worin R', R4 jeweils unabhängig voneinander-C (=NH)-NH2, das auch einfach durch-COA,-CO- [C (R6) 2] n-Ar,-COOA, -OH oder durch eine konventionelle Aminoschutzgruppe substituiert sein kann, NH-C (=NH)-NH2,-CO-N=C (NH2) 2, R2.R3.R5 jeweils unabhängig voneinander H, A, OR6, N(R6)2, NO2, CN, Hal, NHCOA, NHCOAr, NHSOsA, NHSO2Ar, COOR6, CON (R6) 2, CONHAr, COR6, COAr, S (O) nA, S (O) nAr, -O-[C(R6)2]m-COOR6,-[C(R6)2]p-COOR6,-O[C(R6)2]m- CON(R6)2,-[C(R6)2]p-CON(R6)2,-O-[C(R6)2]m-CONHAr, oder- [C (R6) 2] p-CONHAr, X -[C(R6)2]n-, -CR6=CR6-,-[C(R6)2]n-O-, -O-[C(R6)2]n-, -COO-, -OOC-, -CONR6- oder -NR6CO-, R6 H, A oder Benzyl,

A Alkyl mit 1-20 C-Atomen, worin eine oder zwei CH2-Gruppen durch O-oder S-Atome oder durch-CR6=CR6-Gruppen und/oder 1-7 H-Atome durch F ersetzt sein können, Ar unsubstituiertes oder ein-, zwei-oder dreifach durch A, Ar', oR6, OAr', N (R6) 2, NO2, CN, Hal, NHCOA, NHCOAr', NHSOsA. NHS02Ar', COOR6, CON (R6) 2, CONHAr', COR6, COAr', S (O) nA oder S (O) nAr' substituiertes Phenyl oder Naphthyl.

Ar'unsubstituiertes oder ein-, zwei-oder dreifach durch A, oR6, N (R6) 2, N02, CN, Hal, NHCOA, COOR6, CON (R6) 2, COR6 oder S (O) nA substituiertes Phenyl oder Naphthyl, Hal F, Cl, Br oder 1, n 0,1 oder 2, m 1 oder 2, p 1 oder 2 bedeutet, sowie deren Salze und Solvate als NHE-3-Inhibitoren.

Andere Inhibitoren des Natrium/Protonen-Austauschers Subtyp 3 sind z. B. in der EP 0 825 178 beschrieben.

Der Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, neue Verbindungen mit wertvol- len Eigenschaften aufzufinden, insbesondere solche, die zur Herstellung von Arzneimitteln verwendet werden können.

In der DE 19819548 ist beschrieben, daß die Verbindungen der Formel I und ihre Salze Faktor Xa inhibierende Eigenschaften aufweisen und daher zur Bekämpfung und Verhütung von thromboembolischen Erkrankungen wie Thrombose, myocardialem Infarkt, Arteriosklerose, Entzündungen, Apoplexie, Angina pectoris, Restenose nach Angioplastie und Claudicatio intermittens eingesetzt werden können.

Überraschenderweise wurde gefunden, daß die Verbindungen der Formel I und ihre Salze bei guter Verträglichkeit den Natrium/Protonen-Aus- tauscher Subtyp 3 inhibieren.

Die Verbindungen der Formel I können als Arzneimittelwirkstoffe in der Human-und Veterinärmedizin eingesetzt werden.

Es ist bekannt, daß der Na+/H+-Austauscher eine Familie mit mindestens 6 unterschiedlichen Isoformen darstellt (NHE-1 bis NHE-6), die nun alle klo- niert sind. Während der Subtyp NHE-1 ubiquitär im ganzen Körper in allen Geweben verteilt ist, werden die übrigen NHE-Subtypen selektiv in spezifi- schen Organen wie in der Niere oder in der Lumenwand und Kontralumi- nalwand des Dünndarms exprimiert. Diese Verteilung spiegelt die spezifi- schen Funktionen wider, denen die verschiedenen Isoformen dienen, nämlich einerseits die Regulation des intrazellulären pH-Werts und des Zelivolumens durch den Subtyp NHE-1 und andererseits die Na+-Auf- nahme und-Wiederaufnahme in Darm und Niere durch die Isoformen NHE-2 bzw. NHE-3. Die Isoform NHE-4 wurde hauptsächlich im Magen gefunden. Die Expression von NHE-5 beschränkt sich auf Gehirn und Neu- ronengewebe. NHE-6 stellt diejenige Isoform dar, die den Natriumproto- nenaustauscher in den Mitochondrien bildet.

Die Isoform NHE-3 wird insbesondere in der Apicalmembran der proxima- len Nierentubuli exprimiert ; ein NHE-3-Hemmstoff übt daher u. a. eine Nie- renschutzwirkung aus.

Die therapeutische Verwendung eines selektiven Hemmstoffs für NHE-3- lsoformen ist vielseitig. NHE-3-Hemmstoffe hemmen oder verringern Ge- webeschäden und Zellnekrosen nach pathophysiologischen hypoxischen und ischemischen Ereignissen, die zu einer Aktivierung der NHE-Aktivität

führen, wie dies während Nierenischämie oder während der Entfernung, des Transports und der Reperfusion einer Niere bei der Nierenverpflan- zung der Fall ist.

Die Verbindungen der Formel I wirken blutdrucksenkend und eignen sich als Arzneimittelwirkstoffe zur Behandlung der Hypertonie. Weiterhin eig- nen sie sich als Diuretika.

Die Verbindungen der Formel I wirken alleine oder in Verbindung mit NHE- lnhibitoren anderer Subtypspezifität antiischämisch und können verwendet werden bei Thrombosen, Atherosklerose, Gefäßspasmen, zum Schutz von Organen, z. B. Niere und Leber, vor und während Operationen, sowie bei chronischem oder akutem Nierenversagen.

Weiterhin können sie verwendet werden zur Behandlung von Schlaganfall, des Hirnödems, Ischämien des Nervensystems, verschiedenen Formen des Schocks sowie zur Verbesserung des Atemantriebs bei beispielsweise folgenden Zuständen : zentrale Schlafapnoen, plötzlicher Kindstod, post- operative Hypoxie und anderen Atemstörungen.

Durch die Kombination mit einem Carboanhydrase-Hemmer kann die At- mungstätigkeit weiter verbessert werden.

Die Verbindungen der Formel I wirken inhibierend auf die Proliferationen von Zellen, beispielsweise der Fibroblasten-Zellproliferation und der Pro- liferation der glatten Gefäßmuskeizellen und können daher zur Behand- lung von Krankheiten verwendet werden, bei denen die Zellproliferation ei- ne primäre oder sekundäre Ursache darstellt.

Die Verbindungen der Formel I können verwendet werden gegen diabeti- sche Spätkomplikationen, Krebserkrankungen, fibrotische Erkrankungen, endotheliale Disfunktion, Organhypertrophien und-hyperplasien, insbe- sondere bei Prostatahyperplasie bzw. Prostatahypertrophie.

Ferner eignen sie sich als Diagnostika zur Bestimmung und Unterschei- dung bestimmter Formen der Hypertonie, der Atherosklerose, des Diabe- tes und proliferativer Erkrankungen.

Da die Verbindungen der Formel I auch den Spiegel der Serumlipoprotei- ne vorteilhaft beeinflussen, können sie zur Behandlung eines erhöhten Blutfettspiegels alleine oder in Kombination mit anderen Arzneimitteln ein- gesetzt werden.

Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung von Verbindungen der Formel I nach Anspruch 1 und ihre physiologisch unbedenklichen Salze und/oder Solvate zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Thrombosen, ischämischen Zuständen des Herzens, des peripheren und zentralen Nervensystems und des Schlaganfalls, ischämischen Zuständen peripherer Organe und Gliedmaßen und zur Behandlung von Schockzu- ständen.

Gegenstand der Erfindung ist weiter die Verwendung von Verbindungen der Formel I nach Anspruch 1 und ihre physiologisch unbedenklichen Sal- ze und/oder Solvate zur Herstellung eines Arzneimittels zum Einsatz bei chirurgischen Operationen und Organtransplantationen und zur Konservie- rung und Lagerung von Transplantaten für chirurgische Maßnahmen.

Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung von Verbindungen der Formel I nach Anspruch 1 und ihre physiologisch unbedenklichen Salze und/oder Solvate zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Krankheiten, bei denen die Zellproliferation eine primäre oder sekundäre Ursache darstellt, zur Behandlung oder Prophylaxe von Störungen des Fettstoffwechsels oder gestörtem Atemantrieb.

Gegenstand der Erfindung ist ferner die Verwendung von Verbindungen der Formel I nach Anspruch 1 und ihre physiologisch unbedenklichen Sal- ze und/oder Solvate zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von ischämischer Niere, ischämischen Darmerkrankungen oder zur Pro- phylaxe von akutem oder chronischen Nierenerkrankungen.

Methoden zur Identifizierung von Substanzen, die den Natrium/Protonen- Austauscher Substyp 3 inhibieren, sind z. B. in US 5,871,919 beschrieben.

