CAMPO TÉCNICO

La presente invención se refiere a un consorcio y composiciones que lo comprenden del tipo inoculante biológico que contiene cepas bacterianas específicas de los géneros Pseudomonas, Rahnella y Rhizobium, con capacidad de fijar nitrógeno atmosférico, solubilizar nutrientes minerales y promover la producción de compuestos que estimulan el crecimiento de las plantas sometidas a condiciones extremas.

La invención permite obtener especies forrajeras con mayor contenido de proteína vegetal en pasturas destinadas a la ganadería, generando mayor productividad y mejor calidad bajo las características edafoclimáticas de la zona.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

En el medio edáfico o suelo, ocurren una serie de relaciones de alimentación, muerte, degradación y convivencia a través de la interacción de sus componentes (partículas minerales, materia orgánica, organismos vivos, gases y agua), siendo los organismos vivos, fundamentalmente los microorganismos, los que tienen el papel principal en la dinámica de las transformaciones que allí ocurren.

En una región con ganadería extensiva, es importante conocer la biodiversidad de los suelos e identificar aquellos organismos simbiontes que benefician en la fijación de nitrógeno atmosférico, que solubilizan nutrientes minerales y promueven la producción de compuestos que estimulan el crecimiento de los cultivos en momentos de sequía. Esto es particularmente relevante en suelos de regiones con ambientes extremos y con climas poco favorables, sometidos a frío, abundante nubosidad y viento.

Por ejemplo, las praderas de la Región de Magallanes tienen una composición botánica heterogénea y totalmente influenciada por las incidencias climáticas y edáficas del lugar, siendo una tendencia natural la supervivencia de las especies más adaptadas, así, como las nativas y las naturalizadas. Y son estas mismas praderas las que sostienen los parques nacionales y reservas, además de toda la producción pecuaria extensiva de la región ya sea ovina o bovina, lo que se circunscribe en aproximadamente 5 millones de hectáreas.

En las praderas regionales, una de las principales fuentes de proteína son las leguminosas para la alimentación animal y, es también, una especie base necesaria dentro de la ecología, para detener la degradación del suelo y aumentar la variabilidad de especies. Es por ello que la fijación de nitrógeno biológica se convierte en una fuente de fertilización de los suelos, pudiendo alcanzar niveles de más de 100 kg de Nitrógeno (N en adelante) por hectárea por año en la región.

En la industria del cultivo de especies forrajeras, se conoce el uso de composiciones bacterianas como inoculantes, que contienen microorganismos benéficos para los cultivos, siendo los principales objetivos aumentar y/o mejorar la fijación de nitrógeno, la sol u b¡ l¡ zación de fósforo y otros nutrientes y promover el crecimiento de otros microorganismos benéficos. Por ejemplo, dentro de la Región de Magallanes y la Antártida Chilena, al ser una zona de producción pecuaria principalmente, y en donde la escasez de forraje es la principal limitante para el aumento de la producción a nivel regional, la oportunidad de mejorar las praderas sobre todo en su entrega de proteína vegetal de alta calidad y a bajos costos permitirá aumentar la eficiencia en el rendimiento y en la economía de la región. Se ha probado que los inoculantes con composiciones de microorganismos exógenos generados bajo las condiciones climáticas estándar o no-extremas, no generan los mismos beneficios que se obtienen en comparación con el uso de microorganismos nativos o naturalizados de la zona.

Para poder tener una pradera permanente en regiones con limitantes edafoclimáticas, el mejorar el nivel nutricional en el sistema es uno de los principales potenciadores del crecimiento y balance entre las especies.

ESTADO DEL ARTE

En el estado de la técnica existen composiciones que se benefician del uso de bacterias para ser aplicadas a una planta, a una parte de ella o al terreno en que serán cultivadas, para impartir un beneficio a la misma. Para lograr este objetivo, se divulga el uso de una amplia gama de bacterias beneficiosas para el cultivo de plantas o que son consideradas bacterias promotoras del crecimiento vegetal.

