity antibodies. J Biol Chem 1999,274:18218-18230.], клетки миндалин или лимфоциты костного мозга [Vaughan TJ, Williams AJ, Pritchard К, Osbourn JK, Pope AR, Earnshaw JC, et al . Human antibodies with sub-nanomolar affinities isolated from a large non-immunized phage display library. Nat Biotechnol 1996,14:309-314.]. На основе мРНК синтезируют кДНК, при этом для праймирования реакции могут быть взяты олиго-dT праймеры и статистические гексаолигонуклеотиды, что позволяет получать кДНК копии всех возможных вариантов генов, кодирующих вариабельные домены антител [Улитин АБ, Капралова МВ, Даман АГ, Шепеляковсткая АО, Булгакова ЕВ, Фурсова КК, et al . Библиотека миниантител человека в формате фагового дисплея. Создание и апробация. ДАН: Изд-во «Наука»; 2005.].

Сразу могут использоваться один или несколько праймеров, ограничивающих набор амплифицируемых генов до одного или нескольких семейств генов вариабельных доменов или изотипов антител уже на уровне кДНК [Marks JD, Hoogenboom HR, Bonnert TP, McCafferty J, Griffiths AD, Winter G. Bypassing immunization. Human antibodies from V-gene libraries displayed on phage. J Mol Biol 1991,222:581-597]. Праймеры, используемые для амплификации генов, кодирующих иммуноглобулины, комплементарны их наиболее консервативным участкам. Их последовательности выбирают из коллекций генов, которые организованы в базы данных, такие как база данных Rabat или V BASE. Дизайн праймеров также предусматривает наличие в них внутренних сайтов рестрикции, позволяющих клонировать ПЦР продукты в состав соответствующих векторов .

Конструирование синтетических библиотек основано на замене природных CDR на набор случайных последовательностей, что позволяет создавать огромное разнообразие антигенсвязывающих сайтов.

Фаговый дисплей является первой и самой широко распространенной in vitro технологией для поиска антител. В 1985 году Смит обнаружил, что последовательности чужеродной ДНК могут быть клонированы в нитевидный бактериофаг М13 таким образом, что клонированные последовательности генов экспрессируются на поверхности фаговых частиц как слитые белки (Smith GP : Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science 1985, 228:1315-1317.) . Таким образом, можно проводить селекцю интересующих нас слитых белков на основе их способности связывать другие белки. Это открытие было скомбинировано с методами ПЦР- амплификации, что позволило клонировать кДНК репертуар генов иммуноглобулинов для создания разнообразных фаговых библиотек, содержащих вариабельные домены, которые могут быть использованы для быстрого поиска мишень -специфичных моноклональных антител. Репертуар фаговых библиотек отражает репертуар антител В-лимфоцитов каждого человека или животного, кровь которого была использована при создании библиотеки. В 1995 году две статьи сообщили о создании генетически сконструированных мышей, которые экспрессировали полностью человеческие антитела, репертуар которых может быть соспоставим с полученных гибридомной технологией (Lonberg N, Taylor LD, Harding FA, Trounstine M, Higgins KM, Schramm SR, Kuo CC, Mashayekh R, Wymore K, McCabe JG et al . : Antigen-specific human antibodies from mice comprising four distinct genetic modifications. Nature 1994, 368:856- 859) У этих животных были целенаправленно разрушены гены своих собственных эндогенных тяжелых и к легких цепей иммунноглобулинов и введены трансгены, представляющие собой сегменты генов тяжелых и к легких цепей человека. Оказалось, что репертуар генов человека может быть использован мышиной иммунной системой для создания высокоспецифичных и высокоаффинных антител ко большему разнообразию антигенов. Несмотря на то, что трансгенные мыши экспрессируют В- клеточные рецепторы, которые по существу являются гибридными мышиных и человеческих (человеческий иммуноглобулин, мышиные Ig , Irb и другие сигнальные молекулы), их В-клетки нормально развиваются и созревают.

Термин «моноклональное антитело» или «тАЬ» ОТНОСИТСЯ К антителу, которое синтезировано и выделено отдельной клональной популяцией клеток. Клональная популяция может быть клональной популяцией иммортализованных клеток. В некоторых вариантах осуществления изобретения иммортализованные клетки в клональной популяции являются гибридными клетками, гибридомами, которые обычно получают путем слияния отдельных В-лимфоцитов от иммунизированных животных с отдельными клетками лимфоцитарной опухоли. Гибридомы представляют собой тип сконструированных клеток и не встречаются в природе.

«Нативные антитела» обычно являются гетеротетрамерными гликопротеидами с молекулярной массой примерно 150000 дальтон, состоящие из двух идентичных легких (L) цепей и двух идентичных тяжелых (Н) цепей. Каждая легкая цепь связана с тяжелой цепью одной ковалентной дисульфидной связью, тогда как количество дисульфидных связей между тяжелыми цепями варьирует в разных изотипах иммуноглобулинов. Каждая тяжелая и легкая цепь также имеет равномерно расположенные внутрицепочечные дисульфидные мостики. Каждая тяжелая цепь имеет на одном конце вариабельный домен (VH) , за которым следует несколько константных доменов. Каждая легкая цепь имеет вариабельный домен на одном конце (VL) и константный домен на другом конце. Константный домен легкой цепи выровнен с первым константным доменом тяжелой цепи, и вариабельный домен легкой цепи выровнен с вариабельным доменом тяжелой цепи. Полагают, что конкретные аминокислотные остатки образуют поверхность раздела между вариабельными доменами легкой цепи и тяжелой цепи .

Определение «выделенный» («изолированный») , применяемое для описания различных антител по данному описанию, означает антитело, идентифицированное и выделенное и/или регенерированное из клетки или клеточной культуры, в которой оно экспрессируется. Примеси (загрязняющие компоненты) из природной среды представляют собой материалы, которые, как правило, мешают диагностическому или терапевтическому применению полипептида, и могут включать ферменты, гормоны и другие белковые или небелковые растворенные вещества. В предпочтительных вариантах изобретения антитело очищают (1) до степени, достаточной для получения по меньшей мере 15 остатков N- концевой или внутренней аминокислотной последовательности, при использовании секвенатора с вращающейся стеклянной чашечкой (секвенатора Эдмана) , или (2) до гомогенности методом SDS-PAGE в невосстанавливающих или восстанавливающих условиях с применением окрашивания Кумасси бриллиантовым голубым или, предпочтительно, серебром. Выделенное антитело включает антитела in situ внутри рекомбинантных клеток, так как по меньшей мере один компонент природной среды полипептида отсутствует. Обычно выделенный полипептид получают в результате по меньшей мере одной стадии очистки.

«Выделенная» молекула нуклеиновой кислоты представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, которая идентифицирована и отделена от по меньшей мере одной молекулы нуклеиновой кислоты-примеси, с которой она обычно связана в естественном источнике нуклеиновой кислоты антитела. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты отличается от той формы или набора, в которых она находится в естественных условиях. Таким образом, выделенная молекула нуклеиновой кислоты отличается от молекулы нуклеиновой кислоты, существующей в клетках в естественных условиях. Однако выделенная молекула нуклеиновой кислоты включает молекулу нуклеиновой кислоты, находящуюся в клетках, в которых в норме происходит экспрессия антитела, например, в случае, если молекула нуклеиновой кислоты имеет локализацию в хромосоме, отличную от ее локализации в клетках в естественных условиях.

Термин «эпитоп» при использовании в данном документе относится к части (детерминанте) антигена, который специфически связывается со связывающей молекулой (например, и антитело или родственная молекула, такие как биспецифичная связывающая молекула) . Эпитопные детерминанты обычно состоят из химически активных поверхностных групп молекул, таких как аминокислоты или углеводы, или боковые цепи сахаров, и, как правило, имеют специфические трехмерные структурные характеристики, а также специфические характеристики зарядов. Эпитоп может быть «линейным» или «конформационным. » В линейном эпитопе, все точки взаимодействия между белком (например, антиген) и взаимодействующей молекулой (такой как антитело) происходит линейно вдоль первичной аминокислотной последовательности белка. В конформационном эпитопе, точки взаимодействия происходят через аминокислотные остатки на белке, отделенные друг от друга в первичной аминокислотной последовательности. Когда желаемый эпитоп антигена определен, можно генерировать антитела к этому эпитопу с использованием методик, хорошо известных в данной области техники. Кроме того, генерация и характеристика антител или других связывающих молекул могут пролить свет на информацию о желательных эпитопах. Основываясь на этой информации, можно затем конкурентно скринировать связывающие молекулы для связывания с теми же или аналогичными эпитопами, например, путем проведения исследований конкуренции, чтобы найти связывающие молекулы, которые конкурируют за связывание с антигеном.

Термин «пептидный линкер» в настоящем документе означает любой пептид с возможностью соединения доменов с длиной в зависимости от доменов, которые он связывает между собой, содержащий любую аминокислотную последовательность . Предпочтительно пептидный линкер имеет длину более 5 аминокислот и состоит из любого набора аминокислот, выбранного из G, A, S, Р, Е, Т, D, К.

Термин «in vitro» относится к биологическому объекту, биологическому процессу или биологической реакции вне организма, смоделированному в искусственных условиях. Например, рост клеток in vitro должен пониматься как рост клеток в среде вне организма, например, в пробирке, культуральном флаконе или микропланшете.

Термин «1С50» (50% ингибирующая концентрация) относится к концентрациям препарата, при которых измеряемая активность или отклик, например, рост или пролиферация клеток, таких как опухолевые клетки, ингибируется на 50%. Значение IC50 может оцениваться с помощью соответствующих кривых зависимости ответа от логарифма дозы, с использованием специальных статистических программ для обработки кривых .

Термин GI50 (50% ингибирование роста) относится к концентрациям препарата, при которых пролиферация клеток, таких как опухолевые клетки, ингибируется на 50%. Термин ED50 (ЕС50) (50% эффективная доза/концентрация) относится к концентрациям препарата, при которых измеряемый биологический эффект достигается на 50% (может включать цитотоксичность) . Термин «антипролиферативное действие» подразумевает остановку или ингибирование роста пролиферирующих клеток, таких как раковые клетки.

Понятие «эффекторная функция» антитела относится к видам биологической активности, связанным с Fc-областью (нативной последовательностью Fc-области или с вариантами аминокислотной последовательности Fc-области) антитела, и варьируют в зависимости от изотипа антитела. Примерами эффекторных функций антитела являются: Clq- связывание; комплементзависимая цитотоксичность; связывание Fc- рецептора; антитело-зависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность (ADCC) ; фагоцитоз; понижающая регуляция рецепторов клеточной поверхности (например, В-клеточного рецептора, BCR) и В-клеточная активация .

«Антитело-зависимая клеточная цитотоксичность» или «А СС» относится к опосредованному клетками ответу, при котором неспецифичные цитотоксические клетки, которые экспрессируют рецепторы Fc (FcR) (например, природные клетки-киллеры (NK) , нейтрофилы и макрофаги) , узнают связанное антитело на клетке-мишени и затем вызывают лизис или фагоцитоз клетки-мишени. Первичные клетки для опосредования ADCC, NK- клетки, экспрессируют только FcyRIII, тогда как моноциты экспрессируют FcyRI, FcyRII и FcyRIII. Экспрессия FcR на гематопоэтических клетках суммирована в таблице 3 на странице 464 в публикации Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457-92 (1991) . Чтобы оценить активность в ADCC представляющей интерес молекулы можно осуществить анализы ADCC in vitro, такие как анализы, описанные в патентах США W 5500362 или 5821337. Применимые эффекторные клетки для таких анализов включают мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) и природные клетки- киллеры (NK) . Альтернативно или дополнительно ADCC-активность представляющей интерес молекулы можно оценить in vivo, например, в животной модели, такой как модель, описанная в Clynes et al . PNAS (USA) 95: 652-656 (1998) .

«Эффекторными клетками человека» являются лейкоциты, которые экспрессируют один или несколько FcR и осуществляют эффекторные функции. Предпочтительно клетки экспрессируют, по меньшей мере, FcyRIII и осуществляют ADCC-эффекторную функцию. Примеры лейкоцитов человека, которые опосредуют ADCC, включают мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) , природные клетки-киллеры (NK) , моноциты, цитотоксические Т-клетки и нейтрофилы; при этом предпочтительны РВМС и NK-клетки. Эффекторные клетки могут быть выделены из их природного источника, например, из крови или РВМС, как описано в настоящей публикации .

Термины «Fc-рецептор» и «FcR» используют для описания рецептора, который связывается с Fc-областью антитела. Предпочтительным FcR является FcR человека с нативной последовательностью. Кроме того, предпочтительным FcR является FcR, который связывает IgG-антитело (гамма-рецептор) , и к предпочтительным рецепторам относятся рецепторы подклассов FcyRI, FcyRII и FcyRIII, включая аллельные варианты и альтернативно сплайсируемые формы указанных рецепторов. Рецепторы FcyRII включают FcyRI IA («активирующий рецептор») и FcyRI IB («ингибирующий рецептор») , которые имеют сходные аминокислотные последовательности, которые отличаются главным образом своими цитоплазматическими доменами. Активирующий рецептор FcyRI IA содержит в своем цитоплазматическом домене основанный на тирозине мотив активации иммунорецептора (ITAM) . Ингибирующий рецептор FcyRI IB содержит в своем цитоплазматическом домене основанный на тирозине мотив ингибирования иммунорецептора (ITΊM) (см. обзор в аёгоп, Annu . Rev. Immunol. 15: 203-234 (1997)). Обзор, посвященный FcR, представлен в Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457-92 (1991) . Другие FcR, включая FcR, которые будут идентифицированы в будущем, включены в настоящем описании в термин «FcR». Термин также включает неонатальный рецептор, FcRn, который отвечает за перенос материнских IgG в плод.

Термины «Комплемент-зависимая цитотоксичность» и «СБС» относятся к способности молекулы лизировать мишень в присутствии комплемента. Путь активации комплемента инициируется связыванием первого компонента системы комплемента (Clq) с молекулой (например, антителом) в комплексе со своим антигеном. Чтобы оценить активацию комплемента можно осуществить анализ СБС, например, как описано в Gazzano-Santoro et al . , J. Immunol. Methods 202: 163 (1996) .

Термин «идентичность» или «гомологичность» следует толковать как означающее процентное содержание остатков аминокислот в кандидатной последовательности, которые идентичны остаткам соответствующей последовательности, с которой ее сравнивают, после сравнения последовательностей и введения "брешей", если необходимо достичь максимального процента идентичности для полной последовательности и не учитывая любые консервативные замещения как часть идентичности последовательности. Ни N- или С-концевой удлиняющей, ни инсерционные сегменты не следует толковать как уменьшающие идентичность или гомологичность . Методы и компьютерные программы для сравнения хорошо известны. Идентичность последовательности можно определить, используя программное обеспечение для анализа последовательности (например, Sequence Analysis Software Package, Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Ave . , Madison, WI 53705) . Данное программное обеспечение подходит для подобных последовательностей путем определения степени гомологичности для разнообразных замещений, делеций (элиминирований) и других модификаций .

Фразу «гомологичный», что касается полипептидной последовательности антитела, следует толковать как антитело, проявляющее по крайней мере, 70%-ную, предпочтительно 80%-ную, более предпочтительно 90%-ную и наиболее предпочтительно 95%-ную идентичность последовательности относительно полипептидной последовательности. Термин в отношении последовательности нуклеиновой кислоты следует толковать как последовательность нуклеотидов, проявляющих, по крайней мере, 85%-ную, предпочтительно 90%-ную, более предпочтительно 95%-ную и наиболее предпочтительно 97%-ную идентичность последовательности относительно последовательности нуклеиновой кислоты.

Предлагается модификация (и) аминокислотных последовательностей антител, описанных в настоящей заявке. Например, может быть желательным улучшение аффинности связывания и/или других биологических свойств антитела. Варианты аминокислотной последовательности антитела получают введением соответствующих изменений нуклеотидов в нуклеиновую кислоту антитела или пептидным синтезом. Такие модификации включают, например, делеции, и/или инсерции, и/или замены остатков в аминокислотных последовательностях антитела. Осуществляют любое сочетание делеции, инсерции и замены, чтобы получить конечную конструкцию, при условии, что конечная конструкция обладает требуемыми характеристиками. Изменения аминокислот также могут изменять посттрансляционные процессы в антителе, такие как изменение количества или положения сайтов гликозилирования .

Вариант модификации аминокислотных последовательностей антител с помощью аминокислотных замен. Такой вариант представляет собой замену, по меньшей мере, одного аминокислотного остатка в молекуле антитела на другой остаток. Места, представляющие наибольший интерес для мутагенеза путем замен, включают гипервариабельные области или CDR, но также предполагаются изменения и в области FR или Fc . Консервативные замены показаны в таблице А под заголовком «предпочтительные замены». Если такие замены приводят к изменению биологической активности, то могут быть введены дополнительные существенные изменения, названные «примерами заменам» в таблице А, или изменения, дополнительно описанные ниже при описании классов аминокислот, и может быть проведен скрининг продуктов .

Термины «нуклеиновая кислота», «нуклеиновая последовательность» или «нуклеиновокислотная последовательность», «полинуклеотид», «олигонуклеотид», «полинуклеотидная последовательность» и «нуклеотидная последовательность», которые используются равнозначно в данном описании, обозначают четкую последовательность нуклеотидов, модифицированных или не модифицированных, определяющую фрагмент или участок нуклеиновой кислоты, содержащую или не содержащую неприродные нуклеотиды и являющуюся либо двухцепочечной ДНК или РНК, либо одноцепочечной ДНК или РНК, либо продуктами транскрипции указанных ДНК. Здесь также следует упомянуть, что данное изобретение не относится к нуклеотидным последовательностям в их природной хромосомной среде, т.е. в природном состоянии. Последовательности данного изобретения были выделены и/или очищены, т.е. были взяты прямо или косвенно, например, путем копирования, при этом их среда была по меньшей мере частично модифицирована. Таким образом, также здесь следует подразумевать изолированные нуклеиновые кислоты, полученные путем генетической рекомбинации, например, с помощью принимающих клеток (клеток-хозяев) , или полученные путем химического синтеза.