Für alle Reste in den Verbindungen der Formel I, die mehrfach auftreten, wie z. B. R6, gilt, daß deren Bedeutungen unabhängig voneinander sind.

Unter Hydraten und Solvaten versteht man z. B. die Hemi-, Mono-oder Dihydrate, unter Solvaten z. B. Alkoholadditionsverbindungen wie z. B. mit Methanol oder Ethanol.

In den vorstehenden Formeln bedeutet A Alkyl, ist linear oder verzweigt, und hat 1 bis 20, vorzugsweise 1,2,3,4, 5, 6,7,8,9,10,11 oder 12 C-Atome. A bedeutet vorzugsweise Methyl, weiterhin Ethyl, Propyl, Iso- propyl, Butyl, Isobutyl, sek.-Butyl oder tert.-Butyl, ferner auch Pentyl, 1-, 2- oder 3-Methylbutyl, 1, 1-, 1, 2- oder 2, 2-Dimethylpropyl, 1-Ethylpropyl, He- xyl, 1-, 2-, 3-oder 4-Methylpentyl, 1,1-, 1,2-, 1, 3-, 2,2-, 2, 3-oder 3, 3- Dimethylbutyl, 1-oder 2-Ethylbutyl, 1-Ethyl-1-methylpropyl, 1-Ethyl-2- methylpropyl, 1,1, 2- oder 1,2, 2-Trimethylpropyl, Heptyl, Octyl, Nonyl oder Decyl.

A bedeutet weiterhin z. B. Trifluormethyl, Pentafluorethyl, Allyl oder Crotyl.

COR6 ist Acyl und bedeutet vorzugsweise Formyl, Acetyl, Propionyl, ferner auch Butyryl, Pentanoyl oder Hexanoyl.

COOR6 bedeutet vorzugsweise Methoxycarbonyl, Ethoxycarbonyl, Pro- poxycarbonyl oder Butoxycarbonyl.

Hal bedeutet vorzugsweise F, Cl oder Br, aber auch 1.

R2, R3 und R5 bedeuten, jeweils unabhängig voneinander, vorzugsweise H, Fluor, Chlor, Brom, lod, Hydroxy, Methoxy, Ethoxy, Propoxy, Nitro, Amino, Methylamino, Dimethylamino, Ethylamino, Diethylamino, Acetamido, Sul- fonamido, Methylsulfonamido, Phenylsulfonamido, Methylthio, Ethylthio, Methylsulfinyl, Ethylsulfinyl, Methylsulfonyl, Ethylsulfonyl, Phenylsulfinyl, Phenylsulfonyl, Cyan, Carboxy, Methoxycarbonyl, Ethoxycarbonyl, Car- boxymethoxy, Methoxycarbonylmethoxy, Carboxymethyl, Methoxycar- bonylmethyl, Aminocarbonylmethoxy, Aminocarbonylmethyl, N-Phenyl- aminocarbonylmethoxy, N-Phenylaminocarbonylmethyl, ferner auch Acyl oder Benzol.

Insbesondere bedeuten R2, R5 H.

R3 bedeutet insbesondere z. B. H, COOA oder-OCH2COOR6, wobei R6 H oder Alkyl mit 1-4 C-Atomen bedeutet.

R6 bedeutet H, A oder Benzyl, insbesondere jedoch H oder Alkyl mit 1-4 C- Atomen.

X bedeutet vorzugsweise z. B.-CH2-,-CH=CH-,-CH20-,-0-CH2-,-COO-,

-OOC-,-CONH-oder-NHCO- ; ganz besonders bevorzugt ist-CH20-,-O- CH2-oder-CH2-CH2-.

Ar bedeutet vorzugsweise unsubstituiertes Phenyl oder Naphthyl, weiterhin vorzugsweise z. B. durch A, Fluor, Chlor, Brom, lod, Hydroxy, Methoxy, Ethoxy, Propoxy, Butoxy, Pentyloxy, Hexyloxy, Benzyloxy, Phenethyloxy, Methylthio, Ethylthio, Methylsulfinyl, Ethylsulfinyl, Methylsulfonyl, Ethyl- sulfonyl, Phenylsulfinyl, Phenylsulfonyl, Nitro, Amino, Methylamino, Ethyl- amino, Dimethylamino, Diethylamino, Formamido, Acetamido, Propionyl- amino, Butyrylamino, Methylsulfonamido, Ethylsulfonamido, Propylsulfon- amido, Butylsulfonamido, Phenylsulfonamido, (4-Methylphenyl)-sulfon- amido, Carboxymethoxy, Carboxyethoxy, Methoxycarbonylmethoxy, Me- thoxycarbonylethoxy, Hydroxymethoxy, Hydroxyethoxy, Methoxyethoxy, Carboxy, Methoxycarbonyl, Ethoxycarbonyl, Cyan, Phenylaminocarbonyl, Acyl oder Benzoyl mono-, di-oder trisubstituiertes Phenyl oder Naphthyl, ferner auch Biphenyl.

Ar bedeutet daher bevorzugt z. B. o-, m-oder p-Tolyl, o-, m-oder p-Ethyl- phenyl, o-, m-oder p-Propylphenyl, o-, m-oder p-lsopropylphenyl, o-, m- oder p-tert.-Butylphenyl, o-, m-oder p-Hydroxyphenyl, o-, m-oder p-Nitro- phenyl, o-, m-oder p-Aminophenyl, o-, m-oder p- (N-Methylamino)-phenyl, o-, m-oder p-Acetamidophenyl, o-, m-oder p-Methoxyphenyl, o-, m-oder p-Ethoxyphenyl, o-, m-oder p-Carboxyphenyl, o-, m-oder p-Methoxycar- bonylphenyl, o-, m-oder p- (N, N-Dimethylamino)-phenyl, o-, m-oder p- (N- Ethylamino)-phenyl, o-, m-oder p- (N, N-Diethylamino)-phenyl, o-, m-oder p-Acetylphenyl, o-, m-oder p-Formylphenyl, o-, m-oder p-Fluorphenyl, o-, m-oder p-Bromphenyl, o-, m-oder p-Chlorphenyl, o-, m-oder p-Methyl- sulfonylphenyl, o-, m-oder p-(Phenylsulfonamido)-phenyl, o-, m-oder p- (Methylsulfonamido)-phenyl, o-, m-oder p-Methylthiophenyl, weiter bevor- zugt 2, 3-, 2,4-, 2, 5-, 2,6-, 3, 4- oder 3, 5-Difluorphenyl, 2,3-, 2, 4-, 2,5-, 2, 6-, 3, 4- oder 3, 5-Dichlorphenyl, 2,3-, 2, 4-, 2, 5-, 2,6-, 3, 4-oder 3, 5-Dibrom- phenyl, 2, 4- oder 2, 5-Dinitrophenyl, 2, 5- oder 3, 4-Dimethoxyphenyl, 3- Nitro-4-chlorphenyl, 3-Amino-4-chlor-, 2-Amino-3-chlor-, 2-Amino-4-chlor-, 2-Amino-5-chlor-oder 2-Amino-6-chlorphenyl, 2-Nitro-4-N, N-dimethyl- amino-oder 3-Nitro-4-N, N-dimethylaminophenyl, 2, 3-Diaminophenyl, 2,3,4-, 2,3,5-, 2,3,6-, 2,4, 6- oder 3,4, 5-Trichlorphenyl, 2,4, 6-Trimethoxy-

phenyl, 2-Hydroxy-3, 5-dichlorphenyl, p-lodphenyl, 3, 6-Dichlor-4-amino- phenyl, 4-Fluor-3-chlorphenyl, 2-Fluor-4-bromphenyl, 2, 5-Difluor-4-brom- phenyl, 3-Brom-6-methoxyphenyl, 3-Chlor-6-methoxyphenyl, 3-Chlor-4- acetamidophenyl, 3-Fluor-4-methoxyphenyl, 3-Amino-6-methylphenyl, 3- Chlor-4-acetamidophenyl oder 2, 5-Dimethyl-4-chlorphenyl.

Ar'bedeutet insbesondere z. B. Phenyl oder Naphthyl, ferner bevorzugt z. B. o-, m-oder p-Tolyl, o-, m-oder p-Ethylphenyl, o-, m-oder p-Propyl- phenyl, o-, m-oder p-Isopropylphenyl, o-, m-oder p-tert.-Butylphenyl, o-, m-oder p-Hydroxyphenyl, o-, m-oder p-Nitrophenyl, o-, m-oder p-Amino- phenyl, o-, m-oder p- (N-Methylamino)-phenyl, o-, m-oder p-Acetamido- phenyl, o-, m-oder p-Methoxyphenyl, o-, m-oder p-Ethoxyphenyl, o-, m- oder p-Carboxyphenyl, o-, m-oder p-Methoxycarbonylphenyl, o-, m-oder p- (N, N-Dimethylamino)-phenyl, o-, m-oder p- (N-Ethylamino)-phenyl, o-, m- oder p- (N, N-Diethylamino)-phenyl, o-, m-oder p-Acetylphenyl, o-, m-oder p-Formylphenyl, o-, m-oder p-Fluorphenyl, o-, m-oder p-Bromphenyl, o-, m-oder p-Chlorphenyl oder o-, m-oder p-Methylsulfonylphenyl.