Santillana et al. (2005) estudia el desarrollo de plantas de Lycopersicon esculentum Miller (tomate) inoculadas con bacterias del género Rhizobium en Perú en cuanto a sus variables agronómicas como materia seca aérea y radical, nos muestra que, para el desarrollo de materia seca radical, es de un 43% en todas las bacterias inoculadas de género Rhizobium, incluso siendo superior a aquellas pruebas en donde solo hubo fertilización.

Según el trabajo de Younesi et al. (2013), se midió el crecimiento de la coinoculación de la cepa Pseudomona flourecens y de la cepa Rhizobium melliloti en plantas de Medicago sativa (Alfalfa) en donde se obtuvieron resultados significativos que mencionan que esta co-inoculación con Pseudomonas ayudó en el desarrollo de materia seca aérea y en el aumento de número de nodulos en comparación a aquellas inoculadas solo con bacterias del género Rhizobium.

Por otro lado, en el documento US2018020671 A se describen microorganismos aislados beneficiosos para la agricultura, composiciones y consorcios que los comprenden. Se describen además métodos de uso de dichos microorganismos para conferir propiedades beneficiosas a las plantas de interés. Dentro de las especies descritas, si bien en este documento se presentan los géneros de las bacterias de la invención, no se describe una combinación específica como la descrita en la invención. Respecto a las propiedades de la composición, se menciona la mejora en términos de supervivencia frente a condiciones climáticas extremas.

Por su parte, en el documento US2019039964A presenta métodos y composiciones para mejorar los rasgos de una planta donde la composición comprende al menos una cepa bacteriana modificada genéticamente que fija nitrógeno atmosférico. En cuanto a las especies descritas, se menciona un extenso listado dentro de los que se incluyen algunas especies de los géneros de la invención. En la solicitud de patente internacional WO2019028398A1 se describen composiciones de inoculantes microbianos que incluye especies bacterianas acuáticas. En algunas realizaciones, la composición de inoculante microbiano incluye al menos una bacteria seleccionada de Pseudomonas spp. y un Clostridium spp. En este desarrollo no se menciona el uso de Rahnella ni se aborda el problema de inoculantes de uso en especies vegetales de zonas edafoclimáticas extremas.

Así, es posible apreciar que no existen inoculantes específicos para especies de climas templados fríos y esteparios fríos elaborados a partir de consorcios que comprenden la combinación específica de cepas bacterianas descritas en la presente invención que permitan obtener beneficios en especies vegetales sometidas a dichas condiciones edafoclimáticas.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1 : Plantas de trébol expuestas a diferentes inóculos de Rhizobium, A. control negativo, B. control positivo con inoculante comercial, C. cepa de Torres del Paine (C5),

D. cepa de Tierra del fuego (CZ) (equivalente a la cepa Rhizobium sp. A1 número de depósito RGM 3225) y E. cepa de Torres del Paine (CN).

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención se relaciona con un consorcio en base a microorganismos para ser aplicada como inoculante biológico en especies vegetales, especialmente para cultivos en clima templado frío y estepario frío, donde los microorganismos corresponden a cepas bacterianas de los géneros Pseudomonas, Rahnella y Rhizobium que se aplicarán como un consorcio.

La invención comprende una combinación de cepas bacterianas conformada por Pseudomonas B2 número de depósito RGM 3104, Pseudomonas C3 número de depósito RGM 3105, Rahnella D4 número de depósito RGM 3106 y Rhizobium sp. A1 número de depósito RGM 3225.

La invención además provee composiciones que comprenden dicho consorcio y el uso de este para ser aplicado como bioestimulante en especies vegetales cultivadas en zonas edafoclimáticas extremas.

El consorcio bacteriano de acuerdo con la invención corresponde a una selección de cepas bacterianas específicas obtenidas a partir de consorcios bacterianos aislados desde especies vegetales nativas y/o naturalizadas magallánicas.

Por especies magallánicas se consideran aquellas que crecen en la Región de Magallanes, el que corresponde a especies de clima templado frío y de clima estepario frío, región caracterizada por abundante nubosidad, mucho viento, elevada evapotranspiration potencial, con amplitud térmica reducida y caracterizado por precipitaciones relativamente escasas a lo largo del año, que fluctúan entre los 200 mm a los 1000 mm este a oeste respectivamente, en el área de uso agropecuario y parques nacionales.