Ссылка на нуклеотидную последовательность охватывает его комплимент, если не указано иное. Таким образом, ссылка на нуклеиновую кислоту, имеющую определенную последовательность следует понимать как охватывающие ее комплементарную цепь с ее комплементарной последовательностью .

Выражение «контролирующие последовательности» относится к последовательностям ДНК, необходимым для экспрессии функционально связанной кодирующей последовательности в определенном организме- хозяине. Пригодные для прокариот контролирующие последовательности представляют собой, например, промотор, необязательно оператор и сайт связывания рибосомы. Как известно, в эукариотических клетках присутствуют промоторы, сигналы полиаденилирования и энхансеры.

Нуклеиновая кислота «функционально связана», если она находится в функциональной связи с другой нуклеотидной последовательностью. Например, ДНК предпоследовательности или секреторной лидерной последовательности функционально связывают с ДНК полипептида, если он экспрессируется в виде предпротеина, который принимает участие в секреции полипептида; промотор или энхансер функционально связывают с кодирующей последовательностью, если он оказывает воздействие на транскрипцию последовательности; сайт связывания рибосомы функционально связывают с кодирующей последовательностью, если он расположен так, что может облегчать трансляцию. Как правило, «функционально связан» обозначает, что связанные последовательности ДНК являются смежными, а в случае секреторной лидерной последовательности являются смежными и находятся в фазе считывания. Однако энхансеры не обязательно должны быть смежными.

Термин «вектор» при использовании в настоящем документе означает молекулу нуклеиновой кислоты, способную транспортировать другую нуклеиновую кислоту, с которой она соединена. В некоторых вариантах осуществления изобретения вектор представляет собой плазмиду, т.е. кольцевую двухцепочечную часть ДНК, в которую могут быть лигированы дополнительные сегменты ДНК. В некоторых вариантах осуществления изобретения вектор представляет собой вирусный вектор, в котором дополнительные сегменты ДНК могут быть лигированы в вирусный геном. В некоторых вариантах осуществления изобретения векторы способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую они введены (например, бактериальные векторы, имеющие бактериальный сайт инициации репликации и эписомные векторы млекопитающих) . В других вариантах осуществления изобретения векторы (например, неэписомальные векторы млекопитающих) могут быть интегрированы в геном клетки-хозяина при введении в клетку-хозяина, и таким образом реплицируются вместе с геном хозяина. Более того, некоторые векторы способны направлять экспрессию генов, с которыми они функционально соединены. Такие векторы упоминаются в данном документе как «рекомбинантные экспрессирующие векторы» (или просто «экспрессирующие векторы») .

Термин «рекомбинантная клетка-хозяин» (или просто «клетка- хозяин») при использовании в данном документе означает клетку, в которую введен рекомбинантный экспрессионный вектор. Настоящее изобретение относится к клеткам-хозяевам, которые могут включать, например, вектор в соответствии с настоящим изобретением, описанным выше. Настоящее изобретение относится также к клеткам-хозяевам, которые включают, например, нуклеотидную последовательность, кодирующую тяжелую цепь или ее антигенсвязывающие части, нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь или ее антигенсвязывающие части, или обе из них, первого связывающего домена и/или второго связывающего домена связывающей молекулы по данному изобретению. Следует понимать, что «рекомбинантная клетка-хозяин» и «клетка-хозяин» означают не только конкретную заявленную клетку, но также и потомство такой клетки. Поскольку модификации могут проходить в последующих поколениях вследствие мутации или воздействий окружающей среды, такое потомство не может, на самом деле, быть идентичным родительской клетке, но такие клетки по-прежнему включены в объем термина «клетка-хозяин» при использовании в настоящем документе.

Термин «заболевание или нарушение, опосредованное HER2» подразумевает все заболевания или нарушения, которые либо прямо, либо косвенно связаны с HER2, включая этиологию, развитие, прогресс, персистентность или патологию заболевания или нарушения. «Лечить», «лечение» и «терапия» относятся к методу смягчения или устранения биологического расстройства и/или по меньшей мере одного из сопутствующих ему симптомов. Используемый в данном документе, термин «облегчить» болезнь, заболевание или состояние, означает уменьшение тяжести и/или частоты возникновения симптомов заболевания, расстройства или состояния. Кроме того, содержащиеся в данном документе ссылки на «лечение» включает ссылки на лечебную, паллиативную и профилактическую терапию.

В одном аспекте субъект лечения или пациент является млекопитающим, предпочтительно человеческим субъектом. Вышеупомянутый субъект может быть мужского или женского пола любого возраста.

Термин «нарушение» означает любое состояние, которое можно улучшить в результате лечения по настоящему изобретению. В определение данного термина входят хронические и острые нарушения или заболевания, включающие в себя патологические состояния, которые вызывают предрасположенность млекопитающего к возникновению данного нарушения. Неограничивающие примеры подлежащих лечению заболеваний включают в себя доброкачественные и злокачественные опухоли, например, рак молочной железы, яичника, желудка, шейки матки, эндометрия, матки, слюнной железы, легкого, почки, толстой кишки, ободочной кишки, щитовидной железы, поджелудочной железы, предстательной железы, кожи, головы и/или шеи, глотки, ротовой полости или мочевого пузыря. Предпочтительным подлежащим лечению нарушением согласно изобретению является рак, а именно, рак молочной железы (РМЖ) , злокачественное новообразование желудка, немелкоклеточный рак лёгкого, злокачественное новообразование головы и/или шеи, плоскоклеточный рак головы и шеи (ПРГШ) , колоректальный рак (КРР) , эзофагеальный рак, рак яичника, рак поджелудочной железы, рак ЖКТ, рак почек, рак шейки матки, рак эндометрия, рак матки, злокачественная меланома, рак глотки, рак ротовой полости или рак кожи.

Термины «рак» или «раковый» относятся к физиологическому состоянию или описывают физиологическое состояние у млекопитающих, которое, как правило, характеризуется нерегулируемым ( /-ой) ростом/пролиферацией клеток. Это определение охватывает доброкачественные и злокачественные раковые заболевания. Примеры раковых заболеваний включают, но без ограничения, карциному, лимфому, бластому, саркому и лейкоз. Более конкретные примеры таких раковых заболеваний включают плоскоклеточный рак, мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого, аденокарциному легкого, плоскоклеточную карциному легкого, рак брюшины, печеночноклеточный рак, рак желудка, включая рак ЖКТ, рак поджелудочной железы, глиобластому, глиому, цервикальный рак, рак яичника, рак печени, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак толстой кишки, колоректальный рак, карциному эндометрия и матки, карциному слюнных желез, рак почки (почечноклеточную карциному) , рак предстательной железы (рак простаты) , рак наружных женских половых органов, рак щитовидной железы, печеночную карциному, карциному анального канала, карциному пениса, меланому и различные типы рака головы и шеи.

«Терапевтически эффективным количеством» считается количество вводимого в процессе лечения терапевтического агента, которое избавит в определенной степени от одного или нескольких симптомов заболевания, по поводу которого проводится лечение.

Понятие «хроническое» применение относится к непрерывному (продолжительному) применению агента (ов) в противоположность острому (кратковременному) пути введения, так чтобы поддерживать первоначальное терапевтическое действие (активность) в течение длительного периода времени.

«Прерывистое» применение обозначает лечение, которое не осуществляют последовательно без перерывов, но которое скорее по своей природе является периодическим.

В настоящем описании и в последующей формуле изобретения, если контекстом не предусмотрено иное, слова «иметь», «включать» и «содержать» или их вариации, такие как «имеет», «имеющий», «включает», «включающий», «содержит» или «содержащий», следует понимать как включение указанного целого или группы целых, но не исключение любого другого целого или группы целых.

Подробное описание изобретения

Антитело

Настоящее изобретение относится к биспецифическому антителу, которое специфично связывается с IV субдоменом внеклеточного домена (ECD4) HER2 (рецептор эпидермального фактора роста 2) человека и II субдоменом внеклеточного домена (ECD2) HER2 человека.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к биспецифическому антителу, которое специфично связывается с IV субдоменом внеклеточного домена (ECD4) HER2 (рецептор эпидермального фактора роста 2) человека и II субдоменом внеклеточного домена (ECD2) HER2 человека, и включает:

1) первую антигенсвязывающую часть, которая специфично связывается с IV субдоменом внеклеточного домена (ECD4) HER2, и представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv) трастузумаба с аминокислотной последовательностью

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRY ADS VKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGGG GSGGGGSG GGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYS GVPSRFSG SRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIK ( SEQ ID NO: 1);

2) вторую антигенсвязывающую часть, которая специфично связывается с II субдоменом внеклеточного домена (ECD2) HER2, и представляет собой участок связывания антигена (Fab), включающий вариабельный домен тяжелой цепи (VH) с аминокислотной последовательностью

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAWGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGES IYNQRFKGRF TLSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYWGLGTLVTVSS ( SEQ ID NO: 2), и вариабельный домен легкой цепи (VL) с аминокислотной последовательностью

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKALQDVSRGVAWYQQKPGKAPKLLIYSAHYRYTGVPS RFSGSGSG TDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPYTFGQGTKVEIK ( SEQ ID NO: 6) ;

3) кристаллизующийся фрагмент иммуноглобулина ( Fc-фрагмент ) .

Вариабельный домен тяжелой цепи (VH) с аминокислотной последовательностью

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAWGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGES IYNQRFKGRF TLSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYWGLGTLVTVSS (SEQ ID NO: 2), включает HCDR1-3:

HCDR1 : GFTFTDYTMD (SEQ ID NO: 3);

HCDR2 : DVNPNSGES IYNQRFKG (SEQ ID NO: 4);

HCDR3 : NLGPSFYFDY (SEQ ID NO: 5) . Вариабельный домен легкой цепи (VL) с аминокислотной последовательностью

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKALQDVSRGVAWYQQKPGKAPKLLIYSAHYRYTGVPS RFSGSGSG TDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPYTFGQGTKVEIK ( SEQ ID NO: б), включает LCDR1-3 :

LCDR1 : KALQDVSRGVA ( SEQ ID NO: 7);

LCDR2 : SAHYRYT (SEQ ID NO: 8);

LCDR3 : QQYYIYPYT (SEQ ID NO: 9) .

В некоторых вариантах биспецифическое антитело представляет собой антитело IgG.

В некоторых вариантах биспецифическое антитело IgG относится к изотипу IgGl, IgG2, IgG3 или IgG4 человека.

В некоторых вариантах биспецифическое антитело относится к изотипу IgGl человека.

В некоторых вариантах биспецифическое антитело включает кристаллизующийся фрагмент иммуноглобулина ( Fc-фрагмент ) , который содержит две аминокислотные последовательности второго и третьего константных доменов (СН2-СНЗ), представленные аминокислотной последовательностью

PCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAK TKPREEQ YNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRD ELTKNQV SLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVF SCSVMHEA LHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 10) и аминокислотной последовательностью PCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAK TKPREEQ YNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRE EMTKNQV SLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVF SCSVMHEA LHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 11), соответственно.

В некоторых вариантах биспецифическое антитело включает вторую антигенсвязывающую часть, которая специфично связывается с II субдоменом внеклеточного домена (ECD2) HER2, и представляет собой участок связывания антигена (Fab), включающий:

а) вариабельный домен тяжелой цепи (VH) и первый константный домен тяжелой цепи (CHI), с аминокислотной последовательностью EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAWGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGESIY NQRFKGRF TLSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYWGLGTLVTVSSASTKGPSVF PLAPSSKS TSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGT QTYICNL NHKPSNTKVDKRV ( SEQ ID NO: 12);

б) вариабельный домен легкой цепи (VL) и константный домен легкой цепи (СК) , с аминокислотной последовательностью

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKALQDVSRGVAWYQQKPGKAPKLLIYSAHYRYTG VPSRFSGSGSG TDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSG TASWCLL NNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEV THQGLSSP VTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 13) .

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к биспецифическому антителу, которое специфично связывается с IV субдоменом внеклеточного домена (ECD4) HER2 (рецептор эпидермального фактора роста 2) человека и II субдоменом внеклеточного домена (ECD2) HER2 человека, состоящему из:

1) аминокислотной последовательности, которая специфично связывается с IV субдоменом внеклеточного домена (ECD4) HER2, включающей константные домены СН2 и СНЗ, и одноцепочечный вариабельного фрагмент (scFv) трастузумаба, с аминокислотной последовательностью

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRY ADSVKGRF TISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGG GSGGGGSD IQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSR FSGSRSGT DFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKASGDKTHTCPPCPAPELLGGPS VFLFPPKP KDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVL HQDWLN GKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPS DIAVEWES NGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPGK (SEQ ID NO: 14);

2) тяжелой цепи антитела, которое специфично связывается с II субдоменом внеклеточного домена (ECD2) HER2, включающей вариабельный домен тяжелой цепи (VH) и первый, второй и третий константные домены тяжелой цепи (СН1-СН2-СНЗ ) , с аминокислотной последовательностью EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAWGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGES IYNQRFKGRF TLSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYWGLGTLVTVSSASTKGPSVF PLAPSSKS TSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGT QTYICNL NHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCW VDVSHED PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAP IEKTISK AKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFL VSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK ( SEQ ID NO: 15) ;

3) легкой цепи антитела, которое специфично связывается с II субдоменом внеклеточного домена (ECD2) HER2, включающей вариабельный домен легкой цепи (VL) и константный домен легкой цепи (СК) , с аминокислотной последовательностью

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKALQDVSRGVAWYQQKPGKAPKLLIYSAHYRYTG VPSRFSGSGSG TDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFI FPPSDEQLKSGTASWCLL NNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEV THQGLSSP VTKSFNRGEC ( SEQ ID NO: 13),

где части 1)-3) соединены между собой дисульфидными мостиками.

В некоторых вариантах биспецифическое антитело представляет собой биспецифическое антитело BCD147-02-020, которое специфично связывается с IV субдоменом внеклеточного домена (ECD4) HER2 (рецептор эпидермального фактора роста 2) человека и II субдоменом внеклеточного домена (ECD2) HER2. Биспецифическое антитело BCD147-02-020 представляет собой ассиметричное антитело, то есть включает 1) первую антигенсвязывающую часть, которая специфично связывается с IV субдоменом внеклеточного домена (ECD4) HER2, и представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv) трастузумаба; и 2) вторую антигенсвязывающую часть, которая специфично связывается с II субдоменом внеклеточного домена (ECD2) HER2, и представляет собой участок связывания антигена (Fab) . Биспецифическое антитело BCD147- 02-020 представляет собой бипаратопное антитело, то есть антитело, которое связывается с двумя паратопами, IV и II субдоменами внеклеточного домена HER2 человека.

В некоторых вариантах биспецифическое антитело представляет собой биспецифическое ассиметричное антитело BCD147-02-020, которое специфично связывается с IV и II субдоменами внеклеточного домена HER2 человека .

Биспецифическое антитело BCD147-02-020 состоит из:

1) аминокислотной последовательности, которая специфично связывается с IV субдоменом внеклеточного домена (ECD4) HER2, включающей константные домены СН2 и СНЗ, и одноцепочечный вариабельного фрагмент (scFv) трастузумаба, с аминокислотной последовательностью

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRY ADSVKGRF TISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGG GSGGGGSD IQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSR FSGSRSGT DFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKASGDKTHTCPPCPAPELLGGPS VFLFPPKP KDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVL HQDWLN GKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPS DIAVEWES NGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPGK (SEQ ID NO: 14)- «Fc-knob - scFv-Trastuzumab»;

2) тяжелой цепи антитела, которое специфично связывается с II субдоменом внеклеточного домена (ECD2) HER2, включающей вариабельный домен тяжелой цепи (VH) и первый, второй и третий константные домены тяжелой цепи (СН1-СН2-СНЗ ) , с аминокислотной последовательностью EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAWGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGES IYNQRFKGRF TLSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYWGLGTLVTVSSASTKGPSVF PLAPSSKS TSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGT QTYICNL NHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCW VDVSHED PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAP IEKTISK AKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFL VSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK ( SEQ ID NO: 15) - «НС-hole

- аНЕй2-кандидат 020-VH»;

3) легкой цепи антитела, которое специфично связывается с II субдоменом внеклеточного домена (ECD2) HER2, включающей вариабельный домен легкой цепи (VL) и константный домен легкой цепи (СК) , с аминокислотной последовательностью

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKALQDVSRGVAWYQQKPGKAPKLLIYSAHYRYTG VPSRFSGSGSG TDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFI FPPSDEQLKSGTASWCLL NNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEV THQGLSSP VTKSFNRGEC ( SEQ ID NO: 13)- «Ск - aHER2 -кандидат 020 VL»,

где части 1)-3) соединены между собой дисульфидными мостиками.

Аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 14, которая специфично связывается с IV субдоменом внеклеточного домена (ECD4) HER2, состоит из: 1) константного домена СН2 и СНЗ, с аминокислотной последовательностью

PCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAK TKPREEQ YNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRD ELTKNQV SLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVF SCSVMHEA LHNHYTQKSLSLSPGK ( SEQ ID NO: 10);

2) одноцепочечного вариабельного фрагмента (scFv) трастузумаба с аминокислотной последовательностью

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGY TRYADSVKGRF TISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGG GSGGGGSD IQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSR FSGSRSGT DFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 1);

3) линкера с аминокислотной последовательностью ASGDKTHTCP.