Dementsprechend ist Gegenstand der Erfindung insbesondere die Ver- wendung derjenigen Verbindungen der Formel I, in denen mindestens ei- ner der genannten Reste eine der vorstehend angegebenen bevorzugten Bedeutungen hat. Einige bevorzugte Gruppen von Verbindungen können durch die folgenden Teilformeln la bis li ausgedrückt werden, die der For- mel I entsprechen und worin die nicht näher bezeichneten Reste die bei der Formel I angegebene Bedeutung haben, worin jedoch in la R'R4 jeweils unabhängig voneinander-C (=NH)-NH2, das auch einfach durch OH substituiert sein kann oder -CO-N=C (NH2) 2 bedeuten ; in Ib R2, R5 H bedeuten ; in Ic R', R4 jeweils unabhängig voneinander-C (=NH)-NH2, das auch einfach durch OH substituiert sein kann oder -CO-N=C (NH2) 2,

R2, R5 H und R3 H oder COOR6, bedeuten ; in Id R', R4 jeweils unabhängig voneinander-C (=NH)-NH2, das auch einfach durch OH substituiert sein kann oder -CO-N=C (NH2) 2, R2, R5 H und R3 H, COOR6 oder -O-(CH2)-COOR6, bedeuten ; in le X-CH2-O-oder-O-CH2- bedeuten ; in If R', R4 jeweils unabhängig voneinander-C (=NH)-NH2, das auch einfach durch OH substituiert sein kann oder -CO-N=C (NH2) 2.

R2, R5 H, R3 H oder COOR6 und X-CH2-O-oder-0-CH2- bedeuten ; <BR> <BR> <BR> in Ig R1, R4 jeweils unabhängig voneinander-C (=NH)-NH2, das auch einfach durch OH substituiert sein kann oder -CO-N=C (NH2) 2, R2, R5 H, R3 H, COOR6 oder-0- (CH2) COOR, und X-CH2-O-,-0-CH2-oder-CH2-CH2- bedeuten ; in Ih R', R4 jeweils unabhängig voneinander-C (=NH)-NH2, das auch einfach durch OH substituiert sein kann oder -CO-N=C (NH2) 2, R2, R5 H, R3 H, COOR6, -O-CH2-COOR6, CH2-COOR6, -O-CH2- CON (R6) 2, CH2-CON (R6) 2,-O-CH2-CONHAr oder CH2-CONHAr,

X-CH2-O-,-O-CH2-oder-CH2-CH2-, R6 H oder A, A Alkyl mit 1-4 C-Atomen, bedeuten ; in li R'R4 jeweils unabhängig voneinander-C (=NH)-NH2, das auch einfach durch OH substituiert sein kann oder -CO-N=C(NH2)2, R2, R5 H, R3 H, COOR6,-O-CH2-COOR6, CH2-COOR6,-O-CH2- CON (R6) 2, oder CH2-CON (R6) 2, X -CH2-O-,-O-CH2- oder -CH2-CH2-, R6 H oder A, A Alkyl mit 1-4 C-Atomen, bedeuten.

Die Verbindungen der Formel I und auch die Ausgangsstoffe zu ihrer Her- stellung werden im übrigen nach an sich bekannten Methoden hergestellt, wie sie in der Literatur (z. B. in den Standardwerken wie Houben-Weyl, Methoden der organischen Chemie, Georg-Thieme-Verlag, Stuttgart) be- schrieben sind, und zwar unter Reaktionsbedingungen, die für die genan- nten Umsetzungen bekannt und geeignet sind. Dabei kann man auch von an sich bekannten, hier nicht näher erwähnten Varianten Gebrauch ma- chen.

Die Ausgangsstoffe können, falls erwünscht, auch in situ gebildet werden, so daß man sie aus dem Reaktionsgemisch nicht isoliert, sondern sofort weiter zu den Verbindungen der Formel I umsetzt.

Verbindungen der Formel I können vorzugsweise erhalten werden, indem man Verbindungen der Formel I aus einem ihrer funktionellen Derivate durch Behandeln mit einem solvolysierenden oder hydrogenolysierenden Mittel in Freiheit setzt.

Bevorzugte Ausgangsstoffe für die Solvolyse bzw. Hydrogenolyse sind solche, die sonst der Formel I entsprechen, aber anstelle einer oder meh- rerer freier Amino-und/oder Hydroxygruppen entsprechende geschützte Amino-und/oder Hydroxygruppen enthalten, vorzugsweise solche, die an- stelle eines H-Atoms, das mit einem N-Atom verbunden ist, eine Ami- noschutzgruppe tragen, insbesondere solche, die anstelle einer HN- Gruppe eine R'-N-Gruppe tragen, worin R'eine Aminoschutzgruppe be- deutet, und/oder solche, die anstelle des H-Atoms einer Hydroxygruppe eine Hydroxyschutzgruppe tragen, z. B. solche, die der Formel I entspre- chen, jedoch anstelle einer Gruppe-COOH eine Gruppe-COOR"tragen, worin R"eine Hydroxyschutzgruppe bedeutet.

Bevorzugte Ausgangsstoffe sind auch die Oxadiazolderivate, die in die entsprechenden Amidinoverbindungen überführt werden können.

Die Einführung der Oxadiazolgruppe gelingt z. B. durch Umsetzung der Cyanverbindungen mit Hydroxylamin und Reaktion mit Phosgen, Dial- kylcarbonat, Chlorameisensäureester, N, N'-Carbonyldiimidazol oder Ace- tanhydrid.

Es können auch mehrere-gleiche oder verschiedene-geschützte Amino- und/oder Hydroxygruppen im Molekül des Ausgangsstoffes vorhanden sein. Falls die vorhandenen Schutzgruppen voneinander verschieden sind, können sie in vielen Fällen selektiv abgespalten werden.

Der Ausdruck"Aminoschutzgruppe"ist allgemein bekannt und bezieht sich auf Gruppen, die geeignet sind, eine Aminogruppe vor chemischen Um- setzungen zu schützen (zu blockieren), die aber leicht entfernbar sind, nachdem die gewünschte chemische Reaktion an anderen Stellen des Moleküls durchgeführt worden ist. Typisch für solche Gruppen sind insbe- sondere unsubstituierte oder substituierte Acyl-, Aryl-, Aralkoxymethyl- oder Aralkylgruppen. Da die Aminoschutzgruppen nach der gewünschten Reaktion (oder Reaktionsfolge) entfernt werden, ist ihre Art und Größe im übrigen nicht kritisch ; bevorzugt werden jedoch solche mit 1-20, insbeson- dere 1-8 C-Atomen. Der Ausdruck"Acylgruppe"ist im Zusammenhang mit dem vorliegenden Verfahren in weitestem Sinne aufzufassen. Er um- schließt von aliphatischen, araliphatischen, aromatischen oder hetero-

cyclischen Carbonsäuren oder Sulfonsäuren abgeleitete Acylgruppen so- wie insbesondere Alkoxycarbonyl-, Aryloxycarbonyl-und vor allem Aral- koxycarbonylgruppen. Beispiele für derartige Acylgruppen sind Alkanoyl wie Acetyl, Propionyl, Butyryl ; Aralkanoyl wie Phenylacetyl ; Aroyl wie Ben- zoyl oder Toluyl ; Aryloxyalkanoyl wie POA ; Alkoxycarbonyl wie Methoxy- carbonyl, Ethoxycarbonyl, 2,2, 2-Trichlorethoxycarbonyl, BOC (tert.-Butyl- oxycarbonyl), 2-lodethoxycarbonyl ; Aralkyloxycarbonyl wie CBZ ("Carbo- benzoxy"), 4-Methoxybenzyloxycarbonyl, FMOC ; Arylsulfonyl wie Mtr. Be- vorzugte Aminoschutzgruppen sind BOC und Mtr, ferner CBZ, Fmoc, Ben- zyl und Acetyl.

Der Ausdruck"Hydroxyschutzgruppe"ist ebenfalls allgemein bekannt und bezieht sich auf Gruppen, die geeignet sind, eine Hydroxygruppe vor che- mischen Umsetzungen zu schützen, die aber leicht entfernbar sind, nach- dem die gewünschte chemische Reaktion an anderen Stellen des Mole- küls durchgeführt worden ist. Typisch für solche Gruppen sind die oben genannten unsubstituierten oder substituierten Aryl-, Aralkyl-oder Acyl- gruppen, ferner auch Alkylgruppen. Die Natur und Größe der Hydroxy- schutzgruppen ist nicht kritisch, da sie nach der gewünschten chemischen Reaktion oder Reaktionsfolge wieder entfernt werden ; bevorzugt sind Gruppen mit 1-20, insbesondere 1-10 C-Atomen. Beispiele für Hydroxy- schutzgruppen sind u. a. Benzyl, p-Nitrobenzoyl, p-Toluolsulfonyl, tert.- Butyl und Acetyl, wobei Benzyl und tert.-Butyl besonders bevorzugt sind.