Durante la evaluación de las bacterias a seleccionar para el inoculo, se realizaron diversos análisis, contrastando con respecto a un control y a un inoculante comercial. Los análisis consideraron parámetros para evaluar el desarrollo vegetal, incluyendo, por ejemplo, medición de la altura máxima de planta, materia seca aérea, materia seca radical, largo de raíz promedio, número de tallos, número de nodulos y coloración de nodulos, para la cepa de Rhizobium. Además de ello se evaluó el pH de los suelos utilizados para la prueba de potes, los cuales fueron obtenidos de comunidades vegetales típicas de la región. El uso de un inoculante a base de microorganismos adaptados a las condiciones edafoclimáticas de la zona demostró generar los beneficios que no se lograban obtener al usar inoculantes elaborados con microorganismos de otras regiones o condiciones edafoclimáticas, tales como los bio-inoculantes disponibles actualmente en el estado del arte. Las cepas bacterianas que conforman el consorcio de la invención corresponden a las depositadas en la Colección Chilena de Recursos Genéticos Microbianos (CChRGM) como se muestra a continuación:

Depósito CChRGM Cepas Fecha depósito

RGM 3225 Rhizobium sp. (A1 ) 16/1 1/2021

RGM 3104 Pseudomonas sp. (B2) 01/07/2021

RGM 3105 Pseudomonas sp. (C3) 01/07/2021

RGM 3106 Rahnella sp. (D4) 01/07/2021 El proceso para elaborar un consorcio bacteriano bioestimulante para cultivos de uso agropecuario y forestal de acuerdo a la invención comprende las etapas de: a) Reactivar en medio de cultivo por separado, cada una de las cepas bacterianas Pseudomonas B2 número de depósito RGM 3104, Pseudomonas C3 número de depósito RGM 3105, Rahnella D4 número de depósito RGM 3106 y Rhizobium sp.

A1 número de depósito RGM 3225; b) Incubar las cepas en agitación constante entre 100-150 rpm; durante 24 a 72 horas; a temperatura superior a 15°C e inferior a 20°C preferentemente o hasta conseguir OD 2.0; c) Centrifugar preferentemente a 2300 g x 5 minutos y recolectar el pellet o la masa bacteriana; d) Descartar el sobrenadante y lavar el pellet bacteriano con una solución tampón; y e) Resuspender el pellet en solución acuosa, preferentemente en suero fisiológico o en solución de NaCI al 0,9% estéril; o bien, opcionalmente, liofilizar el pellet bacteriano, dependiendo del uso posterior del consorcio bacteriano.

En donde estas etapas se repiten con cada una de las 4 cepas bacterianas por separado

Formulación

La forma de presentación del bioinoculante para su uso comercial es el inoculo en una matriz de formulación líquida, del tipo suspensión acuosa, o bien en una formulación en polvo, preferentemente como polvo liofilizado.

La suspensión acuosa se elabora resuspendiendo el pellet bacteriano en suero fisiológico o en una solución de NaCI en una proporción de 1 :4 a 1 :10 p/v. En una realización alternativa de la invención, la composición está formulada como recubrimiento para semillas.

La composición que comprende el consorcio bacteriano de acuerdo con la invención está a un pH entre 5 a 6.

Las formulaciones se elaboran en composiciones para uso directo o bien, para diluir previo a su aplicación en campo. La composición puede ser diluida en agua en una proporción 1 :1 a 1 :200 v/v.

La aplicación se realiza preferentemente de forma directa en las semillas y/o en las plántulas a la altura del cuello con 2 o más hojas verdaderas.

En cuanto a cuál tipo de formulación es más conveniente, húmeda o seca, lo más relevante es tener en cuenta la viabilidad de las bacterias, de modo que la mejor opción depende de cada caso, siempre y cuando se almacene de acuerdo con las indicaciones de la composición particular. No obstante, la formulación húmeda permite una rápida preparación y aplicación más simples.