Тяжелая цепь антитела (SEQ ID NO: 15), которая специфично связывается с II субдоменом внеклеточного домена (ECD2) HER2, состоит из :

1) вариабельного домена тяжелой цепи (VH) и первого константного домена тяжелой цепи (CHI), с аминокислотной последовательностью EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAWGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGESIY NQRFKGRF TLSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYWGLGTLVTVSSASTKGPSVF PLAPSSKS TSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGT QTYICNL NHKPSNTKVDKRV ( SEQ ID NO: 12), которая состоит из

a) вариабельного домена тяжелой цепи (VH) с аминокислотной последовательностью

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAWGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGESIY NQRFKGRF TLSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYWGLGTLVTVSS (SEQ ID NO: 2); и b) первого константного домена тяжелой цепи (CHI) с аминокислотной последовательностью

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVL QSSGLYSLSSV VTVPSSSLGTQTYICNLNHKPSNTKVDKRV;

2) второго и третьего константных доменов тяжелой цепи (СН2 и

СНЗ), с аминокислотной последовательностью

PCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRE EMTKNQV SLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVF SCSVMHEA LHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 11);

3) линкера с аминокислотной последовательностью EPKSCDKTHTCP . Легкая цепь антитела (SEQ ID NO: 13), которое специфично связывается с II субдоменом внеклеточного домена (ECD2) HER2, состоит из :

1) вариабельного домена легкой цепи (VL) с аминокислотной последовательностью

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKALQDVSRGVAWYQQKPGKAPKLLIYSAHYRYTGVPS RFSGSGSG TDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPYTFGQGTKVEIK ( SEQ ID NO: б) ; и

2) константного домена легкой цепи (СК) с аминокислотной последовательностью RTVAAPSVFI FPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSL SSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC.

Молекулы нуклеиновых кислот

Настоящее изобретение также относится к молекулам нуклеиновых кислот, а именно к последовательностям, кодирующим биспецифическое антитело, которое специфично связывается с IV субдоменом внеклеточного домена (ECD4) HER2 (рецептор эпидермального фактора роста 2) человека и II субдоменом внеклеточного домена (ECD2) HER2, по данному изобретению, которые описаны в данном документе, необязательно включающим любую последовательность соединяющего их пептидного линкера .

Ссылка на нуклеотидную последовательность, охватывает его комплимент, если не указано иное. Таким образом, ссылка на нуклеиновую кислоту, имеющую определенную последовательность следует понимать, как охватывающие ее комплементарную цепь с ее комплементарной последовательностью. Термин «полинуклеотид», упоминаемый в данном документе, означает полимерную форму нуклеотидов, по меньшей мере 10 оснований в длину, либо рибонуклеотидов, либо дезоксинуклеотидов или модифицированную форму любого типа нуклеотида. Термин включает в себя одно- и двухцепочечные формы.

Настоящее изобретение также относится к нуклеотидным последовательностям, кодирующей аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-15, или любой их комбинации .

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к молекуле нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, которая кодирует аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1-15. Молекула нуклеиновой кислоты может также содержать любую комбинацию указанных нуклеотидных последовательностей.

В одном варианте осуществления изобретения молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую SEQ ID NO: 1, 2 и б. В другом варианте осуществления изобретения молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидные последовательности, кодирующие SEQ ID NO: 1, 2, б, 10-11. В одном варианте осуществления изобретения молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую SEQ ID NO: 1, 12 и 13. В одном варианте осуществления изобретения молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую SEQ ID NO: 1, 10-13.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая содержит нуклеотидные последовательности, кодирующие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 13-15.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к молекуле нуклеиновой кислоты, содержащей любые комбинации вышеуказанных последовательностей нуклеиновых кислот. В любом из указанных выше вариантах осуществления изобретения молекулы нуклеиновых кислот могут быть выделенными.

Молекула нуклеиновой кислоты по данному изобретению может быть выделена из любого источника, который продуцирует биспецифическое антитело, которое специфично связывается с IV и II субдоменами внеклеточного домена HER2 человека. В определенных вариантах осуществления изобретения молекула нуклеиновой кислоты данному изобретению может быть синтезирована, а не выделена.

В некоторых вариантах осуществления изобретения молекула нуклеиновой кислоты по данному изобретению может содержать нуклеотидную последовательность, кодирующую VH домен из первого или второго домена антитела по данному изобретению, соединенного в рамках считывания с нуклеотидной последовательности, кодирующей константный домен тяжелой цепи из любого источника. Аналогичным образом, молекула нуклеиновой кислоты по данному изобретению может содержать нуклеотидную последовательность, кодирующую VL домен из первой или второй области антитела по данному изобретению, объединеной в рамках считывания с нуклеотидной последовательностью, кодирующей константный домен легкой цепи из любого источника.

В еще одном аспекте настоящего изобретения молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие вариабельный домен тяжелой (VH) и/или легкой (VL) цепей первого или второго связывающего домена, могут «преобразовываться» по всей длине генов антитела. В одном варианте осуществления изобретения молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие домены VH или VL преобразуются в гены антитела по всей длине путем вставки в экспрессионный вектор, уже кодирующей константные домены тяжелой цепи (СН) или легкой цепи (CL) , соответственно, так что VH сегмент функционально соединен с СН сегментом ( -ами) в векторе и/или VL сегмент оперативно соединен с CL сегментом в векторе. В другом варианте осуществления изобретения молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие VH и/или VL домены преобразуются в гены по всей длине антитела путем соединения, например, лигирования, молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей VH и/или VL домены, к молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей СН и/или CL домены с использованием стандартных молекулярно-биологических методов. Молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие по всей длине тяжелую и/или легкую цепи, могут затем экспрессироваться из клетки, в которую они были введены.

Молекулы нуклеиновой кислоты могут использоваться для экспрессии большого количества рекомбинантного биспецифического антитела, которое специфично связывается с IV и II субдоменами внеклеточного домена HER2 человека. Молекулы нуклеиновой кислоты могут использоваться для получения биспецифических антител, как описано в настоящем документе. Вектор

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к вектору, подходящему для экспрессии любой из нуклеотидных последовательностей, описанных в настоящем документе.

Настоящее изобретение относится к векторам, содержащим молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют любую из аминокислотных последовательностей биспецифического антитела, которое специфично связывается с IV и II субдоменами внеклеточного домена HER2 человека, или их частей (например, последовательностей тяжелой цепи первого и/или тяжелой и/или легкой цепи второго связывающих доменов) как описано в настоящем документе. Настоящее изобретение далее относится к векторам, содержащим молекулы нуклеиновых кислот, кодирующих биспецифическое антитело или его части.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, биспецифическое антитело, которое специфично связывается с IV и II субдоменами внеклеточного домена HER2 человека, по данному изобретению экспрессируются путем вставки ДНК, кодирующей частично или полностью последовательность первого и второго связывающего домена (например, последовательности тяжелой и легкой цепи, где связывающий домен содержит последовательности тяжелой и легкой цепи) , полученный, как описано выше, в экспрессионных векторах таким образом, что гены функционально соединены с необходимыми последовательностями, контролирующими экспрессию, такими как транскрипционные и трансляционные контрольные последовательности. Экспрессионные векторы включают плазмиды, ретровирусы, аденовирусы, аденоассоциированные вирусы (AAV) , вирусы растений, такие как вирус мозаики цветной капусты, вирусы табачной мозаики, космиды, YAC, EBV полученные эписомы и тому подобное. Молекулы ДНК могут быть лигированы в вектор таким образом, что последовательности, контролирующие транскрипцию и трансляцию в векторе, выполняют предусмотренную функцию регуляции транскрипции и трансляции ДНК. Экспрессионный вектор и последовательности контроля экспрессии могут быть выбраны таким образом, чтобы быть совместимыми с используемой экспрессирующей клеткой-хозяином. Молекулы ДНК, кодирующие частично или по всей длине последовательности первого и второго связывающих доменов (например, последовательности тяжелой и легкой цепи, где связывающий домен содержит последовательность тяжелой и легкой цепи) могут быть введены в отдельные векторы. В одном варианте осуществления изобретения любая комбинация указанных выше молекул ДНК вводится в тот же экспрессионный вектор. Молекулы ДНК могут быть введены в экспрессионный вектор стандартными способами (например, лигированием комплементарных сайтов рестрикции на фрагменте гена антитела и вектора или лигированием тупых концов, если сайты рестрикции отсутствуют) .

Подходящим вектором является тот, который кодирует функционально законченные последовательности СН или CL человеческого иммуноглобулина с конструированием соответствующего места рестрикции так, что любая последовательность VH или VL может быть легко включена и экспрессирована, как описано выше. НС - и LC-кодирование генов в таких векторах может содержать интронные последовательности, что приводит к общему увеличению белковых продуктов антитела путем стабилизации соответствующей мРНК. Интронные последовательности находятся в окружении сплайс-донора и сплайс-акцептора сайтов, которые определяют, где будет происходить сплайсинг РНК. Расположение интронных последовательностей может быть либо в вариабельных или константных участках цепей антитела, или как в вариабельных, так и константных участках, когда используются несколько интронов . Прекращение полиаденилирования и транскрипции может произойти вниз по ходу сайта нативной хромосомы кодируемых участков. Рекомбинантный экспрессионный вектор также может кодировать сигнальный пептид, который облегчает выработку цепочки антитела клеткой-хозяином. Ген цепочки антитела может быть клонирован в вектор таким образом, что сигнальный пептид соединен с рамкой считывания аминоконца цепи иммуноглобулина. Сигнальным пептидом может быть сигнальный пептид иммуноглобулина или гетерологичный сигнальный пептид (то есть, сигнальный пептид белка не иммуноглобулиновой природы) .

Помимо цепочки генов антител, рекомбинантная экспрессия векторов по данному изобретению может нести регулирующие последовательности, которые контролируют экспрессию генов цепи антител в клетке-хозяине . Специалистам в этой области будет понятно, что дизайн экспрессионного вектора, включая выбор регулирующих последовательностей, может зависеть от таких факторов, как селекция клетки-хозяина для трансформации, уровень экспрессии желаемого белка, и т.д. Предпочтительные регулирующие последовательности для экспрессирующей клетки-хозяина млекопитающих включают вирусные элементы обеспечивающие высокий уровень экспрессии белков в клетках млекопитающих, таких как промоторы и/или энхансеры, полученные из ретровирусной LTR, цитомегаловируса (CMV) (например, CMV промотора/энхансера), обезьяньего вируса 40 (SV40) (например, SV40 промотора/энхансера), аденовируса, (например, большого позднего промотора аденовируса (AdMLP) ) , вирус полиомы, а также сильных промоторов млекопитающих, таких как промотор нативных иммуноглобулинов или промотор актина. Для дальнейшего описания вирусных регулирующих элементов и их последовательностей см., например, патенты США 5,168,062, 4,510,245 and 4,968,615. Способы экспрессии связывающих молекул, таких как антитела растений, в том числе описание промоторов и векторов, а также трансформация растений, известны в данной области техники. См., например, патент США 6,517,529. Методы экспрессии полипептидов в бактериальных клетках или клетках грибов, например, дрожжевых клетках, также хорошо известны в данной области техники.

В дополнение к генам цепи антитела и регулирующим последовательностям, рекомбинантные векторы экспрессии изобретения могут нести дополнительные последовательности, такие как последовательности, которые регулируют репликацию вектора в клетках- хозяевах (например, точки начала репликации) и гены селектируемого маркера. Ген селектируемого маркера облегчает селекцию клеток-хозяев, в которые был введен вектор (см., например, патенты США 4,399,216, 4,634,665 и 5,179,017) . Например, обычно ген селектируемого маркера придает устойчивость к лекарственным средствам, таким как G418, гигромицин или метотрексат, клетке-хозяину, в которую вектор введен. Например, гены селектируемого маркера включают ген дигидрофолат редуктазы (DHFR) (для использования в dhfr-клетках-хозяевах при селекции/амплификации метотрексата), ген нео (для селекции G418) и ген синтетазы глутамата.

Термин «последовательность контроля экспрессии», используемый в данном описании, означает полинуклеотидные последовательности, которые необходимы для воздействия на экспрессию и процессинг кодирующих последовательностей, к которым они лигированы. Контролирующие экспрессию последовательности включают соответствующие последовательности инициации транскрипции, терминации, промотора и энхансера; эффективные сигналы процессинга РНК, такие как сплайсинг и сигналы полиаденилирования; последовательности, которые стабилизируют цитоплазматическую мРНК; последовательности, которые повышают эффективность трансляции (т.е. консенсусная последовательность Козака) ; последовательности, которые повышают стабильность белка; и, при желании, последовательности, которые усиливают секрецию белка. Характер таких контролирующих последовательностей различается в зависимости от организма-хозяина; в прокариотах такие контролирующие последовательности, как правило, включают промотор, сайт связывания рибосомы, а также последовательности терминации транскрипции; в эукариотах, как правило, такие контролирующие последовательности включают промоторы и последовательности терминации транскрипции. Термин «контролирующие последовательности» включает, как минимум, все компоненты, наличие которых имеет важное значение для экспрессии и процессинга, и может также включать дополнительные компоненты, чье присутствие является полезным, например, лидирующие последовательности и последовательности слившихся клеток.

Клетки-хозяева

Дополнительный аспект настоящего изобретения относится к способам получения биспецифического антитела, которое специфично связывается с IV и II субдоменами внеклеточного домена HER2 человека, по данному изобретению. Один вариант осуществления изобретения относится к способу получения биспецифического антитела, которое специфично связывается с IV и II субдоменами внеклеточного домена HER2 человека, как определено в настоящем документе, содержащему получение рекомбинантной клетки-хозяина, способной экспрессировать биспецифическое антитело, которое специфично связывается с IV и II субдоменами внеклеточного домена HER2 человека, культивирование указанной клетки-хозяина в условиях, подходящих для экспрессии продукции биспецифического антитела, которое специфично связывается с IV и II субдоменами внеклеточного домена HER2 человека, и выделение данного антитела. Биспецифическое антитело, которое специфично связывается с IV и II субдоменами внеклеточного домена HER2 человека, полученное такой экспрессией в таких рекомбинантных клетках-хозяевах упоминается в данном документе как «рекомбинантное биспецифическое антитело, которое специфично связывается с IV и II субдоменами внеклеточного домена HER2 человека». Изобретение также относится к потомству клеток таких клеток-хозяев и биспецифическому антителу, которое специфично связывается с IV и II субдоменами внеклеточного домена HER2 человека, полученному аналогично.

Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие биспецифическое антитело, которое специфично связывается с IV и II субдоменами внеклеточного домена HER2 человека, по изобретению и векторы, содержащие эти молекулы нуклеиновой кислоты, могут быть использованы для трансфекции подходящего млекопитающего или его клетки, растения или его клетки, бактериальной или дрожжевой клетки-хозяина. Преобразование может происходить любым известным способом для введения полинуклеотидов в клетку хозяина. Способы введения гетерологичных полинуклеотидов в клетки млекопитающих хорошо известны в данной области и включают декстран опосредованную трансфекцию, трансфекцию комплексом нуклеиновой кислоты и позитивно заряженного полимера, трансфекцию преципитатом нуклеиновой кислоты и фосфата кальция, полибрен опосредованную трансфекцию, слияние протопластов, трансфекцию инкапсулированными в липосомы полинуклеотидами и прямую микроинъекцию ДНК в ядра. В дополнение, молекулы нуклеиновых кислот могут быть введены в клетки млекопитающих вирусными векторами. Способы трансфекции клеток хорошо известны в данной области техники. См., например, патенты США, 4,399,216, 4,912,040, 4,740,461 и 4,959,455. Способы трансформации клеток растений хорошо известны в данной области, включая, например, Agrobacterium-опосредованную трансформацию, биолистическую трансформацию, прямую инъекцию, электропорацию и вирусную трансформацию. Методы трансформации клеток бактерий и дрожжей также хорошо известны в данной области.

Клеточные линии млекопитающих, используемые в качестве хозяев для трансформации, хорошо известны в данной области и включают множество иммортализованных доступных клеточных линий. К ним относятся, например, клетки яичников китайского хомячка (СНО) , NS0 клетки, клетки SP2, НЕК-293Т клетки, 293 Фристайл клетки ( Invitrogen) , NIH-3T3 клетки, клетки HeLa, клетки почек хомячка (ВНК) , клетки почек африканских зеленых мартышек (COS), клетки гепатоцеллюлярной карциномы человека (например, Hep G2 ) , А549 клетки и ряд других клеточных линий. Клеточные линии выбираются путем определения, какие клеточные линии имеют высокие уровни экспрессии и обеспечивают необходимые характеристики продуцируемого белка. Другими клеточными линиями, которые могут быть использованы, являются клеточные линии насекомых, такие как Sf9 или Sf21 клетки. Когда векторы рекомбинантной экспрессии, кодирующие биспецифическое антитело, которое специфично связывается с IV и II субдоменами внеклеточного домена HER2 человека, вводятся в клетки-хозяева млекопитающих, антитела продуцируются путем культивирования клеток-хозяев в течение времени, достаточного для экспрессии антител в клетках-хозяевах или, предпочтительнее, выделения антител в питательную среду, в которой выращиваются клетки-хозяева. Биспецифическое антитело, которое специфично связывается с IV и II субдоменами внеклеточного домена HER2 человека, может быть выделено из питательной среды с использованием стандартных методов очистки белка. Клетки-хозяева растений, например, включают Nicotiana, Arabidopsis, ряску, кукурузу, пшеницу, картофель и т.д. Клетки бактерий хозяина включают виды Escherichia и Streptomyces . Дрожжевые клетки-хозяева включают Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris.

Кроме того, уровень продукции биспецифического антитела, которое специфично связывается с IV и II субдоменами внеклеточного домена HER2 человека, по данному изобретению из продуцирующей клеточной линии можно усилить с помощью ряда известных методов. Например, система экспрессии гена глутамин синтетазы (система GS) является достаточно распространенной для усиления экспрессии при определенных условиях. Система GS обсуждается в целом или частично в связи с патентами ЕР 0216846, 0256055, 0323997 и 0338841.