Das In-Freiheit-Setzen der Verbindungen der Formel I aus ihren funktionel- len Derivaten gelingt-je nach der benutzten Schutzgruppe-z. B. mit star- ken Säuren, zweckmäßig mit TFA oder Perchlorsäure, aber auch mit an- deren starken anorganischen Säuren wie Salzsäure oder Schwefelsäure, starken organischen Carbonsäuren wie Trichloressigsäure oder Sulfonsäu- ren wie Benzol-oder p-Toluolsulfonsäure. Die Anwesenheit eines zusätzli- chen inerten Lösungsmittels ist möglich, aber nicht immer erforderlich. Als inerte Lösungsmittel eignen sich vorzugsweise organische, beispielsweise Carbonsäuren wie Essigsäure, Ether wie Tetrahydrofuran oder Dioxan, Amide wie DMF, halogenierte Kohlenwasserstoffe wie Dichlormethan, fer- ner auch Alkohole wie Methanol, Ethanol oder Isopropanol, sowie Wasser.

Ferner kommen Gemische der vorgenannten Lösungsmittel in Frage. TFA

wird vorzugsweise im Überschuß ohne Zusatz eines weiteren Lösungs- mittels verwendet, Perchlorsäure in Form eines Gemisches aus Essigsäu- re und 70 % iger Perchlorsäure im Verhältnis 9 : 1. Die Reaktionstemperatu- ren für die Spaltung liegen zweckmäßig zwischen etwa 0 und etwa 50°, vorzugsweise arbeitet man zwischen 15 und 30° (Raumtemperatur).

Die Gruppen BOC, OBut und Mtr können z. B. bevorzugt mit TFA in Di- chlormethan oder mit etwa 3 bis 5n HCI in Dioxan bei 15-30° abgespalten werden, die FMOC-Gruppe mit einer etwa 5-bis 50 % igen Lösung von Dimethylamin, Diethylamin oder Piperidin in DMF bei 15-30°.

Hydrogenolytisch entfernbare Schutzgruppen (z. B. CBZ, Benzyl oder die Freisetzung der Amidinogruppe aus ihrem Oxadiazolderivat) können z. B. durch Behandeln mit Wasserstoff in Gegenwart eines Katalysators (z. B. eines Edelmetallkatalysators wie Palladium, zweckmäßig auf einem Träger wie Kohle oder wie feuchtes Raney-Nickel unter Zusatz von z. B. Essigsäu- re) abgespalten werden. Als Lösungsmittel eignen sich dabei die oben an- gegebenen, insbesondere z. B. Alkohole wie Methanol oder Ethanol oder Amide wie DMF. Die Hydrogenolyse wird in der Regel bei Temperaturen zwischen etwa 0 und 100° und Drucken zwischen etwa 1 und 200 bar, be- vorzugt bei 20-30° und 1-10 bar durchgeführt. Eine Hydrogenolyse der CBZ-Gruppe gelingt z. B. gut an 5 bis 10 % igem Pd/C in Methanol oder mit Ammoniumformiat (anstelle von Wasserstoff) an Pd/C in Methanol/DMF bei 20-30°.

Verbindungen der Formel I, worin R'und R4-C (=NH)-NH2 bedeuten, kön- nen vorzugsweise aus der entsprechenden Cyanverbindung erhalten wer- den.

Die Umwandlung einer Cyangruppe in eine Amidinogruppe erfolgt durch Umsetzung mit z. B. Hydroxylamin und anschließender Reduktion des N- Hydroxyamidins mit Wasserstoff in Anwesenheit eines Katalysators wie z. B. Pd/C oder Raney-Nickel.

Zur Herstellung eines Amidins der Formel I (R' =-C (=NH)-NH2) kann man an ein Nitril der Formel I (Rn = CN) auch Ammoniak anlagern. Die Anlage- rung erfolgt bevorzugt mehrstufig, indem man in an sich bekannter Weise a) das Nitril mit H2S in ein Thioamid umwandelt, das mit einem Alkylie-

rungsmittel, z. B. CH31, in den entsprechenden S-Alkyl-imidothioester aber- geführt wird, welcher seinerseits mit NH3 zum Amidin reagiert, b) das Nitril mit einem Alkohol, z. B. Ethanol in Gegenwart von HCI in den entspre- chenden Imidoester umwandelt und diesen mit Ammoniak behandelt, oder c) das Nitril mit Lithium-bis- (trimethylsilyl)-amid umsetzt und das Produkt anschließend hydrolysiert.

Herstellung der Cyanverbindungen erfoigt nach an sich bekannten Metho- den.

Verbindungen der Formel I, worin R'und R4-CON (=NH)-NH2 bedeuten, können vorzugsweise aus den entsprechenden Alkoxycarbonylverbindun- gen erhalten werden, indem man mit Guanidin umsetzt.

Es ist ferner möglich, eine Verbindung der Formel I in eine andere Ver- bindung der Formel I umzuwandeln, indem man einen oder mehrere Rest (e), R', R2, R3, R4 und/oder R5 in einen oder mehrere Rest (e) R', R2, R3, R4 und/oder R5 umwandelt, z. B. indem man eine Aminogruppe acyliert oder Nitrogruppen (beispielsweise durch Hydrierung an Raney-Nickel oder Pd-Kohle in einem inerten Lösungsmittel wie Methanol oder Ethanol) zu Aminogruppen reduziert.

Ester können z. B. mit Essigsäure oder mit NaOH oder KOH in Wasser, Wasser-THF oder Wasser-Dioxan bei Temperaturen zwischen 0 und 100° verseift werden.

Ferner kann man freie Aminogruppen in üblicher Weise mit einem Säure- chlorid oder-anhydrid acylieren oder mit einem unsubstituierten oder sub- stituierten Alkylhalogenid alkylieren, zweckmäßig in einem inerten Lö- sungsmittel wie Dichlormethan oder THF und/oder in Gegenwart einer Base wie Triethylamin oder Pyridin bei Temperaturen zwischen-60 und +30°.

Die Umsetzung erfolgt in der Regel in einem inerten Lösungsmittel, in Ge- genwart eines säurebindenden Mittels vorzugsweise eines Alkali-oder Er- dalkalimetall-hydroxids,-carbonats oder-bicarbonats oder eines anderen

Saizes einer schwachen Saure der Alkali-oder Erdalkalimetalle, vorzugs- weise des Kaliums, Natriums, Calciums oder Cäsiums. Auch der Zusatz einer organischen Base wie Triethylamin, Dimethylanilin, Pyridin oder Chinolin oder eines Überschusses der Aminkomponente der Formel II bzw. des Alkylierungsderivates der Formel III kann günstig sein. Die Reak- tionszeit liegt je nach den angewendeten Bedingungen zwischen einigen Minuten und 14 Tagen, die Reaktionstemperatur zwischen etwa 0° und 150°, normalerweise zwischen 20° und 130°.

Als inerte Lösungsmittel eignen sich z. B. Kohlenwasserstoffe wie Hexan, Petrolether, Benzol, Toluol oder Xylol ; chlorierte Kohlenwasserstoffe wie Trichlorethylen, 1, 2-Dichlorethan, Tetrachlorkohlenstoff, Chloroform oder Dichlormethan ; Alkohole wie Methanol, Ethanol, Isopropanol, n-Propanol, n-Butanol oder tert.-Butanol ; Ether wie Diethylether, Diisopropylether, Te- trahydrofuran (THF) oder Dioxan ; Glykolether wie Ethylenglykolmono- methyl-oder-monoethylether (Methylglykol oder Ethylglykol), Ethylen- glykoldimethylether (Diglyme) ; Ketone wie Aceton oder Butanon ; Amide wie Acetamid, Dimethylacetamid, N-Methylpyrrolidon (NMP) oder Dime- thylformamid (DMF) ; Nitrile wie Acetonitril ; Sulfoxide wie Dimethylsulfoxid (DMSO) ; Schwefelkohlenstoff ; Carbonsäuren wie Ameisensäure oder Es- sigsäure : Nitroverbindungen wie Nitromethan oder Nitrobenzol ; Ester wie Ethylacetat oder Gemische der genannten Lösungsmittel.

Eine Base der Formel I kann mit einer Säure in das zugehörige Saure- additionssalz übergeführt werden, beispielsweise durch Umsetzung äqui- valeter Mengen der Base und der Säure in einem inerten Lösungsmittel wie Ethanol und anschließendes Eindampfen. Für diese Umsetzung kom- men insbesondere Säuren in Frage, die physiologisch unbedenkliche Sal- ze liefern. So können anorganische Säuren verwendet werden, z. B.