Las composiciones en base al consorcio de la invención se deben mantener refrigeradas (alrededor de 5°C) en el caso de la formulación líquida. Para el caso de la formulación en polvo liofilizado se puede mantener en un lugar fresco a temperatura ambiente.

Opcionalmente, a las composiciones en base al consorcio de la invención se les podría agregar una fertilización tipo starter para formulaciones como recubrimiento de semilla; o micronutrientes si es para formulaciones destinadas a plántulas. En ambos casos los aditivos adicionados son bajos en nitrógeno. Modos de Uso a) Puede ser usado como bioinoculante directamente en suelos y plantas. b) Puede ser usado como recubrimiento de semillas

El consorcio y las composiciones que lo comprenden pueden ser usada directamente sobre las semillas o en los suelos en donde se cultiven las plantas de interés.

En una realización preferente de la invención, el consorcio de la invención se utiliza para inocular especies forrajeras, tales como plantas de leguminosas y gramíneas o sus semillas.

Opcionalmente el consorcio o sus composiciones se pueden aplicar en forma conjunta con otros productos de uso agrícola compatibles con consorcios bacterianos.

La composición se administra mediante aspersión, inmersión, impregnación o combinaciones de estas.

EJEMPLOS ión del consorcio

Se realizó la mezcla de cada una de las 4 cepas bacterianas para formar un consorcio.

1 . Las cepas integrantes del consorcio bacteriano fueron reactivadas desde chopreservación en tubos centrífuga de 2ml con medio de cultivo LB Caldo al

0.5x. 2. El medio de cultivo se preparó mediante protocolo adicción de sales, fuentes carbonadas y proteicas autoclavadas por separado, diluyendo en agua miliQ, bajo campana de flujo laminar.

3. A las 24 h a T° ambiente fueron inoculadas cada una de las cepas por separado, utilizando 200 pl de cada una de las cepas en caldo cultivo puro (OD 2.0), en frasco tiposhot de 1000 mi de caldo YM/LB 0.5x a T° ambiente.

4. Luego de incubar este caldo en agitación a 150 rpm a T° ambiente hasta obtener punto logarítmico u OD 2.0-

5. Se peletizó el contenido celular mediante centrifugación a baja velocidad y temperatura ambiente (Máximo 5000 x g y mínimo 15°C).

6. Una vez obtenido el pellet del consorcio bacteriano se resuspendió en Cloruro de sodio (NaCI) al 0,8% en agua MiliQ estéril, bajo campana de flujo laminar, y así se obtuvo un volumen para la inoculación.

7. En el caso del consorcio en polvo, se procedió a ultracongelar (alrededor de -86°C) las muestras en tubos centrífuga, para posteriormente liofilizar.

Ejemplo 2: Composición bioinoculante

• Composición de bioinoculante líquido:

Pellet bacteriano de consorcio vivo con no más de 48h de crecimiento más 4 partes de NaCI al 0,8% en agua Miliq estéril.

• Composición de bioinoculante en polvo: Liofilización del bioinoculante líquido, más posterior trituración en molinillo esterilizado superficialmente para su posterior conservación en bolsa al vacío.

3: Solubilización de Fosfatos

Para la prueba, las cepas bacterianas (por separado) fueron incubadas en el medio Pikovskaya (PVK). Utilizando preinóculos en medio de cultivo caldo TS (Triptona-Soya 1 :2 de concentración, pH 6) incubado a 5°C por 48 horas, se procedió a inocular placas de medio PVK mediante la siembra de un spot de 20 pl del cultivo. Las placas se incubaron a 5°C por 72 h y se buscó la formación de un halo de solubilización alrededor de la colonia. Se midió el diámetro del halo y el diámetro de la colonia, determinándose el índice de solubilización de fosfato (ISF) (Kumar et al., 1990) mediante la fórmula:

ISF = A/B

Donde A es el diámetro de la colonia y B es el diámetro de la colonia más el halo. Se utilizaron como control positivo Pseudomona sp. VAL 327 y como control negativo de E. coli ATCC 25922, ambas incubadas a 30°C por 48 h.

Los resultados de los aislados de interés se encuentran en la siguiente tabla:

Tabla 1. Resultados medio PKV.