Вполне вероятно, что биспецифическое антитело, которое специфично связывается с IV и II субдоменами внеклеточного домена HER2 человека, полученное из различных клеточных линий или трансгенных животных, будет отличаться друг от друга профилем гликозилирования . Однако биспецифическое антитело, которое специфично связывается с IV и II субдоменами внеклеточного домена HER2 человека, кодируемое молекулами нуклеиновой кислоты, описанными в данном документе, или содержащее аминокислотные последовательности, приведенные в настоящем документе, является частью данного изобретения, независимо от состояния гликозилирования связывающих молекул и в целом, независимо от наличия или отсутствия пост-трансляционных модификаций.

Получение антител

Изобретение относится также к способам и процессам получения биспецифического антитела, которое специфично связывается с IV и II субдоменами внеклеточного домена HER2 человека.

Моноклональные антитела

Моноклональные антитела можно создавать, например, с помощью метода на основе гибридом, который впервые описан Kohler и др . , Nature,

256, 1975, с. 495, или с помощью методов рекомбинантной ДНК (US

4816567) . При использовании метода на основе гибридом, мышь или другое пригодное животное-хозяин, такое как хомячок, иммунизируют согласно описанной выше методике, для того, чтобы вызывать образование лимфоцитов, которые продуцируют или могут продуцировать антитела, обладающие способностью специфически связываться с белком, применяемым для иммунизации. Согласно другому варианту лимфоциты можно получать в результате иммунизации in vitro. После иммунизации лимфоциты выделяют и затем сливают с клеточной линией миеломы с помощью приемлемого связывающего агента, такого как полиэтиленгликоль, с получением клетки гибридомы.

Полученные таким образом клетки гибридомы высевают и выращивают в пригодной культуральной среде, которая предпочтительно содержит одно или несколько веществ, ингибирующих рост или выживание неслитых родительских клеток миеломы. Например, если родительские клетки миеломы не содержат фермента гипоксантингуанинфосфорибозилт рансферазы (HGPRT или HPRT) , то культуральная среда для гибридом, как правило, должна включать гипоксантин, аминоптерин и тимидин (НАТ-среда) , т.е. вещества, которые препятствуют росту клеток с дефицитом HGPRT .

Предпочтительными применяемые в качестве компонента для слияния клетками миеломы являются клетки, которые легко поддаются слиянию, поддерживают стабильный высокий уровень производства антител выбранными продуцирующими антитела клетками и чувствительны к избирательной среде, на которой происходит отбор несвязанных родительских клеток. Предпочтительными линиями клеток миелом являются линии мышиной миеломы, такие как созданные на основе мышиных линий опухолевых клеток линии МОРС-21 и МРС-11, которые можно получать из Salk Institite Cell Disrtibution Center, Сан-Диего, шт . Калифорния, США, и линии SP-2 или ХбЗ- Ад8-653, которые можно получать из Американской коллекции типовых культур, Роквилл, шт . Мэриленд, США. Описано также применение линий клеток человеческой миеломы и гетеромиеломы типа «мышь -человек» для производства моноклональных антител (Kozbor, J. Immunol., 133, 1984, с. 3001) .

Предпочтительно специфичность связывания моноклональных антител, полученных с использованием клеток гибридомы, определяют методом иммунопреципитации или с помощью анализа связывания in vitro, такого как радиоиммунный анализ (РИА) или твердофазный имммуноферментный анализ (ELISA) .

Аффинность связывания моноклонального антитела можно, например, определять с помощью Скэтчард-анализа, описанного у Munson и др . , Anal. Biochem., 107, 1980, с. 220.

После выявления клеток гибридомы, которые продуцируют антитела требуемой специфичности, аффинности и/или активности, клоны можно субклонировать с помощью метода лимитирующих разведений и выращивать стандартными методами. Пригодные для этой цели среды включают, например, среду DMEM или RPMI-1640. Кроме того, клетки гидрибомы можно выращивать in vivo в виде асцитных опухолей в организме животных, например, путем внутрибрюшинной (i.p.) инъекции клеток мышам.

Моноклональные антитела, секретируемые субклонами, можно отделять от культуральной среды, асцитной жидкости или сыворотки с помощью обычных методов очистки антител, например, аффинной хроматографией (например, с использованием протеин А- или протеин Q-сефарозы) , или ионообменной хроматографии, хроматографии на гидроксилапатитах, гель- электрофореза, диализа и т.д.

ДНК, кодирующую моноклональные антитела, можно легко выделять и секвенировать с помощью общепринятых процедур (например, с использованием олигонуклеотидных зондов, которые обладают способностью специфически связываться с генами, кодирующими тяжелые и легкие цепи мышиных антител) . В качестве предпочтительного источника такой ДНК служат клетки гибридомы. После выделения ДНК можно включать в экспрессионные векторы, которыми затем трансфектируют клетки-хозяева, такие как клетки Е. coli, обезьяньи COS- клетки, клетки яичника китайского хомячка (СНО) или клетки миеломы, которые без трансфекции не продуцируют белок антитела, что приводит к синтезу моноклональных антител в рекомбинантных клетках-хозяевах .

Согласно еще одному варианту осуществления изобретения моноклональные антитела или фрагменты антител можно выделять из фаговых библиотек антител, созданных с помощью методов, описанных у McCafferty и др . , Nature, 348, 1990, сс. 552-554 . У Clackson и др . , Nature, 352, 1991, сс. 624- 628 и Marks и др . , J. Mol. Biol., 222,

1991, сс. 581-597 описано выделение мышиных и человеческих антител соответственно с помощью фаговых библиотек. В последующих публикациях было описано производство высокоаффинных (нМ-диапазон) человеческих антител с помощью перестановки цепи (Marks и др . , Bio/Technology, 10,

1992, сс. 779-783), а также комбинаторная инфекция и рекомбинация in vivo в качестве стратегии конструирования очень больших фаговых библиотек (Waterhouse и др . , Nucl . Acids. Res., 21, 1991, сс. 2265- 2266) . Таким образом, эти методы представляют собой реальную альтернативу традиционным методам выделения моноклональных антител на основе гибридом моноклональных антител.

ДНК, кодирующую антитело, можно также модифицировать, например таким образом, чтобы получать химерные или слитые полипептиды антител, например, путем замены последовательностей константных областей тяжелой и легкой цепи (Сн и CL) на гомологичные мышиные последовательности (US 4816567 и Morrison и др . , Proc. Natl. Acad. Sci. USA: 81, 1984, с. 6851) или с помощью ковалентного связывания кодирующей последовательности иммуноглобулина со всей или с частью кодирующей последовательности полипептида, не относящегося к иммуноглобулинам (гетерологичного полипептида) . Не относящиеся к иммуноглобулинам полипептидные последовательности можно заменять на константные области антитела или заменять на вариабельные области антигенсвязывающего центра антитела, создавая химерное бивалентное антитело, которое содержит один антигенсвязывающий центр, обладающий специфичностью в отношении антигена, и другой антигенсвязывающий центр, обладающий специфичностью в отношении другого антигена.

Человеческие антитела и методика, основанная на применении фаговой дисплейной библиотеки

В настоящее время можно получать трансгенных животных (например, мышей) , которые после иммунизации могут продуцировать полный спектр человеческих антител без производства эндогенного иммуноглобулина. Например, было описано, что гомозиготная делеция областей стыка гена тяжелой цепи антитела ( Дн-сегмента) в организме химерных мышей и мышей с мутацией в зародышевой линии приводит к полному ингибированию производства эндогенного антитела. Перенос набора зародышевой линии гена человеческого иммуноглобулина в такую мутантную зародышевую линию мышей приводит к производству человеческих антител после контрольного заражения антигеном (US 5545806, 5569825, 5591669 (все на имя фирмы GenPharm) ; 5545807; и WO 97/17852) .

В альтернативном варианте для получения человеческих антител и фрагментов антител in vitro из спектра генов вариабельной области (V) иммуноглобулина из организма иммунизированных доноров можно использовать фаговую дисплейную технологию (McCafferty и др . , Nature, 348, 1990, сс. 552-553) . Согласно этой методике гены V-области антитела клонируют в рамке считывания либо с основным, либо с минорным геном оболочечного белка нитчатого бактериофага, такого как М13 или fd, и презентируют в виде функциональных фрагментов антитела на поверхности фаговой частицы. Поскольку нитчатая частица содержит копию одноцепочечной ДНК фагового генома, селекции по признаку функциональных свойств антитела, также приводят к отбору гена, кодирующего антитело, которое обладает указанными свойствами. Таким образом, фаг имитирует некоторые свойства В-клетки. Фаговую презентацию можно осуществлять в различных форматах. Для фаговой презентации можно использовать различные источники сегментов V-генов. Clackson и др . , Nature, 352, 1991, сс. 624-628 выделили различные наборы антител к оксазолону из небольшой произвольной комбинаторной библиотеки V-генов, полученной из селезенки иммунизированных мышей. Можно конструировать спектр V-генов, полученных из организма иммунизированных людей-доноров, и антитела к различному набору антигенов (включая аутоантигены) можно выделять в целом согласно методам, описанным у Marks и др . , J. Mol. Biol., 222, 1991, сс. 581- 597.

Как описано выше, человеческие антитела могут продуцироваться также in vitro активированными В-клетками (см. US 5567610 и 5229275) .

Биспецифические антитела

Биспецифические антитела представляют собой антитела, которые обладают специфичностью к связыванию с двумя различными эпитопами. Например, биспецифическое антитела, которое специфично связывается с двумя различными эпитопами белка, а именно с IV и II субдоменами внеклеточного домена HER2 человека. Биспецифические антитела можно получать в виде полноразмерных антител или фрагментов антител (например, F ( ab ') 2-фрагментов биспецифических антител) .

Методы создания биспецифических антител известны в данной области. Общепринятое получение полноразмерных биспецифических антител основано на совместной экспрессии двух пар тяжелых и легких цепей иммуноглобулина, где обе цепи имеют различную специфичность. Из-за случайного набора тяжелых и легких цепей иммуноглобулина, эти гибридомы (квадромы) потенциально могут продуцировать смесь из 10 различных молекул антител, из которых только одна имеет правильную биспецифическую структуру. Очистка правильной молекулы, которую обычно осуществляют в несколько стадий с помощью аффинной хроматографии, является довольно трудоемкой, а выход продукта - низким. Аналогичные процессы описаны в WO 93/08829.

Согласно другому подходу вариабельные области антитела с требуемой специфичностью связывания ( антигенсвязывающие центры антитела) сливают с последовательностями константной области иммуноглобулина. Слияние предпочтительно осуществляют с константной областью тяжелой цепи Ig, которая включает по меньшей мере часть шарнирных СН2- и СНЗ-областей . Предпочтительно, чтобы по меньшей мере в одном из слияний присутствовала первая константная область тяжелой цепи (СН1), содержащая сайт, необходимый для связывания легкой цепи. ДНК, кодирующие слияния тяжелой цепи иммуноглобулина и при необходимости легкой цепи иммуноглобулина, встраивают в различные экспрессионные векторы и ими совместно трансфектируют приемлемый организм-хозяин. Это обеспечивает большую гибкость в подборе общих пропорций трех полипептидных фрагментов в вариантах, когда в конструкции используют неравные соотношения трех полипептидных цепей с целью оптимизации выходов. Однако можно также встраивать кодирующие последовательности в две или во все три полипептидные цепи в одном экспрессионном векторе, когда экспрессия по меньшей мере двух полипептидных цепей в равных пропорциях обеспечивает высокие выходы или когда соотношения не имеют решающего значения.

В предпочтительном варианте осуществления указанного подхода биспецифические антитела представляют собой гибрид тяжелой цепи иммуноглобулина, обеспечивающий первую специфичность связывания в первом плече, и гибрид пары тяжелая цепь - легкая цепь иммуноглобулина (что обеспечивает вторую специфичность связывания) во втором плече. Было обнаружено, что эта асимметричная структура облегчает отделение требуемой биспецифической молекулы от нежелательных комбинаций цепей иммуноглобулинов, поскольку присутствие легкой цепи иммуноглобулина только в одной половине биспецифической молекулы облегчает разделение. Этот подход описан в WO 94/04690. Дополнительное подробное описание получения биспецифических антител см., например, Suresh и др . , Methods in Enzymology, 121, 1986, с. 210. Согласно следующему подходу, описанному в патенте US 5731168, можно сконструировать область контакта между парой молекул антител с целью повышения до максимального уровня процентного содержания гетеродимеров, которые получают из культуры рекомбинантных клеток. Предпочтительная область контакта включает по меньшей мере часть СНЗ- области. Согласно этому методу одну или несколько небольших аминокислот с боковыми цепями из области контакта первой молекулы антитела заменяют на молекулы с более крупными боковыми цепями (например, на тирозин или триптофан) . Уравновешивающие «полости», идентичные или близкие по размеру большой (им) боковой (ым) цепи (ям) создают в области контакта второй молекулы антитела путем замены аминокислот с крупными боковыми цепями на аминокислоты с более мелкими боковыми цепями (например, на аланин или треонин) . Это обеспечивает механизм, способствующий повышению выхода гетеродимера относительно других нежелательных конечных продуктов.

Биспецифические антитела включают перекрестносшитые антитела или «гетероконъюгаты». Например, одно из антител в гетероконъюгате может быть сшито с авидином, а другое с биотином. Такие антитела можно использовать, например, для направленного переноса клеток иммунной системы к нежелательным клеткам (US 4676980) и для лечения ВИЧ-инфекции (WO 91/00360, WO 92/200373 и ЕР 03089) . Антитела-гетероконъюгаты можно создавать с помощью любого из обычных методов введения перекрестных сшивок. Приемлемые кросс-линкеры хорошо известны в данной области и описаны в US 4676980 наряду с различными методами введения перекрестных сшивок .

Методы получения биспецифических антител из фрагментов антител также описаны в литературе. Например, биспецифические антитела можно получать с помощью химического связывания. Brennan и др . , Science, 229, 1985, с. 81 описали методику, согласно которой интактные антитела подвергают протеолитическому расщеплению, получая F (ab ') 2-фрагменты. Эти фрагменты восстанавливают в присутствии агента, образующего комплексы с дитиолом, такого как арсенит натрия, для стабилизации соседних дитиолов и предупреждения образования межмолекулярных дисульфидных связей. Полученные Fab ' -фрагменты затем превращают в тионитробензоатное (TNB) производное. Одно из Fab ' -TNB-производных затем повторно превращают в Fab'-тиол путем восстановления меркаптоэтиламином и смешивают с эквимолярным количеством другого Fab ' -TNB-производного, получая биспецифическое антитело. Полученные биспецифические антитела можно применять в качестве агентов для избирательной иммобилизации ферментов.

Достигнутый в настоящее прогресс позволяет облегчать непосредственное выделение из Е. coli Fab ' -SH-фрагментов, которые можно химически сшивать с образованием биспецифических антител. Shalaby и др . , J. Exp . Med., 175, 1992, сс. 217-225 описали получение F ( ab ') 2-фрагмента молекулы полностью гуманизированного биспецифического антитела. Каждый Fab ' -фрагмент по отдельности секретировался из Е. coli и его подвергали непосредственному химическому связыванию in vitro с получением биспецифического антитела. Полученное таким образом биспецифическое антитело обладало способностью связываться с клетками, для которых характерна сверхэкспрессия рецептора ЕгЬВ2, и с обычными человеческими Т- клетками, а также стимулировать литическую активность человеческих цитотоксических лимфоцитов, мишенью которых является опухоль молочной железы человека.

Описаны также различные методы получения и выделения фрагментов биспецифических антител непосредственно из культуры рекомбинантных клеток. Например, биспецифические антитела получали с помощью лейциновых «застежек-молний» (Kostelny и др . , J. Immunol., 148(5), 1992, сс. 1547-1553) . Пептиды лейциновых «застежек-молний» из белков Fos и Jun связывали с Fab ' -фрагментами двух различных антител путем генного слияния. Гомодимеры антител восстанавливали в шарнирной области с получением мономеров, а затем путем повторного окисления получали гетеродимеры антител. Этот метод можно применять также для получения гомодимеров антител. Технология на основе «двойных антител», описанная Hollinger и др . , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 1993, сс. 6444-6448, представляет собой другой механизм получения фрагментов биспецифических антител. Фрагменты содержат VH-область, связанную с VL- областью линкером, который является слишком коротким, для того чтобы позволить произойти спариванию двух доменов одной и той же цепи. Таким образом, VH- и VL-области одного фрагмента должны спариваться с комплементарными VL- и VH-областями другого фрагмента, образуя тем самым два антигенсвязывающих центра. Описана также другая стратегия получения фрагментов биспецифических антител, основанная на применении одноцепочечных (Fv)- (sFv) димеров (см. Gruber и др . , J. Immunol, 152, 1994, с. 5368) .

Фармацевтическая композиция

Другим аспектом изобретения является фармацевтическая композиция, содержащая в качестве активного ингредиента (или в качестве единственного активного ингредиента) биспецифическое антитело, которое специфично связывается с IV и II субдоменами внеклеточного домена HER2 человека. Фармацевтическая композиция может включать по меньшей мере одно биспецифическое антитело, которое специфично связывается с IV и II субдоменами внеклеточного домена HER2 человека, как описано в данном документе, и одну или более дополнительных связывающих молекул (например, антител) , которые нацелены на один или более соответствующих поверхностных рецепторов. В некоторых вариантах осуществления изобретения композиции предназначены для улучшения, профилактики или лечения нарушений, которые могут быть связаны с HER2.