Schwefelsäure, Salpetersäure, Halogenwasserstoffsäuren wie Chlorwas- serstoffsäure oder Bromwasserstoffsäure, Phosphorsäuren wie Ortho- phosphorsäure, Sulfaminsäure, ferner organische Säuren, insbesondere aliphatische, alicyclische, araliphatische, aromatische oder heterocyclische ein-oder mehrbasige Carbon-, Sulfon-oder Schwefelsäuren, z. B. Amei- sensäure, Essigsäure, Propionsäure, Pivalinsäure, Diethylessigsäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Pimelinsäure, Fumarsäure, Maleinsäure,

Milchsäure, Weinsäure, Äpfelsäure, Citronensäure, Gluconsäure, Ascor- binsäure, Nicotinsäure, Isonicotinsäure, Methan-oder Ethansulfonsäure, Ethandisulfonsäure, 2-Hydroxyethansulfonsäure, Benzolsulfonsäure, p- <BR> <BR> <BR> Toluolsulfonsäure, Naphthalin-mono-und-disulfonsäuren, Laurylschwefel- säure. Salze mit physiologisch nicht unbedenklichen Säuren, z. B. Pikrate, können zur Isolierung und/oder Aufreinigung der Verbindungen der For- mel I verwendet werden.

Andererseits können Verbindungen der Formel I mit Basen (z. B. Natrium- oder Kaliumhydroxid oder-carbonat) in die entsprechenden Metall-, ins- besondere Alkalimetall-oder Erdalkalimetall-, oder in die entsprechenden Ammoniumsalze umgewandelt werden.

Auch physiologisch unbedenkliche organische Basen, wie z. B. Ethanol- amin können verwendet werden.

Gegenstand der Erfindung ist ferner die Verwendung der Verbindungen der Formel I als NHE-3-lnhibitoren und/oder ihrer physiologisch unbedenk- lichen Salze zur Herstellung pharmazeutischer Zubereitungen, insbeson- dere auf nicht-chemischem Wege. Hierbei können sie zusammen mit min- destens einem festen, flüssigen und/oder halbflüssigen Träger-oder Hilfs- stoff und gegebenenfalls in Kombination mit einem oder mehreren weite- ren Wirkstoffen in eine geeignete Dosierungsform gebracht werden.

Gegenstand der Erfindung sind ferner pharmazeutische Zubereitungen, enthaltend mindestens einen NHE-3-Inhibitor der Formel I und/oder eines seiner physiologisch unbedenklichen Salze und Solvate.

Diese Zubereitungen können als Arzneimittel in der Human-oder Veteri- närmedizin verwendet werden. Als Trägerstoffe kommen organische oder anorganische Substanzen in Frage, die sich für die enterale (z. B. orale), parenterale oder topische Applikation eignen und mit den neuen Verbin- dungen nicht reagieren, beispielsweise Wasser, pflanzliche Öle, Benzyl- alkohole, Alkylenglykole, Polyethylenglykole, Glycerintriacetat, Gelatine, Kohlehydrate wie Lactose oder Stärke, Magnesiumstearat, Talk, Vaseline.

Zur oralen Anwendung dienen insbesondere Tabletten, Pillen, Dragees, Kapseln, Pulver, Granulate, Sirupe, Säfte oder Tropfen, zur rektalen An-

wendung Suppositorien, zur parenteralen Anwendung Lösungen, vorzugs- weise ölige oder wässrige Lösungen, ferner Suspensionen, Emulsionen oder Implantate, für die topische Anwendung Salben, Cremes oder Puder, oder transdermal in Patches.

Die neuen Verbindungen können auch lyophilisiert und die erhaltenen Lyo- philisate z. B. zur Herstellung von Injektionspräparaten verwendet werden.

Die angegebenen Zubereitungen können sterilisiert sein und/oder Hilfs- stoffe wie Gleit-, Konservierungs-, Stabilisierungs-und/oder Netzmittel, Emulgatoren, Salze zur Beeinflussung des osmotischen Druckes, Puffer- substanzen, Farb-, Geschmacks-und/oder mehrere weitere Wirkstoffe enthalten, z. B. ein oder mehrere Vitamine.

Als pharmazeutische Zubereitung für die Verabreichung in Form von Aero- solen oder Sprays sind geeignet z. B. Lösungen, Suspensionen oder Emul- sionen des Wirkstoffs der Formel I in einem pharmazeutisch unbedenkli- chen Lösungsmittel.

Die Verbindungen der Formel I und ihre physiologisch unbedenklichen Salze und Solvate können zur Behandlung und/oder Prophylaxe der oben beschrieben Krankheiten oder Krankheitszuständen verwendet werden.

Dabei werden die erfindungsgemäßen Substanzen in der Regel vorzugs- weise in Dosierungen zwischen etwa 0,1 und 100 mg, insbesondere zwi- schen 1 und 10 mg pro Dosierungseinheit verabreicht. Die tägliche Dosie- rung liegt vorzugsweise zwischen etwa 0,001 und 10 mg/kg Körpergewicht.

Die spezielle Dosis für jeden Patienten hängt jedoch von den verschieden- sten Faktoren ab, beispielsweise von der Wirksamkeit der eingesetzten speziellen Verbindung, vom Alter, Körpergewicht, allgemeinen Gesund- heitszustand, Geschlecht, von der Kost, vom Verabreichungszeitpunkt und -weg, von der Ausscheidungsgeschwindigkeit, Arzneistoffkombination und Schwere der jeweiligen Erkrankung, welcher die Therapie gilt. Die orale Applikation ist bevorzugt.

Vor-und nachstehend sind alle Temperaturen in °C angegeben. In den nachfolgenden Beispielen bedeutet"übliche Aufarbeitung" : Man gibt, falls erforderlich, Wasser hinzu, stellt, falls erforderlich, je nach Konstitution des Endprodukts auf pH-Werte zwischen 2 und 10 ein, extrahiert mit Ethyla-

cetat oder Dichlormethan, trennt ab, trocknet die organische Phase über Natriumsulfat, dampft ein und reinigt durch Chromatographie an Kieselgel und/oder durch Kristallisation.

Massenspektrometrie (MS) : El (Elektronenstoß-lonisation) M+ FAB (Fast Atom Bombardment) (M+H) + Beispiel 1 Eine Lösung von 2,06 g 3-Brombenzonitril und 1,50 g 3-Tolylboronsäure in 50 ml Dimethoxyethan wird mit 247 mg Palladium (II) acetat, 335 mg Tri-o- tolyl-phosphin, 20 ml Wasser und 954 mg wasserfreiem Natriumcarbonat versetzt und unter Rühren 18 Stunden bei 100° C erhitzt. Man arbeitet wie üblich auf, chromatographiert den Rückstand an einer Kieselgelsäule mit Petrolether/Ethylacetat 9 : 1 und erhält 3'-Methylbiphenyl-3-carbonitril als farblosen Feststoff ("A"), El 193.

Eine Lösung von 1, 17 g"A"in 10 ml Tetrachlorkohlenstoff wird mit 1,09 g N-Bromsuccinimid (NBS) und 60 mg Azobisisobutyronitril versetzt und 18 Stunden bei 70° C erhitzt. Man arbeitet wie üblich auf, chromatographiert den Rückstand an einer Kieselgelsäule mit Petrolether/Ethylacetat 9 : 1 und erhält 3'-Brommethylbiphenyl-3-carbonitril als farblosen Feststoff ("B").

Eine Lösung von 500 mg"B"und 238 mg 3-Hydroxybenzonitril in 10 ml Acetonitril wird mit 652 mg Cäsiumcarbonat versetzt und 40 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nachüblicher Aufarbeitung wird der Rückstand an einer reversed-phase-Säule mit Acetonitril/Wasser 65 : 35 chromatogra- phiert. Man erhält als farblosen Feststoff 3'- (3-Cyanphenoxymethyl)- biphenyl-3-carbonitril ("C"), FAB 311.

Eine Lösung von 90 mg"C"und 125 mg Hydroxylammoniumchlorid in 10 ml Ethanol wird mit 1,2 g polymergebundenem Dimethylaminopyridin (DMAP) versetzt und 18 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Man filtriert ab, entfernt das Lösungsmittel und erhält N-Hydroxy-3'- [3- (N-hydroxy- carbamimidoyl)-phenoxymethyl]-biphenyl-3-carboxamidin ("D") als farblo- sen Feststoff, FAB 377.

Eine Lösung von 76 mg"D"in 10 ml Methanol wird mit 100 mg wasser- feuchtem Raney-Nickel und 30 mg Essigsäure versetzt und 18 Stunden bei Raumtemperatur und Normaldruck hydriert. Man filtriert ab, entfernt das Lösungsmittel und erhält 3'-(3-Carbamimidoyl-phenoxymethyl)- biphenyl-3-carboxamidin, Acetat, El 327 (M-NH3), 310 (M+-2 NH3)

Analog erhält man die Verbindungen 3'- (3-Carbamimidoyl-phenoxymethyl)-biphenyl-4-carboxamidin, Di- acetat, FAB 345 ; 3'- (4-Carbamimidoyl-phenoxymethyl)-biphenyl-4-carboxamidin, Di- acetat, FAB 345 ; 3'- (4-Carbamimidoyl-phenoxymethyl)-biphenyl-3-carboxamidin, Di- acetat, FAB 345 ; 4'- (4-Carbamimidoyl-phenoxymethyl)-biphenyl-4-carboxamidin, 4'- (4-Carbamimidoyl-phenoxymethyl)-biphenyl-3-carboxamidin, 4'- (3-Carbamimidoyl-phenoxymethyl)-biphenyl-3-carboxamidin und 4'- (3-Carbamimidoyl-phenoxymethyl)-biphenyl-4-carboxamidin.