Aislado B mm A mm ISF Coloración

A1 6,5 12 1 ,8 Colonia blanca exceso LPS

B2 6 15 2,5 Colonia café claro

C3 7 22 3,1 Colonia blanca opaca

D4 7 15 2,1 Colonia blanca lechosa

Pseudomona sp. VAL 327 5 7 1 ,4

E. co//ATCC 25922 0 0 0 No crece

Promedio grupal 6,8 14,1 2,07

De los 89 aislados evaluados, el mejor desempeño fue de un aislado donde B= 7 mm A= 25 mm, y un ISF= 3,6 con una colonia de coloración blanca amarillenta; el peor desempeño fue de un aislado con B= 7 mm y A= 10 mm, dando un ISF= 1 ,4 con una colonia blanca amarillenta.

Ejemplo 4: Biosíntesis de ácido indol-3-acético AIA (auxina)

Las auxinas son fitohormonas de crecimiento de plantas, debido a su capacidad de estimular el crecimiento diferencial en respuesta a estímulos de luz, jugando el rol más importante en el desarrollo. Se han descrito cuatro auxinas naturales sintetizadas por plantas: AIA, ácido indol-3-butírico (IBA), ácido 4-cloroindol-3- acético (4-CI-AIA) y ácido fenilacético (PAA).

Ensayos in vitro han permitido determinar que el AIA es una de las principales auxinas que participan en el desarrollo de las plantas el cual regula la división y expansión celular, diferenciación vascular, desarrollo de raíz lateral y dominancia apical. La biosíntesis de AIA no está limitada a las plantas superiores. Organismos como bacterias, hongos y algas son capaces de sintetizar AIA, lo que puede afectar el crecimiento y el desarrollo de las plantas.

La prueba inicial cualitativa para determinar los aislados que producían o no auxinas (AIA). Las cepas se incubaron toda la noche a 5°C a 170 rpm en medio LB suplementado con 1 g/L de L-triptófano. Para revelar estas muestras se utilizó la relación de 1 :1 v/v de cultivo y reactivo de Salkowsky.

Se mezcló y reservó a oscuridad por 20 minutos a temperatura ambiente. Se observó viraje de color amarillo a rojo. Se usó como controles positivos Azospirillum brasilense Sp7 y E. coli ATCC 25922 como controles positivos y Salmonella bongori G 7 como control negativo, todas incubadas a 30°C a 170 rpm por toda la noche. Para la cuantificación de las bacterias se inoculó cada pocilio con 50 pl del sobrenadante bacteriano en proporción al reactivo de Salkowsky de 15 pl y la cuantificación de auxinas fue determinada por una curva de calibrado de AIA puro sintético (Sigma-Aldrich, Co.) desde 2,5 a 27,5 pg/ml, realizado por triplicado en placa de 96 pocilios en un espectrofotómetro con lector de placas (NanoQuant infinite M200PRO).

Los resultados de los aislados de interés se encuentran en la siguiente tabla:

Tabla 2. Concentración de AIA en aislados y controles

Aislado AIA pg

A1 26,7

B2 22,0 C3 25,0

D4 25,1

Salmonella bongorí X9617 0,00

Azospirillum brasilense Sp7 44,21

E. collATCC 25922 32,27

Promedio grupal 19,12

De los 89 aislados evaluados, 78 produjeron AIA, siendo el mejor desempeño fue de 34,4 pg AIA y el peor desempeño fue de 1 ,61 pg AIA.

Ejemplo 5: Fijación de nitrógeno: Para determinar si los aislados eran capaces de fijar el nitrógeno atmosférico, las bacterias fueron crecidas en medio TS líquido a 5°C por 3-4 días hasta alcanzar la turbidez necesaria (OD 2.0). Luego, 20 pl del cultivo fueron inoculados en el medio semisólido Nfb libre de nitrógeno.