«Фармацевтическая композиция» обозначает композицию, включающую в себя биспецифическое антитело, которое специфично связывается с IV и II субдоменами внеклеточного домена HER2 человека, согласно изобретению и, по крайней мере, один из компонентов, выбранных из группы, состоящей из фармацевтически приемлемых и фармакологически совместимых эксипиентов, таких как наполнители, растворители, разбавители, носители, вспомогательные, распределяющие, средства доставки, консерванты, стабилизаторы, эмульгаторы, суспендирующие агенты, загустители, регуляторы пролонгированной доставки, выбор и соотношение которых зависит от природы и способа назначения и дозировки. Фармацевтические композиции по настоящему изобретению и способы их изготовления будут бесспорно очевидными для специалистов в этой области. Производство фармацевтических композиций предпочтительно должно соответствовать требованиям GMP (надлежащей производственной практики) . Композиция может включать буферную композицию, тонические агенты, стабилизаторы и солюбилизаторы. Пролонгированное действие композиции может быть обеспечено с помощью агентов, замедляющих абсорбцию активного фармацевтического ингредиента, например, моностеарат алюминия и желатин. Примерами подходящих носителей, растворителей, разбавителей и средств доставки являются вода, этанол, полиспирты, а также их смеси, масла и инъекционные органические сложные эфиры.

«Лекарственное средство (препарат)» - вещество или смесь веществ в виде фармацевтической композиции в виде таблеток, капсул, порошков, лиофилизатов, инъекций, инфузий, мазей и др . готовых форм, предназначенное для восстановления, исправления или изменения физиологических функций у человека и животных, а также для лечения и профилактики болезней, диагностики, анестезии, контрацепции, косметологии и прочего. Любой способ введения пептидов, белков или антител, принятый в данной области, может соответствующим образом использоваться для биспецифического антитела, которое специфично связывается с IV и II субдоменами внеклеточного домена HER2 человека, по данному изобретению.

Термин «фармацевтически приемлемый» означает один или несколько совместимых жидких или твердых компонентов, которые подходят для введения млекопитающему, предпочтительно человеку.

Термин «эксципиент» или «вспомогательное вещество» используется в данном документе для описания любого компонента, отличающегося от ранее описанных по данному изобретению. Это вещества неорганического или органического происхождения, используемые в процессе производства, изготовления лекарственных препаратов для придания им необходимых физико-химических свойств.

Под термином «буфер», «буферная композиция», «буферный агент» понимается раствор, способный сохранять значение pH, благодаря взаимодействию кислотных и щелочных компонентов, входящих в его состав, который дает возможность препарату биспецифического антитела, которое специфично связывается с IV и II субдоменами внеклеточного домена HER2 человека, проявлять устойчивость к изменениям pH. В общем случае, преимущественными являются значения pH фармацевтической композиции от 4,0 до 8,0. В качестве буферных агентов могут быть использованы, например, ацетатный, фосфатный, цитратный, гистидиновый, сукцинатный и т.п. буферные растворы, но, не ограничиваясь ими.

Термины «тонический агент», «осмолитик» или «осмотический агент» в том виде, как они здесь использованы, относятся к эксципиенту, который может подводить осмотическое давление жидкого препарата антитела. «Изотоничный» препарат представляет собой препарат, который имеет осмотическое давление, эквивалентное давлению человеческой крови. Изотоничные препараты обычно имеют осмотическое давление от примерно 250 до 350 мОсм/кг . В качестве изотоноческих агентов могут быть использованы полиолы, моно- и дисахара, аминокислоты, соли металлов, например, хлорид натрия, и т.п., но, не ограничиваясь ими.

Под «стабилизатором» понимается вспомогательное вещество или смесь двух и более вспомогательных веществ, которые обеспечивают физическую и/или химическую стабильность активного агента. В качестве стабилизаторов могут быть использованы аминокислоты, например, аргинин, гистидин, глицин, лизин, глутамин, пролин, но, не ограничиваясь ими; поверхностно-активные вещества, например , полисорбат 20 (торговое наименование Tween 20), полисорбат 80 (торговое наименование Tween 80), полиэтилен-полипропилен гликоль и его кополимеры (торговые наименования Полоксамер (Poloxaner) , Плуроник (Pluronic) ) , натрия додецилсульфат (SDS), но, не ограничиваясь ими; антиоксиданты, например, метионин, ацетилцистеин, аскорбиновая кислота, монотиоглицерол, соли серистых кислот, и т.п., но не ограничиваясь ими; хелатирующие агенты, например, этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) , диэтилентриаминпентауксусная кислота (ДТПА) , цитрат натрия и т.п., но не ограничиваясь ими.

Фармацевтическая композиция является «стабильной», если активный агент сохраняет свою физическую стабильность и/или химическую стабильность и/или биологическую активность в течение заявленного срока годности при температуре хранения, например, при 2-8 °С. Предпочтительно, чтобы активный агент сохранял и физическую, и химическую стабильность, а также биологическую активность. Период хранения выбирается на основании результатов исследования стабильности при ускоренном и естественном хранении.

Фармацевтическая композиция по данному изобретению может изготавливаться, упаковываться или широко продаваться в виде единичной стандартной дозы или множества единичных стандартных доз в виде готовой лекарственной формы. Используемый в данном документе термин «единичная стандартная доза» означает дискретное количество фармацевтической композиции, содержащей заранее определенное количество активного ингредиента. Количество активного ингредиента обычно равно дозировке активного ингредиента, который будет вводиться субъекту, или удобной части такой дозировки, например, половине или трети такой дозировки. Фармацевтические композиции по настоящему изобретению, как правило, пригодны для парентерального введения в виде стерильных лекарственных средств, предназначенных для введения в организм человека с нарушением целостности кожных покровов или слизистых оболочек, минуя желудочно-кишечный тракт путем инъекций, инфузий или имплантации. Например, предполагается, что парентеральное введение включает, помимо прочего, подкожную, внутрибрюшинную, внутримышечную, внутривенную, внутриартериальную, интратекальную, внутрижелудочковую, интрауретральную, внутричерепную, внутрисуставнную, трансдермальную инъекцию или инфузии; и почечные диализные инфузионные методики. Внутриопухолевая доставка, например, внутриопухолевая инъекция, также может быть применима. Также предусмотрена региональная перфузия. Предпочтительные варианты осуществления изобретения включают внутривенный и подкожный пути. Любой способ введения пептидов или белков, принятый в данной области, может соответствующим образом использоваться для биспецифического антитела, которое специфично связывается с IV и II субдоменами внеклеточного домена HER2 человека, по данному изобретению.

Инъекционные лекарственные средства могут быть изготовлены, упакованы или проданы в стандартной лекарственной форме, например, в ампулах, флаконах, полимерных контейнерах, преднаполненных шприцах, устройствах для автоинжекции, но, не ограничиваясь ими. Лекарственные средства для парентерального введения включают, помимо прочего, суспензии, растворы, эмульсии в масляных или водных основах, пасты и тому подобное.

Еще одним вариантом осуществления изобретения является лекарственное средство для парентерального введения, где фармацевтическая композиция предоставлена в сухой форме, то есть, порошка или гранул для растворения в подходящем растворителе (например, стерильной апирогенной воде) перед введением. Такое лекарственное средство может быть получено, например, с помощью лиофилизации, т.е. процесса, известного в данной области техники как сушка из замороженного состояния, включающая в себя замораживание препарата и последующее удаление растворителя из замороженного содержимого .

Биспецифическое антитело, которое специфично связывается с IV и II субдоменами внеклеточного домена HER2 человека, по данному изобретению может также вводиться интраназально или ингаляционно, самостоятельно, в виде смеси с подходящим фармацевтически приемлемым наполнителем из ингалятора, такого как аэрозольный контейнер под давлением, помпа, спрей, распылитель) или небулайзер, в котором используется или не используется подходящий пропеллент, или в виде назальных капель или спрея.

Лекарственное средство для парентерального введения может быть немедленного или модифицированного высвобождения. Лекарственные средства с модифицированным высвобождением включают отсроченное, замедленное, пульсирующее , контролируемое , нацеленное и программируемое высвобождение .

Терапевтическое применение биспецифического антитела, которое специфично связывается с IV и II субдоменами внеклеточного домена HER2 человека, по данному изобретению

В одном аспекте биспецифическое антитело, которое специфично связывается с IV и II субдоменами внеклеточного домена HER2 человека, по данному изобретению применяется в лечении заболеваний или нарушений, которые связаны с активностью HER2.

В одном аспекте субъект лечения или пациент является млекопитающим, предпочтительно человеческим субъектом. Вышеупомянутый субъект может быть мужского или женского пола и любого возраста.

В случае опухоли (например, раковой опухоли) терапевтически эффективное количество биспецифического антитела, которое специфично связывается с IV и II субдоменами внеклеточного домена HER2 человека, может уменьшать число раковых клеток; уменьшать начальный размер опухоли; ингибировать (т.е. до некоторой степени замедлять и, предпочтительно, прекращать) инфильтрацию раковыми клетками периферических органов; ингибировать (т.е. до некоторой степени замедлять и, предпочтительно, прекращать) метастазирование опухоли; ингибировать, до некоторой степени, рост опухоли; и/или облегчать, до некоторой степени, один или более симптомов, обусловленных расстройством. Антитело или фрагмент антитела может, до некоторой степени, предупреждать рост и/или убивать имеющиеся раковые клетки, оно может вызывать цитостатический и/или цитотоксический эффект. При терапии рака эффективность in vivo можно определять, например, оценивая продолжительность жизни, время до прогрессирования заболевания (ТТР) , частоту ответа опухоли на лечение (RR) , продолжительность ответа и/или качество жизни.

Используемые в данном документе термины «совместное назначение», «совместно назначенный» и «в сочетании с» относятся к биспецифическому антителу, которое специфично связывается с IV и II субдоменами внеклеточного домена HER2 человека, с одним или более другими терапевтическими агентами, как предполагается, означают, сслылаются или включают :

1) одновременное введение такой комбинации биспецифического антитела, которое специфично связывается с IV и II субдоменами внеклеточного домена HER2 человека, по данному изобретению и терапевтического агента пациенту, который нуждается в лечении, когда такие компоненты сформулированы вместе в одной лекарственной форме, из которой указанные компоненты высвобождаются практически одновременно указанному пациенту,

2) одновременное введение такой комбинации биспецифического антитела, которое специфично связывается с IV и II субдоменами внеклеточного домена HER2 человека, по данному изобретению и терапевтического агента пациенту, который нуждается в лечении, когда такие компоненты сформулированы отдельно в разных лекарственных формах, введение которых происходит практически в одно и то же время указанному пациенту, после чего указанные компоненты высвобождаются практически одновременно указанному пациенту,

3) последовательное введение такой комбинации биспецифического антитела, которое специфично связывается с IV и II субдоменами внеклеточного домена HER2 человека, по данному изобретению и терапевтического агента пациенту, который нуждается в лечении, когда такие компоненты сформулированы отдельно друг от друга в отдельных лекарственных формах, которые принимаются в последовательно по времени указанным пациентом со значимым временным интервалом между каждым введением, после чего указанные компоненты высвобождаются в практически разное время указанному пациенту; а также

4) последовательное введение такой комбинации биспецифического антитела, которое специфично связывается с IV и II субдоменами внеклеточного домена HER2 человека, по данному изобретению и терапевтического агента пациенту, который нуждается в лечении, когда такие компоненты сформулированы вместе в единый лекарственной форме, из которой высвобождение указанных компонентов происходит контролируемым образом, после чего они одновременно, последовательно или совместно высвобождаются в одно и то же время и/или разное время указанному пациенту, где каждая часть может быть введена одним или разными путями.

Биспецифическое антитело, которое специфично связывается с IV и II субдоменами внеклеточного домена HER2 человека, по данному изобретению может назначаться без дополнительного терапевтического лечения, т.е. в качестве самостоятельной терапии. Кроме того, лечение биспецифическим антителом, которое специфично связывается с IV и II субдоменами внеклеточного домена HER2 человека, по данному изобретению может включать по меньшей мере одно дополнительное терапевтическое лечение (комбинированная терапия) . В некоторых вариантах осуществления изобретения, биспецифическое антитело, которое специфично связывается с IV и II субдоменами внеклеточного домена HER2 человека, может вводиться совместно или быть сформулирована с другим медикаментом/препаратом для лечения рака.

Термин «цитотоксическое средство» в используемом в настоящем описании смысле относится к веществу, которое ингибирует или предотвращает функционирование клеток и/или вызывает разрушение клеток. Подразумевается, что термин включает радиоактивные изотопы (например, At211, 1131, 1125, Y90, Rel86, Rel88, Sml53, Bi212, P32 и радиоактивные изотопы Lu) , химиотерапевтические средства и токсины, такие как низкомолекулярные токсины или ферментативно активные токсины, имеющие происхождение из бактерий, грибов, растений или животных, включая их фрагменты и/или варианты. «Химиотерапевтическим средством» является химическое соединение, применимое для лечения злокачественной опухоли. Примеры химиотерапевтических средств включают алкилирующие агенты, такие как тиотепа и циклофосфамид (CYTOXAN®) ; алкилсульфонаты, такие как бусульфан, импросульфан и пипосульфан; азиридины, такие как бензодопа, карбохинон, метуредопа и уредопа; этиленимины и метилмеламины, включая алтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид и триметилмеламин; ацетогенины (например, буллатацин и буллатацинон) ; дельта-9-тетрагидроканнабинол (дронабинол, MARINOL®) ; бета-лапахон; лапахол; колхицины; бетулиновую кислоту; камптотецин (включая синтетический аналог топотекан (HYCAMTIN®) , СРТ-11 (иринотекан, CAMPTOSAR®) , ацетилкамптотецин, скополектин и 9-аминокамптотецин) ; бриостатин; каллистатин; СС-1065 (включая его синтетические аналоги адозелезин, карзелезин и бизелезин) ; подофиллотоксин; подофиллиновую кислоту; тенипозид; криптофицины (например, криптофицин 1 и криптофицин 8); доластатин; дуокармицин (включая синтетические аналоги KW-2189 и СВ1-ТМ1); элеутеробин; панкратистатин; саркодиктиин; спонгистатин; азотистые иприты, такие как хлорамбуцил, хлорнафазин, холофосфамид, эстрамустин, ифосфамид, мехлорэтамин, гидрохлорид оксида мехлорэтамина, мелфалан, новембихин, фенестерин, преднимустин, трофосфамид, урамустин; нитрозомочевины, такие как кармустин, хлорозотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин и ранимнустин; антибиотики, такие как энедииновые антибиотики (например, калихеамицин, например, калихеамицин гамма II и калихеамицин омега II (см., например, Agnew, Chem. Inti. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)); динемицин, включая динемицин А; эсперамицин; а также хромофор неокарциностатина и родственные хромофоры хромопротеинов - энедииновые антибиотики, аклациномизины, актиномицин, аутрамицин, азасерин, блеомицины, кактиномицин, карабицин, карминомицин, карзинофилин, хромомицины, дактиномицин, даунорубицин, деторубицин, 6-диазо-5-оксо-Ь-норлейцин, доксорубицин (включая ADRIAMICIN®, морфолинодоксорубицин, цианоморфолинодоксорубицин, 2- пирролинодоксорубицин, доксорубициноНС1 в инъецируемых липосомах (DOXOL®) , липосомный доксорубицин TLC D-99 (MYOCET®) , пегилированный липосомный доксорубицин (CAELYX®) и дезоксидоксорубицин) , эпирубицин, эзорубицин, идарубицин, марцелломицин, митомицины, такие как митомицин С, микофеноловую кислоту, ногаламицин, оливомицины, пепломицин, потфиромицин, пуромицин, квеламицин, родорубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, зиностатин, зорубицин; антиметаболиты, такие как метотрексат, гемцитабин (GEMZAR®) , тегафур (UFTORAL®) , капецитабин (XELODA®) , эпотилон и 5-фторурацил (5-FU); аналоги фолиевой кислоты, такие как деноптерин, метотрексат, птероптерин, триметрексат ; аналоги пурина, такие как флударабин, 6- меркаптопурин, тиамиприн, тиогуанин; аналоги пиримидина, такие как анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабин, дидезоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин, флоксуридин; средства, подавляющие функции надпочечников, такие как аминоглю е имид, митотан, трилостан; компенсатор фолиевой кислоты, такой как фолиновая кислота; ацеглатон; гликозид альдофосфамида; аминолевулиновую кислоту; энилурацил; амсакрин; бестрабуцил; бисантрен; эдатраксат; дефофамин; демеколцин; диазихон; элфорнитин; ацетат эллиптиния; этоглуцид; нитрат галлия; гидроксимочевину; лентинан; лонидаинин; майтанзиноиды, такие как майтанзин и ансамитоцины; митогуазон; митоксантрон; мопиданмол; нитраэрин; пентостатин; фенамет; пирарубицин; лозоксантрон; 2- этилгидразид ; прокарбазин; полисахаридный комплекс PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR) ; разоксан; ризоксин; сизофиран; спирогерманий; тенуазоновую кислоту; триазиквон; 2 , 2 ' , 2»-трихлортриэтиламин; трихотецены (например, токсин Т-2, верракурин А, роридин А и ангуидин) ; уретан; дакарбазин; манномустин; митобронитол; митолактол; пипоброман; гацитозин; арабинозид («ага-С») ; тиотепа; таксоид, например паклитаксел (TAXOL®) , препарат паклитаксела на основе сконструированных связанных с альбумином наночастиц (ABRAXANETM) и доцетаксел (TAXOTERE®) ; хлорамбуцил; б-тиогуанин; меркаптопурин; метотрексат; средства на основе платины, такие как цисплатин, оксалиплатин и карбоплатин; алкалоиды барвинка, которые предотвращают полимеризацию тубулина из образующихся микротрубочек, включая винбластин (VELBAN®) , винкристин (ONCOVIN®) , виндезин (ELDISINE®, FILDESIN®) и винорелбин (NAVELBINE®) ; этопозид (VP-16); ифосфамид; митоксантрон; лейковорин; новантрон; эдатрексат; дауномицин; аминоптерин; ибандронат; ингибитор топоизомеразы RFS 2000; дифторметилорнитин (DMFO) ; ретиноиды, такие как ретиноевая кислота, включая бексаротен (TARGRETIN®) ; бифосфонаты, такие как клодронат (например, BONEFOS® или OSTAC®) , этидронат (DIDROCAL®) , NE-58095, золедроновую кислоту/золедронат (ZOMETA®), алендронат (FOSAMAX®), памидронат (AREDIA®) , тилудронат (SKELID®) или ризендронат (ACTONEL®) ; троксацитабин ( 1 , 3-диоксолановый нуклеозидный аналог цитозина); антисмысловые олигонуклеотиды, например олигонуклеотиды, которые ингибируют экспрессию генов в путях передачи сигналов, вовлеченных в пролиферацию аберрантных клеток, таких как, например, РКС-альфа, Raf, H-Ras и рецептора эпидермального фактора роста (EGF-R) ; вакцины, такие как вакцина THERATOPE® и вакцины для генной терапии, например вакцина ALLOVECTIN®, вакцина LEUVECTIN® и вакцина VAXID®; ингибитор топоизомеразы 1 (например, LURTOTECAN®) ; rmRH (например, ABARELIX®) ; BAY439006 (сорафениб; Bayer) ; SU-11248 (Pfizer) ; перифосин, ингибитор ЦОГ-2 (например, целекоксиб или эторикоксиб) , ингибитор протеосом (например, PS341); бортезомиб (VELCADE®) ; CCI-779; типифарниб (811577); орафениб, АВТ510; ингибитор Вс1-2, такой как облимерсен натрия (GENASENSE®) ; пиксантрон; ингибиторы EGFR (см. определение ниже) ; ингибиторы тирозинкиназ (см. определение ниже) ; и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого из указанных выше средств; а также сочетания двух или более указанных выше средств, такие как CHOP, сокращенное название комбинированной терапии циклофосфамидом, доксорубицином, винкристином и преднизолоном, и FOLFOX, сокращенное название схемы лечения оксалиплатином (ELOXATINTM) в сочетании с 5-FU и лейковорином.