Beispiel 2 Analog Beispiel 1 erhä ! t man durch Umsetzung von 3-Brombenzonitril mit 3-Methoxyphenylboronsäure die Verbindung 3'-Methoxybiphenyl-3- carbonitril.

Durch anschließende Etherspaltung mit Aluminiumtriiodid in Acetonitril und Umsetzung mit 3-Brommethyl-benzonitril erhält man 3'- (3-Cyan- benzyloxy)-biphenyl-3-carbonitril.

Durch Umsetzung mit Hydroxylamin und Reduktion mit Wasserstoff unter Ra-Ni-Katalyse erhält man 3'- (3-Carbamimidoyl-benzyloxy)-biphenyl-3- carboxamidin Analog erhält man

4'- (4-Carbamimidoyl-benzyloxy)-biphenyl-4-carboxamidin, Diacetat, FAB 345 ; 4'- (3-Carbamimidoyl-benzyloxy)-biphenyl-4-carboxamidin, Diacetat, FAB 345.

Beispiel 3 Analog Beispiel 1 erhält man durch Umsetzung von 3-Cyanphenylboron- säure mit 3-Brom-5-methyl-benzoesäuremethylester die Verbindung 3'- Cyan-5-methyl-biphenyl-3-carbonsäuremethylester. Durch Bromierung mit NBS und Umsetzung mit 3-Hydroxybenzonitril erhält man 3'-Cyan-5- (3- Cyan-phenoxymethyl)-biphenyl-3-carbonsäuremethylester.

Reaktion mit Hydroxylamin und Reduktion mit H2/Ra-Ni ergibt die Verbin- dung 3'-Carbamimidoyl-5- (3-carbamimidoyl-phenoxymethyl)-biphenyl-3- carbonsäuremethylester.

Durch Verseifung des Esters mit wässriger NaOH erhält man daraus 3'- Carbamimidoyl-5- (3-carbamimidoyl-phenoxymethyl)-biphenyl-3- carbonsäure.

Durch Chromatographie an reversed-phase-Säule mit Acetoni- tril/Wasser/TFA-Gemisch erhält man 3'-Carbamimidoyl-5- (3- carbamimidoyl-phenoxymethyl)-biphenyl-3-carbonsäure,Bistrif luoracetat.

Analog erhä ! t man die Verbindungen 4'-Carbamimidoyl-4- (4-carbamimidoyl-phenoxymethyl)-biphenyl-3- carbonsauremethylester, FAB 403; 4'-Carbamimidoyl-4- (3-carbamimidoyl-phenoxymethyl)-biphenyl-2- carbonsäuremethylester, FAB 403 ;

3'-Carbamimidoyl-4- (4-carbamimidoyl-phenoxymethyl)-biphenyl-2- carbonsäuremethylester, FAB 403 ; 3'-Carbamimidoyl-4- (3-carbamimidoyl-phenoxymethyl)-biphenyl-2- carbonsäuremethylester, FAB 403 ; 4'-Carbamimidoyl-5- (3-carbamimidoyl-phenoxymethyl)-biphenyl-4- carbonsäuremethylester, FAB 403 ; 3'-Carbamimidoyl-5- (3-carbamimidoyl-phenoxymethyl)-biphenyl-4- carbonsäuremethylester, FAB 403.

Beispiel 4 Analog Beispiel 1 erhä ! t man durch Umsetzung von 3-Brombenzoesäure- methylester mit 3-Tolylboronsäure 3'-Methylbiphenyl-3-carbonsäuremethyl- ester. Durch Bromierung mit NBS und Umsetzung mit 3-Hydroxybenzoe- säuremethylester erhält man daraus 3'- (3-Methoxycarbonyl-phenoxy- methyl)-biphenyl-3-carbonsäuremethylester. Durch Umsetzung mit Guani- dinhydrochlorid in methanolischer Natriummethanolatlösung erhält man daraus N- [3'- (3-Guanidinocarbonyl-phenoxymethyl)-biphenyl-3-carbonyl]- guanidin Analog erhält man die Verbindung N- [4'- (4-Guanidinocarbonyl- phenoxymethyl)-biphenyl-4-carbonyl]-guanidin.

Beispiel 5 Eine Lösung von 7,0 g 3-Brom-5-methylphenol und 5,97 g Bromessigsäu- remethylester sowie 13 g Cäsiumcarbonat in 100 mi Acetonitril wird bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Nach üblicher Aufarbeitung erhält man 9,70 g (3-Brom-5-methylphenoxy)-essigsäuremethylester ("AB").

Eine Suspension von 2,0 g"AB", 100 mg Tetrakis (triphenylphosphin)- Palladium und 0,85 g Natriumcarbonat in 50 ml Toluol wird zum Sieden erhitzt. Dann wird eine Lösung von 2,94 g 3-Cyanphenylboronsaure in 30 ml Methanol zugetropft und 14 Stunden unter Rückfluß erhitzt. Man arbei- tet wie üblich auf und erhalt 2,17 g (3'-Cyan-5-methyl-biphenyl-3-yloxy)- essigsauremethylester ("AC").

Eine Lösung von 1,2 g"AC"und 0,765 g NBS in 50 ml Tetrachlorkohlen- stoff wird bei Raumtemperatur mit UV-Licht bestrahlt. Nach üblicher Aufar- beitung erhalt man 1,54 g (3'-Cyan-5-brommethyl-biphenyl-3-yloxy)- essigsäuremethylester ("AD").

Eine Lösung von 185 mg"AD", 63,1 mg 4-Hydroxybenzonitril und 172, 7 mg Cäsiumcarbonat in 10 ml Acetonitril wird bei Raumtemperatur 4 Tage gerührt. Nach üblicher Aufarbeitung erhält man [3'-Cyan-5- (4- cyanphenoxymethyl)-biphenyl-3-yloxy]-essigsauremethylester ("AE").

Eine Lösung von 60 mg"AE", 69,5 mg Hydroxylammoniumchlorid und 101 mg Triethylamin in 10 ml Methanol wird 14 Stunden unter Rückfluß erhitzt.

Nach Entfernen des Lösungsmittels wird in Wasser aufgenommen. Man trennt ab und erhält 70 mg [3'-N-Hydroxyamidino-5- (4-N-hydroxyamidino- phenoxymethyl)-biphenyl-3-yloxy]-essigsauremethylester ("AF"). Durch Reduktion mit H2/Raney-Nickel erhält man daraus [3'-Amidino-5- (4- amidinophenoxymethyl)-biphenyl-3-yloxy]-essigsäuremethylest er, FAB 433

Analog erhält man die Verbindungen [4'-Amidino-5- (4-amidinophenoxymethyl)-biphenyl-3-yloxy]- essigsäuremethylester, FAB 433 [3'-Amidino-5- (3-amidinophenoxymethyl)-biphenyl-3-yloxy]- essigsäuremethylester, FAB 433 [4'-Amidino-5- (3-amidinophenoxymethyl)-biphenyl-3-yloxy]- essigsäuremethylester, FAB 433.

Ersetzt man in der ersten Stufe Bromessigsäuremethylester durch Brom- essigsäure-tert.-butylester sö können die in der letzten Stufe erhaltenen tert.-Butylester mit Trifluoressigsäure gespalten werden und man erhält die entsprechenden Carbonsäuren [3'-Amidino-5- (4-amidinophenoxymethyl)-biphenyl-3-yloxy]- essigsäure, Bistrifluoracetat, FAB 419 ; <BR> <BR> [4'-Amidino-5- (4-amidinophenoxymethyl)-biphenyl-3-yloxy]-<BR> essigsäure ;

[3'-Amidino-5- (3-amidinophenoxymethyl)-biphenyl-3-yloxy]-<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> essigsaure ;<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> [4'-Amidino-5- (3-amidinophenoxymethyl)-biphenyl-3-yloxy]-<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> essigsäure.

Beispiel 6 Eine Lösung von 5,0 g 3'-Brommethyl-biphenyl-3-carbonitril und 5 ml Tri- ethylphosphit werden zusammengegeben und langsam auf 150° erhitzt.

Man rührt 6 h bei 150° nach und erhä ! t nach üblicher Aufarbeitung 6,05 g (3'-Cyan-biphenyl-3-ylmethyl)-phosphonsäurediethylester ("BA").

Zu einer Lösung von 1,0 g"BA"und 3-Cyanbenzaldehyd in 20 ml Ethy- lenglycoldimethylether gibt man unter Eiskühlung und Stickstoff 150 mg Natriumhydrid. Man rührt 4 Stunden nach, arbeitet wie üblichauf und erhält 0,93 g 3'- [2- (3-Cyanphenyl)-vinyl]-biphenyl-3-carbonitril ("BB").