Tabla 3. Medio de cultivo semi-sólido Nfb

Composición Concentración

C4H6O5 5 g/l

K2HPO4 0,5 g/l

MgSO4 - 7H2O 0,2 g/l

NaCI 0,1 g/l

CaCI2 - 2H2O 0,02 g/l

KOH 4,8 g/l Agar 5 g/l

Solución Traza 2 ml/l

Azul de bromotimol 0,5% 2 ml/l

Fe - EDTA 1 ,64% 4 ml/l

Solución Vitaminas 1 ml/l pH 6,8

Tabla 4. Composición de la Solución de Vitaminas

Composición Concentración

Biotina 0,1 g/l

Vitamina B6 0,2 g/l

Tabla 5. Composición de la Solución Traza

Composición g / 1

CuSO4 - 5H2O 0,4

ZnSO4 - 7H2O 0,12

H2BO3 1 ,4

Na2Mo4 - 2H2O 1

MnSO4 - H2O 1 ,5 Se incubó durante 7 días a una temperatura de 5°C. Pasado este tiempo, se observó viraje del medio desde el azul al verde y se tomó como positivos aquellos que presentaron una película de crecimiento blanca en la zona superficial microaerófilo del medio (0-5 mm). Se utilizó Bradyrhizobium japonicum USDA 110 como control positivo y E. coli ATCC 25922 como control negativo, ambas incubadas a 30°C por 48 h. Los resultados de los aislados de interés se encuentran en la siguiente tabla:

Tabla 6. Resultados crecimiento en medio Nfb

Aislado Nfb

D4 2

A1 1

C3 1

B2 2

Donde 0: No crece; 1 : Crece (película); 2: Crece en película y vira medio a amarillo completamente.

De los 89 aislados evaluados, sólo 25 aislados fueron capaces de crecer en el medio NFB.

Ejemplo 6: Evaluación en plantas

Se evaluaron tres diferentes consorcios conformados por una mezcla de los aislados por medio de los inóculos individuales, junto con un control comercial y un control negativo sin inoculación. El consorcio Inoculante B corresponde al conformado por: Rhizobium sp., Pseudomonas sp., Pseudomonas sp., Rahnella sp. Se realizaron dos experimentos uno sobre suelo y el otro sobre perlita, para ambos crecieron plantas de trébol y se midió la cantidad de plántulas y la cantidad de tallos. En base a lo anterior el inoculante B, fue el que presentó mejor desarrollo promedio de ambos experimentos en cantidad de tallos, mientras que fue el segundo mejor promedio de ambos ensayos en cantidad de plántulas.

Tabla 7. Número de plántulas y cantidad de tallos para los dos ensayos realizados. El inoculante comercial usado es DIPEX, que corresponde a un polvo liofilizado de Rhizobium leguminosarum br. Trifolii. A continuación se muestra la producción de materia seca y los números de nodulos promedio del experimento realizado sobre suelo.

Tabla 8. Producción de materia seca y número de nodulos como promedio de las repeticiones usadas en el ensayo sobre suelo.

Ejemplo 7: Evaluación en plantas de trébol blanco

En la Figura 1 se muestra el efecto de aplicar inóculos en plantas de trébol. Todos los inóculos corresponden a Rhizobium, en donde se aprecia que el uso de inoculante comercial (DIPEX, que corresponde a un polvo liofilizado de Rhizobium leguminosarum br. Trifolii.) es estadísticamente inferior a la cepa utilizada en el consorcio. Las cepas C, D y E indicadas en la figura 1 corresponden a cepas nativas, en donde la cepa D (CZ en la tabla 9) es una de las utilizadas dentro del consorcio y corresponde a la cepa de Rhizobium para la que se obtiene el mayor desarrollo vegetal.

En la Tabla 9 se muestran los resultados de materia seca tras la aplicación de los inóculos. El inoculo se aplicó al inicio de la prueba sobre el suelo donde crecían las plántulas de trébol.

Tabla 9. Producción de materia seca de todas las cepas usadas en el ensayo bajo cuatro tratamientos de nitrógeno aplicado.

D.E. = Desviación estándar. Los promedios con letras mayúsculas son significativamente diferentes entre diferentes dosis de nitrógeno. Mientras que con letra minúscula indica diferencias significativas entre cepas, según la prueba de LSD (a=0,05).