Также в указанное определение включены противогормональные средства, которые действуют, регулируя или ингибируя действие гормонов на опухоли, такие как антиэстрогены со смешанным профилем агонист/антагонист, включая тамоксифен (NOLVADEX®), 4- гидрокситамоксифен, триоксифен, торемифен (FARESTON®); идоксифен, дролоксифен, ралоксифен (EVISTA®) , триоксифен, кеоксифен и избирательные модуляторы рецепторов эстрогена (SERM) , такие как SERM3; чистые антиэстрогены без агонистических свойств, такие как фулвестрант (FASLODEX®) и ЕМ800 (такие средства могут блокировать димеризацию рецепторов эстрогена (ER) , ингибировать связывание ДНК, усиливать метаболизм ER и/или снижать уровни ER) ; ингибиторы ароматазы, включая стероидные ингибиторы ароматазы, такие как форместан и эксеместан (AROMAS IN®) , и нестероидные ингибиторы ароматазы, такие как анастразол (ARIMIDEX®) , летрозол (FEMARA®) и аминоглутетимид и другие ингибиторы ароматазы, включая ворозол (RIVISOR®) , ацетат мегестрола (MEGASE®) , фадрозол, имидазол; агонисты рилизинг-гормона лютеинизирующего гормона, включая лейпролид (LUPRON® и ELIGARD®) , гозерелин, бузерелин и триптерелин; половые стероиды, включая прогестины, такие как ацетат мегестрола и ацетат медроксипрогестерона, эстрогены, такие как диэтилстилбестрол и премарин и андрогены/ретиноиды, такие как флуоксиместерон, полностью трансретиноевая кислота и фенретинид; онапристон; антипрогестероны; понижающие регуляторы рецепторов эстрогенов (ERD) ; антиандрогены, такие как флутамид, нилутамид и бикалутамид; тестолактон; и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого из указанных выше средств; а также сочетания двух или более указанных выше средств.

Дозы и пути введения

Биспецифическое антитело, которое специфично связывается с IV и II субдоменами внеклеточного домена HER2 человека, по данному изобретению будут вводиться в количестве, эффективном для лечения состояния, о котором идет речь, т.е. в дозах и в течение периодов времени, необходимых для достижения желаемого результата. Терапевтически эффективное количество может изменяться в зависимости от таких факторов, как конкретное состояние, по поводу которого проводится лечение, возраста, пола и веса пациента, а также является ли введение биспецифического антитела, которое специфично связывается с IV и II субдоменами внеклеточного домена HER2 человека, самостоятельным лечением или оно проводится в комбинации с одним или более дополнительных препаратов или методов лечения.

Схемы приема лекарственных средств можно регулировать, чтобы обеспечить оптимальный желаемый ответ. Например, может быть введен один болюс, несколько разделенных доз могут быть введены в течение некоторого времени, или доза могут быть пропорционально уменьшена или увеличена в зависимости от остроты терапевтической ситуации. Особенно полезным является изготовление парентеральных композиций в стандартной лекарственной форме для простоты введения и однородности дозирования. Стандартная лекарственная форма при использовании в данном документе, относится к физически дискретным единицам, пригодным в качестве единичных доз для пациентов/субъектов, подлежащих лечению; каждая единица содержит заданное количество активного соединения, рассчитанное для получения желаемого терапевтического эффекта в сочетании с требуемым фармацевтическим носителем. Спецификация для стандартных лекарственных форм по настоящему изобретению, как правило, диктуется и непосредственно зависит от (а) уникальных характеристик химиотерапевтического агента и конкретного терапевтического или профилактического эффекта, которые должны быть достигнуты, и (Ь) ограничений, присущих в технике компаундирования такого активного соединения для лечения чувствительности у субъектов.

Таким образом, квалифицированным специалистам понятно, исходя из раскрытия, представленного в данном документе, что дозы и режим дозирования корректируются в соответствии со способами, хорошо известными в терапевтической области. Это означает, что может быть легко установлена максимально переносимая доза и может быть также определено эффективное количество, обеспечивающее обнаруживаемый терапевтический эффект для пациента, так же как и требования к времени введения каждого агента для достижения видимого терапевтического эффекта для пациента. Таким образом, хотя некоторые дозы и схемы режима введения приведены в качестве примеров в данном документе, эти примеры никоим образом не ограничивают дозы и режимы введения, которые могут понадобиться для пациента в практике применения настоящего изобретения .

Следует отметить, что значения дозировки могут изменяться, в зависимости от типа и тяжести состояния, которое следует облегчить, и может включать одну или более доз. Кроме того, необходимо понимать, что для любого конкретного пациента, конкретные схемы введения должны быть скорректированы через некоторое время согласно индивидуальной потребности и на усмотрение медицинского работника, который осуществляет введение или контролирует введение композиций, и что диапазоны концентрации, приведенные в данном описании, приведены только в качестве примера и не предназначены для ограничения объема или практики заявленных композиций. Кроме того, режим дозирования с композициями по данному изобретению может быть основан на различных факторах, включая тип заболевания, возраст, вес, пол, состояния здоровья пациента, тяжесть состояния, путь введения и конкретное используемое биспецифическое антитело, которое специфично связывается с IV и II субдоменами внеклеточного домена HER2 человека. Таким образом, режим дозирования может широко варьироваться, но может определяться регулярно с помощью стандартных методов. Например, дозы могут быть скорректированы на основе фармакокинетических и фармакодинамических параметров, которые могут включать клинические эффекты, такие как токсические эффекты или лабораторные значения. Таким образом, настоящее изобретение охватывает индивидуальное повышение дозы, которое определяется квалифицированным специалистом. Определение необходимой дозы и режимы хорошо известны в соответствующей области техники и будут понятны специалисту в данной области после ознакомления с идеями, раскрытыми в данном документе.

Примеры подходящих способов введения предусмотрены выше.

Предполагается, что подходящая доза биспецифического антитела, которое специфично связывается с IV и II субдоменами внеклеточного домена HER2 человека, по данному изобретению будет в диапазоне от 0,1- 200 мг/кг, предпочтительно 0,1-100 мг/кг, в том числе около 0,5-50 мг/кг, например, около 1-20 мг/кг. Биспецифическое антитело, которое специфично связывается с IV и II субдоменами внеклеточного домена HER2 человека, может быть введено, например, в дозе по меньшей мере 0,25 мг/кг, например, по меньшей мере 0,5 мг/кг, в том числе не менее 1 мг/кг, например, по меньшей мере 1,5 мг/кг, например, также как не менее 2 мг/кг, например, по меньшей мере 3 мг/кг, в том числе по меньшей мере 4 мг/кг, например, по меньшей мере 5 мг/кг; и например вплоть до максимально 50 мг/кг, в том числе вплоть до максимально 30 мг/кг, например, вплоть до максимально 20 мг/кг, в том числе вплоть до максимально 15 мг/кг. Введение будет повторяться обычно в подходящие промежутки времени, например, раз в неделю, раз в две недели, один раз каждые три недели или один раз каждые четыре недели, и так долго, как будет сочтено целесообразным ответственным врачом, который может в некоторых случаях увеличить или уменьшить дозу при необходимости.

Изделие (продукты) и наборы

Следующим вариантом осуществления изобретения является изделие, которое содержит продукты, применяемые для лечения рака, выбранного из группы: рак молочной железы (РМЖ) , злокачественное новообразование желудка, немелкоклеточный рак лёгкого, злокачественное новообразование головы и/или шеи, плоскоклеточный рак головы и шеи (ПРГШ) , колоректальный рак (КРР) , эзофагеальный рак, рак яичника, рак поджелудочной железы, рак ЖКТ, рак почек, рак шейки матки, рак эндометрия, рак матки, злокачественная меланома, рак глотки, рак ротовой полости или рак кожи. Изделие представляет собой контейнер с этикеткой и листовкой-вкладышем, которые могут быть размещены в блистере и/или пачке. Приемлемыми контейнерами являются, например флаконы, ампулы, шприцы и т.д. Контейнеры могут быть изготовлены из различных материалов, таких как стекло или полимерные материалы. Контейнер содержит композицию, эффективную для лечения определенного состояния, и может иметь стерильный входной канал) . По меньшей мере одно действующее вещество в композиции представляет собой биспецифическое антитело, которое специфично связывается с IV и II субдоменами внеклеточного домена HER2 человека, предлагаемое в изобретении. На этикетке и листовке-вкладыше в упаковке указано, что лекарственное средство применяют для лечения конкретного состояния. Этикетка и/или листовка-вкладыш в упаковке дополнительно должны содержать инструкции по введению композиции антитела пациенту, в том числе информацию о показаниях, применении, дозе, пути введения, противопоказаниях и/или мерах предосторожности, касающихся применения таких терапевтических продуктов. В одном из вариантов осуществления изобретения на листовке-вкладыше в упаковке указано, что композицию применяют для лечения заболевания или нарушения, опосредуемого HER2, а именно рака, выбранного из группы: рак молочной железы (РМЖ) , злокачественное новообразование желудка, немелкоклеточный рак лёгкого, злокачественное новообразование головы и/или шеи, плоскоклеточный рак головы и шеи (ПРГШ) , колоректальный рак (КРР) , эзофагеальный рак, рак яичника, рак поджелудочной железы, рак ЖКТ, рак почек, рак шейки матки, рак эндометрия, рак матки, злокачественная меланома, рак глотки, рак ротовой полости или рак кожи.

Кроме того, изделие может включать другие продукты, необходимые с коммерческой точки зрения и с точки зрения потребителя, например, растворители, разбавители, фильтры, иглы и шприцы, но не ограничиваясь ими .

Диагностическое использование и композиции

Биспецифическое антитело, которое специфично связывается с IV и II субдоменами внеклеточного домена HER2 человека, по настоящему изобретению также используются в диагностических целях (например, in vitro, ex vivo) . Например, данное биспецифическое антитело может использоваться для обнаружения или измерения уровня HER2 в образцах, полученных от пациента, например, образец ткани или образец жидкости тела, такой как воспалительный экссудат, кровь, сыворотка крови, жидкость кишечника, слюна или моча. Подходящие методы обнаружения и измерения включают иммунологические методы, такие как проточная цитометрия, твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА) , хемилюминесцентный анализ, радиоиммуноанализ и иммуногистология. Изобретение далее включает наборы, например, диагностические наборы, содержащие биспецифическое антитело, которое специфично связывается с IV и II субдоменами внеклеточного домена HER2 человека, описанные в данном документе.

Примеры

Для наилучшего понимания изобретения приводятся следующие примеры. Эти примеры приведены только в иллюстративных целях и не должны толковаться как ограничивающие сферу применения изобретения в любой форме .

Все публикации, патенты и патентные заявки, указанные в этой спецификации включены в данный документ путем отсылки. Хотя вышеупомянутое изобретение было довольно подробно описано путем иллюстрации и примера в целях исключения двусмысленного толкования, специалистам в данной области на основе идей, раскрытых в данном изобретении, будет вполне понятно, что могут быть внесены определенные изменения и модификации без отклонения от сущности и объема прилагаемых вариантов осуществления изобретения.

Материалы и общие методы

Общая информация, касающаяся нуклеотидных последовательностей легких и тяжелых цепей человеческого иммуноглобулина, представлена у: Rabat Е.А. и др . , Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5- oe изд . , изд-во Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991. Аминокислоты цепей антител пронумерованы согласно нумерации EU (Edelman G.M. и др . , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63, 1969, ее. 78- 85; Rabat Е.А. и др . , Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-ое изд., изд-во Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991) .

Методы рекомбинантной ДНК

Для манипуляций с ДНК использовали стандартные методы, описанные у Sambrook J. и др . , Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989. Реагенты для молекулярной биологии использовали согласно инструкциям производителей .

Синтез генов

Требуемые сегменты генов получали из олигонуклеотидов, созданных путем химического синтеза. Генные сегменты длиной от 300 до 4000 т.п.н., которые фланкированы уникальными сайтами рестрикции, собирали путем отжига и лигирования олигонуклеотидов, включая ПЦР-амплификацию и последующее клонирование через указанные сайты рестрикции. Последовательности ДНК субклонированных генных фрагментов подтверждали путем секвенирования ДНК.

Определение последовательностей ДНК

Последовательности ДНК определяли путем секвенирования по Сенгеру .

Анализ последовательностей ДНК и белков и обработка данных о последовательностях

Применяли пакет программ фирмы Infomax's Vector NT1 Advance suite, версия 8.0 для создания, картирования, анализа, аннотирования и иллюстрации последовательностей. Экспрессионные векторы

Для экспрессии описанных антител и антигенов применяли варианты экспрессионных плазмид, предназначенных для экспрессии в клетках прокариот (E.coli) кратковременной экспрессии в клетках эукариот (например, в клетках СНО) . Помимо кассеты экспрессии антитела векторы содержали: сайт инициации репликации, обеспечивающий репликацию указанной плазмиды в E.coli, гены, придающие устойчивость в E.coli к различным антибиотикам (например, к ампициллину и канамицину) .

Слияние генов, содержащих описанные цепи антитела, как указано ниже, осуществляли с помощью ПЦР и/или синтеза и сборки генов с использованием известных методов и процедур рекомбинации путем соединения соответствующих сегментов нуклеиновых кислот, например, с использованием уникальных сайтов рестрикции в соответствующих векторах. Субклонированные нуклеотидные последовательности подтверждали секвенированием ДНК. Для кратковременных трансфекций создавали большие количества плазмид посредством получения плазмид из трансформированных культур Е. coli.

Пример 1

Продукция рекомбинантных антигенов и контрольных антител в суспензионной культуре клеток млекопитающих

Последовательности экстраклеточного домена Нег2 человека и животных Нег2 были синтезированы и клонированы в вектор для наработки белка в клетках млекопитающих с тагом Fc (фиг. 1) по сайтам рестрикции Sall/Notl .

В качестве контроля использовали антитела с опубликованной последовательностью Pertuzumab, Trastuzumab. Гены вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей антител были синтезированы и клонированы в вектора рЕЕ-НС, рЕЕ-СК (фиг. 2, 3, 4), предназначенною для наработки белка в клетках млекопитающих, по сайтам рестрикции Sall/Nhel и Sall/BstWI соответственно.

Плазмиды нарабатывали в необходимых количествах в клетках E.coli и очищали при помощи набора Qiagen.

Антигены и контрольные антитела продуцировали в клетках постоянной клеточной линии, полученной из клеток яичника китайского хомячка (линия СНО-Т) . Суспензионное культивирование осуществляли в колбах на орбитальном шейкере-инкубаторе, с использованием бессывороточных сред производства компании HyCell TransFx-C с добавлением 8 мМ L-глутамина и 1 г/л плюроника 68. Для транзиентной экспрессии клетки в концентрации 2-2,2*10 ⁶ кл/мл трансфецировали с помощью линейного полиэтиленимина (ПЭИ «МАХ», компания «Polysciences») . Соотношение ДНК/ПЭИ составляло 1:3/1:10. Через 9 дней после трансфекции культуральную жидкость отделяли от клеток фильтрацией через глубинный фильтр с размером пор 0,5/0,22 мкм. Целевые белки выделяли из культуральной жидкости с помощью аффинной хроматографии . Рекомбинантные белки с Fc из куль уральной жидкости выделяли и очищали, используя колонку для аффинной хроматографии протеин А. Осветленную культуральную жидкость пропускали через колонку HiTrap rProtein A Sepharose FF объемом 5 мл (GE Healthcare) , уравновешенную фосфатно-солевым буфером (ФСБ, pH 7,4) . Затем колонку промывали 5 колоночными объемами ФСБ, чтобы вымыть неспецифически связывающие компоненты. Связанный антиген элюировали, используя 0,1 М глициновый буфер pH 3. Главный протеиновый пик элюции собирали и доводили его pH до нейтральности с помощью 1 М буфера Tris (pH 8) . Все стадии проводили при скорости потока 110 см/ч. Далее белок переводили в ФСБ (pH 7,4) с помощью диализа, используя технологию SnakeSkin Dialysis Tubing, фильтровали (0,22 мкм) , переносили в пробирки и хранили при -70°С.