Nach Hydrierung von 360 mg"BB"mit Pd-C-5 % in Methanol erhält man 360 mg 3'- [2- (3-Cyanphenyl)-ethyl]-biphenyl-3-carbonitril ("BC"). Nach Umsetzung mit Hydroxylammmoniumchlorid und Hydrierung mit Raney- Nickel erhält man analog Beispiel 1 die Verbindung 3'- [2- (3-Amidino- phenyl)-ethyl]-biphenyl-3-carboxamidin, FAB 343 Analog erhält man die Verbindung 3'- [2- (4-Amidinophenyl)-ethyl]-biphenyl- 3-carboxamidin, FAB 343.

Beispiel 7 Die Verbindung N- [3'- (4-Guanidinocarbonyl-benzyloxy)-biphenyl-3- carbonyl]-guanidin, Dihydrochlorid, FAB 431 erhält man z. B. gemäß nachstehendem Reaktionsschema :

Pd Br Pd (PPh3),/Na2CO, N (HO) 2B 0 (HO) zB O All,/Acetonitril 1. MeOH/HCI O ber 0 /2. H20 / Br 0 I \ I > Avo Ds 0 NaOH/MeOH ou HO 0 OH 0 zozo N H2 0 ; 0 NH, 1-Chlor-1-methylpyridiniumiodid N-Methylpyrrolidon N-Ethyldiisopropylamin (Mukaiyama) O NH O 0 N N H H H H /N'N\/O O NH O 25% ige HCI NHz 'hi N N \ \ p I \ /N\/NH2 H, N N o- Dihydrochlorid

Analog erhält man nachstehende Verbindungen N- [3'- (3-Guanidinocarbonyl-benzyloxy)-biphenyl-3-carbonyl]-guanidi n, Dihydrochlorid, FAB 431 ; N- [3'- (4-Guanidinocarbonyl-benzyloxy)-biphenyl-4-carbonyl]-guanidi n, Dihydrochlorid, FAB 431 ; N- [3'- (3-Guanidinocarbonyl-benzyloxy)-biphenyl-4-carbonyl]-guanidi n, Dihydrochlorid, FAB 431.

Pharmakologische Tests Im folgenden ist die Methodik dargestellt, die zur Charakterisierung der Verbindungen der Formel I als NHE-3-Inhibitoren verwendet wurde.

Die Verbindungen der Formel I wurden in bezug auf ihre Selektivität ge- genüber den Isoformen NHE-1 bis NHE-3 charakterisiert. Die drei Isofor- men wurden in Maus-Fibroblastenzellinien stabil exprimiert. Die Hemmwir- kung der Verbindungen wurde durch Bestimmung der EIPA-empfindlichen 22Na-Aufnahme in die Zellen nach intrazellulärer Acidose beurteilt.

Zur Charakterisierung der Na/H-Austauschhemmstoffe in bezug auf ihre Isoformselektivität untersuchten wir die Verbindungen auf ihre Hemmung der NHE-Isoformen NHE-1,-2 und-3, die in einer Maus- Fibroblastenzellinie stabil exprimiert wurden (siehe Verfahrensteil), da- durch, daß die EIPA-empfindliche 22Na-Aufnahme in die Zellen nach in- trazellulärer Acidose bestimmt wurde.

Material und Methoden LAP1-Zellinien, die die unterschiedlichen NHE-Isoformen exarimieren Die LAP1-Zellinien, die die Isoformen NHE-1,-2 und-3 exprimieren (eine Maus-Fibroblastenzellinie), wurden von Prof. J. Pouysségur (Nice, Frank-

reich) erhalten. Die Transfektionen wurden nach dem Verfahren von Fran- chi et al. (1986) durchgeführt. Die Zellen wurden in Dulbeccos modifizier- tem Eagle-Medium (DMEM) mit 10% inaktiviertem fötalem Kälberserum (FKS) kultiviert. Zur Selektion der NHE-exprimierenden Zellen wurde das sogenannte"Säureabtötungsverfahren"von Sardet et al. (1989) verwen- det. Die Zellen wurden zuerst 30 Minuten in einem NH4CI-haltigen bicar- bonat-und natriumfreien Puffer durch Waschen mit einem bicarbonat-, NH4CI-und natriumfreien Puffer entfernt und es wurde mit einem bicarbo- natfreien NaCI-haltigen Puffer inkubiert. Nur diejenigen zellen, die NHE funktionell exprimieren, konnten in der intrazellulären Ansäuerung, der sie ausgesetzt wurden, überleben.

Charakterisierunq von NHE-Hemmstoffen in bezuq auf ihre Isoformselekti- vität Mit den obengenannten Maus-Fibroblastenzellinien, die die Isoformen NHE-1, NHE-2 und NHE-3 exprimieren, wurden Verbindungen nach der von Counillon et al. (1993) und Scholz et al. (1995) beschriebenen Vorge- hensweise auf Selektivität gegnüber den Isoformen geprüft. Die Zellen wurden intrazellulär nach dem NH4CI-Prepulse-Verfahren und anschlie- ßend durch Inkubation in einem bicarbonatfreien 22Na+-haltigen Puffer an- gesäuert. Aufgrund der intrazellulären Ansäuerung wurde NHE aktiviert und Natrium wurde in die zellen aufgenommen. Die Auswirkung der Prüfverbindung wurde als Hemmung der EIPA (Ethyl-isopropylamilorid)- empfindlichen 22Na+-Aufnahme ausgedrückt.

Die Zellen, die NHE-1, NHE-2 und NHE-3 exprimierten, wurden in einer Dichte von 5-7,5 x 104 Zellen/Näpfchen in Mikrotiterplatten mit 24 Näpf- chen überimpft und 24 bis 48 Stunden bis zur Konfluenz gezüchtet. Das Medium wurde abgesaugt und die Zellen wurden 60 Minuten bei 37° C im NH4CI-Puffer (50 mM NH4CI, 70 mM Cholinchlorid, 15 mM MOPS, pH 7, 0) inkubiert. Anschließend wurde der Puffer entfernt und die Zellen wurden rasch zweimal mit dem Cholinchlorid-Waschpuffer (120 mM Cholinchlorid, 15 mM PIPES/Tris, 0, 1 mM Ouabain, 1 mM Mit2, 2 mM CaCts, pH 7, 4) überschichtet ; in diesem Puffer wurden die Zellen 6 Minuten inkubiert.

Nach Ablaufen der Inkubationszeit wurde der Inkubationspuffer abgesaugt.

Zwecks Entfernung extrazellulärer Radioaktivität wurden die Zellen viermal

rasch mit eiskalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen.

Danach wurden die Zellen durch Zusatz von 0,3 ml 0,1 N NaOH pro Näpf- chen solubilisiert. Die zellfragmenthaltigen Lösungen wurden in Szintillati- onsröhrchen überführt. Jedes Näpfchen wurde noch zweimal mit 0,3 mi 0,1 N NaOH gewaschen und die Waschlösungen wurden ebenfalls in die entsprechenden Szintillationsröhrchen gegeben. Die das Zellysat enthal- tenden Röhrchen wurden mit Szintillationscocktail versetzt und die in die Zellen aufgenommene Radioaktivität wurde durch Bestimmung der- Strahlung bestimmt.

Hemmung der 22Na+-Aufnahme in Kaninchen-Ervthrozvten Die Na+/H+-Austauschaktivität wurde auch durch Beobachtung der Auf- nahme von 22Na-lonen in sauergestellte Kaninchen-Erythrozyten be- stimmt. Kaninchen-Erythrozyten haben bei Untersuchungen zur Na+/H+- Austauschaktivität breite Anwendung gefunden (Escobales & Fugueroa, 1991 ; Morgan & Canessa, 1990). Der EIPA-empfindliche Anteil der 22Na+- Aufnahme in sauergestellte Erythrozyten wurde als Na+/H+-abhängige <BR> <BR> 22Na+-Aufnahme angesehen<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> Zellpräparation Die Präparation der roten Blutkörperchen sowie die interne Ansäuerung der roten Blutkörperchen wurden in starker Anlehnung an die Verfahren von Morgan und Canessa (1990) durchgeführt.

Das Blut wurde von Kaninchen erhalten (z. B. New Zealand White). Es wurde in 50-ml-Falcon-Zentrifugenröhrchen aufgefangen, die 5 ml Natri- umheparinlösung (250 U/ml) enthielten. Das Blut und die Heparinlösung wurden gut vermischt. Die roten Blutkörperchen wurden durch Zentrifuga- tion bei 2000 x g bei 4° C gewonnen ; Plasma und Leukozytenmanschette wurden entfernt. Die verbleibende Lösung wurde durch 200-pm-Gaze fil- triert. Das Filtrat wurde mit Waschpuffer wieder auf das ursprüngliche Vo- lumen suspendiert (140 mM KCI, 0,15 mM MgCI2, 10 mM TRIS/MOPS, pH 7,4). Die roten Blutkörperchen wurden wiederum durch Zentrifugation ge- wonnen (2000 x g, 4° C). Der Waschvorgang wurde zweimal wiederholt.