Чистоту полученного раствора белка оценивали с помощью SDS-гель- электрофореза в редуцирующих и нередуцирующих условиях.

Пример 2

Создание синтетических оптимизированных комбинаторных библиотек Fab-фрагментов

Для создания мутантных антител, специфичных против Нег2 был проведен структурный анализ отобранных природный байндеров на основе 3D моделирования с использованием программных пакетов Schrodinger Suite компании Schrodinger и пакета YLab компании БИОКАД. В качестве кристаллической структуры мишени была выбрана PDB 1S78, включающая в себя структуру мишени и контрольного антитела pertuzumab, обладающего схожим эпитопом связывания. Гомологичный фолдинг природных байндеров осуществлялся с помощью инструментов BioLuminate (часть пакета Schrodinger Suite компании Schrodinger) и BENDER (часть пакета YLab компании БИОКАД) . Получение модели взаимодействующего комплекса осуществлялся с помощью инструмента белок-белкового докинга HEDGE (часть пакета YLab компании БИОКАД) . Выбор оптимальных поз был проведен с помощью оценки усредненной энергии связывания на 50 наносекундном интервале молекулярной динамики (инструмент Desmond, часть пакета Schrodinger Suite) с помощью метода MM-GBSA (с силовым полем OPLS_2005) для фреймов динамики, взятых на различных интервалах симуляции. Визуализация полученной структуры создана с помощью инструмента PyMOL компании Schrodinger.

С помощью пакета YLab были определены и исправлены потенциальные сайты пост-трансляционных модификаций, а также предложены точки замен, повышающие гуманизацию предложенных последовательностей и потенциально повышающих связывание. Оценка точек проводилась с помощью структурных замен аминокислот в выбранных позициях и оценки изменения энергии связывания с помощью вычисления методом MM-GBSA (с силовым полем OPLS_2005) . Дизайн олигонуклеотидов для синтеза был осуществлен пакетом OligoDesigner (часть пакета YLab компании БИОКАД) .

Библиотека содержала 335 различных Fab-кандидатов: 1) 135 кандидатов в сете с отбором по аффинности (до 10 замен в б CDR) ; 2) 211 кандидатов в сете с отбором по стабильности (по 1 мутации в каждом CDR из набора) , скомбинированных из 196 различных тяжелых цепей и 37 легких цепей (фиг. 5-8) .

Гены Fab антител были синтезированы с использованием вырожденных олигонуклеотидов и клонированы в вектор pBL, предназначенный для наработки Fab-фрагментов в клетках Е. coli, по сайтам Ncol, Nhel (фиг. 9) .

Пример 3

Отбор высокоаффинных клонов из синтетической библиотеки, специфически связывающих Нег2 человека

Наработку Fab проводили по стандартной методике: бактериальные клетки Е. coli B121Gold трансформировали экспрессионными векторами, содержащими гены Fab, а последующее добавление индуктора, запускало транскрипцию 1ас-оперона, что при культивировании полученных трансформантов вызывало экспрессию Fab, которые экспортировались в периплазматическое пространство клеток. Далее проводили ИФА для проверки связывания Fab с иммобилизованным на подложке антигеном Нег2- Fc в концентрации 0,2 мкг/мл на планшетах (medium binding от Greiner bio one) в 0.1 M аНСОз, pH 9.0 (антиген иммобилизовали в течении ночи при 4°С) . В качестве положительного контроля использовали Fab контрольного антитела Pertuzumab (Roche) . Все последующие этапы проводили при комнатной температуре по стандартному протоколу ИФА с использованием высокопроизводительной автоматизированной платформы на базе роботизированных систем Genetix Qpix2xt (от Molecular Device) и Tecan Freedom EVO 200 (от Tecan) . После каждого этапа проводили отмывку 300 мкл на лунку 1х ФСБТ в трех повторностях. Проводили блокирования неспецифических участков связывания на планшете 1% обезжиренным молоком в 1х ФСБТ, после отмывки происходило связывание с аналитом, в качестве которого выступали супернатанты клеток Е. coli в обьеме 60 мкл на лунку. Детекция иммунных комплексов осуществлялась при помощи козьих анти-Fab антител, коньтированных с пероксидазой (от Pierce- ThermoScientific) в разведении 1:7500. Окрашивание субстрат- хромогенной смеси проводили добавлением субстратного раствора (Н2О2- 0,02% и ТМБ в CHsCOONa рН5.5) в объёме 50 мкл на 15 минут. Остановку реакции осуществили 25 мкл H2S04 1%. Цветовой сигнал измеряли при длине волны 450 нм, используя подходящий планшет-ридер Tecan-Sunrise (от Tecan) . Степень связывания антитела была пропорциональна интенсивности цветового сигнала. Клоны, у которых интенсивность цветового сигнала превышала сигнал от контрольного антитела, проверяли в ИФА на неспецифическое связывание.

В результате было отобрано 348 клонов для дальнейшего анализа. Пример 4

Анализ неспецифического связывания отобранных Fab с другими антигенами

ИФА использовали также для анализа неспецифического связывания исследуемых Fab-фрагментов с другими антигенами. Исследование проводили, как описано выше, но в качестве антигенов для иммобилизации использовали Angiopoetin2-H6F, Cmet-Fc, GM-CSFl-Fc, INF 2b в 0.1 M ИаНСОЗ, pH 9.0 (антиген иммобилизовали в течении ночи при 4°С) . В качестве контроля специфического связывания использовали Her2-Fc (антиген иммобилизовали в течении ночи при 4°С) . Все последующие этапы проводили по стандартному протоколу ИФА с использованием высокопроизводительной автоматизированной платформы на базе роботизированных систем Genetix Qpix2xt (от Molecular Device) и Tecan Freedom EVO 200 (от Tecan) . Клоны, у которых значение оптической плотности в контрольных лунках (неспецифическое связывание) не превышало значения оптической плотности отрицательного контроля, проверяли в конкурентном ИФА анализе для выявления Fab, блокирующих взаимодействие контрольного антитела Pertuzumab в формате IgG с антигеном Her2-Fc.

Последовательности вариабельных доменов позитивных клонов секвенировали согласно стандартным протоколам и анализировали.

Пример 5

Отбор высокоаффинных Fab фрагментов по скорости диссоциации

Off-rate скрининг проводили с использованием прибора Pall Forte Bio Octet Red 394. Анти FAB2G CHl-биосенсоры в течение 30 минут регидратировали в рабочем буфере, содержащем 10 мМ ФСБ, pH 7.2-7.4, 0.1% Твин-20, 0,1% БСА. В исследуемые образцы супернатантов Е. coli добавляли рабочий буфер до конечной концентрации 10%. Затем анти и FABCHl-биосенсоры погружали в супернатанты Е. coli, содержащие Fab- фрагменты кандидатов антител, на 12 часов при 4°С. Сенсоры с иммобилизованными на поверхности Fab-фрагментами переносили в лунки с рабочим буфером, где прописывали базовую линию (60 с.) . Далее сенсоры переносили в лунки с раствором аналита (Her2-Fc, 30 мкг/мл) для ассоциации комплекса антиген-антитело (300 с.) . Затем сенсоры возвращали в лунки, содержащие рабочий буфер, для последующей стадии диссоциации (600 с.) . После каждого эксперимента использованные сенсоры регенерировали путем трехкратного помещения их в буфер для регенерации (10 мМ Gly-HCl, pH 1,7) после чего использовали в следующем эксперименте. Анализ полученных кривых проводили с помощью программного обеспечения Octet Data Analysis (версия 8.2) согласно стандартной процедуре по модели взаимодействия 1:1 Local. Восемь клонов, показавших взаимодействие с антигеном представлены в приложении (Фиг.10) . Пример 6

Получение полноразмерных антител в формате IgGl и биспецифических антител в формате асимметрии

Для полученных 8 кандидатов (Пример 5) с помощью инструмента OligoDesigner программного пакета YLab (Биокад) была проведена кодон- оптимизация для СНО (по 2 кодон-оптимизации для каждого клона) . Оптимизированные последовательности вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей были синтезированы de novo и клонированы в вектора рЕЕ- НС, рЕЕ-СК (формат IgGl) или в вектора рЕЕ-HChole, рЕЕ-СК (для формата асимметрии) по сайтам рестрикции Sall/Nhel и Sall/BsiWl соответственно .

Схематическое изображение формата асимметрии изображено на фиг. 11. Данный формат представляет собой антитело, в котором в константных доменах тяжелых цепей внесены мутации (hole=Y352C, T369S, L371A, Y419V; knob=S390C, T402W) , обеспечивающие образование гетеродимера. Тяжелая цепь, содержащая выпуклость (knob) содержит следующие домены: Trastuzumab в формате scFv, гибкий линкер, Fc-knob (Фиг. 12) . Тяжелая цепь, содержащая впадину (hole), состоит из доменов: VH оптимизированных кандидатов, СН1, шарнирная область IgGl, Fc-hole. В пару к тяжелой цепи с hole нарабатывалась также легкая цепь, содержащая домены VL оптимизированных кандидатов, и домен СК.

Полученными генетическими конструкциями трансформировали клеточную линию СНО-Т-НС. Белки выделяли и очищали по стандартной методике путем аффинной хроматографии на бактериальном белке Protein А как описано в примере 1. Электрофорез проводили в денатурирующих условиях в 7,5% ПААГ (Фиг.13, 14, 15, 16) . Продуктивность кандидатов BCD147-02-004 , -006, -011, -015, -016, -018, -025 оказалась ниже порогового уровня (50 мг/л) , и соответственно они не брались на выделение и очистку.

Пример 7

Определение аффинности полноразмерных антител на Forte Bio Octert RED 384

Эксперименты по исследованию аффинности связывания антител к антигену Нег2 человека проводили на приборе Forte Bio Octert RED 384. Her2-Fc человека в концентрации 20 мкг/мл иммобилизовали на поверхности аминореактивных сенсоров второго поколения (ForteBio, AR2G) по стандартному протоколу согласно инструкции производителя для подготовки и иммобилизации AR2G сенсоров. Анализ проводили при 30 °С с использованием ФСБ, содержащим 0,1% Твин-20 и 0,1% БСА в качестве рабочего буфера. После того как в буферном растворе прописывали базовую линию сенсоры погружали в лунки с раствором антител в концентрации в 10 раз превышающей предполагаемую константу диссоциации на 600 секунд, где происходит ассоциация комплекса. Затем детектировали диссоциацию комплекса в буферном растворе в течении 600 секунд.

Кривые связывания с вычетом базового сигнала анализировали с помощью программы Octet Data Analysis (версия 8.2) согласно стандартной процедуре с использованием модели взаимодействия 1:1. Анти-Нег2 антитела специфически и с высокой аффинностью связываются с антигеном человека с константами, представленными на Фиг.17.

Пример 8.1

Определение эпитопной специфичности кандидатов

Эксперименты по исследованию эпитопной специфичности антител к антигену Нег2 человека проводили на приборе Forte Bio Octert RED 384 в форматах «Ip-tandem» и «Sandwich».

Формат «Ip-tandem» - конкуренция с Trastuzumab: Her2-Fc человека в концентрации 20 мкг/мл иммобилизовали на поверхности аминореактивных сенсоров второго поколения (ForteBio, AR2G) по стандартному протоколу согласно инструкции производителя для подготовки и иммобилизации AR2G сенсоров. Анализ проводили при 30 °С с использованием ФСБ, содержащим 0,1% Твин-20 и 0,1% БСА в качестве рабочего буфера. После того как в буферном растворе прописывали базовую линию сенсоры погружали в лунки с раствором контрольных антител Trastuzumab в концентрации 60 мкг/мл где происходит ассоциация. Затем, после насыщения антигена, погружали в раствор с анализируемыми образцами в концентрации 15 мкг/мл. Все кандидаты показывали связывание с антигеном за эпитоп, отличный от эпитопа Trastuzumab (фиг 18.) .

Формат «Ip-tandem» - конкуренция с Pertuzumab: Her2-Fc человека в концентрации 20 мкг/мл иммобилизовали на поверхности аминореактивных сенсоров второго поколения (ForteBio, AR2G) по стандартному протоколу согласно инструкции производителя для подготовки и иммобилизации AR2G сенсоров. Анализ проводили при 30 °С с использованием ФСБ, содержащим 0,1% Твин-20 и 0,1% БСА в качестве рабочего буфера. После того как в буферном растворе прописывали базовую линию сенсоры погружали в лунки с раствором контрольных антител Pertuzumab в концентрации 60 мкг/мл, где происходит ассоциация. Затем, после насыщения антигена, сенсоры погружали в раствор с анализируемыми образцами в концентрации 15 мкг/мл. Все кандидаты показывали связывание с антигеном за эпитоп, отличный от эпитопа Pertuzumab (фиг. 19) .

Формат «Sandwich»: Trastuzumab в концентрации 30 мкг/мл иммобилизовали на поверхности аминореактивных сенсоров второго поколения (ForteBio, AR2G) по стандартному протоколу согласно инструкции производителя для подготовки и иммобилизации AR2G сенсоров. Анализ проводили при 30°С с использованием ФСБ, содержащим 0,1% Твин- 20 и 0,1% БСА в качестве рабочего буфера. После того как в буферном растворе прописывали базовую линию сенсоры погружали в лунки с Нег2- Fc человека в концентрации 15 мкг/мл. Затем сенсоры погружали в лунки с раствором Pertuzumab в концентрации 30 мкг/мл. Затем сенсоры погружали в лунки с анализируемыми образцами в концентрации 30 мкг/мл. Все кандидаты не показывали связывания с антигеном за эпитопы, отличные от эпитопа Pertuzumab и Trastuzumab (фиг.20) .

Пример 8.2

Анализ неспецифического связывания антител к нецелевым антигенам

Эксперименты по исследованию неспецифического связывания антител к нецелевым антигенам человека проводили на приборе Forte Bio Octert RED 384.

Сенсоры anti-human Fc (ForteBio, AHC) погружали в раствор с антителами в концентрации 30 мкг/мл на 300 секунд для их иммобилизации. Затем сенсоры с загруженным антителом погружали в лунки с растворами нецелевых антигенов в концентрации 30 мкг/мл на 150 с. Затем детектировали диссоциацию комплекса в течении 150 секунд.

Затем другие, незагруженные антителами, АНС сенсоры погружали в лунки с растворами нецелевых антигенов с аналогичными параметрами, как описано ранее, для считывания референсного сигнала. При обработке данных референсный сигнал вычитался из сигнала, полученного с сенсоров с иммобилизованными антителами.

Анализ проводили при 30°С с использованием ФСБ, содержащим 0,1% Твин-20 и 0,1% БСА в качестве рабочего буфера. В панель неспецифических антигенов входят: Ang2, IL23, GMCSF Fe, IL6R, IL5R, IL4R, DLL4 , PDL1, LAG3 , FGF2 , НегЗ, CD3 ED, CD137, PCSK9 , PD1. Данные антигены не содержат Fc-тага.

Кривые связывания с вычетом референсного сигнала анализировали с помощью программы Octet Data Analysis (версия 8.2) согласно стандартной процедуре с использованием модели взаимодействия 1:1. Кандидаты BCD147-02-002 , -007, -008, -009, -012, -013, -014, -017, - 019, -021, -022, -026, -030, -033, -034, -035 продемонстрировали связывание с нецелевыми антигенами, и в дальнейшую работу не брались.

Пример 9

Получение клеточной линии, стабильно продуцирующей биспецифические антитела в формате асиммерик

По результатам всех вышеперечисленных тестов лучше всего показал себя кандидат BCD147-02-020. Последовательности его тяжелой и легкой цепи, а также последовательность Trastuzumab в формате scFv были клонированы в вектора pSX по сайтам Hindlll, Xbal . Полученные плазмиды нарабатывали в клетках Е. coli и выделяли с помощью прибора BenchPro в количестве 600-700 мкг . Плазмиды линеаризовали в течение ночи с помощью эндонуклеазы Pvul, затем переосаждали этанолом и доводили конечную концентрацию до 900-1100 нг/мкл.

Клеточную линию CHO-K1-S культивировали в среде S.3.87 ММ (синтетическая среда, разработанная в «БИОКАД» без содержания FBS) + 6 mM Glutamine. Трансфекцию генетическими конструкциями, содержащими кодирующие последовательности цепей кандидата BCD147-02-020, проводили с помощью электропорации на приборе Nucleofector™ (Lonza) согласно протоколу производителя.

На следующий день после трансфекции в течение 24 дней проводилась селекция трансфецированной культуры добавлением в среду пуромицина (конечная концентрация 7,2 мкг/мл) , гигромицина Б (конечная концентрация 640 мкг/мл) и бластицидина (конечная концентрация 2,62 мкг/мл) . Полученная после селекции популяция клеток была клонирована. Клеточный клон, экспрессирующий BCD147-02-020, был выбран на основе результатов анализа уровня целевого белка и гомогенности его структуры, с учетом скорости роста, гомогенности популяции и отсутствия морфологических изменений.

Пример 10

Сравнение кандидата антитела против HER2-HER2 BCD147-02-020 и моноклональных антител трастузумаб, пертузумаб, а также смеси трастузумаб и пертузумаб в антипролиферативном тесте на культуре клеток ВТ-474

Для анализа антипролиферативной активности использовали клеточную линию рака молочной железы ВТ-474 с гиперэкспрессией рецептора HER2 (линия HER2+++) .

Клетки культивировали в среде DMEM/F12 с 2 мМ глутамином, 10% FBS (фетальной бычьей сывороткой), 10 мкг/мл инсулина при 37°С, 5% С02. Клетки снимали с поверхности культуральных флаконов с помощью трипсина. Жизнеспособность и количество клеток оценивали с использованием красителя трипановый синий. Готовили суспензию клеток в среде DMEM/F12 с 2 мМ глутамином, 10% FBS, 10 мкг/мл антибиотика гентамицина с плотностью 1 * 10 ⁵ клеток/мл. В лунки 96-луночного планшета вносили по 100 мкл полученной клеточной суспензии, инкубировали планшет 1 час при 37 °С и 5% СОг. Готовили серию разведений антител трастузумаб, пертузумаб, смесь трастузумаб и пертузумаб и BCD147-02- 020 от концентрации 100 мкг/мл, вносили в планшет с клетками по 10 мкл на лунку планшета. Для приготовления смеси трастузумаб и пертузумаб смешивали в соотношении 1:1 двукратные растворы каждого из антител. Планшет инкубировали в течение 5 суток при 37 °С, 5% СОг. После окончания времени инкубации проводили анализ жизнеспособности клеток с помощью красителя Аламар синий ( alamarBlue®) . Вносили по 11 мкл красителя в лунки планшета, инкубировали планшет при 37 °С, 5% СОг до развития градиентной окраски. Оценивали уровень флюоресценции с помощью планшетного детектора Infinite М200Рго при длине волны возбуждения/испускания 544/590 нм. Построение кривых зависимости интенсивности флуоресценции от концентрации белка проводили с помощью программного обеспечения Magellan ver. 7.2, использовали модель 4-х- параметровой кривой с оптимизацией коэффициентов по алгоритму Levenberg-Marquardt . Уровень ингибирования пролиферации при максимальной концентрации кандидата BCD147-02-020 в 1,43 раза превышает смесь моноклональных антител трастузумаб и пертузумаб.

Результаты показаны на фиг. 22.

Пример 11

Сравнение кандидата антитела против HER2-HER2 BCD147-02-020 и моноклональных антител трастузумаб, пертузумаб, а также смеси трастузумаб и пертузумаб в антипролиферативном тесте с внесением hrEGF на культуре клеток ВТ-474

Оценку антипролиферативной активности с внесением человеческого рекомбинантного эпидермального фактора роста (hrEGF) проводили как описано в Примере 10, за исключением следующего: суспензию клеток готовили в среде DMEM/F12 с 2 мМ глутамином, 1% FBS, 10 мкг/мл антибиотика гентамицина с плотностью 2*10 ⁵ клеток/мл. Вносили в лунки планшета по 50 мкл клеточной суспензии. Вносили по 50 мкл раствора hrEGF, получали конечную концентрацию hrEGF 1 нМ. Серию разведений антител готовили от концентрации 500 мкг/мл.

Уровень ингибирования пролиферации при максимальной концентрации кандидата BCD147-02-020 в 1,44 раза превышает смесь моноклональных антител трастузумаб и пертузумаб.

Результаты показаны на фиг. 23.

Пример 12

Сравнение кандидата антитела против HER2-HER2 BCD147-02-020 и моноклональных антител трастузумаб и смеси трастузумаб и пертузумаб в антипролиферативном тесте на культуре клеток ВТ-474 Clone 5

Антипролиферативный анализ на клетках ВТ-474 Clone 5, устойчивых к трастузумабу в пролиферативных тестах, проводили как описано в Примере 10.

Для кандидата BCD147-02-020 отношение максимального уровня ингибирования пролиферации к точке 0, составило 1,5 раза. Кандидат BCD147-02-020, в отличие от антител трастузумаб и смеси трастузумаб и пертузумаб, оказывает антипролиферативный эффект на клеточную линию, устойчивую к трастузумабу в пролиферативных тестах.

Результаты показаны на фиг. 24.

Пример 13

Сравнение кандидата антитела против HER2-HER2 BCD147-02-020 и смеси моноклональных антител трастузумаб и пертузумаб в анализе антитело-зависимой клеточной цитотоксичности (ADCC) на клеточной линии ВТ-474 с использованием репортерных клеточных линий Jurkat ADCC Reporter High и Jurkat ADCC Reporter Low

Анализ ADCC проводили с использованием в качестве клеток- эффекторов репортерных линий Jurkat, стабильно экспрессирующих на своей поверхности FcyRIIIa (CD16a) рецептор и несущих ген, кодирующий люциферазу, экспрессирующийся в ответ на активацию NFAT-пути, которая в свою очередь происходит после взаимодействия FcyRIIIa рецептора с Fc-частью антитела, при условии связывания антитела с антигеном на поверхности клеток-таргетов . В анализе использовали 2 репортерные клеточные линии Jurkat, стабильно экспрессирующие FcyRIIIa рецептор, вариант V158 (с высокой афинностью к Fc - Jurkat Reporter ADCC High) и стабильно экспрессирующие FcyRIIIa рецептор, вариант F158 (с низкой афинностью к Fc - Jurkat Reporter ADCC Low) .

Суспензию клеточной линии ВТ-474 в среде flMEM/F12, 2 мМ глутамином, 10% FBS с концентрацией 5*10 ⁴ клеток/мл, вносили в 96- луночные планшеты с белыми стенками по 100 мкл на лунку. Планшеты с клетками инкубировали ночь при 37 °С, 5% СОг. Клеточные линии Jurkat Reporter ADCC High и Jurkat Reporter ADCC Low переводили в среду RPMI- 1640, 2 мМ глутамином, 10% FBS, с плотностью клеточной суспензии 1 * 10 ⁶ клеток/мл. Селективные антибиотики не добавляли. Также, инкубировали ночь при 37 °С, 5% СОг.

По окончании времени инкубации из лунок с клетками ВТ-474 отбирали супернатант и вносили по 40 мкл приготовленных серий разведений антител BCD147-02-020 и смеси трастузумаб и пертузумаб в среде RPMI-1640, 2 мМ глутамином, 4% FBS ultra-low IgG. Вносили по 40 мкл клеточной суспензии Jurkat Reporter ADCC High или Jurkat Reporter ADCC Low c концентрацией 1,875*10 ⁶ клеток/мл. Планшеты инкубировали при 37°С, 5% С0 ₂ в течение 5 часов. Вносили по 80 мкл субстрата для люциферазы Bio- Glo (Promega) , проводили измерение люминесценции с использованием Infinite М200Рго при времени инкубации 8 мин, считывании люминесценции при времени интеграции 100 ms. Построение кривых зависимости интенсивности люминесценции от концентрации белка проводили с помощью программного обеспечения Magellan ver. 7.2, использовали модель 4-х- параметровой кривой с оптимизацией коэффициентов по алгоритму Levenberg-Marquardt .

Активность кандидата BCD147-02-020 составила 99,2% от активности смеси антител трастузумаб и пертузумаб с использованием репортерной линии с высокоаффинным FcyRIIIa рецептором, и 121,2% - с использованием репортерной линии с низкоаффинным FcyRIIIa рецептором.

Результаты показаны на фиг. 25 и фиг. 26.

Пример 14

Сравнение кандидата антитела против HER2-HER2 BCD147-02-020 и моноклональных антител трастузумаб, и смеси трастузумаб и пертузумаб в анализе комплементзависимой цитотоксичности (CDC) на клеточных линиях ВТ-474 и SK-BR-3

Для анализа комплементзависимой цитотоксичности использовали 2 клеточные линии рака молочной железы - ВТ-474 и SK-BR-3, с повышенной экспрессией рецептора HER2. В качестве положительного контроля комплементзависимой цитоксичности использовали моноклональное антитело ритуксимаб в концентрации 50 мкг/мл и клеточную линию WIL2-

S .

Анализ проводили в среде RPMI-1640, 2мМ глутамином, 0,1% бычьим сывороточным альбумином, 50 мкг/мл гентамицина. Готовили серию разведений антител трастузумаб, смеси трастузумаб и пертузумаб, BCD147-02-020 от концентрации 50 мкг/мл. Вносили в 96-луночные планшеты по 50 мкл на лунку. Вносили 50 мкл клеточной суспензии ВТ- 474 или SK-BR-3 с плотностью 0,4*10 ⁶ клеток/мл. Для положительного контроля комплементзависимой цитоксичности вносили клеточную суспензию WIL2-S с плотностью 1 * 10 ⁶ клеток/мл. Готовили рабочий раствор комплемента разведением жидкого препарата комплемента человека в 4 раза. Вносили рабочий раствор комплемента по 50 мкл/лунку. Планшеты инкубировали в течение 2 часов при 37 °С, 5% СОг. Вносили по 15 мкл красителя Аламар синий в лунки планшета, инкубировали планшет при 37° С, 5% СОг до развития градиентной окраски. Оценивали уровень флюоресценции с помощью планшетного детектора Infinite М200Рго при длине волны возбуждения/испускания 544/590 нм.

Кандидат BCD147-02-020, также как трастузумаб и смесь трастузумаба и пертузумаба не оказывают комплементзависимой цитотоксичности на клеточные линии ВТ-474 и SK-BR-3.

Результаты показаны на фиг. 27.

Пример 15

Сравнение кандидата антитела против HER2-HER2 BCD147-02-020 и смеси моноклональных антител трастузумаб и пертузумаб в анализе антитело-зависимой клеточной цитотоксичности (ADCC) на клеточной линии HUVEC с использованием репортерной клеточной линии Jurkat ADCC Reporter High

Анализ ADCC проводили аналогично описанному в примере 13, за исключением следующего: в качестве таргетной линии использовали клетки HUVEC. Клетки HUVEC размораживали в день анализа, отмывали от DMSO, готовили клеточную суспензию с концентрацией 2*10 ⁵ клеток/мл в среде Medium200 с lx LSGS (Gibco) , смешанной 1:1 со средой Medium200, 5% Attachment factor (Gibco) , 4 мкг/мл гентамицин, вносили по 50 мкл/лунку в 96-луночные планшеты с белыми стенками. Инкубировали планшеты с клетками в течение 1,5-2х часов при 37 °С, 5% С0 ₂ . Вносили титр антител смеси трастузумаб и пертузумаб, BCD147-02-020, и антител, связывающихся с DLL4 в качестве положительного контроля ADCC на HUVEC, по 25 мкл/лунку. Титр антител готовили с шагом 2, от концентрации 400 мкг/мл. Вносили суспензию Jurkat Reporter ADCC High, с концентрацией 3,75*10 ⁶ клеток/мл, по 25 мкл/лунку. Инкубировали в течение 5 часов при 37°С, 5% С0 ₂ · Добавляли 100 мкл реагента Bio-Glo (Promega) , проводили измерение люминесценции с использованием Infinite М200Рго при времени инкубации 8 мин, считывании люминесценции при времени интеграции 100 ms. Для смеси трастузумаб и пертузумаб показана незначительная активность в данном тесте, кандидат BCD147-02-020 не показал активности в данном тесте.

Результаты показаны на фиг. 28.

Пример 1 б

Оценка эффективности препарата BCD-147-02-20 на модели подкожных ксенографтов

Для оценки эффективности использовали иммунодефицитных Nude- мышей, которым подкожно прививали опухолевую линию ZR-75-1. Каждое животное в группе получало 2, 5х10 ⁶ /мышь опухолевых клеток. Перед введением клетки смешивали с Matrigel® в соотношении 1:1. Полученную смесь вводили подкожно. Оценку эффективности проводили с использованием 4 доз препарата BCD-147-02-20, препарата сравнения смесь препаратов Трастузумаба и Пертузумаба (положительный контроль) и плацебо (отрицательный контроль) .

Таблица 1. Распределение животных по группам в эксперименте по определению эффективности препарата BCD-147-02-20

В ходе эксперимента оценивали вес животных (до введения, и далее два раза в неделю) , объем опухолевого узла, использовали следующую формулу :

где W - ширина опухолевого узла, L - длинна опухолевого узла.

Критерием эффективности исследуемого препарата служат показатель торможения роста опухоли (ТРО) и индекс прироста опухоли (I), которые вычисляют по формулам:

ТРО (%)= (Vo-Vk) /Vk *100,

где Vk и Vo - средний объем опухоли (мм ³ ) в контрольной опытных группах, соответственно.

Ii = Vi/Vo,

Где I - индекс прироста опухоли, i-сутки эксперимента, Vo - объем опухоли в день начала лечения.

Результаты показаны на фигурах 29 и 30. Пример 17

Оценка эффективности препарата BCD-147-02-20 на модели подкожных ксенографтов

Для оценки эффективности использовали иммунодефицитных Nude- мышей, которым подкожно прививали опухолевую линию SKBR3. Каждое животное в группе получало 5, 0х10 ⁶ /мышь опухолевых клеток. Перед введением клетки смешивали с Matrigel® в соотношении 1:1. Полученную смесь вводили подкожно. Оценку эффективности проводили с использованием 4 доз препарата BCD-147-02-20, препарата сравнения смесь препаратов Трастузумаба и Пертузумаба (положительный контроль) и плацебо (отрицательный контроль) .

Таблица 2. Распределение животных по группам в эксперименте по определению эффективности препарата BCD-147-02-20

В ходе эксперимента оценивали вес животных (до введения, и далее два раза в неделю) , объем опухолевого узла, использовали следующую формулу :

где W - ширина опухолевого узла, L - длинна опухолевого узла.

Критерием эффективности исследуемого препарата служат показатель торможения роста опухоли (ТРО) и индекс прироста опухоли (I), которые вычисляют по формулам:

ТРО (%)= (Vo-Vk) /Vk *100,

где Vk и Vo - средний объем опухоли (мм ³ ) в контрольной опытных группах, соответственно.

Ii =Vi/Vo,

Где I - индекс прироста опухоли, i-сутки эксперимента, Vo - объем опухоли в день начала лечения.

Результаты показаны на фигурах 31 и 32. Пример 18

Оценка эффективности препарата BCD-147-02-20 на модели подкожных ксенографтов

Для оценки эффективности использовали иммунодефицитных Nude- мышей, которым подкожно прививали опухолевую линию ВТ-474. Каждое животное в группе получало 5, 0х10 ⁶ /мышь опухолевых клеток. Перед введением клетки смешивали с Matrigel® в соотношении 1:1. Полученную смесь вводили подкожно. Оценку эффективности проводили с использованием 4 доз препарата BCD-147-02-20, препарата сравнения смесь препаратов Трастузумаба и Пертузумаба (положительный контроль) и плацебо (отрицательный контроль) .

Таблица 3. Распределение животных по группам в эксперименте по определению эффективности препарата BCD-147-02-20

В ходе эксперимента оценивали вес животных (до введения, и далее два раза в неделю) , объем опухолевого узла, использовали следующую формулу :

где W - ширина опухолевого узла, L - длинна опухолевого узла.

Критерием эффективности исследуемого препарата служат показатель торможения роста опухоли (ТРО) и индекс прироста опухоли (I), которые вычисляют по формулам:

ТРО (%)= (Vo-Vk) /Vk *100,

где Vk и Vo - средний объем опухоли (мм ³ ) в контрольной опытных группах, соответственно.

Ii =Vi/Vo,

Где I - индекс прироста опухоли, i-сутки эксперимента, Vo - объем опухоли в день начала лечения.

Результаты показаны на фигурах 33 и 34.

Пример 19

Результаты оценки токсикокинетических свойств препарата BCD-147- 02-20 при однократном внутривенном введении яванским макакам (Масаса fascicularis ) Исследование проведено на 12 самцах яванских макак (Масаса fascicularis ) . Животные были распределены на 4 группы. Наименование групп приведено в таблице 4.

Таблица 4. Распределение животных по группам в эксперименте по токсикокинетике

В рамках исследования клинический осмотр проводился ежедневно, кроме того оценивали:

- вес животных;

- температуру тела;

- общий анализ мочи;

- общий анализ крови по показателям: количество эритроцитов, количество лейкоцитов, концентрация гемоглобина;

биохимический анализ сыворотки крови по показателям: лактатдегидрогеназа, билирубин общий, общий белок, глюкоза, аспартатаминотрансфераза, аланин-аминотрансфераза;

- исследование концентрации препарата в сыворотке крови.

Не было показано влияния препарата на интегральные показатели токсичности, а также на функциональное состояние органов и систем органов по оцениваемым параметрам (в случае отсутствия, в противном случае указать) .

Пример 20

Оценка токсичности при многократном внутривенном введении яванским макакам в течение 13 недель с последующим периодом свободным от введения в течение 30 дней

Исследование токсичности при многократном внутривенном введении в течение 13 недель с последующим периодом восстановления в течение 30 дней проводили на релевантном виде животных - яванских макаках. В эксперименте использовали 3 уровня доз. Схема экспериментальных групп представлена в таблице 5. Таблица 5. Распределение животных по группам в эксперименте по оценке токсичности при многократном введении

В ходе проведения исследования оценивали следующие параметры:

- результаты клинического осмотра;

- вес животных (до введения далее еженедельно) ;

- температуру тела (до введения далее еженедельно до окончания эксперимента) ;

- влияние на сердечно-сосудистую систему, для чего оценивали биоэлектрическую активность сердца с использованием кардиографа «Поли- Спектр;

- общий анализ мочи;

- общий анализ крови по показателям: количество эритроцитов, количество лейкоцитов, концентрация гемоглобина, количество лимфоцитов, количество моноцитов, количество нейтрофилов, количество эозинофилов, количество базофилов;

- оценка влияния на свертывающую систему крови по показателям: активированное частичное тромбопластиновое время, концентрация фибриногена, протромбиновое время;

- биохимический анализ сыворотки крови по показателям: натрий, калий, креатинин, мочевина, щелочная фосфатаза, лактатдегидрогеназа, билирубин общий, общий белок, глюкоза, триглицериды, аспартатаминотрансфераза, аланинаминотрансфераза холестерин общий;

- на момент окончания периода введения проводили эвтаназию и последующее патоморфологическое исследование животных основной группы максимальной дозы, на момент окончания исследования животных сателлитной группы максимальной дозы и контрольной группы;

- в рамках проведения исследования токсичности оценивали также местно-раздражающее действие препаратов для чего выделяли и проводили гистологическое исследование мягких тканей в месте введения препарата. Для всех испытанных доз не было показано токсического действия препарата .