Intrazelluläre Ansäuerunq Zur intrazellulären Ansäuerung wurden 5 ml der abgesetzten gesammelten roten Blutkörperchen wiederum mit 45 ml Ansäuerungspuffer suspendiert (170 mM KCI, 0,15 mM Mit2, 0,1 mM Ouabain, 10 mM Glucose, 10 mM Saccharose, 20 mM Tris/Mes, pH 6,2). Die Suspension der roten Blutkör- perchen wurde 10 Minuten bei 37° C inkubiert (unter gelegentlichem Mi- schen). Um den internen pH zu fixieren, versetzt man mit bis zu 200 Jv) und 1mM DIDS bzw. DIAMOX (acetazolamid). Man inkubierte noch 30 Mi- nuten bei 37° C.

Die roten Blutkörperchen wurden anschließend durch Zentrifugation ge- wonnen (4 Minuten bei 2000 x g, 4° C) ; sie wurden wiederum mit eiskalter ungepufferter Waschlösung (170 mM KCI, 40 mM Saccharose, 0,15 mM MgCtz) suspendiert und damit viermal gewaschen.

Inkubation sowie Messunq der 22Na-Aufnahme Die Inkubation wurde in Macrowell-Tube-Streifen in einem Format von 8 x 12 durchgeführt. Mit der Inkubation wurde dadurch begonnen, daß man 200 pl Inkubationspuffer (160 mM KCI, 22NaCI (37 MBq/Näpfchen), 10 mM NaCI, 0,15 mM Mit2, 0,1 mM Ouabain, 10 mM Glucose, 40 mM Saccha- rose, 10 mM Tris/MOPS, ph 8,0,0,5 mM Diamox, 1% DMSO) mit 20 ul der (vorgewärmten) angesäuerten Lösung der roten Blutkörperchen versetzte.

Die Prüfsubstanzen wurden zuerst mit 100% DMSO gelöst und die Lösung wurde anschließend mit Inkubationspuffer auf die entsprechenden Kon- zentrationen verdünnt. Man inkubierte 5 Minuten bei 37° C. (In Vorversu- chen wurde gezeigt, daß unter diesen Inkubationsbedingungen die 22Na- Aufnahmerate während der 5-minütigen Inkubationsdauer linear war).

Die Inkubation wurd edurch Zugabe von 800 lli eiskalter Stopplösung (112 mM Mit2, 0,1 mM Ouabain) gestoppt. Die Röhrchen wurden kurzfristig auf Eis aufbewahrt. Anschließend wurden die Röhrchen mit Parafilm ab- gedeckt und die roten Blutkörperchen wurden durch 7-minütige Zentrifuga- tion bei 2000 x g und 4° C gewonnen. Der Überstand wurde mit einem selbstgemachten Absaugegerät abgesaugt, mit dem man 4 nebeneinan- derliegende Röhrchen gleichzeitig absaugen konnte ; Abstandhalterringe an den weiteren Enden der Spitzen verhinderten, daß die Spitzen zu tief in

die Röhrchen eintauchten und man das Pellet der roten Blutkörperchen absaugte. Alle 22Na-haltigen Überstände sowie Waschlösungen wurden aufbewahrt und als radioaktiver Abfall entsorgt.

Die roten Blutkörperchen wurden dreimal mit 900 pu eiskalter Stopplösung gewaschen, und zwar dadurch, daß man den oben beschriebenen Sus- pendierungs-/Zentrifugationsschritt wiederholte. Nach dem letzten Wa- schen wurde das Pellet der roten Blutkörperchen mit 200 pI Wasser ver- setzt. Anschließend wurden die Röhrchen 2 x 30 Minuten mit Ultraschall behandelt. Anschließend wurden die Macrowell-Tube-Streifen auseinan- dergenommen und jedes Röhrchen wurde kopfüber in ein eigenes Szintil- lationsröhrchen gegeben ; durch leichtes Schütteln entleerte sich die hä- molysierte Lösung der roten Blutkörperchen in das Szintillationsgläschen.

Jedes Gläschen wurde mit 3 ml der Szintillationsflüssigkeit Aquasafe 300 PS versetzt, und die Gläschen wurden mit Verschlüssen versehen und gut gemischt.

Die in die roten Blutkörperchen aufgenommene Radioaktivität wurde in ei- nem Szintillationszähler durch Verfolgen des ß-Zerfalls bestimmt.

Pro Substanzkonzentration wurde die bestimmung in dreifacher Wieder- holung durchgeführt. Von jedem Wert wurde das Mittel der Zählungsbe- stimmung in gegenwart von 10 pM EIPA subtrahiert, um die nicht-Na+/H+- abhängige 22Na-Aufnahme in die Erythrozyten einzubeziehen. Das Mittel der verbleibenden Zählungen in Abwesenheit einer Substanz wurde als 100-%-Kontrolle verwendet ; die Mittelwerte in Gegenwart der Prüfverbin- dungen wurden als Prozentsatz dieses Kontrollwerts ausgedrückt. Die pro- zentmäßigen Aufnahmedaten wurden semilogarithmisch aufgetragen ; IC50-Werte wurden dadurch erzielt, daß man unter Verwendung der Glei- chung f (x) = 100/ (1 + (IC50/x) **n) die Werte an eine nichtlineare Kurve an- passte.

Literatur : Couillon et al. (1993) Mol. Pharmacol. 44 : 1041-1045 Escobales und Figueroa (1991) J. Membrane Biol. 120, 41-49 Franchi et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 : 9388-9392 Morgan und Canessa (1990) J. Membrane Biol. 118, 193-214 Sardet et al. (1989) Cell 56 : 271-280 Scholz et al. (1995) Cardiovasc. Res. 29 : 260-268

Testergebnisse ZIZI HN 'J NH Code EMD 221960 IC50 (NHE-3) = 1-2 µM 2. NH NH2 HN W U NH 2 NH Diacetat ; Code EMD 221963 IC50 (NHE-3) = 1 µM 3. NH NHE H2N w// NH O 0 Diacetat ; Code EMD 246326 IC50 (NHE-3) = 3 uM 4.

H N I I/NH NH 0 1 NH 2 Diacetat ; Code EMD 246327 IC50 (NHE-3) = 3-4 µM.

Die nachfolgenden Beispiele betreffen pharmazeutische Zubereitungen : Beispiel A : Injektionsgläser Eine Lösung von 100 g eines NHE-3-Inhibitors der Formel I und 5 g Dina- triumhydrogenphosphat wird in 3 I zweifach destilliertem Wasser mit 2 n Salzsäure auf pH 6,5 eingestellt, steril filtriert, in Injektionsglaser abgefüllt, unter sterilen Bedingungen lyophilisiert und steril verschlossen. Jedes In- jektionsglas enthalt 5 mg Wirkstoff.

Beispiel B : Suppositorien Man schmilzt ein Gemisch von 20 g eines NHE-3-inhibitors der Formel I mit 100 g Sojalecithin und 1400 g Kakaobutter, gießt in Formen und Itiflt erkalten. Jedes Suppositorium enthält 20 mg Wirkstoff.

Beispiel C : Lösung Man bereitet eine Lösung aus 1 g eines NHE-3-Inhibitors der Formel @, 9,38 g NaH2PO. 4 # 2 H2O, 28, 48 g Na2HPO4 # 12 H2O und 0,1 g Benzalko- niumchlorid in 940 ml zweifach destilliertem Wasser. Man stellt auf pH 6, 8 ein, foliot auf 1 1 auf und sterilisiert durch Bestrahlung. Diese Lösung kann in Form von Augentropfen verwendet werden.

Beispiel D : Salbe Man mischt 500 mg eines NHE-3-inhibitors der Formel I mit 99,5 g Vaseli- ne unter aseptischen Bedingungen.

Beispiel E : Tabletten Ein Gemisch von 1 kg eines NHE-3-Inhibitors der Formel I, 4 kg Lactose, 1,2 kg Kartoffelstärke, 0,2 kg Talk und 0,1 kg Magnesiumstearat wird in üblicher Weise zu Tabletten verpreßt, derart, daß jede Tablette 10 mg Wirkstoff enthält.

Beispiel F : Dragees Analog Beispiel E werden Tabletten gepreßt, die anschließend in üblicher <BR> <BR> Weise mit einem Überzug aus Saccharose, Kartoffelstärke, Talk, Tragant und Farbstoff überzogen werden.

Beispiel G : Kapseln 2 kg eines NHE-3-Inhibitors der Formel I werden in üblicher Weise in Hart- gelatinekapseln gefüllt, so daß jede Kapsel 20 mg des Wirkstoffs enthält.

Beispiel H : Ampullen Eine Lösung von 1 kg NHE-3-Inhibitor der Formel I in 60 I zweifach destil- liertem Wasser wird steril filtriert, in Ampullen abgefüllt, unter sterilen Be- dingungen lyophilisiert und steril verschlossen. Jede Ampulle enthält 10 mg Wirkstoff.